CN108594413A - 一种基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法与装置 - Google Patents

Abstract

根据本发明的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法与装置，装置包括分束镜、频率调制器、第一反射镜、第二反射镜，二分之一波片，偏振分光棱镜、二向色镜，二维振镜、聚焦物镜、第一透镜单元、针孔组件、探测器。分束镜、第一反射镜沿第一光轴线依次设置，分束镜、频率调制器、第二反射镜沿第二光轴线依次设置，第一反射镜、频率调制器、二分之一波片以及偏振分光棱镜沿第三光轴线依次设置，第二反射镜、偏振分光棱镜、二向色镜以及二维振镜第四光轴线依次设置，二维振镜、聚焦物镜沿第五光轴线依次设置，二向色镜，第一透镜单元、针孔组件以及探测器沿第六光轴线依次设置。

Description

一种基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法与装置

技术领域

本发明属于光学技术领域，具体涉及一种基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法与装置。

背景技术

光学成像由于具有非接触、非破坏性特点，被广泛应用于生命科学、材料科学等研究领域。而光学分辨率则是光学成像系统的一个重要指标，通常分辨率越高越好。光学分辨率包括横向分辨率和轴向分辨率，这两者之间会彼此限制。即横向分辨率越高、轴向分辨率越低；轴向分辨率越高，横向分辨率越低。因此，如何提高横向分辨率与轴向分辨率是研究人员持续努力的目标。如果能够同时实现高横向分辨率与高轴向分辨率则具有重要应用价值。

利用线偏振光的矢量特性在光学显微成像等领域中有重要的研究意义。例如，共焦显微镜系统是物象共轭的点对点成像，聚焦的激光束在样品表面扫描，同时光电检测器件接收样品反射的荧光(或透射的荧光)，样品结构的变化使激发的荧光强度改变，因而使光电检测器的输出电流改变，经过信号处理，同步显示在计算机屏幕上。由于照射的线偏振光通过高数值孔径的透镜聚焦，产生的是面积很小的椭圆光斑。如果沿椭圆光斑短轴方向对样品扫描，根据瑞利判据，共焦显微镜扫描步长为两倍椭圆短轴距离时，光电探测器即可响应反射光强度的改变，即分辨出两点的差异，系统分辨率很高。如果沿椭圆光斑长轴方向对样品扫描，且扫描步长小于两倍椭圆长轴距离时，根据瑞利判据，光电探测器将不能响应反射光强度的改变，无法分辨出两点的差异。因此系统的分辨率决定于聚焦光斑长轴大小。在先技术中,参见“K.A.Serrels，E.Ramsay，R.J.Warburton and D.T.Reid，Nanoscaleoptical microscopy in the vectorial focusing regime，nature photonics，vol.2，May2008,311-314”，为了提高分辨率，在扫描长轴方向时机械的插入二分之一波片改变入射线偏振光的偏振方向，但是这会降低系统改变扫描方向时的扫描速率及系统分辨精度，而且由于其中一束入射光多经过了一次二分之一波片，因此这两束正交偏振光的入射功率不同，从而使聚焦光束功率发生变化，会增加系统误差，系统稳定性不高。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法与装置，通过一种有效的光学结构，同时构建两束偏振方向正交的的线偏振光照明，并且利用双光束的频率调制来区分两束正交线偏振光聚焦后形成的椭圆光斑的重叠区域与其它非重叠区域，利用光电探测器接收信号的频率解调来提取两束正交线偏振光聚焦后形成的椭圆光斑的重叠区域对应的有效信号，实现提高三维分辨率的目的。

本发明提供了一种基于双光束频率调制的三维高分辨率成像装置，具有这样的特征，包括分束镜、频率调制器、第一反射镜、第二反射镜，二分之一波片，偏振分光棱镜、二向色镜，二维振镜、聚焦物镜、第一透镜单元、针孔组件、探测器，其中，分束镜、第一反射镜沿第一光轴线依次设置，分束镜、频率调制器、第二反射镜沿与第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置，第一反射镜、频率调制器、二分之一波片以及偏振分光棱镜沿与第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，第三光轴线与第二光轴线平行，第二反射镜、偏振分光棱镜、二向色镜以及二维振镜沿与第三光轴线垂直的第四光轴线依次设置，二维振镜、聚焦物镜沿与第四光轴线垂直的第五光轴线依次设置，二向色镜，第一透镜单元、针孔组件以及探测器沿与第四光轴线垂直的第六光轴线依次设置，第一透镜单元包括一个透镜或多个透镜的组合。

在本发明提供的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像装置中，其特征在于，还包括：其中，设置在第二光轴线上且位于频率调制器与第二反射镜之间的第二透镜单元，第二透镜单元包括一个透镜或多个透镜的组合。

本发明提供了一种基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法，利用上述的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像装置，其特征在于,包括以下步骤：

步骤1，将分束镜、第一反射镜沿第一光轴线依次设置；

步骤2，将分束镜、频率调制器、第二反射镜沿与第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置；

步骤3，将第一反射镜、频率调制器、二分之一波片以及偏振分光棱镜沿与第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，第三光轴线与第二光轴线平行；

步骤4，将第二反射镜、偏振分光棱镜、二向色镜以及二维振镜沿与第三光轴线垂直的第四光轴线依次设置；

步骤5，将二维振镜、聚焦物镜以及样品沿与第四光轴线垂直的第五光轴线依次设置；

步骤6，将二向色镜、第一透镜单元、针孔组件以及探测器与第四光轴线垂直的第六光轴线依次设置，其中，第一透镜单元面对二向色镜的反射面；

步骤7，一束沿第一光轴线方向进行入射的第一方向入射线偏振光经过分束镜后输出两束具有第一方向线偏振光的第一光束和第二光束；

步骤8，第一光束沿第二光轴线方向经过频率调制器施加载频f1后输出第一载频光束，第一载频光束经第二反射镜反射沿第四光轴线方向经过偏振分光棱镜透射、二向色镜透射后进入二维振镜沿第五光轴线经聚焦物镜聚焦后，在样品上得到横向的第一聚焦光斑，

第二光束沿第一光轴线方向经过第一反射镜反射后，沿第三光轴线方向经过频率调制器施加载频f2后输出第二载频光束，第二载频光束经过二分之一波片后输出第二方向线偏振光，第二方向线偏振光经过偏振分光棱镜反射后改变方向，第二方向线偏振光沿第四光轴线方向经二向色镜透射后进入二维振镜沿第五光轴线经聚焦物镜聚焦后，在样品上得到横向的第二聚焦光斑；

步骤9，样品上的第一聚焦光斑与第二聚焦光斑重叠，并激发样品产生荧光，形成与第一聚焦光斑与第二聚焦光斑对应的第一荧光光斑和第二荧光光斑；

步骤10，第一荧光光斑和第二荧光光斑经过聚焦物镜、二维振镜、二向色镜、聚焦透镜单元后，在针孔装置上形成一个重叠的荧光聚焦光斑，并被探测器接收；

步骤11，利用频率解调算法，提取出探测器接收的重叠的具有载频f1和f2的荧光聚焦光斑信号，并通过分析探测器上的荧光聚焦光斑的强度并随着二维振镜的扫描变化，可以区分出具有不同调制频率的焦点各自激发的荧光信号，从而重构出反映样品信息的二维图像。

在本发明提供的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法中，还可以具有这样的特征：其中，二向色镜与第四光轴线的夹角为45度。

另外，在本发明提供的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤9中，样品上的第一聚焦光斑与第二聚焦光斑重叠且为线偏振态正交。

另外，在本发明提供的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤2中，还包括设置在第二光轴线上且位于频率调制器与第二反射镜的用于提高轴向分辨率的第二透镜单元。

另外，在本发明提供的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法中，还可以具有这样的特征：其中，第二透镜单元包括一个透镜或多个透镜的组合，用于将第一载频光束的聚焦平面与第二载频光束的聚焦平面分开一定距离。

另外，在本发明提供的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤11中，利用频率解调算法，提取出探测器接收的重叠的具有载频f1和f2的荧光聚焦光斑信号，并通过分析探测器上的荧光聚焦光斑的强度并随着二维振镜的扫描变化，可以区分出具有不同调制频率的焦点各自激发的荧光信号，从而重构出反映样品信息的三维图像。

发明的作用与效果

根据本发明所涉及的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像装置，包括分束镜、频率调制器、第一反射镜、第二反射镜，二分之一波片，偏振分光棱镜、二向色镜，二维振镜、聚焦物镜、第一透镜单元、针孔组件以及探测器。

本发明利用双光束的频率调制来区分两束正交线偏振光聚焦后形成的椭圆光斑的重叠区域与其它非重叠区域，利用光电探测器接收信号的频率解调来提取两束正交线偏振光聚焦后形成的椭圆光斑的重叠区域对应的有效信号，从而实现提高三维分辨率的目的。

附图说明

图1是本发明的实施例中利用双光束线偏振光的矢量特性与频率调制来提高横向分辨率的原理示意图；

图2是本发明的实施例中利用双光束的频率调制来提高轴向分辨率的原理示意图；

图3是本发明的实施例中基于双光束频率调制的三维高分辨率激光共聚焦扫描成像示意图；以及

图4是本发明的实施例中扫描样品时提高分辨率的示意图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法与装置作具体阐述。

实施例一

如果光学系统采用线偏振相干光照明，对于高数值孔径光学系统，其聚焦平面上的聚焦光斑分布显著受照明光的偏振特性影响。如图1所示，如果采用y方向线偏振相干光照明，其聚焦平面上的聚焦光斑为椭圆形分布，且椭圆的短轴与线偏振光的方向(此时为y方向)垂直，即此时椭圆的短轴方向沿x方向。如果采用x方向线偏振相干光照明，则聚焦平面上的椭圆聚焦光斑的短轴方向沿y方向。光学系统横向分辨率决定于聚焦光斑的尺寸。显然，如果采用y方向线偏振相干光照明，则光学系统x方向具有更高的横向分辨率；如果采用x方向线偏振相干光照明，则光学系统y方向具有更高的横向分辨率。显然，如果能够同时利用y方向线偏振光和x方向线偏振光照明，根据叠加原理，则聚焦平面上的聚焦光斑分布为图1中右图所示，显然其阴影区域同时在x方向和y方向具有更小的尺寸部分，如果用阴影区域作为有效聚焦光斑，则能够在x方向和y方向显著提高横向分辨率。不过，此时图1中右图所示非阴影区域也会恶化横向分辨率。为了解决这个问题，我们将y方向线偏振相干光照明施加频率为f1的载频(称为照明光1z)，x方向线偏振相干光照明施加频率为f2的载频(称为照明光2z)，那么图1中右图所示阴影区域光斑的载频为f1+f2，其它非阴影区域的载频分别为f1和f2。这样载频为f1+f2的阴影区域光斑在样品上激发的荧光信号也存在载频f1+f2，通过频率解调算法，则可以提取出载频f1+f2的荧光信号。从而达到提高横向分辨率的目的。

正如在图1中，我们将y方向线偏振相干光照明施加频率为f1的载频(称为照明光1z)，x方向线偏振相干光照明施加频率为f2的载频(称为照明光2z)，同时在照明光1z中增加一个透镜，微调其聚焦平面，使照明光1z的聚焦平面与照明光2z的聚焦平面分开一定距离，则如图2所示，照明光1z的聚焦光斑(虚线区域)与照明光2z的聚焦光斑在轴向(z轴)方向分开一定距离，图中阴影区域光斑的载频为f1+f2，其它非阴影区域的载频分别为f1和f2。这样载频为f1+f2的阴影区域光斑在样品上激发的荧光信号也存在载频f1+f2，通过频率解调算法，则可以提取出载频f1+f2的荧光信号。从而达到提高轴向分辨率的目的。

如图3所示，图3所在的平面为yz面，x轴垂直于yz面。基于双光束频率调制的三维高分辨率成像装置包括分束镜1、频率调制器2、第二透镜单元3、第二反射镜4，第一反射镜5、二分之一波片6，偏振分光棱镜7、二向色镜8，二维振镜9、聚焦物镜10、第一透镜单元12、针孔组件13、探测器14。

分束镜1、第一反射镜5沿第一光轴线依次设置，分束镜1、频率调制器2、第二透镜单元3、第二反射镜4沿与第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置，第一反射镜5、频率调制器2、二分之一波片6以及偏振分光棱镜7沿与第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，第三光轴线与第二光轴线平行，第二反射镜4、偏振分光棱镜7、二向色镜8以及二维振镜9沿与第三光轴线垂直的第四光轴线依次设置，二维振镜9、聚焦物镜10、样品11沿与第四光轴线垂直的第五光轴线依次设置，二向色镜8，第一透镜单元12、针孔组件13以及探测器14沿与第四光轴线垂直的第六光轴线依次设置。

一束y方向的线偏振光经过分束镜1后分成光束I和光束Ⅱ两束偏振光。y方向线偏振光光束I经过频率调制器2后被施加了载频f1，经过第二透镜3、第二反射镜4反射，经过偏振分光棱镜7透射，经过二向色镜8、二维振镜9、聚焦物镜10后聚焦到样品11上。y方向线偏振光光束Ⅱ经过频率调制器2后被施加了载频f2，光束Ⅱ经过二分之一波片6后变为x方向线偏振光，经过偏振分光棱镜7反射，经过二向色镜8、二维振镜9、聚焦物镜10后聚焦到样品11上。二分之一波片6的作用是使光束Ⅱ的线偏振态相对于光束I的线偏振态方向旋转90°，因此光束I与光束Ⅱ经过偏振棱镜7后就相当于合成了一束光，该光束具有两个正交的线偏振态。光束I与光束Ⅱ均为线偏振光，光束I的线偏振态与光束Ⅱ的线偏振态正交，且光束I与光束Ⅱ是同时产生的，这两者的聚焦光斑同时聚焦的样品上。

根据光路传输的可逆原则，光束I与光束Ⅱ通过聚焦物镜10后在样品11上产生的具有不同调制频率的聚焦光斑激发样品11上的荧光，形成与聚焦光斑对应的荧光光斑，发出的荧光光斑经过聚焦物镜10、二维振镜9、二向色镜8、透镜12，在针孔组件13上形成一个荧光聚焦光斑，并被针孔组件13后面的探测器14接收。通过分析探测器14的光斑强度随着二维振镜9的扫描变化，同时利用频率解调算法，就可以区分出多个具有不同调制频率的焦点各自激发的荧光信号，从而重构出反映样品11信息的二维图像。

频率调制器2用于对光束I和光束Ⅱ分别施加不同的载频。频率调制器2可以是液晶斩波器、机械斩波器，或者其它能够给入射光束实时频率调制的方案。

第二透镜单元3可以为单透镜，也可以为透镜组，其作用是使光束I的聚焦面与光束Ⅱ的聚焦面在轴向分离一定的距离，在轴向形成类似图2的两个聚焦光斑。照明光1z的聚焦光斑(虚线区域)与照明光2z的聚焦光斑在轴向(z轴)方向分开一定距离，图中阴影区域光斑的载频为f1+f2，其它非阴影区域的载频分别为f1和f2。这样载频为f1+f2的阴影区域光斑在样品上激发的荧光信号也存在载频f1+f2，通过频率解调算法，则可以提取出载频f1+f2的荧光信号。从而达到提高轴向分辨率的目的。

二分之一波片6的作用是使光束Ⅱ的线偏振态方向旋转90°，从而使二分之一波片6的出射光束Ⅱ的线偏振态与光束I的线偏振态方向正交。

二向色镜8放在偏振分光棱镜7与二维振镜5之间，用于将返回的荧光信号反射至第一透镜单元12后在针孔组件13上形成一个荧光聚焦光斑，并被针孔组件13后面的探测器14接收。实施例中，二向色镜6与第四光轴线的夹角为45度。

二维振镜9由两个一维振镜通过机械方式固定为正交布置方式，一维振镜可以为检流计振镜或者共振振镜，如Cambridge Technology公司Galvanometer Optical Scanner6230H，与CRS 8kHz Resonant Scanner。

第一透镜单元12包括一个透镜或多个透镜的组合。

探测器14为光电探测器，包括点式光电探测器和阵列式光电探测器，如光电倍增管、雪崩二极管、电子倍增CCD等。

实施例中，第二透镜单元3、第一透镜单元12均为单透镜，频率调制器2采用液晶斩波器，二维振镜9中的两个一维振镜均采用共振振镜，探测器14采用光电倍增管。

通过合适选择透镜3的光学参数，透镜3可以使光束I的聚焦平面与光束Ⅱ的聚焦平面分开一定距离，在轴向(z轴方向)形成图2所示的聚焦光斑。由于带有载频f1的光束I是y方向线偏振，带有载频f2的光束Ⅱ是x方向线偏振，所以光束I与光束Ⅱ在样品11上聚焦成的横向聚焦光斑如图1右图所示。这样载频为f1+f2的阴影区域光斑在样品上激发的荧光信号也存在载频f1+f2，荧光信号经过聚焦物镜10、二维振镜9、二向色镜8反射，再通过透镜12、针孔组件13入射到探测器14上。通过频率解调算法，则可以提取出探测器14接收的载频f1+f2的荧光信号。因此，带有载频f1的y方向线偏振光束I与带有载频f2的x方向线偏振光束Ⅱ在样品11上的三维方向(横向与轴向)形成的有效聚焦光斑(载频为f1+f2的阴影区域光斑)显著小于未采用本发明专利时的聚焦光斑，从而能够显著提高三维分辨率(横向和轴向)。

通过分析探测器14的光斑强度随着二维振镜9的扫描变化，同时利用频率解调算法，就可以区分出多个具有不同调制频率的焦点各自激发的荧光信号，从而重构出如图4所示的反映样品信息的二维图像(假设扫描n行n列个点)。

一种基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法，包括以下步骤：

步骤1，将分束镜、第一反射镜沿第一光轴线依次设置；

步骤2，将分束镜、频率调制器、第二透镜单元、第二反射镜沿与第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置；

步骤3，将第一反射镜、频率调制器、二分之一波片以及偏振分光棱镜沿与第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，第三光轴线与第二光轴线平行；

步骤4，将第二反射镜、偏振分光棱镜、二向色镜以及二维振镜沿与第三光轴线垂直的第四光轴线依次设置；

步骤5，将二维振镜、聚焦物镜以及样品沿与第四光轴线垂直的第五光轴线依次设置；

步骤6，将二向色镜、第一透镜单元、针孔组件以及探测器与第四光轴线垂直的第六光轴线依次设置，其中，第一透镜单元面对二向色镜的反射面；

步骤7，一束沿第一光轴线方向进行入射的第一方向入射线偏振光经过分束镜后输出两束具有第一方向线偏振光的第一光束和第二光束；

步骤8，第一光束沿第二光轴线方向经过频率调制器施加载频f1后输出第一载频光束，第一载频光束经第二透镜单元聚焦后，经第二反射镜反射沿第四光轴线方向经过偏振分光棱镜透射、二向色镜透射后进入二维振镜沿第五光轴线经聚焦物镜聚焦后，在样品上得到轴向的第一聚焦光斑，

第二光束沿第一光轴线方向经过第一反射镜反射后，沿第三光轴线方向经过频率调制器施加载频f2后输出第二载频光束，第二载频光束经过二分之一波片后输出第二方向线偏振光，第二方向线偏振光经过偏振分光棱镜反射后改变方向，第二方向线偏振光沿第四光轴线方向经二向色镜透射后进入二维振镜沿第五光轴线经聚焦物镜聚焦后，在样品上得到横向的第二聚焦光斑；

步骤9，样品上的第一聚焦光斑与第二聚焦光斑重叠，并激发样品产生荧光，形成与第一聚焦光斑与第二聚焦光斑对应的第一荧光光斑和第二荧光光斑；

步骤10，第一荧光光斑和第二荧光光斑经过聚焦物镜、二维振镜、二向色镜、聚焦透镜单元后，在针孔装置上形成一个重叠的荧光聚焦光斑，并被探测器接收；

步骤11，利用频率解调算法，提取出探测器接收的重叠的具有载频f1和f2的荧光聚焦光斑信号，并通过分析探测器上的荧光聚焦光斑的强度并随着二维振镜的扫描变化，可以区分出具有不同调制频率的焦点各自激发的荧光信号，从而重构出反映样品信息的三维图像。

实施例的作用与效果

根据本实施例所涉及的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像装置，包括分束镜、频率调制器、第一反射镜、第二反射镜，二分之一波片，偏振分光棱镜、二向色镜，二维振镜、聚焦物镜、第一透镜单元、针孔组件以及探测器。

本发明利用双光束的频率调制来区分两束正交线偏振光聚焦后形成的椭圆光斑的重叠区域与其它非重叠区域，利用光电探测器接收信号的频率解调来提取两束正交线偏振光聚焦后形成的椭圆光斑的重叠区域对应的有效信号，从而实现提高二维分辨率的目的。

进一步地，实施例中还包括设置在第二光轴线上且位于频率调制器与第二反射镜的用于提高轴向分辨率的第二透镜单元。其作用是使光束I的聚焦面与光束Ⅱ的聚焦面在轴向分离一定的距离，在轴向形成两个聚焦光斑，提高轴向分辨率。从而实现提高三维分辨率的目的。

上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于双光束频率调制的三维高分辨率成像装置，其特征在于，包括：分束镜、频率调制器、第一反射镜、第二反射镜，二分之一波片，偏振分光棱镜、二向色镜，二维振镜、聚焦物镜、第一透镜单元、针孔组件、探测器，

其中，所述分束镜、所述第一反射镜沿第一光轴线依次设置，

所述分束镜、所述频率调制器、所述第二反射镜沿与所述第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置，

所述第一反射镜、所述频率调制器、所述二分之一波片以及所述偏振分光棱镜沿与所述第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，所述第三光轴线与所述第二光轴线平行，

所述第二反射镜、所述偏振分光棱镜、所述二向色镜以及所述二维振镜沿与所述第三光轴线垂直的第四光轴线依次设置，

所述二维振镜、所述聚焦物镜沿与所述第四光轴线垂直的第五光轴线依次设置，

所述二向色镜，所述第一透镜单元、所述针孔组件以及探测器沿与所述第四光轴线垂直的第六光轴线依次设置，

所述第一透镜单元包括一个透镜或多个透镜的组合。

2.根据权利要求1所述的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像装置，其特征在于，还包括：

其中，设置在所述第二光轴线上且位于所述频率调制器与第二反射镜之间的第二透镜单元，

所述第二透镜单元包括一个透镜或多个透镜的组合。

3.一种基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法，利用权利要求1所述的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像装置，其特征在于,包括以下步骤：

步骤1，将所述分束镜、所述第一反射镜沿第一光轴线依次设置；

步骤2，将所述分束镜、所述频率调制器、所述第二反射镜沿与所述第一光轴线垂直的第二光轴线依次设置；

步骤3，将所述第一反射镜、所述频率调制器、二分之一波片以及偏振分光棱镜沿与所述第一光轴线垂直的第三光轴线依次设置，所述第三光轴线与所述第二光轴线平行；

步骤4，将所述第二反射镜、所述偏振分光棱镜、所述二向色镜以及所述二维振镜沿与所述第三光轴线垂直的第四光轴线依次设置；

步骤5，将所述二维振镜、聚焦物镜以及样品沿与所述第四光轴线垂直的第五光轴线依次设置；

步骤6，将所述二向色镜、所述第一透镜单元、所述针孔组件以及探测器与所述第四光轴线垂直的第六光轴线依次设置，其中，所述第一透镜单元面对所述二向色镜的反射面；

步骤7，一束沿所述第一光轴线方向进行入射的第一方向入射线偏振光经过所述分束镜后输出两束具有第一方向线偏振光的第一光束和第二光束；

步骤8，所述第一光束沿所述第二光轴线方向经过所述频率调制器施加载频f1后输出第一载频光束，所述第一载频光束经所述第二反射镜反射沿所述第四光轴线方向经过所述偏振分光棱镜透射、所述二向色镜透射后进入所述二维振镜沿所述第五光轴线经所述聚焦物镜聚焦后，在所述样品上得到横向的第一聚焦光斑，

所述第二光束沿所述第一光轴线方向经过所述第一反射镜反射后，沿所述第三光轴线方向经过所述频率调制器施加载频f2后输出第二载频光束，所述第二载频光束经过所述二分之一波片后输出第二方向线偏振光，所述第二方向线偏振光经过所述偏振分光棱镜反射后改变方向，所述第二方向线偏振光沿所述第四光轴线方向经所述二向色镜透射后进入所述二维振镜沿所述第五光轴线经所述聚焦物镜聚焦后，在所述样品上得到横向的第二聚焦光斑；

步骤9，所述样品上的所述第一聚焦光斑与所述第二聚焦光斑重叠，并激发所述样品产生荧光，形成与所述第一聚焦光斑与所述第二聚焦光斑对应的第一荧光光斑和第二荧光光斑；

步骤10，所述第一荧光光斑和所述第二荧光光斑经过所述聚焦物镜、所述二维振镜、所述二向色镜、所述聚焦透镜单元后，在所述针孔装置上形成一个重叠的荧光聚焦光斑，并被所述探测器接收；

步骤11，利用频率解调算法，提取出所述探测器接收的重叠的具有载频f1和f2的所述荧光聚焦光斑信号，并通过分析所述探测器上的所述荧光聚焦光斑的强度并随着所述二维振镜的扫描变化，可以区分出具有不同调制频率的焦点各自激发的荧光信号，从而重构出反映样品信息的二维图像。

4.根据权利要求3所述的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法，其特征在于：

其中，所述二向色镜与所述所述第四光轴线的夹角为45度。

5.根据权利要求3所述的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法，其特征在于：

其中，所述步骤9中，所述样品上的所述第一聚焦光斑与所述第二聚焦光斑重叠且为线偏振态正交。

6.根据权利要求3所述的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法，其特征在于：

其中，所述步骤2中，还包括设置在所述第二光轴线上且位于所述频率调制器与所述第二反射镜的用于提高轴向分辨率的第二透镜单元。

7.根据权利要求6所述的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法，其特征在于：

其中，所述第二透镜单元包括一个透镜或多个透镜的组合，用于将所述第一载频光束的聚焦平面与所述第二载频光束的聚焦平面分开一定距离。

8.根据权利要求6或7所述的基于双光束频率调制的三维高分辨率成像方法，其特征在于：

其中，步骤11中，利用频率解调算法，提取出所述探测器接收的重叠的具有载频f1和f2的所述荧光聚焦光斑信号，并通过分析所述探测器上的所述荧光聚焦光斑的强度并随着所述二维振镜的扫描变化，可以区分出具有不同调制频率的焦点各自激发的荧光信号，从而重构出反映样品信息的三维图像。