CN102944540A - 一种深层散射介质中的三维成像系统及方法 - Google Patents

Abstract

一种深层散射介质中的三维成像系统，包括沿光路传播方向依次设置的光源、贝赛尔光束产生及扫描装置、荧光收集系统、信号探测部件以及图像采集系统，贝塞尔光束产生及扫描装置包括沿光路设置的平移台、锥镜、第一透镜、振镜以及4f系统；本发明解决了现有的三维技术采用逐点扫描获取三维图像的低效性且无法对散射介质中的荧光体进行成像的技术问题，采用了能够产生沿光传播方向形成线聚焦的准贝塞尔光束作为激发光，代替现有的双光子激发荧光扫描显微技术中产生点聚焦的高斯光束，将原本的平面扫描变成了体积扫描，实现了快速获取散射介质内部荧光分布图像。

Description

一种深层散射介质中的三维成像系统及方法

技术领域

本发明提出了一种在深层散射介质中进行三维成像的系统及方法。利用超短脉冲线聚焦光束激发产生双光子荧光，实现对散射介质中，尤其是生物组织内部，荧光标记物的三维空间分布成像。该发明适用于生物学、医学，生物物理和环境科学等领域的研究和应用。

背景技术

荧光显微技术以其高灵敏度、高空间分辨率、丰富的分子对比机制成为生物医学研究中必不可少的设备。由于光的散射效应的存在，普通的荧光显微镜只能对很薄（<10微米）的样品或者是样品表面很薄的一层进行成像，才能得到较理想的高分辨图像。对于散射介质内的荧光体的显微成像，目前要借助共聚焦或双光子激发等手段，来去除焦点以外各处发出的荧光影响，同时结合激光扫描成像技术来实现。

激光扫描成像技术采用的是扫描聚焦的光斑来逐点激发产生荧光，并同时进行数据采集，图像是由计算机按扫描的顺序重建而得到。这种逐点扫描的方式对于三维的厚组织的成像存在明显的不足。首先是获取三维图像的低效性：比如对于一块厚组织成像，要获得一幅512x512x200的三维图像，如果扫描的速度是1k行/秒，大致需要2分钟时间，在这段时间内被观察的对象很有可能早已改变了原先所在的位置，甚至于已完全离开了扫描观察的区域，使得很多快速的动态过程无法观测。其次是无法实时得到三维视场的体视效果，因为得到全部三维信息需要对整个视场范围进行200次幅扫描（每幅512x512）。传统的体视显微技术可以实时得到体视效果，但是无法对散射介质中的荧光体进行成像。

针对上述问题我们提出了用线聚焦的光束替代普通扫描荧光显微成像技术中的点聚焦光束，来实现散射介质中的立体成像。实现线聚焦的最常用方法是用透镜聚焦一个圆锥形的波前，在聚焦区域产生所谓的准贝塞尔光束，这种光束在有限的聚焦区域里具有贝塞尔光束的特性。贝塞尔光束具有“无衍射”的特性，即其光场分布的粗细不随光束的传播而变化，而且其居于中心的中心光瓣的束腰大小接近于衍射极限的大小。另外，贝塞尔光束在遇到障碍物时，中心光束会自行修复其缺失，具有“自愈和”的特性。

发明内容

为了解决现有的三维技术采用逐点扫描获取三维图像的低效性且无法对散射介质中的荧光体进行成像的技术问题，本发明提供一种深层散射介质中的三维成像系统及方法，本发明提出了用线聚焦的光束替代普通扫描荧光显微成像技术中的点聚焦光束，来实现散射介质中的三维成像。

本发明的技术解决方案：

一种深层散射介质中的三维成像系统，其特殊之处在于：包括沿光路传播方向依次设置的光源、贝赛尔光束产生及扫描装置、荧光收集系统、信号探测部件以及图像采集系统，

所述光源为激光器，

所述贝塞尔光束产生及扫描装置包括沿光路设置的平移台、锥镜、第一透镜1、振镜以及4f系统；所述4f系统包括第二透镜和第三透镜，所述第二透镜放置在振镜的反射光路上，第二透镜2和第三透镜3之间的距离L=f2+f3，其中f2为第二透镜的焦距，f3为第三透镜的焦距，所述锥镜放置在平移台上，所述锥镜与第一透镜之间的距离等于第一透镜的焦距f1，所述振镜8放置在第一透镜和第二透镜的焦点重合处，

所述信号探测部件的输入端朝向荧光收集系统的荧光输出端，所述信号探测部件的输出端与图像采集系统的输入端连接。

上述荧光收集系统包括双色镜以及物镜，所述双色镜放置在第三透镜的透射光路上，所述物镜放置在双色镜的透射光路上，物镜的另一端放置有样品。

上述信号探测部件为光电倍增管或单光子探测器。

还包括准直扩束系统，所述准直扩束系统设置在光源和贝赛尔光束产生及扫描装置之间，所述准直扩束系统包括沿光源传输方向设置的扩束器5和光阑6。

还包括聚光镜13和第二光电倍增管15，所述聚光镜设置在样品的一侧，与物镜相对，所述聚光镜的透射端朝向第二光电倍增管15。

一种深层散射介质中的三维成像方法，其特殊之处在于：包括以下步骤：

1】光源产生一束激光；

2】将激光转变为准贝塞尔光束；

3】将准贝塞尔光束通过第一透镜聚焦，在振镜上产生准贝塞尔光束的傅立叶频谱，形成两个正交的扫描光场；

4】将扫描光场通过双色镜后透射至物镜焦区，在物镜的焦区产生聚焦的、在z方向线状延伸的准贝塞尔光束；

5】获取图像：

5.1】转动振镜，准贝塞尔光束作为激发光对样品做垂直光轴的横向扫描，收集所产生的荧光并进行光电转换，通过图像采集系统得到样品的第一幅两维图像；

5.2】横向移动锥镜，然后转动振镜，准贝塞尔光束作为激发光对样品做垂直光轴的第二次横向扫描，收集所产生的荧光并进行光电转换，通过图像采集系统得到样品的第二幅两维图像；

5.3】对扫描得到的两幅两维图像进行体视合成，获得样品的三维分布信息。

上述步骤5】具体为，物镜收集样品所产生的荧光，并通过双色镜反射给光电倍增管进行光电转换或聚光镜收集样品所产生的荧光，并透射给第二光电倍增管。

在激光束转变为准贝塞尔光束之前还经过准直扩束。

本发明所具有的优点：

1、本发明采用了能够产生沿光传播方向形成线聚焦的准贝塞尔光束作为激发光，代替现有的双光子激发荧光扫描显微技术中产生点聚焦的高斯光束，将原本的平面扫描变成了体积扫描，实现了快速获取散射介质内部荧光分布图像。

2、本发明使得聚焦线的延伸方向与光轴方向形成一个倾斜角，对同一个样品分别用带有不同倾斜角的聚焦线进行两次扫描成像，然后再将两幅图分别显示给观察者的左右两眼实现三维立体的成像效果。

附图说明

图1本发明锥镜所产生准贝赛尔光束；

图2通过移动锥镜实现双视角扫描示意图；

图3本发明三维成像系统的结构示意图；

图4本发明获取第一个视角的两维图像的流程；

图5本发明获取第二个视角的两维图像的流程。

具体实施方式

各组成部分的作用和实现如下：

超短脉冲激光器产生的皮秒或飞秒脉冲可以在样品上通过双光子吸收效应产生荧光，其信号强度正比于激光强度的平方，这种非线性效应导致荧光信号被定位在纵向延伸的贝塞尔零级光束聚焦线上，从而使高穿透深度的体扫描成为可能。

扩束准直部分，可以对飞秒脉冲进行空间整形，为后面的扫描装置提供更理想的高斯光束。

贝赛尔光束产生和扫描装置：贝塞尔光束可以通过很多方法来产生，一个比较简单的方法是用基模高斯光束通过圆锥镜形成的零阶准贝塞尔光束，假设圆锥镜的张角为γ，材料的折射率为n，高斯光束的束腰半径为W₀，波长为λ，那么贝塞尔光束的几何光学传播方向和光轴Z方向的夹角α₀，最大传播距离Z_max，中心光瓣的半径r₀和轴上的光强分布I(0,z)可表示为：

α₀=(n-1)γ

Z_max=w₀/(tanα)

r₀=2.405λ/(2πsinα₀)

I_B(0,z)∝α₀ ²z/λ·exp[-2(α₀z/w₀)²]                        (1)

产生的贝塞尔光束由第一透镜1聚焦到振镜上，再通过焦距为f2的第二透镜2和焦距为f3的第三透镜3组成的4f系统，入射到物镜的入瞳。第二透镜2和第三透镜3的相距L=f1+f2。为了产生两个倾斜的聚焦线，锥镜放在一个可以横向移动的平移台上。

贝塞尔光束最终被投射到物镜焦区，通过双光子吸收产生荧光信号。部分反向传播的荧光信号被显微物镜收集并通过光电探测器（如光电倍增管）接收变为电信号，经采集系统和计算机的处理，用于重建荧光图像。由于物镜的收集的体积只限于其设计的焦点区域，所以不能很有效的收集聚焦线上发出的荧光。为了尽可能的多收集产生的荧光，可以采用聚光镜进行前向收集，聚光镜所收集的荧光信号可以最后汇总到另一个第二光电探测器15上，其信号输出与物镜收集的信号叠加后，就可以得到整个体积幅图像。重建体视图，需要获得图面说明。

本发明采用了能够产生沿光传播方向形成线聚焦的准贝塞尔光束作激发光，代替现有的双光子激发荧光扫描显微技术中产生点聚焦的高斯光束，将原本的平面扫描变成了体积扫描，实现了快速获取散射介质内部荧光分布图像。由于从点扫描改成线扫描，荧光的收集也有所不同，透镜收集的荧光基本局限在焦点附近发出的，适合于点扫描成像。对于线扫描我们提出的收集方式，来充分获取聚焦线上各处发出的荧光

为了实现三维体视图像的生成，我们提出如下方法：让准贝塞尔光束产生的聚焦线的延伸方向与光传播的方向形成一个倾斜角，如果对同一个样品分别用带有不同倾斜角的聚焦线进行两次扫描成像，然后再将两幅图分别显示给观察者的左右两眼，就可以实现三维立体的成像效果。用带有不同倾斜角度的聚焦线得到的图像，类似于立体视觉中人眼左右两眼的观察方向的角度的差别，这个角度就是产生体视的关键所在。

产生这种倾斜的聚焦线的方法为：

1、如图3所示，转动振镜；

2、如图4所示，横向移动锥镜，通过切换锥镜的横向位置，使投射在振镜上的聚焦环微移，转动振镜，进而通过4ｆ系统使入射在物镜上的光环产生微移，通过物镜使得聚焦场与光轴的夹角在两个视角上切换。两幅不同视角的体扫描图像可以通过目前的立体显示技术来再现观察样品的体视效果。

实施例：

为了高效激发荧光标记样品中的双光子荧光，并高速对样品扫描，激发光源一般采用高重复频率（如80MHz）的超短脉冲锁模激光器。例如可以采用Sepctra-Physics公司的Mai Tai超快飞秒激光器，它具有较宽的光谱调节范围（690nm~1040nm），可以激发常见的荧光标记物产生双光子荧光。脉冲宽度一般选择在100~200飞秒，更大的脉宽会降低双光子激发效率，从而减弱贝赛尔光束激发的深度。

显微物镜在本发明中既作为扫描贝塞尔光束的组件，也作为反向荧光收集的组件。为使扫描场能够在不同扫描角度下具有较好的贝塞尔聚焦场，宜采用大入瞳直径的物镜（约6mm以上）。为了使提高散射的荧光光子的收集效率，根据文献Ducros,M.et al.Journal of Neuroscience Methods 198,172–180(2011).应采用低放大倍率、高数值孔径的物镜。

扩束装置与光阑使得入射到锥镜中心的光斑保持均匀，同时保证合适的尺寸，能够充分利用扫描振镜的有效尺寸，最终通过4ｆ系统在物镜入瞳处产生合适大小环状光场分布。

本发明利用锥镜产生贝塞尔光束，锥镜所产生的远场光束的发散角随着底角角度的增加而增大，采用小底角的（例如2°）的锥镜，使得后面的4ｆ系统能够中继整个光束。

振镜的扫描角度范围决定了观察样品的视场大小，但是最大扫描角度不能超过后续4f系统和物镜入瞳的孔径限制。

Claims (8)

1.一种深层散射介质中的三维成像系统，其特征在于：包括沿光路传播方向依次设置的光源、贝赛尔光束产生及扫描装置、荧光收集系统、信号探测部件以及图像采集系统，

所述光源为激光器，

所述贝塞尔光束产生及扫描装置包括沿光路设置的平移台、锥镜、第一透镜（1）、振镜以及4f系统；所述4f系统包括第二透镜和第三透镜，所述第二透镜放置在振镜的反射光路上，第二透镜（2）和第三透镜（3）之间的距离L=f2+f3，其中f2为第二透镜的焦距，f3为第三透镜的焦距，所述锥镜放置在平移台上，所述锥镜与第一透镜之间的距离等于第一透镜的焦距f1，所述振镜（8）放置在第一透镜和第二透镜的焦点重合处，

所述信号探测部件的输入端朝向荧光收集系统的荧光输出端，所述信号探测部件的输出端与图像采集系统的输入端连接。

2.根据权利要求1所述的深层散射介质中的三维成像系统，其特征在于：所述荧光收集系统包括双色镜以及物镜，所述双色镜放置在第三透镜的透射光路上，所述物镜放置在双色镜的透射光路上，物镜的另一端放置有样品。

3.根据权利要求1或2所述的深层散射介质中的三维成像系统，其特征在于：所述信号探测部件为光电倍增管或单光子探测器。

4.根据权利要求3所述的深层散射介质中的三维成像系统，其特征在于：还包括准直扩束系统，所述准直扩束系统设置在光源和贝赛尔光束产生及扫描装置之间，所述准直扩束系统包括沿光源传输方向设置的扩束器(5)和光阑(6)。

5.根据权利要求3所述的深层散射介质中的三维成像系统，其特征在于：还包括聚光镜（13）和第二光电倍增管（15），所述聚光镜设置在样品的一侧，与物镜相对，所述聚光镜的透射端朝向第二光电倍增管(15)。

6.一种深层散射介质中的三维成像方法，其特征在于：包括以下步骤：

1】光源产生一束激光；

2】将激光转变为准贝塞尔光束；

3】将准贝塞尔光束通过第一透镜聚焦，在振镜上产生准贝塞尔光束的傅立叶频谱，形成两个正交的扫描光场；

4】将扫描光场通过双色镜后透射至物镜焦区，在物镜的焦区产生聚焦的、在z方向线状延伸的准贝塞尔光束；

5】获取图像：

5.1】转动振镜，准贝塞尔光束作为激发光对样品做垂直光轴的横向扫描，收集所产生的荧光并进行光电转换，通过图像采集系统得到样品的第一幅两维图像；

5.2】横向移动锥镜，然后转动振镜，准贝塞尔光束作为激发光对样品做垂直光轴的第二次横向扫描，收集所产生的荧光并进行光电转换，通过图像采集系统得到样品的第二幅两维图像；

5.3】对扫描得到的两幅两维图像进行体视合成，获得样品的三维分布信息。

7.根据权利要求6所述的深层散射介质中的三维成像方法，其特征在于：所述步骤5】具体为，物镜收集样品所产生的荧光，并通过双色镜反射给光电倍增管进行光电转换或聚光镜收集样品所产生的荧光，并透射给第二光电倍增管。

8.根据权利要求6或7所述的深层散射介质中的三维成像方法，其特征在于：在激光束转变为准贝塞尔光束之前还经过准直扩束。

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