JP2007279085A - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】大きな直径を持つピンホールを通過した光から得られた画像を観察して焦点を合わせる場合にも、セクショニング分解能を変更する精度を高いままに維持できる共焦点顕微鏡を提供する。
【解決手段】試料１０からの射出光束を集光する集光光学系と、集光光学系の瞳面近傍に配置される光分離部材１９と、光分離部材１９により分離された光束を、それぞれ直径の違うピンホールを用いて、特定の焦点範囲のみの光を透過させる光遮蔽手段と、ピンホールを通過したそれぞれの光を検出する検出手段２１ａ〜２１ｃと、検出されたそれぞれの光束を、走査光学系に同期して画像化する画像構成装置、２２、２５とを備え、画像構成装置において、大きな直径のピンホールを通過した光による画像を観測しながら焦点を合わせる際に、最小の直径のピンホールを通過した光による画像の焦点の合致度を計算して、その結果を表示する機能を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
【選択図】 図２

Description

本発明は、共焦点顕微鏡に関するものである。

従来の光分離部材を用いた共焦点顕微鏡システム（例えば、特開２００５−２７４５９１号公報（特許文献１）に記載されるもの等）の例を図６に示す。光源１１から射出した光束は、照明用レンズ１２及び励起フィルタ１３を通り、ダイクロイックミラー１４にて反射され、ガルバノミラー１５に入射する。ガルバノミラー１５は、光束を走査光束に変え、走査光束は、対物レンズ１６によって、ステージ上の試料１０に集光され、試料１０上にスポットを形成する。

試料１０上のスポット形成領域からは、光（蛍光）が放出される。試料１０から放出された光（蛍光）は、対物レンズ１６を通り、ガルバノミラー１５へ入射する。ガルバノミラー１５は、入射した光（蛍光）を、走査光束と同じ角度で元の平行光束に戻し、光（蛍光）は、ダイクロイックミラー１４へ入射する。ダイクロイックミラー１４に入射した光（蛍光）は、光源１１からの光束と波長が違うので、ダイクロイックミラー１４を透過し、蛍光フィルタ１７を通り、集光レンズ１８によって集光され、光分離部材１９に入射する。

光分離部材１９には、直径の違うピンホール（図７の１９ａ、１９ｂ及び１９ｃ）を有しており、入射した光は、それぞれのピンホールに対応した光束に分離される。分離された光は、光検出器２１ａ、２１ｂ及び２１ｃにそれぞれ入射し、光検出器は、光電子変換を行い、その光の量（明るさ）に応じた、デジタルデータとして、コンピュータ２２に送信する。

コンピュータ２２はそのデータを１画素のデータとして記録する。この記録をガルバノミラー１５の走査するタイミングと同期して並べることで、画像として構築し、コンピュータ２２上のモニタに表示する。

また、前記光分離部材１９から射出される光を、可動シャッタ２０により、選択することができる。

図７は、前記光分離部材１９の一例を示した詳細図である。前記集光レンズ１８によって集光された光は、ピンホール１９ａを通る。ただし、ピンホール１９ａを通る光はその直径に応じた、特定の焦点面からの光のみである。すなわち、この特定の焦点面からの光のみ、ピンホール１９ａを通過し、光検出器２１ａに入射する。

ピンホール１９ａを通過できなかった光は、ピンホール１９ａの周り及び光分離部材１９の逆側の面にある反射面１９ｂ’にて反射され、ピンホール１９ｂを通る。ここでも、ピンホール１９ｂを通る光はその直径に応じた、ピンホール１９ａよりは範囲が広いが、特定の焦点面からの光のみである。この特定の焦点面からの光のみ、ピンホール１９ｂを通過し、光検出器２１ｂに入射する。

ピンホール１９ｂを通過できなかった光は、ピンホール１９ｂの周り及び光分離部材１９の逆側の面にある反射面１９ｃ’にて反射され、ピンホール１９ｃを通る。ここでも、ピンホール１９ｃを通る光はその直径に応じた、ピンホール１９ｂよりは範囲が広いが、特定の焦点面からの光のみである。この特定の焦点面からの光のみ、ピンホール１９ｃを通過し、光検出器２１ｃに入射する。ピンホール１９ｂを通過できなかった光は、特には検出されない。

以上のシステムによれば、ピンホールの直径を切り替えることなく、一度に複数のセクショニングを持つ画像を得ることができる。また、さらに、画像を取得した後にコンピュータ２２上でそれぞれのピンホール１９ａ、１９ｂ、１９ｃを通過した光から得られた画像を得ることで、セクショニング分解能を高精度に変更したものと同等の画像を得ることも可能である。これらのことは、特許文献１に詳しく説明されている。
特開２００５−２７４５９１号公報

このような共焦点顕微鏡では、最小のピンホールを通過した光で得られた画像が最大の分解能を有しているので、通常はこの画像を観察しながらで焦点を合わせて、全体の画像を観察する。しかしながら、最小の直径のピンホールを通過した光で得られた画像では十分な明るさが得られない場合に、それより大きな直径のピンホールを通過した光で得られた画像を観察して焦点を合わせることがある。その際に、観察している像を見ている限りでは十分に焦点が合っている状態であったとしても、焦点深度が最も浅い分解能を持つ最小の直径のピンホールを通過した光の焦点深度よりも深いため、最小の直径のピンホールを通過した光から得られる像の焦点がぼけてしまうことがある。

その状態においては、コンピュータ２２上でそれぞれのピンホール１９ａ、１９ｂ、１９ｃから得られた画像を計算する際の、セクショニング分解能を変更する精度が低くなってしまい、問題であった。

本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、最小の直径より大きな直径を持つピンホールを通過した光から得られた画像を観察して焦点を合わせる場合にも、最小の直径を持つピンホールを通過した光から得られた画像の焦点も十分に合うようにして、セクショニング分解能を変更する精度を十分に高いままに維持できる共焦点顕微鏡を提供することを課題とする。

前記課題を解決するための第１の手段は、照明光束を射出する光源と、前記照明光束を、試料上を走査する走査光束に変換する走査光学系と、前記走査光束を試料上に集光する光学系と、前記試料からの射出光束を集光する集光光学系と、前記集光光学系の瞳面近傍の所定位置に配置され、前記射出光束を少なくとも２つの光束に分離する光分離部材であって、それぞれ直径の異なる複数のピンホールが形成された反射手段を有し、各ピンホールの大きさに対応して、前記試料中の前記光学系による特定の焦点範囲からの光のみを透過させ、他の焦点範囲からの光は反射させることにより光を分離する光分離部材と、前記ピンホールを通過したそれぞれの光を検出する検出手段と、前記検出手段により検出されたそれぞれの光を、前記走査光学系に同期して画像化する画像構成装置とを備え、前記画像構成装置において、最小直径より大きな直径のピンホールを通過した光による画像を観測しながら焦点を合わせる際に、最小の直径のピンホールを通過した光による画像の焦点の合致度を計算して、その結果を表示する機能を有することを特徴とする共焦点顕微鏡である。

前記課題を解決するための第２の手段は、前記第１の手段であって、前記焦点の合致度を計算する方法が、前記最小の直径のピンホールを通過した光による画像の全画素の輝度平均を計算し、その輝度平均を前記結果とする方法であることを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第３の手段は、前記第１の手段であって、前記焦点の合致度を計算する方法が、前記最小の直径のピンホールを通過した光による画像の全画素のコントラストを計算し、その値を前記結果とする方法であることを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第４の手段は、前記第２の手段又は第３の手段であって、前記焦点の合致度を計算手段する際に、前記最小の直径のピンホールを通過した光による画像の輝度に閾値を設け、前記閾値以下の輝度を持つ画素を、計算の対象より除去することを特徴とするものである。

本発明によれば、最小の直径より大きな直径を持つピンホールを通過した光から得られた画像を観察して焦点を合わせる場合にも、最小の直径を持つピンホールを通過した光から得られた画像の焦点も十分に合うようにして、セクショニング分解能を変更する精度を十分に高いままに維持できる共焦点顕微鏡を提供することができる。

以下、本発明の実施の形態の例を、図を用いて説明する。図１は、本発明の実施の形態の１例である共焦点顕微鏡における、焦点深度とピンホールの直径について模式的に説明したものである。

図１の左側の図は、最小の直径を持つピンホール１９ａを通過した光、及びそれにより得られる画像について示したものである。試料１０内に照射された照明光は、焦点スポット２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ、２３ｅそれぞれの深度にて集光され、スポットを形成する。焦点スポット２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ、２３ｅそれぞれから射出した光（蛍光）は、対物レンズ１６、不図示（図２に示す）のガルバノミラー１５、ダイクロイックミラー１４を通り、集光レンズ１８に入射する。集光レンズ１８は入射した光を共焦点の位置での集光スポット２３ａ’、２３ｂ’、２３ｃ’、２３ｄ’、２３ｅ’に集光する。その際、集光レンズ１８の焦点位置に配置された最小の直径をもつピンホール１９ａに集光される。

しかし、焦点深度の範囲２３Ａよりも浅い位置の焦点スポット２３ａ、２３ｂから射出された光（蛍光）は、ピンホール１９ａの手前で集光され、その後発散し、ピンホール１９ａを通過しない。さらに、焦点深度の範囲２３Ａよりも深い位置の焦点スポット２３ｄ、２３eから射出された光（蛍光）は、集光される前にピンホール１９ａに当たってしまい、ピンホール１９ａを通過しない。

よって、焦点深度の範囲２３Ａの範囲にある焦点スポット２３ｃから射出された光（蛍光）のみが、２３ｃ’にて集光され、ピンホール１９ａを通過し、光検出器２１ａに入射する。

このピンホール１９ａを通過した光により、画像２４ａに示すような画像が形成される。この画像２４ａは、焦点深度の範囲２３Ａが狭いため、画像の輝度は暗いが、セクショニング性能が高く、コントラストの高い画像となる。

図１の中央の図は、中間の直径をもつピンホール１９ｂを通過した光、及びそれにより得られる画像について示したものである。この図においては、焦点深度の範囲２３Ｂは前記の焦点深度の範囲２３Ａよりも広がっており、そのため、試料上の焦点スポット２３ｂ、２３ｃ、２３ｄから射出された光（蛍光）は、集光レンズ１８により集光され、ピンホール１９ｂを通過し、光検出器２１ｂに入射する。

このピンホール１９ｂを通過した光により、画像２４ｂに示すような画像が形成される。この画像２４ｂは、焦点深度の範囲２３Ｂが中間の広さであるため、画像の輝度は少々明るくなるが、セクショニング性能は画像２４ｃよりは悪い画像となる。この場合、焦点深度の範囲２３Ｂよりも浅い焦点スポット２３ａから発する光（蛍光）と焦点深度の範囲２３Ｂよりも深い焦点スポット２３ｅから発する光（蛍光）のみがピンホール１９ｂを通過することができない。

図１の右側の図は、最大の直径をもつピンホール１９ｃについて示したものである。

この図においては、焦点深度の範囲２３Ｃは前記の焦点深度の範囲２３Ｂよりもさらに広がっており、そのため、試料上の焦点スポット２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ、２３ｅから射出された光（蛍光）は、全て集光レンズ１８により集光され、ピンホール１９ｃを通過し、光検出器２１ｃに入射することができる。

このピンホール１９ｃを通過した光により、画像２４ｃに示すような画像が形成される。この画像２４ｃは、焦点深度の範囲２３Ｃが最大であるため、画像の輝度は明るくなるが、セクショニング性能は悪い画像となる。

図２は、本発明の実施の形態の１例である、光分離部材を用いた共焦点顕微鏡システムの概要を図示したものである。光源１１から射出した光束は、照明用レンズ１２及び励起フィルタ１３を通り、ダイクロイックミラー１４にて反射され、ガルバノミラー１５に入射する。ガルバノミラー１５は、光束を走査光束に変え、走査光束は、対物レンズ１６によって、ステージ上の試料１０に集光され、試料１０上にスポットを形成する。

試料１０上のスポット形成領域からは、光（蛍光）が放出される。試料１０から放出された光（蛍光）は、対物レンズ１６を通り、ガルバノミラー１５へ入射する。ガルバノミラー１５は、入射した光（蛍光）を、走査光束と同じ角度で元の平行光束に戻し、光（蛍光）は、ダイクロイックミラー１４へ入射する。ダイクロイックミラー１４に入射した光（蛍光）は、光源１１からの光束と波長が違うので、ダイクロイックミラー１４を透過し、蛍光フィルタ１７を通り、集光レンズ１８によって集光され、光分離部材１９に入射する。

光分離部材１９には、直径の違うピンホール（図７の１９ａ、１９ｂ及び１９ｃ）を有しており、入射した光は、それぞれのピンホールに対応した光束に分離される。分離された光は、光検出器２１ａ、２１ｂ及び２１ｃにそれぞれ入射し、光検出器は、光電子変換を行い、その光の量（明るさ）に応じた、デジタルデータとして、焦点合致度測定器２５に送信する。

焦点合致度測定器２５は、そのデータを１画素のデータとして記録する。この記録をガルバノミラー１５の走査するタイミングと同期して並べることで、それぞれ直径の違うピンホール（図７の１９ａ、１９ｂ及び１９ｃ）から得られた画像（図１の２４ａ、２４ｂ、２４ｃ）として構築する。

１フレーム分の画像が構成された段階で、最小の直径のピンホール１９ａに対応する画像（図１の２４ａ）の全画素の平均値を計算し、それを焦点の合致度データとして、それぞれ直径の違うピンホール（図７の１９ａ、１９ｂ及び１９ｃ）から得られた画像（図１の２４ａ、２４ｂ、２４ｃ）とともにコンピュータ２２に送信する。

コンピュータ２２は得られた複数の直径の違うピンホール（図７の１９ａ、１９ｂ及び１９ｃ）画像（図１の２４ａ、２４ｂ、２４ｃ）から、観察するピンホールの直径に対応する画像を構築し、モニタに表示する。

さらに、コンピュータ２２は、前述の焦点の合致度データをモニタ上に表示する。そうすることで、観察する画像データが、ピンホールの直径が最小の直径のピンホール１９ａよりも大きいピンホール１９ｂ、１９ｃを通過した光（蛍光）により得られたものである場合でも、焦点の合致度データを参照することで、最小の直径のピンホール１９ａで得られる画像（図１の２４ａ）の焦点も十分に合致した位置にステージを調整することができるようになる。

また、最小の直径のピンホール１９ａを通過して得られる光（蛍光）は、画像２４ａとして構築した場合に、ほとんどが背景であり、従って、ほとんどの画素の輝度値はほぼ０に近い。そこで、背景かどうかを判断する閾値を焦点合致度測定器２５に設定し、その閾値以下の値は背景画素であるとして、焦点の合致度データを計算する際に無視するようにすることで、さらに焦点の合致度の変化量の精度を向上させることもできる。

図３は、Ｚステージの位置（試料１０を保持するステージの光軸方向の位置）と、そのときの画像の明るさの関係をグラフにて示したものである。このグラフは横軸にＺステージの位置を、縦軸に全画素の輝度の平均値を正規化したものをプロットしたものである。

１点鎖線２６ｃは、Ｚステージの位置と最大の直径を持つピンホール１９ｃで検出される画像の明るさの関係を示すグラフである。このグラフは、焦点深度の範囲（図１の２３Ｃ）に近づくと、値が上がり始め、焦点深度の範囲（図１の２３Ｃ）内にあれば、ほぼ焦点の合致した画像２４ｃを得ることができる。しかし、その焦点が合ったと判断できる範囲２８ｃは広く、どこが理想の焦点面２７であるかは不明である。さらに、Ｚステージの位置を焦点面より浅くした場合と、深くした場合において、その画像のボケ具合が違うため、焦点が合ったと判断できる範囲２８ｃの中心も理想の焦点面２７とはずれており、最小の直径を持つピンホール１９ａから得られた画像２４ａの焦点が合っているかどうかはわからない。

点線２６ｂは、Ｚステージの位置と中間の直径を持つピンホール１９ｂで検出される画像の明るさの関係を示すグラフである。この場合、焦点が合ったと判断できる範囲２８ｂは２８ｃよりは狭いが、どこが理想の焦点面２７かは不明であり、さらに、その焦点が合ったと判断できる範囲２８ｂの中心も理想の焦点面２７からはずれているため、最小の直径を持つピンホール１９ａの焦点が合っているかは不明である。

実線２６ｃは、Ｚステージの位置と最小の直径を持つピンホール１９ａで検出される画像の明るさの関係を示すグラフである。この場合、焦点が合ったと判断できる範囲２８ａは十分に狭く、ほぼ、理想の焦点面２７と合致している。

この図は、本発明において、最小の直径ではないピンホール１９ｂまたは１９ｃから得られる画像２４ｂまたは２４ｃを観察している状態で、実線２６ａの輝度データを利用して、その輝度データの平均値を示すことで、理想の焦点面２７にほぼ合致させることが可能であることを示している。

図２の例においては、焦点合致度測定器２５はコンピュータ２２の外にあるが、ソフトウェアとして作成し、コンピュータ２２の中の画像を構築し表示するソフトウェアに組み込んでもかまわない。

さらに、以上の実施の形態においては、光分離部材１９のように一体になった光学部材を用いているが、特にこれに限定するものではなく、直径の違うピンホールを２つ以上用意し、試料から得られる光（蛍光）を分離してそれぞれのピンホールに集光でき、ある直径のピンホールの画像を用いて焦点を合わせる際に、それよりも直径の小さいピンホールの画像データを焦点の合致度として計算して示す方法をとってもよいということは言うまでもない。このような、直径の違うピンホールの配置方法の例は、特許文献１に記載されている。

また、本実施形態の例においては、光分離部材１９により、３種類の異なる直径を持つピンホールに分離しているが、これに限るものではなく、３種類以上のまたは２種類の異なる直径をもつピンホールを用いて行うことを制限するものではない。

さらに、本実施形態においては、Ｚステージの位置を手動で動かしている例を示したが、焦点合致度測定器２５がＺステージコントロール機能を有し、その得られた焦点の合致度データを用いて、自動でＺステージを理想の焦点面に移動させるようにしてもかまわない。

また、前記の例においては、焦点合致度測定器２５における焦点の合致度データの計算に、輝度値の平均を使用しているが、この計算において、他のコントラストや明るさを示すことができる方法を用いてもよい。

以下に、コントラスト値の計算方法の例を示す。取得された画像データの１つの注目画素ｎとその近傍の画素について、図４の垂直方向コントラスト計算フィルタ３０を行列演算で掛け合わせる。その結果を注目画素の垂直方向コントラスト値Ｖｎとする。同様に、図４の水平方向コントラスト計算フィルタ３１を用いた結果Ｖｈを求める。

次に、Ｖｎ、Ｖｈそれぞれの二乗した値を足したものを、その注目画素ｎのコントラスト値Ｃｎとする。全ての画素において、コントラスト値Ｃｎを計算し、それを全て合計する。その結果をコントラスト値を計算した画素の数で割るとその画像のコントラスト値が算出される。

さらに、このコントラスト値を、画素データのとりうる最大値（デジタルデータが８ビットの場合は２５５になる）の二乗を二倍したもので割って、０から１までのデータとして正規化する。そうすることで、デジタルデータのビット数が違う場合にも対応できる。

上記例においては、垂直方向コントラスト計算フィルタ３０および水平方向コントラスト計算フィルタ３１を用いて計算しているが、それを用いずに、図５のようなラプラシアンフィルタ３２を用いてもよい。その際には、取得された画像データの１つの注目画素ｎとその近傍の画素についてラプラシアンフィルタ３２を行列演算で掛け合わせ、その結果を二乗したものをその注目画素ｎのエッジ値Ｅｎとし、正規化においては、画素データのとりうる最大値の二乗を四倍したもので割ることで対応できる。

このようにして、最小の直径のピンホールを通過して得られる光（蛍光）から形成される画像のコントラストを求め、それを、画像と共に表示するようにすれば、コントラストが最大となるＺステージ位置を合焦位置と判定することにより、最小でない直径のピンホールを通過して得られる光（蛍光）から形成される画像を観察しているときでも、合焦位置を正確に求めることができる。

本発明の実施の形態の１例である共焦点顕微鏡における、焦点深度とピンホールの直径について模式的に説明した図である。 本発明の実施の形態の１例である、光分離部材を用いた共焦点顕微鏡システムの概要を示す図である。 Ｚステージの位置と、そのときの画像の明るさの関係を示す図である。 垂直・水平コントラスト計算フィルタの例を示す図である。 ラプラシアンフィルタの例を示す図である。 従来の光分離部材を用いた共焦点顕微鏡システムの概要を示す図である。 光分離部材の例の概要を示す図である。

符号の説明

１０…試料、１１…光源、１２…照明用レンズ、１３…励起フィルタ、１４…ダイクロイックミラー、１５…ガルバノミラー、１６…対物レンズ、１７…蛍光フィルタ、１８…集光レンズ、１９…光分離部材、１９ａ，１９ｂ，１９ｃ…ピンホール、１９ｂ’，１９ｃ’…反射面、２０…可動シャッタ、２１ａ，２１ｂ，２１ｃ…光検出器、２２…コンピュータ、２３Ａ，２３Ｂ，２３Ｃ…焦点深度の範囲、２３ａ〜２３ｅ…焦点スポット、２３ａ’〜２３ｅ’…集光スポット、２４ａ，２４ｂ，２４ｃ…画像、２５…焦点合致度測定器、２６ａ，２６ｂ，２６ｃ…Ｚ位置と検出される明るさの関係のグラフ、２７…理想の焦点面、２８ａ，２８ｂ，２８ｃ…画像から焦点が合っていると判断される範囲、３０…垂直方向コントラスト計算フィルタ、３１…水平方向コントラスト計算フィルタ、３２…ラプラシアンフィルタ

Claims (4)

1. 照明光束を射出する光源と、
   前記照明光束を、試料上を走査する走査光束に変換する走査光学系と、
   前記走査光束を試料上に集光する光学系と、
   前記試料からの射出光束を集光する集光光学系と、
   前記集光光学系の瞳面近傍の所定位置に配置され、前記射出光束を少なくとも２つの光束に分離する光分離部材であって、それぞれ直径の異なる複数のピンホールが形成された反射手段を有し、各ピンホールの大きさに対応して、前記試料中の前記光学系による特定の焦点範囲からの光のみを透過させ、他の焦点範囲からの光は反射させることにより光を分離する光分離部材と、
   前記ピンホールを通過したそれぞれの光を検出する検出手段と、
   前記検出手段により検出されたそれぞれの光を、前記走査光学系に同期して画像化する画像構成装置とを備え、
   前記画像構成装置において、最小直径より大きな直径のピンホールを通過した光による画像を観測しながら焦点を合わせる際に、最小の直径のピンホールを通過した光による画像の焦点の合致度を計算して、その結果を表示する機能を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記焦点の合致度を計算する方法が、前記最小の直径のピンホールを通過した光による画像の全画素の輝度平均を計算し、その輝度平均を前記結果とする方法であることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記焦点の合致度を計算する方法が、前記最小の直径のピンホールを通過した光による画像の全画素のコントラストを計算し、その値を前記結果とする方法であることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記焦点の合致度を計算手段する際に、前記最小の直径のピンホールを通過した光による画像の輝度に閾値を設け、前記閾値以下の輝度を持つ画素を、計算の対象より除去することを特徴とする請求項２又は請求項３に記載の共焦点顕微鏡。

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