CN113466190B - 一种多模式多光子激光扫描立体显微成像装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多模式多光子激光扫描立体显微成像装置及方法，属于三维光学显微成像技术领域。成像装置包括沿光路依次设置的超快激发光源模块、多模式光场产生模块、激光扫描模块与荧光收集和探测模块；还包括控制和数据采集模块、立体显示模块与电控样品台；多模式光场产生模块包括沿光路依次设置的扩束器、波前调制器件、孔径光阑及傅立叶变换透镜；利用可编程控制波前整形器件，产生不同焦深的激发光场，分别实现点扫描光学层切成像、线扫描光学投影成像以及双视角立体扫描实时立体成像三种成像模式，通过兼容的立体显示器对三维样品进行三种成像模式的实时观测。

Description

一种多模式多光子激光扫描立体显微成像装置及方法
技术领域
本发明涉及一种集成点扫描光学层切、线扫描光学投影和双视角立体扫描实时三维成像三种成像模式的显微成像装置和方法，属于三维光学显微成像技术领域。
背景技术
激光扫描显微镜在生命科学、材料等领域应用广泛。其中双光子激发激光扫描荧光显微是目前主流的用于活体深层组织成像的光学显微技术，自上世纪90年代提出后，至今已被应用到生物活体成像、发育生物学、材料科学等多个领域中，因其具有高穿透深度、低光损伤、高空间分辨率的优点而收到研究人员的广泛关注。但是由于其逐点扫描、逐层成像的三维成像方式限制了成像速度的提高，其三维成像速度一般不到1体帧/秒，三维动态变化需要数据重构之后才可以观测；而且此成像方式单层成像景深很短，无法观测大景深范围的动态变化。
为了提高三维显微成像速度，研究人员从多方面进行了努力：首先是采用具有更高扫描频率的器件，如共振振镜实现8KHz到16KHz的扫描，也可使用声光扫描器件实现频率更高的扫描，但是三维成像仍受限于慢的轴向移动速度，而且成像的视场较小。同时，这一类通过提高点扫描速度的方法，会减少聚焦的激发光束在单个成像点的停留时间，从而每个像素对应的荧光光子数会降低，泊松噪声的影响变得更加显著，图像信噪比下降。其次是利用多焦点激发和多像素探测方法来实现扫描成像的并行化。Bewersdorf等人提出利用微透镜阵列来产生多个激发焦点，并利用相机来记录荧光图像(J.Bewersdorf,R.Pick,andS.W.Hell,"Multifocal multiphoton microscopy,"Opt.Lett.23,655–657(1998))，但这类方法在深层组织成像中受到很大限制，因为荧光光子受到的散射随着成像深度的增加而加剧，最终使得多个焦点之间的串扰大大增加。另外一种思路是通过增加显微成像系统的景深，即扩展景深(EDOF)显微成像，特别是和能对组织深层成像的双光子激发激光扫描荧光显微成像结合起来，可以避免慢速的轴向扫描，从而提高三维成像速度。Dufour等人于2006年利用锥镜产生的贝塞尔光束完成了扩展景深的双光子荧光成像(P.Dufour,M.Piché,Y.De Koninck,and N.McCarthy,"Two-photon excitation fluorescence microscopywith a high depth of field using an axicon,"Appl.Opt.45,9246–9252(2006).)，但成像系统未采用显微物镜，光学分辨率很低，而且系统通过移动样品来代替激光扫描，成像速度很慢。同年，牛津大学的Botcherby等人提出了利用衍射光学元件产生贝塞尔光束的高分辨率双光子荧光成像(E.J.Botcherby,R.
Figure BDA0003097084630000021
and T.Wilson,"Scanning twophoton fluorescence microscopy with extended depth of field,"Opt.Commun.268,253–260(2006).)，但是成像系统也是利用了样品台的扫描代替光束的扫描。
专利ZL201210384895.4和US 10,809,510 B2利用线状分布的准贝塞尔光束替代高斯光束聚焦的点状光场，提高了成像的景深，避免了沿样品深度方向的扫描，以牺牲三维成像区域的深度信息为代价快速获取此区域的投影成像。专利ZL201210384895.4提出手动平移锥镜实现对线状光束的角向偏移，但受限于此操作的时间延迟较大，亦无对应的电控和数据采集措施，无法对三维样品进行实时立体成像。
综上可知，现有的激光扫描显微镜大多利用高斯光束聚焦的点扫描方式，获取短景深的光学层切图像，或者线状的准贝塞尔光束实现光学投影成像，成像功能单一，同时也不能对三维样品的实时立体三维显微成像。
发明内容
为了解决现有的激光扫描显微镜成像功能单一且不能对三维样品的实时立体三维显微成像的问题，本发明提供一种多模式多光子激光扫描立体显微成像装置及方法，基于光场调控方法，利用波前调制器件，分别产生适用于点扫描光学层切、线扫描光学投影成像以及双视角立体扫描三种成像模式的激发光场，并通过计算机控制，与两维扫描振镜协同扫描，实现光学层切、光学投影以及双视角立体扫描实时成像三种成像功能。
本发明的技术方案是提供一种多模式多光子激光扫描立体显微成像装置，其特殊之处在于：包括沿光路依次设置的超快激发光源模块、多模式光场产生模块、激光扫描模块与荧光收集和探测模块；还包括控制和数据采集模块、立体显示模块与电控样品台；控制和数据采集模块包括计算机；
上述超快激发光源模块用于产生激发样品的激发光并进行功率调节；
上述多模式光场产生模块包括沿光路依次设置的扩束器、波前调制器件、孔径光阑及傅立叶变换透镜；上述扩束器用于调节激发光束直径，使激发光束直径与波前调制器件反射面尺寸相匹配；上述波前调制器件用于根据控制和数据采集模块的控制加载相位图，完成不同成像模式对应光场的产生和快速切换；上述孔径光阑用于阻挡从波前调制器件出射光束的零级光斑，放置在距离波前调制器件的f1处，f1为所加载的菲涅尔透镜相位图的焦距；傅立叶变换透镜与孔径光阑同轴放置且使孔径光阑处于其焦平面位置，用于将光束聚焦投射至激光扫描模块；
上述激光扫描模块用于对入射光束做正交方向的二维扫描；
上述荧光收集和探测模块包括荧光收集模块与探测模块，荧光收集模块用于收集样品发出的荧光信号，探测模块用于将荧光信号转化为电信号输出至控制和数据采集模块；
上述控制和数据采集模块，用于产生多模式光场对应的相位图并通过波前调制器件加载，用于控制激光扫描模块进行光束扫描，用于采集荧光收集和探测模块的电信号，并完成图像重构，输出至立体显示模块；
上述立体显示模块，用于根据不同的成像模式完成传统图像显示和立体图像显示；
上述电控样品台用于放置样品和位置调节。
进一步地，上述超快激发光源模块，包括沿光路依次设置的光束超快激光光源、用以保护激光光源的光学隔离器及用于调节激光功率的功率调节部件。
进一步地，上述激光扫描模块包括沿光路依次设置的二维扫描振镜对、扫描透镜与筒镜；二维扫描振镜对放置在傅立叶变换透镜的焦平面位置，用于根据控制和数据采集模块的控制对入射光束做正交方向的二维扫描；扫描透镜放置在距离扫描振镜对一倍焦距处，并和筒镜共焦放置。
进一步地，上述荧光收集模块包括双色镜与位于双色镜一路出射光路中的物镜；上述探测模块包括依次位于双色镜另一路出射光路中的透镜和光电探测器；
光束在二维扫描振镜对上的分布与在物镜入瞳面处的分布共轭；
上述物镜的入瞳面和筒镜的焦面重合，上述双色镜位于物镜和筒镜之间；上述物镜用于收集样品发出的荧光；上述双色镜用于分离激发光和荧光信号；上述透镜用于聚焦荧光信号；上述光电探测器位于透镜焦平面附近，用于荧光信号探测。
进一步地，上述立体显示模块包括兼容人眼双目观测的立体显示器，根据不同的成像模式完成传统图像显示和立体图像显示。
进一步地，上述不同成像模式包括点扫描光学层切成像模式、线扫描光学投影成像模式以及双视角立体扫描实时立体成像模式。
本发明还提供利用上述一种多模式多光子激光扫描立体显微成像装置的成像方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
步骤1、超快激发光源模块产生脉冲激光，扩束并准直；
步骤2、针对不同的成像模式，由计算机产生对应光场的相位图并加载到波前调制器件上；
在点扫描光学层切成像模式下，为波前调制器件加载菲涅尔透镜相位或同类相位图，产生点状光场；
在线扫描光学投影成像模下，为波前调制器件加载锥镜相位或同类相位图，产生线状光场；
在双视角立体扫描实时立体成像模式下，为波前调制器件叠加对应左右视角的线性相位图，先后产生左视角的线状光场与右视角的线状光场；
步骤3、在点扫描光学层切成像模式下，点状光场聚焦于孔径光阑的中心位置，通过傅立叶变换透镜，启动二维扫描振镜对扫描程序，在激光扫描振镜对上形成两个正交方向的扫描光场；
在线扫描光学投影成像模式下，线状光场聚焦于孔径光阑的中心位置，通过傅立叶变换透镜，启动二维扫描振镜对扫描程序，在激光扫描振镜对上形成两个正交方向的扫描光场；
在双视角立体扫描实时立体成像模式下，首先左视角线状光场聚焦于孔径光阑的中心位置，通过傅立叶变换透镜，启动二维扫描振镜对扫描程序，在激光扫描振镜对上形成对应左视角光束的两个正交方向的扫描光场；之后切换为右视角线状光场，右视角线状光场聚焦于孔径光阑的中心位置，通过傅立叶变换透镜，启动二维扫描振镜对扫描程序，在激光扫描振镜对上形成对应右视角光束的两个正交方向的扫描光场；
步骤4、在点扫描光学层切成像模式下，将扫描光场在荧光收集模块的焦平面位置产生点状光束；
在线扫描光学投影成像模式下，将扫描光场在荧光收集模块的焦平面位置产生线状光束；
在双视角立体扫描实时立体成像模式下，将扫描光场在荧光收集模块的焦平面位置产生两条倾斜的线状光束；
步骤5、获取图像：
在点扫描光学层切成像模式下，荧光收集模块收集所产生的荧光信号，探测模块将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的两维图像；
在线扫描光学投影成像模式下，荧光收集模块收集所产生的荧光信号，探测模块将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的两维投影图像；
在双视角立体扫描实时立体成像模式下，荧光收集模块首先收集左视角(或右视角)线状光束作为激发光时，所产生的荧光，探测模块将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的沿左视角线状光束延伸方向投影的两维投影图像；然后，收集右视角(或左视角)线状光束作为激发光对样品做垂直光轴的横向扫描时，所产生的荧光并进行光电转换，通过控制和数据采集模块得到样品的沿右视角线状光束延伸方向投影的两维投影图像；对扫描得到的两幅两维投影图像进行体视合成，并输出至立体显示器。
进一步地，步骤4具体为：在点扫描光学层切成像模式下，将扫描光场通过双色镜后透射至物镜并在物镜的焦平面位置产生点状光束；
在线扫描光学投影成像模式下，将扫描光场通过双色镜后透射至物镜并在物镜的焦平面位置产生线状光束；
在双视角立体扫描实时立体成像模式下，将扫描光场通过双色镜后透射至物镜并在物镜的焦平面位置产生两条倾斜的线状光束。
进一步地，步骤5具体为：
在点扫描光学层切成像模式下，物镜收集所产生的荧光信号，并通过双色镜反射给光电探测器将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的两维层切图像；
在线扫描光学投影成像模式下，物镜收集所产生的荧光信号，并通过双色镜反射给光电探测器将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的两维投影图像；
在双视角立体扫描实时立体成像模式下，物镜首先收集左视角线状光束作为激发光时，所产生的荧光，并通过双色镜反射给光电探测器将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的沿左视角线状光束延伸方向投影的两维投影图像；然后，收集右视角线状光束作为激发光对样品做垂直光轴的横向扫描时，所产生的荧光，并通过双色镜反射给光电探测器将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的沿右视角线状光束延伸方向投影的两维投影图像；对扫描得到的两幅两维投影图像进行体视合成，并输出至立体显示器。
本发明的有益效果是：
1、本发明基于光场调控方法，利用波前调制器件，通过在波前调制器件加载对应的相位图分别产生适用于点扫描光学层切、线扫描光学投影成像以及双视角立体扫描三种成像模式的激发光场，并通过计算机控制，与两维扫描振镜协同扫描，实现光学层切、光学投影以及双视角立体扫描实时成像三种成像功能。
2、本发明通过快速切换两个光场相位实现双视角立体扫描实时成像，此两个相位图由计算机程序产生，把入射到波前调制器件上的激光调制产生出与光轴呈0°～15°立体角的两个角向相反的线状光场，此相位图加载和切换由计算机程序自动完成，相位切换的时刻为某一视角的垂直于光轴的两维扫描完成之后，相位的切换时间由空间光调制器的调制方式和性能决定，一般在数毫秒至数十毫秒，可以满足立体成像左右视角图像需要基本同步的需求，不会产生图像错位或双视角图像延时。因此可以实现对三维样品的实时立体三维显微成像。
附图说明
图1多模式多光子激光扫描立体显微装置图；
图2多模式多光子激光扫描立体显微控制模块图；
图3三种成像模式对应的聚焦场光场分布图；
图4三种成像模式分别对应的相位图；
图5三种成像模式的光场在物镜入瞳处的分布图；
图6一种三模式双光子激光扫描立体显微成像结果示例。其中a为小鼠脑神经三维分布的点扫描光学层切成像结果，b为其两个视角的高景深光学投影成像结果；c为植物花粉样品的光学层切成像结果，d为其两个视角的高景深光学投影成像结果。b和d可通过立体显示装置作实时立体观测。
图中附图标记为：
1-激发光源模块，2-多模式光场产生模块，3-激光扫描模块，4-荧光收集和探测模块，5-控制和数据采集模块，6-立体显示模块，7-电控样品台；
11-超短脉冲激光器，12-光学隔离器，13-偏振分束器；
21-扩束器，22-波前调制器件，23-孔径光阑，24-傅立叶变换透镜；
31-二维扫描振镜对，32-扫描透镜，33-筒镜；
41-双色镜，42-显微物镜，43-样品，45-聚焦透镜，46-光电探测器；
51模拟和数字控制板卡；
61-立体显示器。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明做进一步地描述。
如图1，本实施例多模式激光扫描立体显微成像装置包括沿光路依次设置的激发光源模块1、多模式光场产生模块2、激光扫描模块3及荧光收集和探测模块4；还包括控制和数据采集模块5、立体显示模块6以及电控样品台7。控制和数据采集模块5与多模式光场产生模块2、激光扫描模块3、荧光收集和探测模块4及电控样品台7连接。
激发光源模块1包括超短脉冲激光器11、电光调制器及依次设置在超短脉冲激光器11出射光路中的光学隔离器12、偏振分束器13及根据实际光路排布所需的反射镜。多模式光场产生模块2包括沿光路依次设置的扩束器21、波前调制器件22、孔径光阑23及傅立叶变换透镜24。波前调制器件22可以为空间光调制器或其他具备波前调制功能的器件，如数字微镜器件等。激光扫描模块3包括沿光路依次设置的二维扫描振镜对31、扫描透镜32及筒镜33。荧光收集和探测模块4包括双色镜41，设置在双色镜41透射光路中的显微物镜42，依次设置在双色镜41反射光路中的聚焦透镜45和光电探测器46。控制和数据采集模块5至少包含一台计算机以及模拟和数字控制板卡51。立体显示模块6包括立体显示器61。
此实施例通过控制和数据采集模块5中的计算机统一调配硬件资源，与各个电控部件的连接和控制如图2所示。超短脉冲激光器11与电控样品台7通过USB接口或串口与计算机连接，立体显示器61通过DVI或HDMI线缆与计算机连接，波前调制器件22通过兼容的视频线或控制卡与计算机连接，二维扫描振镜对31、光电探测器46与模拟和数字控制板卡51经由PCI接口及扩展组件机箱与计算机连接，完成信号同步、硬件控制和数据存储。
激发光源模块1中的光学隔离器12用以保护激光光源，偏振分束器13用以手动衰减光强，电光调制器用以可编程控制调节光强。其中，激发光波长和强度根据所使用的荧光样品43而定。
本实施例，多模式光场产生模块2中的扩束器21采用了开普勒式扩束器，也可以替换为伽利略式扩束器，实现同样的功能。调节扩束器21的位置，使之入射到波前调制器件22上激光光束准直，其扩束后直径与波前调制器件22的反射面尺寸相匹配。扩束后光束的光轴一般与波前调制器件22法相呈小角度夹角，一般在0～10°，经波前调制器件22调制后利用孔径光阑23阻挡零级光斑，再经傅立叶变换透镜24聚焦后投射至二维扫描振镜对31上。多模式光场产生于孔径光阑23处，与显微物镜42的前焦平面共轭，也即与样品43的成像面共轭。不同的成像模式通过计算机软件实现切换，并预先生成对应的相位图。相位的切换时间由空间光调制器的调制方式和性能决定，一般在数毫秒至数十毫秒，可以满足立体成像左右视角图像需要基本同步的需求。以最终聚焦在样品43处的光束为参照，光束角向切换使得光束在样品43处作与光轴呈0～20°的小角度倾斜。
激光扫描模块3中的二维扫描振镜对31具有横向两维扫描光束的作用，一般由电流计振镜作为慢轴，共振振镜或电流计振镜作为快轴，把聚焦后的光束扫描。以最终聚焦在样品43处的光束为参照，二维扫描振镜对31对光束的扫描使得其在样品43处作垂直于光轴的二维横向平移。光束经二维扫描振镜对31后通过扫描透镜32和筒镜33最终传播至显微物镜42的入瞳面。扫描透镜32需放置在距离二维扫描振镜对31反射面为其一倍焦距处，筒镜33与扫描透镜32距离应为其二者焦距之和。光束在二维扫描振镜对31上的分布应与在显微物镜42入瞳面处的分布共轭。二维扫描振镜对31也可以采用独立扫描方式，在快轴和慢轴振镜中间插入一对中继透镜，使两个振镜面和中继透镜呈4f距离关系。
荧光收集和探测模块4由双色镜41、显微物镜42、聚焦透镜45和光电探测器46组成。扫描的激发光束经显微物镜42投射至位于电控样品台7的样品43，在显微物镜42的前焦平面附近激发出的荧光信号被同一显微物镜42收集，并经双色镜41反射后被聚焦透镜45聚焦到光电探测器46上，光电探测器46可使用光电倍增管或单光子探测器件等。光电探测器46的受光面应处于聚焦透镜45的焦平面附近，已达到最大的荧光探测效率。本实施例荧光收集和探测模块4只标出了单个荧光通道的探测方法，多通道探测可通过在双色镜41的反射光路中继续放入所需要探测波长的双色镜，以及相应的聚焦透镜和光电探测器即可。
控制和数据采集模块5用以加载波前调制器件22上的相位图，控制二维扫描振镜对31的工作状态，采集光电探测器返回的模拟信号，以及图像的重构等工作。三种成像模式由用户通过计算机软件界面切换，在波前调制器件22上加载相应的光学相位图，并对采集所得的信号做分别作对应的处理。
经控制和数据采集模块5得到的图像，通过立体显示模块6实时显示。此模块包含一套通过快门方式进行左右视角快速切换的立体显示器61，以及兼容的红外发射器和立体观测眼镜。当系统工作于双视角立体扫描实时显微成像模式时，通过软件开启立体显示模式；当系统工作于点扫描光学层切和光学投影成像模式时，通过软件关闭立体显示模式，仅显示单层的光学层切图或对应线聚焦扫描形成的光学投影图。
具体的，根据本发明内容，三种成像模式在实施例中按以下方式工作。
在点扫描光学层切成像模式下，超快激发光源模块产生脉冲激光，扩束并准直；由计算机产生菲涅尔透镜相位图(图4中a)，并加载在波前调制器件2，产生点状光场；点状光束聚焦于孔径光阑23的中心位置，与傅立叶变换透镜24共焦。图3中a为点聚焦光场，给出了其基本分布形态。在二维扫描振镜对31上形成准直的高斯光束，此时波前调制器件22和傅立叶变换透镜24形成光束缩束。再经扫描透镜32和筒镜33传播至共轭面，即显微物镜42的入瞳，其分同样是高斯状分布，其光斑分布需基本充满或大于物镜入瞳，以达到最优分辨率，如图5中a所示。通过控制和数据采集模块5启动扫描程序，在激光扫描振镜对上形成两个正交方向的扫描光场，扫描光场在物镜的焦平面位置产生点状光束，物镜收集所产生的荧光信号，并通过双色镜反射给光电探测器将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的两维图像，实时显示在立体显示模块6上。
在线扫描光学投影成像模式下，超快激发光源模块产生脉冲激光，扩束并准直；由控制和数据采集模块5产生对应线状光场的相位图(图4中b)，并加载在波前调制器件22，产生线状光场，如锥镜相位或用优化算法产生的相位；线状光束聚焦于孔径光阑23的中心位置，大致呈准贝塞尔光束分布，孔径光阑23的直径需大于此光束分布的直径。图3中b线聚焦光场给出了其基本分布形态。在二维扫描振镜对31上形成环状结构分布光场，再经扫描透镜32和筒镜33传播至共轭面，即显微物镜42的入瞳，其分同样是环状结构，其光斑分布需和显微物镜42入瞳同轴且直径要小于显微物镜42入瞳直径，如图5中b所示。通过控制和数据采集模块5启动扫描程序，所获得的数据经处理后重构为二维投影图像，实时显示在立体显示模块6上。
在双视角立体扫描成像模式下，超快激发光源模块产生脉冲激光，扩束并准直；由控制和数据采集模块产生对应线状光场的相位图，并叠加符号相反的两个小角度线性相位，产生对应左右视角的两个相位图(图4中c)。光束通过波前调制器件22后聚焦于孔径光阑23的中心位置，大致呈准贝塞尔光束分布，孔径光阑23的直径需大于光束的直径。图3中c线聚焦光场给出了对应两个视角的线状光场的基本分布形态，需要注意的是在成像过程中某一时刻只存在一个视角的光束照明样品。对应左右视角的光束在二维扫描振镜对31上形成有横向偏移的环状结构分布光场，再经扫描透镜32和筒镜33传播至共轭面，即显微物镜42的入瞳，其分同样是横向存在偏移的环状结构，其光斑分布需和物镜入瞳同轴且直径要小于物镜入瞳直径，如图5中c所示。
成像过程开始时，首先启动立体显示器61进入立体显示模式，再通过控制和数据采集模块5在波前调制器件22上加载左视角对应的相位图，再启动振镜扫描程序，所获得的数据经处理后重构为对应左视角的二维投影图像；通过计算机程序切换加载对应右视角对应的相位图，并把采集获取的数据经处理后重构为对应右视角的二维投影图像；把左右两幅投影图像实时显示在立体显示模块6上，观测者佩戴兼容的立体观测眼镜进行观测。
对所述三种成像模式，采集重构得到的图像除可进行实时观测外，也可利用控制和数据采集模块5中的计算机程序完成数据存储，供用户进一步分析测量。
本发明通过快速切换两个光场相位实现双视角立体扫描实时成像，此两个相位图由计算机程序产生，最终在样品处产生出与光轴呈0°～15°立体角的两个角向相反的线状光场，相位切换的时刻为某一视角的垂直于光轴的两维扫描成像完成后。两维扫描通过呈正交方向振动的扫描振镜组成，相位的切换和两维振镜的扫描需通过计算机软件按照一定的时序自动完成，才可实现实时立体成像，不会产生图像错位或双视角图像延时。利用所述双视角立体扫描方法获取的数据，经过软件处理分离为对应左右两个视角的图像，并实时输出至立体显示装置，观测者佩戴兼容的立体观测部件完成对三维样品的实时立体显微观测。
本发明通过在波前调制器件加载对应的相位图产生三种成像模式对应的三种光场，且经波前调制器件(如空间光调制器)形成的三种模式的光场需处于其菲涅尔衍射区，而不是通常的频谱调制模式，即傅立叶变换面位置。三种光场必须处于对应样品观测面的共轭面处，其相位分别为可以产生点聚焦的等效相位，例如菲涅尔透镜相位φ1＝-k/2f·r2，其中k＝2π/λ为波数，f为焦距，r为空间光调制器的径向空间坐标；可以产生线状光场的等效相位，如锥镜相位φ2＝-k·c·r，其中c为描述锥面波偏离角的系数；可以产生倾斜线状光场的相位，如锥镜相位叠加对应立体角的线性相位φ3＝φ2±d·x，其中x为空间光调制器横向坐标，对应产生角向切换的方向，d为描述体视角的系数，决定了线状光场的倾斜程度。三种相位通过计算机软件实时加载和切换，完成三种成像模式的切换。除双视角立体扫描成像模式外，其他两种成像模式所获取的图像数据不再分左右两个视角处理，显示设备从立体显示模式实时切换至普通显示模式，此过程由计算机程序自动完成。
根据实施例，三种成像模式在物镜的入瞳处呈现对应的光场分布特征：对应光层切模式的光场呈高斯模式分布，基本充满物镜入瞳；对应光学投影成像模式，光场呈与光轴同心的环状光场分布，其环带分布根据所产生线状光场的长度而呈现更复杂的变化，如多环带结构或环带宽度的增加或减小；对应立体扫描实时显微成像模式，光场随时间变化呈对称偏离光轴的两个环状光场的交替照明，分别对应左右两个视角的激发光场。
图6是利用本实施例对两种生物样品成像得到的结果。其中，a、b为小鼠神经样品的成像结果，c、d为植物花粉样品的成像结果。a、c对应使用系统的光学层切模式成像，可以看出其具有较短的景深，离焦荧光信号衰减剧烈；b、d使用双视角立体扫描实时成像模式获取，其左右两部分分别对应左右视角的图像，可以看出其景深较大，不同深度的样品都可以清晰成像，是三维分布的样品沿两个视角方向的投影图像，经实验测量对应景深约为80μm。

Claims (8)

1.一种多模式多光子激光扫描立体显微成像装置，其特征在于：包括沿光路依次设置的超快激发光源模块(1)、多模式光场产生模块(2)、激光扫描模块(3)与荧光收集和探测模块(4)；还包括控制和数据采集模块(5)、立体显示模块(6)与电控样品台(7)；控制和数据采集模块(5)包括计算机；
所述超快激发光源模块(1)用于产生激发样品的激发光并进行功率调节；
所述多模式光场产生模块(2)包括沿光路依次设置的扩束器(21)、波前调制器件(22)、孔径光阑(23)及傅立叶变换透镜(24)；所述扩束器(21)用于调节激发光束直径，使激发光束直径与波前调制器件(22)反射面尺寸相匹配；所述波前调制器件(22)用于根据控制和数据采集模块(5)的控制加载相位图，完成不同成像模式对应光场的产生和快速切换；所述不同成像模式包括点扫描光学层切成像模式、线扫描光学投影成像模式以及双视角立体扫描实时立体成像模式；
所述孔径光阑(23)用于阻挡从波前调制器件(22)出射光束的零级光斑，放置在距离波前调制器件(22)的f1处，f1为所加载的菲涅尔透镜相位图的焦距；傅立叶变换透镜(24)与孔径光阑(23)同轴放置且使孔径光阑(23)处于其焦平面位置，用于将光束聚焦投射至激光扫描模块(3)；
所述激光扫描模块(3)用于对入射光束做正交方向的二维扫描；
所述荧光收集和探测模块(4)包括荧光收集模块与探测模块，荧光收集模块用于收集样品(43)发出的荧光信号，探测模块用于将荧光信号转化为电信号输出至控制和数据采集模块(5)；
所述控制和数据采集模块(5)，用于产生多模式光场对应的相位图并通过波前调制器件(22)加载，用于控制激光扫描模块(3)进行光束扫描，用于采集荧光收集和探测模块(4)的电信号，并完成图像重构，输出至立体显示模块(6)；
所述立体显示模块(6)，用于根据不同的成像模式完成传统图像显示和立体图像显示；
所述电控样品台(7)用于放置样品和位置调节。
2.根据权利要求1所述的多模式多光子激光扫描立体显微成像装置，其特征在于：所述超快激发光源模块(1)，包括沿光路依次设置的光束超快激光光源、用以保护激光光源的光学隔离器及用于调节激光功率的功率调节部件。
3.根据权利要求2所述的多模式多光子激光扫描立体显微成像装置，其特征在于：所述激光扫描模块(3)包括沿光路依次设置的二维扫描振镜对(31)、扫描透镜(32)与筒镜(33)；二维扫描振镜对(31)放置在傅立叶变换透镜(24)的焦平面位置，用于根据控制和数据采集模块(5)的控制对入射光束做正交方向的二维扫描；扫描透镜(32)放置在距离二维扫描振镜对(31)一倍焦距处，并和筒镜(33)共焦放置。
4.根据权利要求3所述的多模式多光子激光扫描立体显微成像装置，其特征在于：
所述荧光收集模块包括双色镜(41)与位于双色镜(41)一路出射光路中的显微物镜(42)；所述探测模块包括依次位于双色镜(41)另一路出射光路中的聚焦透镜(45)和光电探测器(46)；
光束在二维扫描振镜对(31)上的分布与在显微物镜(42)入瞳面处的分布共轭；
所述显微物镜(42)的入瞳面和筒镜(33)的焦面重合，所述双色镜(41)位于显微物镜(42)和筒镜(33)之间；所述显微物镜(42)用于收集样品(43)发出的荧光；所述双色镜(41)用于分离激发光和荧光信号；所述聚焦透镜(45)用于聚焦荧光信号；所述光电探测器(46)位于聚焦透镜(45)焦平面附近，用于荧光信号探测。
5.根据权利要求4所述的多模式多光子激光扫描立体显微成像装置，其特征在于：所述立体显示模块(6)包括兼容人眼双目观测的立体显示器(61)，根据不同的成像模式完成传统图像显示和立体图像显示。
6.利用权利要求1-5任一所述的一种多模式多光子激光扫描立体显微成像装置的成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、超快激发光源模块产生脉冲激光，扩束并准直；
步骤2、针对不同的成像模式，由计算机产生对应光场的相位图并加载到波前调制器件上；
在点扫描光学层切成像模式下，为波前调制器件加载菲涅尔透镜相位图或同类相位图，产生点状光场；
在线扫描光学投影成像模下，为波前调制器件加载相应相位图或同类相位图，产生线状光场；
在双视角立体扫描实时立体成像模式下，为波前调制器件加载左右视角的相位图，先后产生左视角的线状光场与右视角的线状光场；
步骤3、在点扫描光学层切成像模式下，点状光场聚焦于孔径光阑的中心位置，通过傅立叶变换透镜，启动扫描程序，在激光扫描振镜对上形成两个正交方向的扫描光场；
在线扫描光学投影成像模式下，线状光场聚焦于孔径光阑的中心位置，通过傅立叶变换透镜，启动扫描程序，在激光扫描振镜对上形成两个正交方向的扫描光场；
在双视角立体扫描实时立体成像模式下，首先左视角线状光场聚焦于孔径光阑的中心位置，通过傅立叶变换透镜，启动扫描程序，在激光扫描振镜对上形成对应左视角光束的两个正交方向的扫描光场；之后切换为右视角线状光场，右视角线状光场聚焦于孔径光阑的中心位置，通过傅立叶变换透镜，启动扫描程序，在激光扫描振镜对上形成对应右视角光束的两个正交方向的扫描光场；
步骤4、在点扫描光学层切成像模式下，将扫描光场在荧光收集模块的焦平面位置产生点状光束；
在线扫描光学投影成像模式下，将扫描光场在荧光收集模块的焦平面位置产生线状光束；
在双视角立体扫描实时立体成像模式下，将扫描光场在荧光收集模块的焦平面位置产生两条倾斜的线状光束；
步骤5、获取图像：
在点扫描光学层切成像模式下，荧光收集模块收集所产生的荧光信号，探测模块将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的两维图像；
在线扫描光学投影成像模式下，荧光收集模块收集所产生的荧光信号，探测模块将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的两维投影图像；
在双视角立体扫描实时立体成像模式下，荧光收集模块首先收集左视角线状光束作为激发光时，所产生的荧光，探测模块将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的沿左视角线状光束延伸方向投影的两维投影图像；然后，收集右视角线状光束作为激发光对样品做垂直光轴的横向扫描时，所产生的荧光并进行光电转换，通过控制和数据采集模块得到样品的沿右视角线状光束延伸方向投影的两维投影图像；对扫描得到的两幅两维投影图像进行体视合成，并输出至立体显示器。
7.根据权利要求6所述的成像方法，其特征在于，步骤4具体为：在点扫描光学层切成像模式下，将扫描光场通过双色镜后透射至物镜并在物镜的焦平面位置产生点状光束；
在线扫描光学投影成像模式下，将扫描光场通过双色镜后透射至物镜并在物镜的焦平面位置产生线状光束；
在双视角立体扫描实时立体成像模式下，将扫描光场通过双色镜后透射至物镜并在物镜的焦平面位置产生两条倾斜的线状光束。
8.根据权利要求7所述的成像方法，其特征在于：步骤5具体为：
在点扫描光学层切成像模式下，物镜收集所产生的荧光信号，并通过双色镜反射给光电探测器将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的两维层切图像；
在线扫描光学投影成像模式下，物镜收集所产生的荧光信号，并通过双色镜反射给光电探测器将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的两维投影图像；
在双视角立体扫描实时立体成像模式下，物镜首先收集左视角线状光束作为激发光时，所产生的荧光，并通过双色镜反射给光电探测器将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的沿左视角线状光束延伸方向投影的两维投影图像；然后，收集右视角线状光束作为激发光对样品做垂直光轴的横向扫描时，所产生的荧光，并通过双色镜反射给光电探测器将荧光信号转换为电信号并发送至控制和数据采集模块，通过控制和数据采集模块得到样品的沿右视角线状光束延伸方向投影的两维投影图像；对扫描得到的两幅两维投影图像进行体视合成，并输出至立体显示器。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114034678A (zh) * 2021-11-26 2022-02-11 杭州涿溪脑与智能研究所 相位图案生成方法、三光子荧光成像装置及方法
CN114153061B (zh) * 2021-12-01 2023-08-08 天津大学 一种基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法
CN116990950B (zh) * 2023-07-07 2024-03-26 中国科学院西安光学精密机械研究所 基于光场调控的快速三维光片荧光显微成像装置及方法
CN117369106B (zh) * 2023-12-05 2024-03-08 北京大学 一种多点共聚焦图像扫描显微镜及成像方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104568872A (zh) * 2014-12-17 2015-04-29 深圳先进技术研究院 具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102540446B (zh) * 2011-12-28 2014-03-26 中国科学院西安光学精密机械研究所 一种基于数字微镜器件的高速结构照明光学显微系统及方法
US9201008B2 (en) * 2012-06-26 2015-12-01 Universite Laval Method and system for obtaining an extended-depth-of-field volumetric image using laser scanning imaging
CN102944540B (zh) * 2012-10-11 2016-03-02 中国科学院西安光学精密机械研究所 一种深层散射介质中的三维成像系统及方法
CN102981277B (zh) * 2012-12-12 2015-11-25 苏州大学 产生径向贝塞尔-高斯光束的系统和方法
TW201546486A (zh) * 2014-06-11 2015-12-16 Univ Nat Cheng Kung 利用數位微型反射鏡元件之多光子螢光激發顯微裝置
CN105182523B (zh) * 2015-09-23 2017-11-07 北京大学 一种基于一阶贝塞尔光束的sted超分辨显微镜及调节方法
WO2017139885A1 (en) * 2016-02-16 2017-08-24 UNIVERSITé LAVAL Method and system for improving lateral resolution in optical scanning microscopy
CN106290284B (zh) * 2016-09-19 2023-03-10 浙江大学 结构光照明的双光子荧光显微系统与方法
CN106547079B (zh) * 2017-01-17 2018-11-20 中国科学院上海光学精密机械研究所 实时三维激光荧光显微成像装置
CN106970055B (zh) * 2017-04-28 2019-08-27 浙江大学 一种三维荧光差分超分辨显微方法及装置
CN109031635A (zh) * 2018-09-07 2018-12-18 苏州国科医疗科技发展有限公司 一种双光子受激发射损耗复合显微镜
CN109407293A (zh) * 2018-10-31 2019-03-01 浙江大学 基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置和方法
CN110146473B (zh) * 2019-04-16 2020-10-13 浙江大学 一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置及方法
CN110007453B (zh) * 2019-05-13 2023-11-21 中国科学院生物物理研究所 一种多照明模式的荧光信号测量装置及其测量方法和应用
CN110941100A (zh) * 2019-11-29 2020-03-31 哈尔滨工业大学 一种结合多光子激发的多模式阵列型扫描成像装置
CN110954522B (zh) * 2019-12-18 2022-07-08 深圳大学 一种多焦点超分辨光学显微成像方法及装置
CN111273433A (zh) * 2020-02-25 2020-06-12 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种高速大视场数字扫描光片显微成像系统

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104568872A (zh) * 2014-12-17 2015-04-29 深圳先进技术研究院 具有光学层析能力的荧光显微光谱成像系统

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