CN111323399A - 多色荧光同步检测的液滴微流控芯片 - Google Patents

多色荧光同步检测的液滴微流控芯片 Download PDF

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陈艳
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Abstract

本发明提供了一种多色荧光同步检测的液滴微流控芯片，包括：芯片本体、激发光纤、检测光纤以及反光镜，芯片本体内设有激发光纤预留槽、检测光纤预留槽和检测流道，检测流道包括检测区域，反光镜靠近检测区域设置；激发光纤预留槽内插入的激发光纤与检测光纤预留槽内插入的检测光纤的一端汇聚于检测区域，激发光纤的另一端分支成多个分光纤，以分别连接散射光光源和至少一个激发光源，检测光纤的另一端连接检测模块；流经检测区域的液滴被激发光纤照射，液滴产生的光信号被反光镜反射并被检测光纤采集。所述芯片的空间光学体积小、集成度高，可对多种荧光真正实现同步检测。

Description

多色荧光同步检测的液滴微流控芯片
技术领域
本发明涉及生物医学应用仪器领域，尤其涉及一种多色荧光同步检测的液滴微流控芯片。
背景技术
数字PCR(Digital Polymerase Chain Reaction)技术是继一代普通PCR、二代荧光定量PCR之后的第三代PCR技术。其原理是将含有待测核酸分子的荧光定量PCR反应体系分散至数以万计的微体积单元，每个微体积不含或至多只包含1个待测核酸分子。每个微体积作为一个独立的反应单元，扩增完成后，逐个检测每个微体积单元的荧光信号，只有包含待测核酸分子的微体积单元才能产生荧光信号，有荧光信号判读为1，无荧光信号判读为0，根据信号计数的泊松分布计算出样本浓度。
数字PCR起步阶段通常使用CCD(电荷耦合器件)拍照的方式识别携带样品的液滴和空液滴，但其需要不断进行大面积的反复拍照。近年来通常采用空间光学方案，即使用物镜聚焦来激发液滴荧光，以检测荧光信号，可在短时间内实现大量液滴的统计，且不受拍照面积的限制。但空间光学的体积庞大、调焦复杂；此外，对无样品的空液滴还通常会添加另一种荧光染料作为阴性信号识别。当需要对多色荧光信号检测时，其激发系统通常使用时间复用光路，调光复杂，造成两种荧光信号无法实时检测。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种多色荧光同步检测的液滴微流控芯片，解决了传统的空间光学方案的光学空间自身体积庞大、调焦操控复杂的问题，其可以对多种荧光真正实现同步检测，也无需对空液滴添加荧光标记就可识别出空液滴。
本发明提供一种多色荧光同步检测的液滴微流控芯片，包括：芯片本体、激发光纤、检测光纤以及反光镜，所述芯片本体内设有激发光纤预留槽、检测光纤预留槽和检测流道，所述检测流道包括检测区域，所述反光镜靠近所述检测区域设置；所述激发光纤预留槽用于插入所述激发光纤，所述检测光纤预留槽用于插入所述检测光纤，所述激发光纤的一端和所述检测光纤的一端汇聚于所述检测区域，所述激发光纤的另一端分支成多个分光纤，用于分别连接散射光光源和至少一个激发光源，所述检测光纤的另一端连接检测模块；流经所述检测区域的液滴被所述激发光纤的光线照射，所述液滴产生的光信号被所述反光镜反射并被所述检测光纤采集，当所述液滴为空液滴时，所述光信号为散射光信号，当所述液滴为可产生荧光的液滴时，所述光信号为散射光信号和至少两种荧光信号的叠加信号。
其中，所述多色荧光为两种荧光信号；所述检测模块包括依次设置的准直镜、二向色镜，所述二向色镜用于将两种荧光信号分开；所述检测模块还包括依次设置在所述二向色镜的第一出光侧的第一滤光片和第一检测器，以及依次设置在所述二向色镜的第二出光侧的第二滤光片和第二检测器；其中，所述二向色镜还用于将所述散射光信号分至所述第一出光侧或所述第二出光侧。
其中，流经所述检测区域的液滴位于所述反光镜的焦点上，所述反光镜为弧面镜；所述反光镜与所述检测光纤位于同一水平面上，且所述反光镜与所述检测光纤均垂直于所述检测流道。
其中，所述芯片本体包括底层芯片以及层叠于所述底层芯片上的顶层芯片，所述底层芯片上设有第一缺口以及第二缺口，所述顶层芯片上设有与所述第一缺口适配的第一槽、与所述第二缺口适配的第二槽，及所述检测流道，所述底层芯片与所述顶层芯片对接时，所述第一缺口与所述第一槽形成收容所述激发光纤的所述激发光纤预留槽，所述第二缺口与所述第二槽形成收容所述检测光纤的所述检测光纤预留槽。
其中，所述激发光纤预留槽、所述检测光纤预留槽以及所述检测流道的中心轴位于同一水平面上。
其中，所述检测流道包括混合入口，所述顶层芯片上设有第一注入口、连通于所述第一注入口的调节相流道、第二注入口以及连通于所述第二注入口的液滴流道，所述液滴流道和所述调节相流道的一端均交汇于所述混合入口，在所述混合入口处所述调节相流道中的调节相间隔形成于所述液滴流道中的所述液滴之间以调节所述液滴之间的间距。
其中，所述激发光纤预留槽与所述检测光纤预留槽的深度不同。
其中，所述激发光纤的数值孔径、内径以及外径分别为0.1、62.5微米以及125微米。
其中，所述检测光纤的数值孔径、内径以及外径分别为0.38、200微米以及225微米。
其中，所述反光镜的材质包括低熔点金属合金。
本发明提供的液滴微流控芯片中集成有所述一分为多的激发光纤与所述检测光纤和反光镜，其空间光学体积小、集成度高，解决了传统的空间光学方案的光学空间自身体积庞大、调焦操控复杂的问题，进而解决了由于拍照面积的限制对样品浓度测定的准确性；所述液滴微流控芯片能同时检测空液滴的散射光信号，以及可产生荧光的液滴的散射光信号和荧光信号的叠加信号；更重要的是，其适用于单激发或多激发的多色荧光的激发和检测，真正实现多色荧光的同步检测，且不影响多信号响应。
附图说明
为更清楚地阐述本发明的技术方案和有益效果，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。
图1是本发明实施例提供的液滴微流控芯片的结构示意图。
图2是图1中与检测光纤连接的检测模块的结构示意图。
图3是图1中液滴微流控芯片的侧面结构示意图。
图4是图1中顶层芯片的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种液滴微流控芯片，用于液滴(特别是PCR液滴)的多色荧光同步检测。
如图1所示，液滴微流控芯片包括芯片本体1、激发光纤10、检测光纤20以及反光镜30，芯片本体1内设有激发光纤预留槽40、检测光纤预留槽50、检测流道60。其中，激发光纤预留槽40用于插入/容纳激发光纤10，检测光纤预留槽50用于插入/容纳检测光纤20，检测流道60是液滴的流动通道。在本发明一实施方式中，液滴可以包括PCR反应后的空液滴、可产生荧光(尤其是多色荧光)的样本液滴等。
检测流道60包括检测区域70，反光镜30设置在检测流道60外，并靠近检测区域70。激发光纤10的一端和检测光纤20的一端汇聚于检测区域70，激发光纤10的另一端分支为多个分光纤，用于分别连接散射光光源和至少一个激发光源，检测光纤20的另一端连接检测模块80。这里，激发光纤10为一分为多的光纤，这样其出射的光线就同步混合有散射光和荧光激发光，避免空间光学中耦合多种光源的困难，以便在检测区域70对液滴进行照射，产生可被检测模块80检测到的光信号。
流经检测区域70的液滴被激发光纤10的光线照射，液滴产生的光信号被反光镜30反射并被检测光纤20采集，当液滴为空液滴时，所述光信号为散射光信号，当液滴为可产生荧光的液滴时，所述光信号为散射光信号和至少两种荧光信号的叠加信号。具体地，流经检测区域70的液滴被激发光纤10的光线照射，当该液滴为无荧光的空液滴时，其产生的散射光信号经反光镜30反射，并被检测光纤20采集，并被传送至检测模块80；当该液滴为可产生荧光的样本液滴时，其产生的荧光信号和散射光信号的叠加信号被检测光纤20采集，并被传送至检测模块80。检测模块80对收到的所述光信号进行处理、统计，并区分出散射光信号，以及多色荧光信号中的各种。散射光信号的数目对应全部液滴的数目。
本发明提供的所述液滴微流控芯片中，集成有所述一分为多的激发光纤10与检测光纤20和反光镜30，其空间光学体积小、集成度高，解决了传统的空间光学方案的光学空间自身体积庞大、调焦操控复杂的问题，进而解决了由于拍照面积的限制对样品浓度测定的准确性；所述液滴微流控芯片能同时检测空液滴的散射光信号，以及可产生荧光的液滴的散射光信号和荧光信号的叠加信号；更重要的是，其适用于单激发或多激发的多色荧光的激发和检测，真正实现多色荧光的同步检测，且不影响多信号响应。
进一步地，下面以多色荧光为两种荧光信号时为例，来说明检测模块80的结构。如图2所示，检测模块80包括依次设置的准直镜81、二向色镜82，二向色镜82用于将两种荧光信号分开；检测模块80还包括依次设置在二向色镜82的第一出光侧的第一滤光片83和第一检测器84，以及依次设置在二向色镜的第二出光侧的第二滤光片85和第二检测器86；其中，二向色镜82还用于将所述散射光信号分至第一出光侧或第二出光侧(即散射光信号可以被第一检测器84检测到，或者被第二检测器86检测到)。
显然地，第一滤光片83和第二滤光片85允许通过的波长不同，以将两种荧光信号区分开来。基于检测模块80的存在，通过一次测量至少可得到被测目标物的两个波长的荧光信息，简化了检测过程和设备。而基于散射光信号与第一或第二荧光信号的强弱不同，二者仍可被同一出光侧的检测器区分开来，进而实现各液滴的计数统计，最终确定样品浓度。
更具体地以单激发的多色荧光的检测为例，激发光纤10连接有波长为510-530nm的散射光光源；以及488nm的荧光激发光源，其可激发带样本的液滴发射出波长介于510-530nm的第一荧光，和波长介于560-580nm的第二荧光。可产生荧光的液滴的所述光信号经过准直镜81后，光束被维持准直性，经过二向色镜81(透射截止波长为530nm)后，透射出560-580nm的第一荧光信号(落入第一滤光片83的带通波长范围)，反射出510-530nm的散射光和510-530nm的第二荧光信号(落入第二滤光片85的带通波长范围)，这样第一荧光信号可被放置在第一滤光片83后的第一检测器84检测到，第二荧光信号和散射光信号可被放置在第二滤光片85后的第二检测器86检测到。相应地，对于空液滴而言，其被检测光纤20采集到的光信号仅为散射光信号，被第二检测器86检测到。这样第一荧光信号和第二荧光信号可以分别在两个检测器上独立地作为阳性信号响应，而经过检测光纤20之后的510-530nm的散射光较弱，其作为第二检测器86上的阴性信号，保证了全部液滴的统计。
可选地，第一检测器84和第二检测器86为光电倍增管，可将接收到的相应光信号转换为电信号并放大，后续可在与其连接的上位机上区分出阴、阳信号。
当然，作为本发明的延伸，所述液滴微流控芯片的检测模块80也可实现三种以上荧光的同步检测，例如经二向色镜81分出了两组荧光，其中分至其第一出光侧的第一组荧光包括了两种荧光，分至其第一出光侧的第二组荧光包括了一种荧光，可在其第一出光侧后再放置第二个二向色镜，以将第一组荧光中的两种荧光再分开。
优选地，流经检测区域70的液滴位于反光镜30的焦点上，反光镜30为弧面镜。这样，经激发光纤10照射后的液滴的光信号就尽可能地被反光镜30所反射。其中，反光镜30与检测光纤20位于同一水平面上，且反光镜30与检测光纤20均垂直于检测流道60。这样经反光镜30反射后的所述液滴的光信号就能最大程度地被检测光纤20采集到，减少信号损失。
可选地，在靠近检测区域70处，激发光纤10与检测光纤20的夹角为45°。这样，激光光源可以尽可能地不被反光镜30反射而避免干扰荧光信号和散射光信号。
在本实施例中，激发光纤10的数值孔径(NA)为0.1，激发光纤10的内径以及外径分别为62.5微米以及125微米。其中，内径62.5微米可以满足光强的传输，NA选用0.1，将发射角度限制在很小的范围内，避免了激发的发散角过大而引起照射区域过大，进而避免了相邻液滴之间的信号串扰。
在本实施例中，检测光纤20的数值孔径(NA)为0.38，检测光纤20的内径以及外径分别200微米以及225微米。其中，内径200微米可以保证最大地收集液滴发出的荧光截面，提升荧光收集效率，NA 0.38尽可能实现被反射的散射光最大的发射角度收集。
请参阅图3，在本发明一实施方式中，芯片本体1包括底层芯片11以及层叠于底层芯片11上的顶层芯片12，底层芯片体11朝向顶层芯片12的表面上设有第一缺口111、第二缺口112及检测流道60，顶层芯片12朝向底层芯片11的表面上设有与第一缺口111适配的第一槽121以及与第二缺口112适配的第二槽122。当底层芯片11与顶层芯片12对接时，第一缺口111与第一槽121形成收容激发光纤10的激发光纤预留槽40，第二缺口112与第二槽122形成收容检测光纤20的检测光纤预留槽50。其中，底层芯片11以及顶层芯片12的对接方式包括但不限于采用真空氧等离子体进行键合封装。底层芯片11的材料包括但不限于玻璃，顶层芯片12的材料包括但不限于聚二甲基硅氧烷、玻璃等。
可选地，顶层芯片12上第一槽121背离检测区域70的进口端大于其靠近检测区域70的端口。相应地，底层芯片11上第一缺口111的形状与之相同。这样可便于激发光纤10从对接好的激发光纤预留槽40中插入。例如，顶层芯片12上第一槽121背离检测区域70的进口端呈单边燕尾形，第二槽122背离检测区域70的进口端呈双边燕尾形。
在本实施一实施方式中，激发光纤预留槽40与检测光纤预留槽50通过光刻方法形成。激发光纤预留槽40与检测光纤预留槽50的深度不同。这样，可满足不同外径的激发光纤10、检测光纤20的固定。
在本发明中，激发光纤预留槽40、检测光纤预留槽50以及检测流道60的中心轴(图3中的L1为其中心轴)位于同一平面上(图3中的L2为底层芯片11、顶层芯片12的分界线)。具体地，由于激发光纤预留槽40、检测光纤预留槽50以及检测流道60的中心轴位于同一平面上，进而激发光纤10的中心轴、检测光纤20的中心轴、以及检测流道60中的液滴的中心位于同一条平面上，进而激发光纤10的光线可以最大面积地照射到液滴上，检测光纤20可最大面积地收集所述液滴的光信号，进而提高了收光效率，提高了检测的灵敏性。
请参阅图4，检测流道60的一端具有混合入口601，顶层芯片12上设有第一注入口123、连通于第一注入口123的调节相流道124、第二注入口125以及连通于第二注入口125的液滴流道126，液滴流道126的一端和调节相流道124的一端均交汇于混合入口601，在混合入口601处调节相流道124中的调节相间隔形成于液滴流道126中的液滴之间以调节液滴之间的间距。具体地，第一注入口123用于将调节相从中注入调节相流道124(对于油包水型的液滴来说，调节相通常为油相)，第二注入口125用于将液滴从中注入液滴流道126。其中，第一注入口123、第二注入口125为贯通顶层芯片12的通孔，液滴流道123和调节相流道124设置在顶层芯片12朝向底层芯片11的表面上。液滴与调节相在混合入口601相遇，调节相间隔形成于液滴之间，进而液滴彼此有规律的间隔分开，避免了液滴过于紧密而导致液滴之间的散射光相互串扰、无法分辨，进而提高了计算结果的准确性。可选地，在混合入口601处，液滴流道126、调节相流道124与检测流道60同轴。
请继续参阅图4，顶层芯片12上还设有第三注入口128以及与第三注入口128连通的反光镜容置通道129。反光镜容置通道129垂直于检测流道60，第三注入口128用于形成反光镜的材料(如低熔点的金属合金)的注入，形成反光镜的材料从第三注入口128注入反光镜容置通道129，形成反光镜30。可选地，反光镜容置通道129朝向检测光纤20的端口呈弧形，进行形成具有弧面的反光镜30。最终的反光镜呈液态或固态，优选呈液态。
反光镜30的材质采用低熔点的金属合金(例如铟、铋、锡的合金，或者镓、铟、锡的合金)，实现了利用低熔点材料的流动性使得反光镜30的制作简单，成本低，避免了通常使用的磁控溅射镀膜和化学氧化还原沉积的方法制作所带来的制作复杂、成本高等问题。反光镜容置通道129可采用微纳加工技术制成，可在液滴微流控芯片中实现不同结构的反光镜30的制作，且可以实现微小光学元件的集成和复杂设计。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施方式而已，当然不能以此来限定本发明的权利范围，本领域普通技术人员可以在本发明揭露的技术范围内，轻易地想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种多色荧光同步检测的液滴微流控芯片，其特征在于，包括：芯片本体、激发光纤、检测光纤以及反光镜，所述芯片本体内设有激发光纤预留槽、检测光纤预留槽和检测流道，所述检测流道包括检测区域，所述反光镜靠近所述检测区域设置；所述激发光纤预留槽用于插入所述激发光纤，所述检测光纤预留槽用于插入所述检测光纤，所述激发光纤的一端和所述检测光纤的一端汇聚于所述检测区域，所述激发光纤的另一端分支成多个分光纤，用于分别连接散射光光源和至少一个激发光源，所述检测光纤的另一端连接检测模块；流经所述检测区域的液滴被所述激发光纤的光线照射，所述液滴产生的光信号被所述反光镜反射并被所述检测光纤采集，当所述液滴为空液滴时，所述光信号为散射光信号，当所述液滴为可产生荧光的液滴时，所述光信号为散射光信号和至少两种荧光信号的叠加信号。
2.根据权利要求1所述的液滴微流控芯片，其特征在于，所述多色荧光为两种荧光信号；
所述检测模块包括依次设置的准直镜、二向色镜，所述二向色镜用于将两种荧光信号分开；所述检测模块还包括依次设置在所述二向色镜的第一出光侧的第一滤光片和第一检测器，以及依次设置在所述二向色镜的第二出光侧的第二滤光片和第二检测器；其中，所述二向色镜还用于将所述散射光信号分至所述第一出光侧或所述第二出光侧。
3.根据权利要求1所述的液滴微流控芯片，其特征在于，流经所述检测区域的液滴位于所述反光镜的焦点上，所述反光镜为弧面镜；所述反光镜与所述检测光纤的中心轴位于同一水平面上，且所述反光镜与所述检测光纤均垂直于所述检测流道。
4.根据权利要求1所述的液滴微流控芯片，其特征在于，所述芯片本体包括底层芯片以及层叠于所述底层芯片上的顶层芯片，所述底层芯片上设有第一缺口以及第二缺口，所述顶层芯片上设有与所述第一缺口适配的第一槽、与所述第二缺口适配的第二槽，以及所述检测流道，所述底层芯片与所述顶层芯片对接时，所述第一缺口与所述第一槽形成收容所述激发光纤的所述激发光纤预留槽，所述第二缺口与所述第二槽形成收容所述检测光纤的所述检测光纤预留槽。
5.根据权利要求4所述的液滴微流控芯片，其特征在于，所述激发光纤预留槽、所述检测光纤预留槽以及所述检测流道的中心轴位于同一平面上。
6.根据权利要求4所述的液滴微流控芯片，其特征在于，所述检测流道包括混合入口，所述顶层芯片上设有第一注入口、连通于所述第一注入口的调节相流道、第二注入口以及连通于所述第二注入口的液滴流道，所述液滴流道和所述调节相流道的一端均交汇于所述混合入口，在所述混合入口处所述调节相流道中的调节相间隔形成于所述液滴流道中的所述液滴之间以调节所述液滴之间的间距。
7.根据权利要求5所述的液滴微流控芯片，其特征在于，所述激发光纤预留槽与所述检测光纤预留槽的深度不同。
8.根据权利要求1-7任一项所述的液滴微流控芯片，其特征在于，所述激发光纤的数值孔径、内径以及外径分别为0.1、62.5微米以及125微米。
9.根据权利要求1-7任一项所述的液滴微流控芯片，其特征在于，所述检测光纤的数值孔径、内径以及外径分别为0.38、200微米以及225微米。
10.根据权利要求1-7任一项所述的液滴微流控芯片，其特征在于，所述反光镜的材质包括低熔点的金属合金。
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