JP2007279085A - 共焦点顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
【課題】大きな直径を持つピンホールを通過した光から得られた画像を観察して焦点を合わせる場合にも、セクショニング分解能を変更する精度を高いままに維持できる共焦点顕微鏡を提供する。
【解決手段】試料10からの射出光束を集光する集光光学系と、集光光学系の瞳面近傍に配置される光分離部材19と、光分離部材19により分離された光束を、それぞれ直径の違うピンホールを用いて、特定の焦点範囲のみの光を透過させる光遮蔽手段と、ピンホールを通過したそれぞれの光を検出する検出手段21a〜21cと、検出されたそれぞれの光束を、走査光学系に同期して画像化する画像構成装置、22、25とを備え、画像構成装置において、大きな直径のピンホールを通過した光による画像を観測しながら焦点を合わせる際に、最小の直径のピンホールを通過した光による画像の焦点の合致度を計算して、その結果を表示する機能を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
【選択図】 図2
【解決手段】試料10からの射出光束を集光する集光光学系と、集光光学系の瞳面近傍に配置される光分離部材19と、光分離部材19により分離された光束を、それぞれ直径の違うピンホールを用いて、特定の焦点範囲のみの光を透過させる光遮蔽手段と、ピンホールを通過したそれぞれの光を検出する検出手段21a〜21cと、検出されたそれぞれの光束を、走査光学系に同期して画像化する画像構成装置、22、25とを備え、画像構成装置において、大きな直径のピンホールを通過した光による画像を観測しながら焦点を合わせる際に、最小の直径のピンホールを通過した光による画像の焦点の合致度を計算して、その結果を表示する機能を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
【選択図】 図2
Description
本発明は、共焦点顕微鏡に関するものである。
従来の光分離部材を用いた共焦点顕微鏡システム(例えば、特開2005−274591号公報(特許文献1)に記載されるもの等)の例を図6に示す。光源11から射出した光束は、照明用レンズ12及び励起フィルタ13を通り、ダイクロイックミラー14にて反射され、ガルバノミラー15に入射する。ガルバノミラー15は、光束を走査光束に変え、走査光束は、対物レンズ16によって、ステージ上の試料10に集光され、試料10上にスポットを形成する。
試料10上のスポット形成領域からは、光(蛍光)が放出される。試料10から放出された光(蛍光)は、対物レンズ16を通り、ガルバノミラー15へ入射する。ガルバノミラー15は、入射した光(蛍光)を、走査光束と同じ角度で元の平行光束に戻し、光(蛍光)は、ダイクロイックミラー14へ入射する。ダイクロイックミラー14に入射した光(蛍光)は、光源11からの光束と波長が違うので、ダイクロイックミラー14を透過し、蛍光フィルタ17を通り、集光レンズ18によって集光され、光分離部材19に入射する。
光分離部材19には、直径の違うピンホール(図7の19a、19b及び19c)を有しており、入射した光は、それぞれのピンホールに対応した光束に分離される。分離された光は、光検出器21a、21b及び21cにそれぞれ入射し、光検出器は、光電子変換を行い、その光の量(明るさ)に応じた、デジタルデータとして、コンピュータ22に送信する。
コンピュータ22はそのデータを1画素のデータとして記録する。この記録をガルバノミラー15の走査するタイミングと同期して並べることで、画像として構築し、コンピュータ22上のモニタに表示する。
また、前記光分離部材19から射出される光を、可動シャッタ20により、選択することができる。
図7は、前記光分離部材19の一例を示した詳細図である。前記集光レンズ18によって集光された光は、ピンホール19aを通る。ただし、ピンホール19aを通る光はその直径に応じた、特定の焦点面からの光のみである。すなわち、この特定の焦点面からの光のみ、ピンホール19aを通過し、光検出器21aに入射する。
ピンホール19aを通過できなかった光は、ピンホール19aの周り及び光分離部材19の逆側の面にある反射面19b’にて反射され、ピンホール19bを通る。ここでも、ピンホール19bを通る光はその直径に応じた、ピンホール19aよりは範囲が広いが、特定の焦点面からの光のみである。この特定の焦点面からの光のみ、ピンホール19bを通過し、光検出器21bに入射する。
ピンホール19bを通過できなかった光は、ピンホール19bの周り及び光分離部材19の逆側の面にある反射面19c’にて反射され、ピンホール19cを通る。ここでも、ピンホール19cを通る光はその直径に応じた、ピンホール19bよりは範囲が広いが、特定の焦点面からの光のみである。この特定の焦点面からの光のみ、ピンホール19cを通過し、光検出器21cに入射する。ピンホール19bを通過できなかった光は、特には検出されない。
以上のシステムによれば、ピンホールの直径を切り替えることなく、一度に複数のセクショニングを持つ画像を得ることができる。また、さらに、画像を取得した後にコンピュータ22上でそれぞれのピンホール19a、19b、19cを通過した光から得られた画像を得ることで、セクショニング分解能を高精度に変更したものと同等の画像を得ることも可能である。これらのことは、特許文献1に詳しく説明されている。
特開2005−274591号公報
このような共焦点顕微鏡では、最小のピンホールを通過した光で得られた画像が最大の分解能を有しているので、通常はこの画像を観察しながらで焦点を合わせて、全体の画像を観察する。しかしながら、最小の直径のピンホールを通過した光で得られた画像では十分な明るさが得られない場合に、それより大きな直径のピンホールを通過した光で得られた画像を観察して焦点を合わせることがある。その際に、観察している像を見ている限りでは十分に焦点が合っている状態であったとしても、焦点深度が最も浅い分解能を持つ最小の直径のピンホールを通過した光の焦点深度よりも深いため、最小の直径のピンホールを通過した光から得られる像の焦点がぼけてしまうことがある。
その状態においては、コンピュータ22上でそれぞれのピンホール19a、19b、19cから得られた画像を計算する際の、セクショニング分解能を変更する精度が低くなってしまい、問題であった。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、最小の直径より大きな直径を持つピンホールを通過した光から得られた画像を観察して焦点を合わせる場合にも、最小の直径を持つピンホールを通過した光から得られた画像の焦点も十分に合うようにして、セクショニング分解能を変更する精度を十分に高いままに維持できる共焦点顕微鏡を提供することを課題とする。
前記課題を解決するための第1の手段は、照明光束を射出する光源と、前記照明光束を、試料上を走査する走査光束に変換する走査光学系と、前記走査光束を試料上に集光する光学系と、前記試料からの射出光束を集光する集光光学系と、前記集光光学系の瞳面近傍の所定位置に配置され、前記射出光束を少なくとも2つの光束に分離する光分離部材であって、それぞれ直径の異なる複数のピンホールが形成された反射手段を有し、各ピンホールの大きさに対応して、前記試料中の前記光学系による特定の焦点範囲からの光のみを透過させ、他の焦点範囲からの光は反射させることにより光を分離する光分離部材と、前記ピンホールを通過したそれぞれの光を検出する検出手段と、前記検出手段により検出されたそれぞれの光を、前記走査光学系に同期して画像化する画像構成装置とを備え、前記画像構成装置において、最小直径より大きな直径のピンホールを通過した光による画像を観測しながら焦点を合わせる際に、最小の直径のピンホールを通過した光による画像の焦点の合致度を計算して、その結果を表示する機能を有することを特徴とする共焦点顕微鏡である。
前記課題を解決するための第2の手段は、前記第1の手段であって、前記焦点の合致度を計算する方法が、前記最小の直径のピンホールを通過した光による画像の全画素の輝度平均を計算し、その輝度平均を前記結果とする方法であることを特徴とするものである。
前記課題を解決するための第3の手段は、前記第1の手段であって、前記焦点の合致度を計算する方法が、前記最小の直径のピンホールを通過した光による画像の全画素のコントラストを計算し、その値を前記結果とする方法であることを特徴とするものである。
前記課題を解決するための第4の手段は、前記第2の手段又は第3の手段であって、前記焦点の合致度を計算手段する際に、前記最小の直径のピンホールを通過した光による画像の輝度に閾値を設け、前記閾値以下の輝度を持つ画素を、計算の対象より除去することを特徴とするものである。
本発明によれば、最小の直径より大きな直径を持つピンホールを通過した光から得られた画像を観察して焦点を合わせる場合にも、最小の直径を持つピンホールを通過した光から得られた画像の焦点も十分に合うようにして、セクショニング分解能を変更する精度を十分に高いままに維持できる共焦点顕微鏡を提供することができる。
以下、本発明の実施の形態の例を、図を用いて説明する。図1は、本発明の実施の形態の1例である共焦点顕微鏡における、焦点深度とピンホールの直径について模式的に説明したものである。
図1の左側の図は、最小の直径を持つピンホール19aを通過した光、及びそれにより得られる画像について示したものである。試料10内に照射された照明光は、焦点スポット23a、23b、23c、23d、23eそれぞれの深度にて集光され、スポットを形成する。焦点スポット23a、23b、23c、23d、23eそれぞれから射出した光(蛍光)は、対物レンズ16、不図示(図2に示す)のガルバノミラー15、ダイクロイックミラー14を通り、集光レンズ18に入射する。集光レンズ18は入射した光を共焦点の位置での集光スポット23a’、23b’、23c’、23d’、23e’に集光する。その際、集光レンズ18の焦点位置に配置された最小の直径をもつピンホール19aに集光される。
しかし、焦点深度の範囲23Aよりも浅い位置の焦点スポット23a、23bから射出された光(蛍光)は、ピンホール19aの手前で集光され、その後発散し、ピンホール19aを通過しない。さらに、焦点深度の範囲23Aよりも深い位置の焦点スポット23d、23eから射出された光(蛍光)は、集光される前にピンホール19aに当たってしまい、ピンホール19aを通過しない。
よって、焦点深度の範囲23Aの範囲にある焦点スポット23cから射出された光(蛍光)のみが、23c’にて集光され、ピンホール19aを通過し、光検出器21aに入射する。
このピンホール19aを通過した光により、画像24aに示すような画像が形成される。この画像24aは、焦点深度の範囲23Aが狭いため、画像の輝度は暗いが、セクショニング性能が高く、コントラストの高い画像となる。
図1の中央の図は、中間の直径をもつピンホール19bを通過した光、及びそれにより得られる画像について示したものである。この図においては、焦点深度の範囲23Bは前記の焦点深度の範囲23Aよりも広がっており、そのため、試料上の焦点スポット23b、23c、23dから射出された光(蛍光)は、集光レンズ18により集光され、ピンホール19bを通過し、光検出器21bに入射する。
このピンホール19bを通過した光により、画像24bに示すような画像が形成される。この画像24bは、焦点深度の範囲23Bが中間の広さであるため、画像の輝度は少々明るくなるが、セクショニング性能は画像24cよりは悪い画像となる。この場合、焦点深度の範囲23Bよりも浅い焦点スポット23aから発する光(蛍光)と焦点深度の範囲23Bよりも深い焦点スポット23eから発する光(蛍光)のみがピンホール19bを通過することができない。
図1の右側の図は、最大の直径をもつピンホール19cについて示したものである。
この図においては、焦点深度の範囲23Cは前記の焦点深度の範囲23Bよりもさらに広がっており、そのため、試料上の焦点スポット23a、23b、23c、23d、23eから射出された光(蛍光)は、全て集光レンズ18により集光され、ピンホール19cを通過し、光検出器21cに入射することができる。
このピンホール19cを通過した光により、画像24cに示すような画像が形成される。この画像24cは、焦点深度の範囲23Cが最大であるため、画像の輝度は明るくなるが、セクショニング性能は悪い画像となる。
図2は、本発明の実施の形態の1例である、光分離部材を用いた共焦点顕微鏡システムの概要を図示したものである。光源11から射出した光束は、照明用レンズ12及び励起フィルタ13を通り、ダイクロイックミラー14にて反射され、ガルバノミラー15に入射する。ガルバノミラー15は、光束を走査光束に変え、走査光束は、対物レンズ16によって、ステージ上の試料10に集光され、試料10上にスポットを形成する。
試料10上のスポット形成領域からは、光(蛍光)が放出される。試料10から放出された光(蛍光)は、対物レンズ16を通り、ガルバノミラー15へ入射する。ガルバノミラー15は、入射した光(蛍光)を、走査光束と同じ角度で元の平行光束に戻し、光(蛍光)は、ダイクロイックミラー14へ入射する。ダイクロイックミラー14に入射した光(蛍光)は、光源11からの光束と波長が違うので、ダイクロイックミラー14を透過し、蛍光フィルタ17を通り、集光レンズ18によって集光され、光分離部材19に入射する。
光分離部材19には、直径の違うピンホール(図7の19a、19b及び19c)を有しており、入射した光は、それぞれのピンホールに対応した光束に分離される。分離された光は、光検出器21a、21b及び21cにそれぞれ入射し、光検出器は、光電子変換を行い、その光の量(明るさ)に応じた、デジタルデータとして、焦点合致度測定器25に送信する。
焦点合致度測定器25は、そのデータを1画素のデータとして記録する。この記録をガルバノミラー15の走査するタイミングと同期して並べることで、それぞれ直径の違うピンホール(図7の19a、19b及び19c)から得られた画像(図1の24a、24b、24c)として構築する。
1フレーム分の画像が構成された段階で、最小の直径のピンホール19aに対応する画像(図1の24a)の全画素の平均値を計算し、それを焦点の合致度データとして、それぞれ直径の違うピンホール(図7の19a、19b及び19c)から得られた画像(図1の24a、24b、24c)とともにコンピュータ22に送信する。
コンピュータ22は得られた複数の直径の違うピンホール(図7の19a、19b及び19c)画像(図1の24a、24b、24c)から、観察するピンホールの直径に対応する画像を構築し、モニタに表示する。
さらに、コンピュータ22は、前述の焦点の合致度データをモニタ上に表示する。そうすることで、観察する画像データが、ピンホールの直径が最小の直径のピンホール19aよりも大きいピンホール19b、19cを通過した光(蛍光)により得られたものである場合でも、焦点の合致度データを参照することで、最小の直径のピンホール19aで得られる画像(図1の24a)の焦点も十分に合致した位置にステージを調整することができるようになる。
また、最小の直径のピンホール19aを通過して得られる光(蛍光)は、画像24aとして構築した場合に、ほとんどが背景であり、従って、ほとんどの画素の輝度値はほぼ0に近い。そこで、背景かどうかを判断する閾値を焦点合致度測定器25に設定し、その閾値以下の値は背景画素であるとして、焦点の合致度データを計算する際に無視するようにすることで、さらに焦点の合致度の変化量の精度を向上させることもできる。
図3は、Zステージの位置(試料10を保持するステージの光軸方向の位置)と、そのときの画像の明るさの関係をグラフにて示したものである。このグラフは横軸にZステージの位置を、縦軸に全画素の輝度の平均値を正規化したものをプロットしたものである。
1点鎖線26cは、Zステージの位置と最大の直径を持つピンホール19cで検出される画像の明るさの関係を示すグラフである。このグラフは、焦点深度の範囲(図1の23C)に近づくと、値が上がり始め、焦点深度の範囲(図1の23C)内にあれば、ほぼ焦点の合致した画像24cを得ることができる。しかし、その焦点が合ったと判断できる範囲28cは広く、どこが理想の焦点面27であるかは不明である。さらに、Zステージの位置を焦点面より浅くした場合と、深くした場合において、その画像のボケ具合が違うため、焦点が合ったと判断できる範囲28cの中心も理想の焦点面27とはずれており、最小の直径を持つピンホール19aから得られた画像24aの焦点が合っているかどうかはわからない。
点線26bは、Zステージの位置と中間の直径を持つピンホール19bで検出される画像の明るさの関係を示すグラフである。この場合、焦点が合ったと判断できる範囲28bは28cよりは狭いが、どこが理想の焦点面27かは不明であり、さらに、その焦点が合ったと判断できる範囲28bの中心も理想の焦点面27からはずれているため、最小の直径を持つピンホール19aの焦点が合っているかは不明である。
実線26cは、Zステージの位置と最小の直径を持つピンホール19aで検出される画像の明るさの関係を示すグラフである。この場合、焦点が合ったと判断できる範囲28aは十分に狭く、ほぼ、理想の焦点面27と合致している。
この図は、本発明において、最小の直径ではないピンホール19bまたは19cから得られる画像24bまたは24cを観察している状態で、実線26aの輝度データを利用して、その輝度データの平均値を示すことで、理想の焦点面27にほぼ合致させることが可能であることを示している。
図2の例においては、焦点合致度測定器25はコンピュータ22の外にあるが、ソフトウェアとして作成し、コンピュータ22の中の画像を構築し表示するソフトウェアに組み込んでもかまわない。
さらに、以上の実施の形態においては、光分離部材19のように一体になった光学部材を用いているが、特にこれに限定するものではなく、直径の違うピンホールを2つ以上用意し、試料から得られる光(蛍光)を分離してそれぞれのピンホールに集光でき、ある直径のピンホールの画像を用いて焦点を合わせる際に、それよりも直径の小さいピンホールの画像データを焦点の合致度として計算して示す方法をとってもよいということは言うまでもない。このような、直径の違うピンホールの配置方法の例は、特許文献1に記載されている。
また、本実施形態の例においては、光分離部材19により、3種類の異なる直径を持つピンホールに分離しているが、これに限るものではなく、3種類以上のまたは2種類の異なる直径をもつピンホールを用いて行うことを制限するものではない。
さらに、本実施形態においては、Zステージの位置を手動で動かしている例を示したが、焦点合致度測定器25がZステージコントロール機能を有し、その得られた焦点の合致度データを用いて、自動でZステージを理想の焦点面に移動させるようにしてもかまわない。
また、前記の例においては、焦点合致度測定器25における焦点の合致度データの計算に、輝度値の平均を使用しているが、この計算において、他のコントラストや明るさを示すことができる方法を用いてもよい。
以下に、コントラスト値の計算方法の例を示す。取得された画像データの1つの注目画素nとその近傍の画素について、図4の垂直方向コントラスト計算フィルタ30を行列演算で掛け合わせる。その結果を注目画素の垂直方向コントラスト値Vnとする。同様に、図4の水平方向コントラスト計算フィルタ31を用いた結果Vhを求める。
次に、Vn、Vhそれぞれの二乗した値を足したものを、その注目画素nのコントラスト値Cnとする。全ての画素において、コントラスト値Cnを計算し、それを全て合計する。その結果をコントラスト値を計算した画素の数で割るとその画像のコントラスト値が算出される。
さらに、このコントラスト値を、画素データのとりうる最大値(デジタルデータが8ビットの場合は255になる)の二乗を二倍したもので割って、0から1までのデータとして正規化する。そうすることで、デジタルデータのビット数が違う場合にも対応できる。
上記例においては、垂直方向コントラスト計算フィルタ30および水平方向コントラスト計算フィルタ31を用いて計算しているが、それを用いずに、図5のようなラプラシアンフィルタ32を用いてもよい。その際には、取得された画像データの1つの注目画素nとその近傍の画素についてラプラシアンフィルタ32を行列演算で掛け合わせ、その結果を二乗したものをその注目画素nのエッジ値Enとし、正規化においては、画素データのとりうる最大値の二乗を四倍したもので割ることで対応できる。
このようにして、最小の直径のピンホールを通過して得られる光(蛍光)から形成される画像のコントラストを求め、それを、画像と共に表示するようにすれば、コントラストが最大となるZステージ位置を合焦位置と判定することにより、最小でない直径のピンホールを通過して得られる光(蛍光)から形成される画像を観察しているときでも、合焦位置を正確に求めることができる。
10…試料、11…光源、12…照明用レンズ、13…励起フィルタ、14…ダイクロイックミラー、15…ガルバノミラー、16…対物レンズ、17…蛍光フィルタ、18…集光レンズ、19…光分離部材、19a,19b,19c…ピンホール、19b’,19c’…反射面、20…可動シャッタ、21a,21b,21c…光検出器、22…コンピュータ、23A,23B,23C…焦点深度の範囲、23a〜23e…焦点スポット、23a’〜23e’…集光スポット、24a,24b,24c…画像、25…焦点合致度測定器、26a,26b,26c…Z位置と検出される明るさの関係のグラフ、27…理想の焦点面、28a,28b,28c…画像から焦点が合っていると判断される範囲、30…垂直方向コントラスト計算フィルタ、31…水平方向コントラスト計算フィルタ、32…ラプラシアンフィルタ
Claims (4)
- 照明光束を射出する光源と、
前記照明光束を、試料上を走査する走査光束に変換する走査光学系と、
前記走査光束を試料上に集光する光学系と、
前記試料からの射出光束を集光する集光光学系と、
前記集光光学系の瞳面近傍の所定位置に配置され、前記射出光束を少なくとも2つの光束に分離する光分離部材であって、それぞれ直径の異なる複数のピンホールが形成された反射手段を有し、各ピンホールの大きさに対応して、前記試料中の前記光学系による特定の焦点範囲からの光のみを透過させ、他の焦点範囲からの光は反射させることにより光を分離する光分離部材と、
前記ピンホールを通過したそれぞれの光を検出する検出手段と、
前記検出手段により検出されたそれぞれの光を、前記走査光学系に同期して画像化する画像構成装置とを備え、
前記画像構成装置において、最小直径より大きな直径のピンホールを通過した光による画像を観測しながら焦点を合わせる際に、最小の直径のピンホールを通過した光による画像の焦点の合致度を計算して、その結果を表示する機能を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。 - 前記焦点の合致度を計算する方法が、前記最小の直径のピンホールを通過した光による画像の全画素の輝度平均を計算し、その輝度平均を前記結果とする方法であることを特徴とする請求項1に記載の共焦点顕微鏡。
- 前記焦点の合致度を計算する方法が、前記最小の直径のピンホールを通過した光による画像の全画素のコントラストを計算し、その値を前記結果とする方法であることを特徴とする請求項1に記載の共焦点顕微鏡。
- 前記焦点の合致度を計算手段する際に、前記最小の直径のピンホールを通過した光による画像の輝度に閾値を設け、前記閾値以下の輝度を持つ画素を、計算の対象より除去することを特徴とする請求項2又は請求項3に記載の共焦点顕微鏡。
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