JP4677728B2 - 共焦点顕微鏡及び共焦点顕微鏡システム - Google Patents

Description

本発明は、共焦点顕微鏡及び共焦点顕微鏡システムに関する。

共焦点顕微鏡（特許文献１など）は、生体標本などの試料上に照明光を集光すると共にその試料上の集光部から射出する光束を共焦点絞り面に集光し、その共焦点絞りを通過した光束の光量を光検出器で検出するものである。また、その試料の二次元の画像を得るため、試料上を集光部（スポット）で走査しながらその検出を行う。
共焦点絞り面には、ピンホール部材が配置される。ピンホール部材はピンホール（開口）内に集光する光線のみを透過し、それ以外の光線をカットするので、試料上の特定の高さから射出した光線のみが光検出器に入射し、それ以外の高さから射出した光線は光検出器に入射しない。

このため、共焦点顕微鏡によれば、観察対象を試料上の特定の高さに位置する薄い層の像のみに限定（セクショニング）することができる。
そのセクショニング分解能（観察対象となる層の薄さ）を変更するためには、ピンホール部材の開口径を変更すればよい。開口径を大きくするとセクショニング分解能が低くなり、開口径を小さくするとセクショニング分解能が高くなる。

この変更をユーザが試料の種類などに応じて自在にすることができるよう、従来の共焦点顕微鏡は、ピンホール部材のピンホール径（開口径）を制御する機構（特許文献１の図１など）や、ピンホール径の互いに異なる複数のピンホール部材を選択的に光路に挿脱する機構などを備えている（特許文献１の図８など）。
実開平６−１６９２７号公報

しかしながら、ピンホール径を制御する機構（特許文献１の図１など）は、共焦点顕微鏡を複雑化（大型化・高コスト化）する問題があり、また、ピンホール部材を挿脱する機構（特許文献１の図６など）は、ピンホールと光路との位置合わせを煩雑化するなどの問題がある。よって、従来の共焦点顕微鏡は、少なくともその構成と性能との一方に問題を抱えていた。

そこで本発明は、シンプルな構成でありながらも高精度にセクショニング分解能を変更することの可能な共焦点顕微鏡及び共焦点顕微鏡システムを提供することを目的とする。

本発明の共焦点顕微鏡は、光源と、前記光源からの光を試料に集光する照明光学系と、前記試料からの光を結像する結像光学系と、前記結像光学系に関し前記試料の集光点と略共役な位置に入射する光を、少なくとも前記試料の前記集光点の近傍領域からの光と、その周辺領域からの光とに分離し、それぞれ検出する検出手段とを備え、前記検出手段は、前記結像光学系の焦点深度内に光軸に対して傾斜して配置された光学部材と、前記光学部材において前記集光点と略共役な位置に設けられ、かつその位置に入射する光を前記近傍領域からの光と前記周辺領域からの光とに分離する光分離面と、前記近傍領域からの光と前記周辺領域からの光とを独立して検出する検出器とを有し、前記光分離面は、前記近傍領域からの光を受ける円形の第１面と、前記周辺領域からの光を受ける第２面とを有し、前記光学部材は、前記周辺領域からの光の光路に対し直列の関係で複数の前記光分離面を配置しており、前記複数の光分離面の間では、後段に配置されたものほど前記第１面の径が大きく設定され、前記複数の光分離面の間では、前記第１面のタイプは透過面及び反射面の一方に統一され、かつ前記第２面のタイプは透過面及び反射面の他方に統一されている。

また、前記検出手段は、複数の前記検出器を備えてもよい。
前記検出手段は、前記近傍領域からの光を検出する第１の前記検出器と、前記周辺領域からの光を検出する第２の前記検出器とを有してもよい。
また、前記検出手段は、前記分離された前記近傍領域からの光と前記周辺領域からの光との双方を受光する単一の検出器と、前記近傍領域からの光の光路と、前記周辺領域からの光の光路との一方を開閉するシャッターとを有し、前記光学部材は、前記近傍領域からの光及び前記周辺領域からの光を前記単一の検出器へ導いてもよい。
また、前記検出手段は、前記近傍領域からの光と前記周辺領域からの光との光量和、又は、前記近傍領域からの光の光量を検出してもよい。
また、本発明の共焦点顕微鏡システムは、本発明の共焦点顕微鏡と、前記複数の検出器が生成する複数の検出信号のうち少なくとも２つを選択し、加算する選択加算手段とを備えることを特徴とする。
また、本発明の共焦点顕微鏡システムは、本発明の共焦点顕微鏡と、前記複数の検出器が生成する複数の検出信号を個別に記憶する記憶手段と、前記記憶手段が記憶した複数の検出信号を用いて演算する演算処理手段とを備えることを特徴とする。

以上、本発明の共焦点顕微鏡又は共焦点顕微鏡システムでは、試料上の比較的薄い層を示す光束と、その上下の層を示す光束とが分離される。よって、これらの光束を選択的に検出可能な検出手段の動作や、各検出器で検出した各光束の信号の演算により、セクショニング分解能が変化する。
その結果、この共焦点顕微鏡又は共焦点顕微鏡システムは、シンプルな構成でありながらも高精度にセクショニング分解能を変更することが可能となる。

以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。
［第１実施形態］
図１、図２、図３、図４、図５を参照して本発明の第１実施形態について説明する。
本実施形態は、蛍光共焦点顕微鏡装置の実施形態である。
本実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置には、図１に示すように、光源１１、照明用レンズ１２、フィルタ１３、ダイクロイックミラー１４、ガルバノミラー１５、対物レンズ１６、フィルタ１７、集光レンズ１８、光分離部材であるマスク部材１９、可動シャッタ２０、光検出器２１、コンピュータ２２、モニタ２３、入力器２４などが備えられる。この蛍光共焦点顕微鏡装置には、蛍光観察用に予め処理された試料１０が配置される。

なお、このうち、マスク部材１９、可動シャッタ２０、光検出器２１からなる光学系が光検出部１である。また、照明用レンズ１２と対物レンズ１６とが請求項ににおいて照明光束を集光する光学系に対応し、対物レンズ１６と集光レンズ１８とが請求項における集光光学系に対応する。
光源１１から射出した光は、照明用レンズ１２、フィルタ１３、ダイクロイックミラー１４、ガルバノミラー１５、及び対物レンズ１６を介して試料１０上に集光し、試料１０上にスポットを形成する。試料１０上のスポットの形成領域からは、光（蛍光）が射出する。

その試料１０から射出した光束は、対物レンズ１６に戻り、対物レンズ１６、ガルバノミラー１５を介してダイクロイックミラー１４に入射する。
ダイクロイックミラー１４に入射した光束は、ダイクロイックミラー１４を透過し、マスク１３及び照明用レンズ１２が配置されている方向とは異なる方向へ射出し、フィルタ１７、集光レンズ１８を介してマスク部材１９に入射する。

マスク部材１９は、図２に示すように、試料１０上のスポットの形成領域と光学的に略共役な位置にピンホール１９ａ’，１９ｂ’，１９ｃ’（請求項２における透過面に対応。）などを配置している（詳細は後述）。
マスク部材１９に入射した光束は、それらピンホール１９ａ’，１９ｂ’，１９ｃ’の近傍に集光し、それらピンホール１９ａ’，１９ｂ’，１９ｃ’からマスク部材１９の外部へ射出する。

ピンホール１９ａ’，１９ｂ’，１９ｃ’から射出した光束は、可動シャッタ２０を介して光検出器２１に入射する。
光検出器２１は、入射した光束の光量に応じた信号を出力する。この信号は、コンピュータ２２に取り込まれる。
ここで、ガルバノミラー１５は、不図示のモータにより駆動される。この駆動により、試料１０上をスポットが二次元的に走査する。コンピュータ２２は、この走査中に光検出器２１が出力した信号を取り込む。

この信号に基づいて、コンピュータ２２は試料１０の二次元の画像の画像データを構築し、その画像をモニタ２３に表示する。
以上の構成の本実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置においては、光検出部１に特徴がある。以下、この光検出部１の各要素を詳細に説明する。
図２に示すように、マスク部材１９には、集光レンズ１８の焦点深度内の略中央の面に対し傾斜した姿勢で光分離面である反射透過面１９ａが設けられている。

反射透過面１９ａは、集光レンズ１８の光軸を中心とした微小円形の透過面（ピンホール）１９ａ’と、そのピンホール１９ａ’の周辺領域をカバーする反射面１９ａ”とからなる。ピンホール１９ａ’の径ｒａは、試料１０上に形成されたスポット（集光部）の径に相当する。
このマスク部材１９では、集光レンズ１８から入射した光束のうち、ピンホール１９ａ’の形成位置に入射するもの（中央光束）のみがピンホール１９ａ’からマスク部材１９の外部へ射出し、それ以外（周辺光束）は反射面１９ａ”にて集光レンズ１８の方向からずれた方向に反射する。

マスク部材１９には、さらに、その反射面１９ａ”で反射した光束を反射する反射面１９Ａが、透過反射面１９ａと平行な姿勢で設けられている。
マスク部材１９には、さらに、その反射面１９Ａで反射した光束に対し反射透過面１９ａと同じ姿勢で反射透過面１９ｂが設けられている。
反射透過面１９ｂは、その光束の中心近傍に配置されたピンホール１９ｂ’と、そのピンホール１９ｂ’の周辺領域をカバーする反射面１９ｂ”とからなる。ピンホール１９ｂ’の径ｒｂは、ピンホール１９ａ’の径ｒａよりも大きく、例えば、ｒｂ＝２ｒａである。

このマスク部材１９では、反射面１９Ａで反射した光束のうち、ピンホール１９ｂ’の形成位置に入射するもの（中央光束）のみがピンホール１９ｂ’からマスク部材１９の外部へ射出し、それ以外（周辺光束）は反射面１９ｂ”にて反射面１９Ａからずれた方向に反射する。
マスク部材１９には、さらに、その反射面１９ｂ”で反射した光束を反射する反射面１９Ｂが、反射面１９Ａと同じ姿勢で設けられている。

この反射面１９Ｂと上述した反射面１９Ａとは、反射透過面１９ａ，１９ｂによって分離された中央光束と周辺光束とを後述する光検出器２１の検出面に導光する役割を果たす。
マスク部材１９には、さらに、その反射面１９Ｂで反射した光束に対し反射透過面１９ｂと同じ姿勢で反射透過面１９ｃが設けられている。

反射透過面１９ｃは、その光束の中心近傍に配置されたピンホール１９ｃ’と、そのピンホール１９ｃ’の周辺領域をカバーする反射面１９ｃ”とからなる。ピンホール１９ｃ’の径ｒｃは、ピンホール１９ｂ’の径ｒｂよりも大きく、例えば、ｒｃ＝２ｒｂである。
このマスク部材１９では、反射面１９Ｂで反射した光束のうち、ピンホール１９ｃ’の形成位置に入射するもの（中央光束）のみがピンホール１９ｃ’からマスク部材１９の外部へ射出する。

なお、反射透過面１９ａと反射面１９Ａとの間隔、及び反射面１９Ａと反射透過面１９ｂとの間隔、及び反射透過面１９ｂと反射面１９Ｂとの間隔、及び反射面１９Ｂと反射透過面１９ｃとの間隔は、反射透過面１９ｂと反射透過面１９ｃとが集光レンズ１８の焦点深度内に位置するよう、十分に短く設定される。
以上の構成のマスク部材１９は、例えば次のようにして形成できる。

少なくとも、試料１０からの射出光（蛍光）に対し透明な透明基板（光学ガラス基板など）を用意し、その透明基板の一方の面にその光を反射する性質の光学膜（クロム膜など）を、反射面１９ａ”，１９ｂ”，１９ｃ”となるべき領域に成膜し、同様の性質の光学膜を、他方の面の反射面１９Ａ，１９Ｂとなるべき領域に成膜する。
なお、反射面１９ａ”，１９ｂ”，１９ｃ”の一部又は全部は連続していてもよい。また、反射面１９Ａ，１９Ｂは連続していてもよい。また、この透明基板において光束が最初に入射する部分には、その入射角度を０に近づけて余分な反射光の発生を防ぐために、図２に示すような楔状の透明部材１９’を貼付するとよい。透明部材１９’の材料は、透明基板と同じ材料、又は透明基板と略同じ屈折率の材料であることが好ましい。また、透明基板の各箇所には、適宜、迷光の発生を防止するための反射防止膜などの公知の膜が成膜されることが好ましい。

次に、光検出器２１の検出面は、以上のマスク部材１９のピンホール１９ａ’からの射出光束の光路と、ピンホール１９ｂ’からの射出光束の光路と、ピンホール１９ｃ’からの射出光束の光路との全部をカバーできるだけのサイズを有している。
可動シャッタ２０は、図２に点線で示すようにステップ状に駆動され、その駆動量に応じて少なくとも次の３つの状態Ｓａ，Ｓｂ，Ｓｃに設定可能である。

第１の状態Ｓａは、ピンホール１９ａ’からの射出光束の光路を開放し、かつピンホール１９ｂ’，１９ｃ’からの射出光束の光路を遮断する状態である。
第２の状態Ｓｂは、ピンホール１９ａ’，１９ｂ’からの射出光束の光路を開放し、かつピンホール１９ｃ’からの射出光束の光路を遮断する状態である。
第３の状態Ｓｃは、ピンホール１９ａ’，１９ｂ’，１９ｃ’からの射出光束の光路を全て開放する状態である。

このような可動シャッタ２０の遮光部には、様々なものが適用できる。可動シャッタ２０の駆動機構に回転機構を採用した場合、例えば、図３（ａ）,（ｂ）,（ｃ）の何れかのように、径方向の長さが段階的に変化した羽状の部材を適用できる。
また、可動シャッタ２０の駆動には、手動、電動の何れをも適用できる。因みに、電動化する場合、可動シャッタ２０の駆動機構にモータ（ステッピングモータ）が取り付けられる。そのモータは、ユーザインタフェースに対し電気的に接続される。因みに、そのユーザインタフェースとして図１の入力器２４を利用する場合、そのモータをコンピュータ２２に対し電気的に接続すればよい。

次に、本実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置の効果について図４を用いて説明する。なお、図４は、マスク部材１９の各反射透過面１９ａ，１９ｂ，１９ｃと、試料１０の各層１０ａ，１０ｂ，１０ｃとの関係を示す模式図である。図４において、図１，図２に示すものと同じ要素については、同一符号で示した。
試料１０において対物レンズ１６の焦点面付近の薄い層１０ａから射出した光束のみがそのピンホール１９ａ’を通過できる。

また、薄い層１０ａを挟む上下２層（図４の厚い層１０ｂから薄い層１０ａを差し引いたもの）から射出した光束のみが、反射透過面１９ｂのピンホール１９ｂ’を通過できる。
また、厚い層１０ｂを挟む上下２層（図４の極めて厚い層１０ｃから厚い層１０ｂを差し引いたもの）から射出した光束のみが、反射透過面１９ｃのピンホール１９ｃ’を通過できる。

よって、可動シャッタ２０が図２の第１の状態Ｓａにあるとき（ピンホール１９ａ’からの射出光束の光路のみが開放されているとき）には、薄い層１０ａが観察対象となり、その薄い層１０ａの画像がモニタ２３上に図４の（ａ）のように表示される。
また、可動シャッタ２０が図２の第２の状態Ｓｂにあるとき（ピンホール１９ａ’，１９ｂ’からの射出光束の光路のみが開放されているとき）には、厚い層１０ｂが観察対象となり、その厚い層１０ｂの画像がモニタ２３上に図４の（ｂ）のように表示される。

また、可動シャッタ２０が図２の第３の状態Ｓｃにあるとき（ピンホール１９ａ’,１９ｂ’,１９ｃからの射出光束の光路が全て開放されているとき）には、極めて厚い層１０ｃが観察対象となり、その極めて厚い層１０ｃの画像がモニタ２３上に図４の（ｃ）のように表示される。
したがって、本実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置によれば、ユーザが可動シャッタ２０を駆動するだけで、セクショニング分解能を（ａ），（ｂ），（ｃ）のとおり変更することができる。

ここで、この蛍光共焦点顕微鏡装置では、マスク部材１９が、薄い層１０ａを示す光束、厚い層１０ｂを示す光束、極めて厚い層１０ｃを示す光束の全てを生成する。
そして、セクショニング分解能を変更する際の唯一の駆動部分である可動シャッタ２０は、光束の光路を開放／遮断するだけの単純な役割しか担っていない。
よって、可動シャッタ２０の位置合わせに対する要求精度は低く、その駆動機構の構成は単純化可能である。

そして、たとえ可動シャッタ２０の位置合わせ精度が低くとも、マスク部材１９の位置合わせさえ予め高精度に行われていれば、各層の画像はそれぞれ高精度に取得される。
したがって、本実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置は、シンプルな構成でありながらも高精度にセクショニング分解能を変更することができる。
（その他）
なお、本実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置では、光検出器に対し必要な光束を導光する手段としてマスク部材１９の反射面１９Ａ，１９Ｂを用いたが、その反射面の数を増加させたり、反射面の代わりに光ファイバ（導光方向が自在である。）を利用したりすれば、マスク部材１９における反射透過面１９ａ，１９ｂ，１９ｃの配置自由度を高めることができる。但し、光路中の光量ロスが許容範囲内に収まるようマスク部材１９は設計される必要がある。

また、可動シャッタ２０の挿入角度は、図２に示すように各光束に対し略垂直にする必要はなく、各光束に対し非垂直に（例えば、マスク部材１９に沿う角度に）してもよい。
また、上述した説明では、セクショニング分解能の切り換え数（マスク部材１９に形成されるピンホールの数）が「３」となっているが、必要に応じて３より大きい数、又は２に増減してもよい。その増減数に応じて、反射透過面１９ａ，１９ｂ，・・・の数を増減すればよい。

また、図１に示す光検出部１に代えて、図５に示す光検出部を適用することもできる。この検出部のマスク部材２９と、図１の光検出部１のマスク部材１９との間では、反射面及び透過面との利用の仕方が反転している。
以下、図５の光検出部について説明する。
この光検出部のマスク部材２９には、図１に示した集光レンズ１８の焦点深度内の所定面に対し傾斜した姿勢で反射透過面２９ａが設けられている
反射透過面２９ａは、集光レンズ１８の光軸近傍に配置された微小円形の反射面２９ａ’と、その反射面２９ａ’の周辺領域をカバーする透過面２９ａ”とからなる。反射面２９ａ’の径ｒａは、試料１０上に形成されたスポットの径に相当する。

このマスク部材２９では、集光レンズ１８から入射した光束のうち、反射面２９ａ’の形成位置に入射するもの（中央光束）のみが反射面２９ａ’にて反射してマスク部材２９の外部へ射出し、それ以外（周辺光束）は透過面２９ａ”を透過する。
マスク部材２９には、さらに、その透過面２９ａ”を透過した光束に対し反射透過面２９ａと同じ姿勢で反射透過面２９ｂが設けられている。

反射透過面２９ｂは、その光束の中心近傍に配置された円形の反射面２９ｂ’と、反射面２９ｂ’の周辺領域をカバーする透過面２９ｂ”とからなる。反射面２９ｂ’の径ｒｂは反射面２９ａ’の径ｒａよりも大きく、例えば、ｒｂ＝２ｒａである。
このマスク部材２９では、透過面２９ａ”を透過した光束のうち、反射面２９ｂ’の形成位置に入射するもの（中央光束）のみが反射面２９ｂ’にて反射してマスク部材２９の外部へ射出し、それ以外（周辺光束）は透過面２９ｂ”を透過する。

マスク部材２９には、さらに、その透過面２９ｂ”を透過した光束に対し反射透過面２９ｂと同じ姿勢で反射透過面２９ｃが設けられている。
反射透過面２９ｃは、その光束の中心近傍に配置された円形の反射面２９ｃ’と、反射面２９ｃ’の周辺領域をカバーする透過面２９ｃ”とからなる。反射面２９ｃ’の径ｒｃは反射面２９ｂ’の径ｒｂよりも大きく、例えば、ｒｃ＝２ｒｂである。

このマスク部材２９では、透過面２９ｂ”を透過した光束のうち、反射面２９ｃ’の形成位置に入射するもの（中央光束）のみが反射面２９ｃ’にて反射してマスク部材２９の外部へ射出する。
このマスク部材２９によれば、反射透過面２９ａ，２９ｂによって分離された中央光束と周辺光束とが同一方向に導光される。

因みに、このマスク部材２９については、透明基板の必要な箇所に光を反射する性質の光学膜を成膜することによって形成できる。図５のように透明基板の内部に光学膜を成膜するためには、例えば、透明基板を２つの部材にカットし、カットしてできた２つの部材の一方の断面に光学膜を形成し、再びそれらの部材を貼り合わせればよい。
なお、反射透過面２９ａと反射透過面２９ｂとの間隔、及び反射透過面２９ｂと反射透過面２９ｃとの間隔は、反射透過面２９ｂと反射透過面２９ｃとが集光レンズ１８の焦点深度内に位置するよう、十分に短く設定される。

光検出器２１の検出面は、以上のマスク部材２９の反射面２９ａ’からの射出光束の光路と、反射面２９ｂ’からの射出光束の光路と、反射面２９ｃ’からの射出光束の光路との全部をカバーできるだけのサイズを有している。
可動シャッタ２０は、ステップ状に駆動され、その駆動量に応じて少なくとも次の３つの状態Ｓａ，Ｓｂ，Ｓｃに設定可能である。

第１の状態Ｓａは、反射面２９ａ’からの射出光束の光路を開放し、かつ反射面２９ｂ’，２９ｃ’からの射出光束の光路を遮断する状態である。
第２の状態Ｓｂは、反射面２９ａ’，２９ｂ’からの射出光束の光路を開放し、かつ反射面２９ｃ’からの射出光束の光路を遮断する状態である。
第３の状態Ｓｃは、反射面２９ａ’，２９ｂ’，２９ｃ’からの射出光束の光路を全て開放する状態である（以上、図５に示した光検出部の説明）。

［第２実施形態］
図６を参照して本発明の第２実施形態について説明する。ここでは、第１実施形態との相違点についてのみ説明する。
本実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置においては、図６に示すように、可動シャッタ２０が省略され、マスク部材１９のピンホール１９ａ’，１９ｂ’，１９ｃ’と同数（ここでは３つ）の光検出器２１ａ，２１ｂ，２１ｃが備えられ、かつそれら光検出器２１ａ，２１ｂ，２１ｃと同数（ここでは３つ）のスイッチ３１ａ，３１ｂ，３１ｃが、光検出器２１ａ，２１ｂ，２１ｃとコンピュータ２２との間に備えられる。このうち、マスク部材１９、光検出器２１ａ，２１ｂ，２１ｃからなる光学系が光検出部２である。

なお、光検出器２１ａとスイッチ３１ａとの間には電流／電圧変換器（Ｉ／Ｖ）２１ａ’が挿入され、光検出器２１ｂとスイッチ３１ｂとの間には電流／電圧変換器２１ｂ’が挿入され、光検出器２１ｃとスイッチ３１ｃとの間には電流／電圧変換器２１ｃ’が挿入される。また、スイッチ３１ａ，３１ｂ，３１ｃとコンピュータ２２との間には、Ａ／Ｄ変換器（Ａ／Ｄ）２１”が挿入される。また、Ａ／Ｄ変換器２１”の出力は、コンピュータ２２内の画像ボード２２３に接続される。因みに、これら電流／電圧変換器、Ａ／Ｄ変換器、画像ボードは、図１に示す蛍光共焦点顕微鏡装置にも同様に備えられるが、その蛍光共焦点顕微鏡装置では電流／電圧変換器の数は１である（図１では不図示。）。

光検出器２１ａの検出面は、ピンホール１９ａ’からの射出光束の光路をカバーし、光検出器２１ｂの検出面は、ピンホール１９ｂ’からの射出光束の光路をカバーし、光検出器２１ｃの検出面は、ピンホール１９ｃ’からの射出光束の光路をカバーしている。
よって、光検出器２１ａ→電流／電圧変換器２１ａ’→スイッチ３１ａ→Ａ／Ｄ変換器２１”の経路は、ピンホール１９ａ’からの射出光束の光量を示す信号ｓａの経路となる。

また、光検出器２１ｂ→電流／電圧変換器２１ｂ’→スイッチ３１ｂ→Ａ／Ｄ変換器２１”の経路は、ピンホール１９ｂ’からの射出光束の光量を示す信号ｓｂの経路となる。
また、光検出器２１ｃ→電流／電圧変換器２１ｃ’→スイッチ３１ｃ→Ａ／Ｄ変換器２１”の経路は、ピンホール１９ｃ’からの射出光束の光量を示す信号ｓｃの経路となる。
それら別々の経路を経てＡ／Ｄ変換器２１”に入力された信号ｓａ，ｓｂ，ｓｃは、足し合わされた上で、コンピュータ２２の画像ボード２２３に入力される。

画像ボード２２３に入力された信号は、画像ボード２２３上のフレームメモリＭに順次書き込まれ、そのフレームメモリＭ上に１枚の画像を示す画像データを構築する。コンピュータ２２のＣＰＵ２２１は、その画像データに基づいてモニタ２３に画像を表示する。
ここで、コンピュータ２２内のＣＰＵ２２１は、画像ボード２２３を介してスイッチ３１ａ，３１ｂ，３１ｃに接続されており、それらスイッチ３１ａ，３１ｂ，３１ｃを個別に開状態／閉状態にセットすることができる。

また、コンピュータ２２に対しユーザは予め、セクショニング分解能を複数段階（ここでは、高，中，低の３段階）の何れかに指定することができる。ＣＰＵ２２１は、インタフェース回路（Ｉ／Ｆ）２２４を介して入力器２４からの信号を受信し、ユーザの指定した段階を認識する。
このような蛍光共焦点顕微鏡装置は、コンピュータ２２内のＣＰＵ２２１の指示の下で次のとおり動作する。

ユーザの予め指定した段階が「高」であったとき、ＣＰＵ２２１は、スイッチ３１ａを閉状態にセットし、スイッチ３１ｂ，３１ｃを開状態にセットする。
この状態では、信号ｓａの経路のみが開通するので、Ａ／Ｄ変換器２１”には信号ｓａのみが入力される。よって、フレームメモリＭ上には、信号ｓａによる画像データＤａが構築される。したがって、モニタ２３には図４（ａ）に示したような薄い層１０ａの画像が表示される。

ユーザの予め指定した段階が「中」であったとき、ＣＰＵ２２１は、スイッチ３１ａ，３１ｂを閉状態にセットし、スイッチ３１ｃを開状態にセットする。
この状態では、信号ｓａの経路と信号ｓｂの経路とが開通するので、Ａ／Ｄ変換器２１”には信号ｓａと信号ｓｂとのみが入力される。よって、フレームメモリＭ上には、信号ｓａ，ｓｂによる画像データＤａｂが構築される。したがって、モニタ２３には図４（ｂ）に示したような厚い層１０ｂの画像が表示される。

ユーザの予め指定した段階が「低」であったとき、ＣＰＵ２２１は、スイッチ３１ａ，３１ｂ，３１ｃを閉状態にセットする。
この状態では、信号ｓａの経路と信号ｓｂの経路と信号ｓｃの経路が全て開通するので、Ａ／Ｄ変換器２１”には信号ｓａと信号ｓｂと信号ｓｃとが入力される。よって、フレームメモリＭ上には、信号ｓａ，ｓｂ，ｓｃによる画像データＤａｂｃが構築される。したがって、モニタ２３には図４（ｃ）に示したような極めて厚い層１０ｃの画像が表示される。

したがって、本実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置によれば、ユーザは、入力器２４を操作するだけで、セクショニング分解能を図４の（ａ），（ｂ），（ｃ）のとおり変更することができる。
ここで、この蛍光共焦点顕微鏡装置では、マスク部材１９が、薄い層１０ａを示す光束、厚い層１０ｂを示す光束、極めて厚い層１０ｃを示す光束の全てを生成する。

そして、セクショニング分解能を変更する際に駆動されるのは、コンピュータ２２とスイッチ３１ａ，３１ｂ，３１ｃのみである。
よって、マスク部材１９の位置合わせさえ予め高精度に行われていれば、各層の画像はそれぞれ高精度に取得される。
したがって、本実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置は、シンプルな構成でありながらも高精度にセクショニング分解能を変更することができる。

（その他）
なお、光検出器２１ａ，２１ｂ，２１ｃの配置角度は、図６に示すように各光束に対し略垂直にする必要はなく、各光束に対し非垂直に（例えば、マスク部材１９に沿う角度に）してもよい。
また、上記実施形態では、電気的に開閉されるスイッチ３１ａ，３１ｂ，３１ｃ（コンピュータ２２からの電気的な指示に従って開閉されるスイッチ）を説明したが、手動で開閉するスイッチ３１ａ，３１ｂ，３１ｃを用いることもできる。このときユーザは、入力器２４を操作する代わりにそれらスイッチ３１ａ，３１ｂ，３１ｃを、上述したＣＰＵ２２１が開閉したのと同様に開閉すればよい。

［第３実施形態］
図７を参照して本発明の第３実施形態について説明する。
本実施形態は、蛍光共焦点顕微鏡装置の実施形態である。ここでは、第２実施形態との相違点についてのみ説明する。
本実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置においては、図７に示すように、スイッチ３１ａ，３１ｂ，３１ｃが省略され、その代わりにコンピュータ２２の内部が一部変更される。

コンピュータ２２内の画像ボード２２３には、光検出器２１ａ，２１ｂ，２１ｃから並行して出力される信号ｓａ，ｓｂ，ｓｃを並行して格納する複数のフレームメモリＭａ，Ｍｂ，Ｍｃが設けられる。また、それら信号ｓａ，ｓｂ，ｓｃの経路には、複数のＡ／Ｄ変換器２１ａ”，２１ｂ”，２１ｃ”が並列に挿入される。
また、コンピュータ２２に対しユーザは予め、又は画像取得後でも、セクショニング分解能を複数段階（ここでは、高，中，低の３段階）の何れかに指定又は変更することができる。ＣＰＵ２２１は、インタフェース回路（Ｉ／Ｆ）２２４を介して入力器２４からの信号を受信し、ユーザの指定した段階を認識する。

このような蛍光共焦点顕微鏡装置は、コンピュータ２２内のＣＰＵ２２１の指示の下で次のとおり動作する。
各光検出器２１ａ，２１ｂ，２１ｃから並行して出力される信号ｓａ，ｓｂ，ｓｃは、電流／電圧変換器２１ａ’２１ｂ’，２１ｃ’，Ａ／Ｄ変換器２１ａ”，２１ｂ”，２１ｃ”を介してフレームメモリＭａ，Ｍｂ，Ｍｃに対し並行して書き込まれる。

よって、フレームメモリＭａ上には信号ｓａによる画像データＤａが構築され、フレームメモリＭｂ上には信号ｓｂによる画像データＤｂが構築され、フレームメモリＭｃ上には信号ｓｃによる画像データＤｃが構築される。これら画像データＤａ，Ｄｂ，Ｄｃは、コンピュータ２２内のＲＡＭ２２２などの記憶部に格納される。
ここで、ユーザの指定した段階が「高」であったとき、ＣＰＵ２２１は、画像データＤａをＲＡＭ２２２から読み出し、その画像データＤａに基づく画像をモニタ２３に表示する。この画像は、図４（ａ）に示したような薄い層１０ａの画像となる。

ユーザの指定した段階が「中」であったとき、ＣＰＵ２２１は、画像データＤａ，ＤｂをＲＡＭ２２２から読み出し、それら画像データＤａ，Ｄｂの和をとり（画像データＤａ，Ｄｂを重畳させ）、その和の画像データＤａｂに基づく画像をモニタ２３に表示する。この画像は、図４（ｂ）に示したような厚い層１０ｂの画像となる。
ユーザの指定した段階が「低」であったとき、ＣＰＵ２２１は、画像データＤａ，Ｄｂ，ＤｃをＲＡＭ２２２から読み出し、それら画像データＤａ，Ｄｂ，Ｄｃの和をとり（画像データＤａ，Ｄｂ，Ｄｃを重畳させ）、その和の画像データＤａｂｃに基づく画像をモニタ２３に表示する。この画像は、図４（ｃ）に示したような極めて厚い層１０ｃの画像である。

したがって、本実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置によれば、ユーザは、入力器２４を操作するだけで、セクショニング分解能を図４の（ａ），（ｂ），（ｃ）のとおり変更することができる。
ここで、この蛍光共焦点顕微鏡では、マスク部材１９が、薄い層１０ａを示す光束、厚い層１０ｂを示す光束、極めて厚い層１０ｃを示す光束の全てを生成する。そして、セクショニング分解能を変更する際に駆動されるのは、コンピュータ２２のみである。

よって、マスク部材１９の位置合わせさえ予め高精度に行われていれば、各層の画像はそれぞれ高精度に取得される。
したがって、本実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置は、シンプルな構成でありながらも高精度にセクショニング分解能を変更することができる。
さらに、本実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置は、複数の光検出器２１ａ，２１ｂ，２１ｃを用いて、取得した画像データを演算することで画像取得後におけるセクショニング分解能の変更や、異なる層の画像情報の取得が可能になるので、画像取得前にセクショニング分解能を指定する必要がない。そのため、画像取得のセット時間が短くなる。また、試料への光照射時間も減り、試料のダメージを軽減できる。

また、各画像データが並行して取得されるので、同じ時点の試料１０を様々なセクショニング分解能で観察することが可能になる。
これは、時間経過に伴って状態が変化するような試料（生体試料など）を、同じ状態の下で様々なセクショニング分解能で観察したい場合などに極めて有効である。
また、各画像データは個別に記憶されるので、ユーザは所望するタイミングで所望する回数だけ、セクショニング分解能を変更することができる。

（その他）
なお、本実施形態では、モニタ２３上に同時に表示される画像が、試料１０の何れかの層の画像１つのみであるかのごとく説明したが、２以上にしてよいことは言うまでもない。
［その他］
また、第２実施形態又は第３実施形態では、セクショニング分解能の切り換え数が「３」となっているが、必要に応じて３より大きい数、又は２に増減してもよい。その増減数に応じて、反射透過面１９ａ，１９ｂ，・・・の数を増減すればよい。

また、第２実施形態又は第３実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置は、図６，図７に示す光検出部２以外に、例えば図８，図９，図１０，図１１，図１２の何れかに示すような光検出部を適用することができる。なお、適用された光検出部内の光検出器の数に応じて、上述した電流電圧変換器、スイッチ、Ａ／Ｄ変換器、フレームメモリなどはそれぞれ最適な数だけ配置される。

以下、図８、図９、図１０、図１１、図１２に示す各光検出部について説明する。なお、これらの各図では図２、図５と同様、各反射透過面の符号には集光レンズ１８に近い側から順に、添え字「ａ」，「ｂ」，「ｃ」，・・・を付した。また、各反射透過面において中央光束に作用する面の符号は、その反射透過面と同じ符号に「’」を付したものであり、周辺光束に作用する面の符号は、その反射透過面と同じ符号に「”」を付したものである。また、各光検出器の符号には、それに対応する反射透過面と同じ添え字「ａ」，「ｂ」，「ｃ」，・・・を付した。

また、各図に示す何れのマスク部材においても、集光レンズ１８から離れた反射透過面ほど、中央光束に作用する面（ピンホール又は反射面）の径が大きい。また、各反射透過面は何れも集光レンズ１８の焦点深度内に配置されている。
図８に示す光検出部のマスク部材２９は、図５に示したのと同じマスク部材である。つまり、反射透過面２９ａ，２９ｂ，２９ｃの中央が反射面２９ａ’，２９ｂ’，２９ｃ’、その周辺が透過面２９ａ”，２９ｂ”，２９ｃ”となっている。光検出器２１ａ，２１ｂ，２１ｃは、それら反射面２９ａ’，２９ｂ’，２９ｃ’からの射出光束の光路を個別にカバーする。

図９に示す光検出部のマスク部材３９は、図２に示したマスク部材２９において、反射面１９Ａの位置に反射透過面１９ｂ、反射透過面１９ｂの位置に反射透過面１９ｃを設けたものである。
図１０に示す光検出部のマスク部材２９は、図８に示したのと同じマスク部材である。但し、この光検出部には光検出器２１ｄが追加されている。光検出器２１ｄは、反射透過面２９ｃの透過面２９ｃ”を透過した光束の光路をカバーする。

図１１に示す光検出部のマスク部材５９は、マスク部材２９において、集光レンズ１８に近い方から数えて２番目の反射透過面２９ｂの傾斜方向が、他の反射透過面２９ａ，２９ｃの傾斜方向と反対になったものである。光検出器２１ｂは、そのような反射透過面２９ｂの反射面２９ｂ’からの射出光束の光路をカバーする。
図１２に示す光検出部のマスク部材６９には、透明基板を用いた他のマスク部材とは異なり、プリズム（ここでは５角プリズム）が用いられている。

マスク部材６９は、５角プリズムの第２面、第３面に、ピンホール６９ａ’と反射面６９ａ”とからなる反射透過面６９ａ、ピンホール６９ｂ’と反射面６９ｂ”とからなる反射透過面６９ａをそれぞれ設けてなる。
光検出器２１ａは、ピンホール６９ａ’からの射出光束の光路をカバーし、光検出器２１ｂは、ピンホール６９ｂ’からの射出光束の光路をカバーし、光検出器２１ｃは、マスク部材６９において何ら反射透過面を設けていない最終面（第５面）からの射出光束の光路をカバーする。

因みに、その光検出器２１ｃの前側には、マスク部材６９の各ピンホール６９ａ’，６９ｂ’よりも大きい開口６９ｃ’を有した絞り６９ｃが配置されている。
他の光検出部内の同様の光検出器（図９の光検出器２１ｄ，図１０の光検出器２１ｄ、図１１の光検出器２１ｄ）の全段にも、同様の絞りを配置してもよい。
また、上記各実施形態は、蛍光共焦点顕微鏡装置（蛍光観察用の共焦点顕微鏡装置）の実施形態であるが、本発明は、蛍光観察用以外の共焦点顕微鏡装置にも同様に適用可能である。

第１実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置の構成図である。 第１実施形態の光検出部を説明する図である。 可動シャッタ２０の遮光部の例を示す図である。 マスク部材１９の各反射透過面１９ａ，１９ｂ，１９ｃと、試料１０の各層１０ａ，１０ｂ，１０ｃとの関係を示す模式図である。 マスク部材２９を説明する図である。 第２実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置の構成図である。 第３実施形態の蛍光共焦点顕微鏡装置の構成図である。 第２実施形態又は第３実施形態に適用し得る光検出部の別の例を示す図である。 第２実施形態又は第３実施形態に適用し得る光検出部の別の例を示す図である。 第２実施形態又は第３実施形態に適用し得る光検出部の別の例を示す図である。 第２実施形態又は第３実施形態に適用し得る光検出部の別の例を示す図である。 第２実施形態又は第３実施形態に適用し得る光検出部の別の例を示す図である。

符号の説明

１１ 光源
１２ 照明用レンズ
１３，１７ フィルタ
１４ ダイクロイックミラー
１５ ガルバノミラー
１６ 対物レンズ
１８ 集光レンズ
１９，２９，３９，５９，６９ マスク部材
１９ａ，１９ｂ，・・・，２９ａ，２９ｂ，・・・，６９ａ，６９ｂ，・・・ 反射透過面
１９ａ”，１９ｂ”，・・・，２９ａ’，２９ｂ’，・・・，６９ａ”，６９ｂ”，・・・反射面
１９ａ’，１９ｂ’，・・・，６９ａ’，６９ｂ’，・・・ピンホール
２９ａ”，２９ｂ”，・・・透過面
６９ｃ 絞り
６９ｃ’ 開口
２０ 可動シャッタ
２１ 光検出器
２２ コンピュータ
２３ モニタ
２４ 入力器
２１’電流／電圧変換器（Ｉ／Ｖ）
３１ スイッチ
２１”Ａ／Ｄ変換器（Ａ／Ｄ）
Ｍ フレームメモリ
２２１ ＣＰＵ
２２２ ＲＡＭ
２２４ インタフェース回路（Ｉ／Ｆ）

Claims (7)

1. 光源と、
   前記光源からの光を試料に集光する照明光学系と、
   前記試料からの光を結像する結像光学系と、
   前記結像光学系に関し前記試料の集光点と略共役な位置に入射する光を、少なくとも前記試料の前記集光点の近傍領域からの光と、その周辺領域からの光とに分離し、それぞれ検出する検出手段とを備え、
   前記検出手段は、
   前記結像光学系の焦点深度内に光軸に対して傾斜して配置された光学部材と、前記光学部材において前記集光点と略共役な位置に設けられ、かつその位置に入射する光を前記近傍領域からの光と前記周辺領域からの光とに分離する光分離面と、前記近傍領域からの光と前記周辺領域からの光とを独立して検出する検出器とを有し、
   前記光分離面は、
   前記近傍領域からの光を受ける円形の第１面と、前記周辺領域からの光を受ける第２面とを有し、
   前記光学部材は、
   前記周辺領域からの光の光路に対し直列の関係で複数の前記光分離面を配置しており、
   前記複数の光分離面の間では、
   後段に配置されたものほど前記第１面の径が大きく設定され、
   前記複数の光分離面の間では、
   前記第１面のタイプは透過面及び反射面の一方に統一され、かつ前記第２面のタイプは透過面及び反射面の他方に統一されている
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記検出手段は、
   複数の前記検出器を備える
   ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記検出手段は、
   前記近傍領域からの光を検出する第１の前記検出器と、前記周辺領域からの光を検出する第２の前記検出器とを有する
   ことを特徴とする請求項２に記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記検出手段は、
   前記分離された前記近傍領域からの光と前記周辺領域からの光との双方を受光する単一の検出器と、
   前記近傍領域からの光の光路と、前記周辺領域からの光の光路との一方を開閉するシャッターとを有し、
   前記光学部材は、前記近傍領域からの光及び前記周辺領域からの光を前記単一の検出器へ導く
   ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
5. 前記検出手段は、
   前記近傍領域からの光と前記周辺領域からの光との光量和、又は、前記近傍領域からの光の光量を検出する
   ことを特徴とする請求項４に記載の共焦点顕微鏡。
6. 請求項２に記載の共焦点顕微鏡と、
   前記複数の検出器が生成する複数の検出信号のうち少なくとも２つを選択し、加算する選択加算手段と
   を備えることを特徴とする共焦点顕微鏡システム。
7. 請求項２に記載の共焦点顕微鏡と、
   前記複数の検出器が生成する複数の検出信号を個別に記憶する記憶手段と、
   前記記憶手段が記憶した複数の検出信号を用いて演算する演算処理手段と
   を備えることを特徴とする共焦点顕微鏡システム。

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