CN101611323A - 流式细胞术脉冲的区分和应用 - Google Patents

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Abstract

一种分析来自流式细胞仪的脉冲的方法。在所述流式细胞仪中，流体中的微粒经过电磁辐射的激发体积，并与该电磁辐射相互作用，以生成脉冲形式的信号。该方法包括：生成时间－依赖脉冲，其指示经过电磁辐射的激发体积的一个或多个微粒的特性；通过用高于预定值的起点和终点选择该脉冲的一部分来确定测量窗口；和计算该脉冲在测量窗口上关于时间的一阶导数。

Description

流式细胞术脉冲的区分和应用
相关申请的交叉引用
本申请依据35 USC§119(e)要求2006年9月29日提交的、序列号为60/848,200的美国临时专利申请的优先权，其公开内容通过引用全部纳入本说明书。
技术领域
本发明大体上涉及流式细胞术，具体涉及用于分析流式细胞仪所产生的脉冲的方法和设备。
背景技术
流式细胞仪系统被用来检测和计数微生物，并被用在整个生命科学——包括临床诊断和免疫学、蛋白质和核酸检测、血液学、和肿瘤学——的多种应用中。市售的仪器，从复杂的可以被配置为用于多种测量的实验室系统到性能较为有限的低成本台式系统都有。在当前的生物技术市场上，流式细胞仪的价格通常随其测量精度和其能够执行的不同测量的数目而升高。
流式细胞仪通常被用来识别和计数流体样本中具有特殊特性的微粒。如本说明书中所用，术语“微粒”指，例如，乳胶球、细菌、病毒、DNA片段、细胞、分子、或全血的成分。当被适当波长的光照射时，微粒可以直接散射激发光或发出荧光。在许多情形下，通过将探针分子(probe molecular)附着到整个微粒或附着到这些微粒内的显微结构上，将荧光发射属性优化以用于具体测量。
在典型的流式细胞仪中，含有微粒的样本流体流经聚焦光源照射微粒的激发体积处。在流经激发体积时，微粒将光散射到光束外并发出荧光。在许多情形下，通过将探针分子结合到微粒或结合到微粒内的结构上，增强荧光发射过程。通常，通过收集和分析微粒在经过激发体积时发出和散射的光脉冲，来识别和计数微粒。
根据激发体积内及周围的流体的组成，流式细胞仪可以被分为两大类。在鞘流式仪器(sheath flow instrument)中，激发体积区域内的流体具有两种组分：含有微粒的样本流体和不含微粒的鞘流体，其中鞘流体围绕样本流体并将其限制在流动轴附近的区域内。在毛细流式细胞仪(capillary flow cytometer)中，含有微粒的样本流体充满整个流动体积，而不存在鞘流体。
用于分析流式细胞仪所产生的脉冲的技术已经广为人知，并且，例如，在美国专利No.4,021,117和No.3,938,038中有描述，这两个文献的公开内容通过引用全部纳入本说明书。
发明内容
本发明提供了一种分析来自流式细胞仪的脉冲的方法。在所述流式细胞仪中，流体中的微粒经过电磁辐射的激发体积，并与该电磁辐射相互作用，以生成脉冲形式的信号。在该方法中，生成时间-依赖脉冲，其指示一个或多个经过电磁辐射的激发体积的微粒的特性。通过用高于预定值的起点和终点选择该脉冲的一部分，确定测量窗口。计算该脉冲在测量窗口上关于时间的一阶导数。
在一个实施方案中，使用该脉冲的一阶导数，计算经过激发体积的微粒的速率。继而，使用算出的微粒速率，修正该脉冲的测量值。
在另一个实施方案中，确定一阶导数在测量窗口内接近零值的次数(n)。继而，使用已确定的一阶导数接近零的次数(n)，区分脉冲。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种分析来自流式细胞仪的脉冲的方法，在所述流式细胞仪中，流体中的微粒经过部分由两个或更多电磁辐射束限定的两个或更多个激发体积，并与该两个或更多电磁辐射相互作用，以生成脉冲形式的信号。该方法包括：生成经过毛细管中的第一激发体积的第一微粒的第一时间-依赖脉冲；计算第一时间-依赖脉冲在测量窗口上的第一一阶导数；使用第一时间-依赖脉冲的第一一阶导数计算第一微粒的第一速率；生成经过毛细管中的第二激发体积的第二微粒的第二时间-依赖脉冲；计算第二时间-依赖脉冲在测量窗口上的第二一阶导数；使用第二时间-依赖脉冲的第二一阶导数计算第二微粒的第二速率；通过比较算出的第一和第二速率，将第一和第二时间-依赖脉冲相关联。
在一个方面，本发明提供了一种用于分析微粒的设备。该设备包含毛细管；光源；将电磁辐射从光源引导到毛细管以在毛细管中形成激发体积的光学系统；用于使流体中的微粒经过激发体积的装置，在所述激发体积中，微粒与电磁辐射相互作用以散射光和/或发出荧光；用于检测脉冲形式的荧光的装置；用于计算该荧光脉冲在测量窗口上关于时间的一阶导数的装置。
附图说明
通过阅读后文中与以下附图和所附权利要求相结合的详述，将更好地理解本发明的这些及多种其他特征和优点，在附图中：
图1A是图示了鞘流式细胞仪中的流动室的示意图；
图1B是图示了毛细流式细胞仪中的流动室的示意图；
图2是图示了流式细胞仪中的稳定的层流状况的示意图；
图3是图示了鞘流式细胞仪系统的示意图；
图4A是表示了第一微粒在第二微粒进入之前离开激发体积时产生的单峰脉冲的绘图；
图4B是表示了第一和第二微粒的一部分同时被照射时产生的双峰脉冲的绘图；
图4C是表示了第一和第二微粒的大部分同时被照射时产生的双峰脉冲的绘图；
图5是图示了脉冲形状和微粒尺寸之间关系的绘图；
图6是图示了脉冲形状和微粒速率之间关系的绘图；
图7是可以被用来实施本发明的方法的电子系统的框图；
图8是图示了单个微粒珠被照射时的时间-依赖信号及其一阶导数的绘图；
图9是图示了两微粒珠同时被照射时的时间-依赖信号及该时间-依赖信号的一阶导数的绘图；
图10是图示两微粒经过具有两个激发体积的毛细流动室的示意图；
图11A是被碘化丙啶(PI)染色的哺乳动物细胞以125μl/sec的平均体积流率经过毛细细胞仪而生成的未修正的面积数据的绘图；
图11B是被碘化丙啶(PI)染色的哺乳动物细胞以125μl/sec的平均体积流率经过毛细细胞仪而生成的未修正的宽度数据的绘图；
图12A是图11A的数据在根据本发明的一个实施方案的实时速率修正之后的修正数据的绘图；
图12B是图11B的数据在根据本发明的一个实施方案的实时速率修正之后的修正数据的绘图。
具体实施方式
下面参考附图描述本发明的多种实施方案。应注意，某些附图是示意性的，并且附图仅意在帮助描述本发明的具体实施方案。它们不意在作为本发明的完备描述，或作为对本发明范围的限制。
图1A-1B示意性地图示了可以用于实施本发明的方法的两种细胞仪系统的代表性流动室。在图1A所示的鞘流动室10中，鞘流体经由加压入口12进入室10，而含有微粒的样本流体经由加压喷嘴14(核心注射器)注入室10。在该室内壁和核心注射器14之间，形成有鞘流体体积16。在喷嘴尖端18和激发体积19之间的区域，室10的直径逐渐减小，以增大鞘流体的速率并减小样本流体的直径。举例说，激发体积19附近的样本流体的直径在5至50微米之间，而鞘流体的直径等于该室的直径。举例说，在该室含有激发体积的部位，该流动室的直径在50至75微米之间。
在图1B所示的毛细流动室20中，毛细管22提供了充满样本流体的基本恒定的横截面。激发区24中的样本流体的横截面尺寸显著大于鞘流动系统10中的样本流体激发区19的横截面尺寸，从而前者的流动速率相对较小。举例说，毛细流式细胞仪中的正方形流动室20的内边缘尺寸是100微米。在操作中，经由激发体积24，样本流体从样本贮藏器26中被抽出。
鞘流动室毛细流动室明显更为复杂和昂贵。鞘流动室具有几个与测量精度有关的优点。一个优点是，样本流体中的微粒以近似恒定的速率流经激发体积。在这两种细胞仪系统中，流动速率都被调节，以在含有激发体积的室的区域中创造平滑的层流，并使径向速率依赖关系近似于抛物线。在鞘流动室中，样本流体被限制在围绕室轴的狭窄区域，这样就有效地使微粒速率的改变最小化。相反，在毛细流动室中，在室壁附近行进的微粒的速率远小于在室中央附近行进的微粒的速率，如图2所示。举例说，在距正方形毛细细胞仪流动室的轴100微米的可测距离处行进的微粒的速率是在该轴附近行进的微粒的速率的33％。
鞘流动室使用小的、位于中央的激发体积。用具有固定输出能量的激光激发源，鞘流动室中的光强度显著大于其中激发体积充满整个室的毛细流式仪器中的光强度。此外，在鞘流动室中，室壁的散射和反射作用是微小的，并且其大小恒定。在毛细仪器中，壁效应可以是显著的，并且其大小随发射微粒相对于室轴的位置而变化。
由Hoboken市Wiley公司的H.M.Shapiro发表于2004年的“Practical Flow Cytometry”、授予Chupp的美国专利No.4,662,742、授予Recktenwald等人的美国专利No.4,745,285、和美国专利申请公开No.2002/0028434 A1中，描述了流式细胞仪，这些文献的公开内容通过引用全部纳入本说明书。
图3是可以被用来实施本发明的鞘流式细胞仪30的示意性表示。在这个系统中，激发束由光源32生成，光源32诸如：激光；激光驱动频率非线性转换器，诸如倍频器、三倍频器或四倍频器；光学参数振荡器；发光二极管(LED)；超辐射发光二极管；或弧光灯。
激发光学系统34将激发束36聚焦在流动室10中，以限定激发体积38。激发光学系统34在图3中被示为一简单的透镜，但也可以包括一个或多个组件，诸如衍射光学器件、反射光学器件和折射光学器件。一个可选的在激发波长具有高透射度的带通滤波器40可以被放置在激发光源32和激发体积38之间，以阻挡激发源32发出的、处于与激发波长不同波长的光。
被聚焦的激发光经由几个物理过程与流经激发体积38的微粒相互作用，这几个物理过程包括：荧光激发、吸收、小角度散射、和大角度散射。通过测量微粒被激发束照射时生成的光脉冲的波长、振幅、持续时间和形状，微粒可以被识别和计数。
被散射的激发光通常具有由散射微粒的尺寸和形状确定的角度分布，并且所述被散射的激发光集中在相对于激发束传播轴呈大角度(＞45度)和呈小角度(＜10度)的角度处。荧光通常以全立体角发出，并集中在相对于激发束传播方向呈大角度的角度处。
通过研究暗背景上的荧光和散射光脉冲，可以获得最大信噪比。在大角度散射和荧光测量中，通过在相对于激发束传播方向呈大角度的角度处集中光并使用光圈来阻挡非微粒光源，背景光水平被最小化。在前向散射测量中，通常通过阻挡激发束来最小化背景光水平。
返回图3，大角度集中光学系统42将荧光和散射光聚集成锥体，该锥体的轴与激发束传播轴正交。散射光经过二向色分光镜44A、44B，并被透镜或聚焦光学系统48聚焦在大角度散射检测器46的工作元件上。第一波长的荧光被第一二向色分光镜44A反射到第一荧光检测器50A，与第一波长不同的第二波长的荧光被第二二向色分光镜44B反射到第二荧光检测器50B。透镜或聚焦光学系统53A和53B被用来将第一和第二波长的荧光分别聚焦到荧光检测器50A和50B。一个或多个光学带通滤波器52A、52B、52C可以被放置在激发体积38和检测器46、50A、50B之间，以限制到达检测器的波长。
荧光一般由探针分子——诸如有机染色分子——发出，探针分子在特定微粒被引入到流内之前附着到特定微粒或特定微粒的具体结构上。探针分子通常是激发光的强力吸收剂，有效地将所吸收的光能转化为荧光辐射。荧光波长相对于激发光波长的红移(斯托克斯频移)使得可以用常规透射滤波器或光栅将荧光从激发光中分离出来。荧光光子通常在吸收来自激发束的光子后的几纳秒内被发射出来。与典型的流式细胞仪中微粒流经激发体积所需的时间相比，这个时延是短的。
在特定应用中，具有不同发射和/或激发谱的探针分子可以被结合到不同类型的样本微粒或单一类型样本微粒内的不同结构上。通过测量不同波长的荧光脉冲的振幅，可对单个微粒和/或由不同微粒或结构产生的区分信号同时测量。
处于相对于激发束传播轴呈小角度的散射光可以被前向散射成像系统54集中。光束阻挡器56可以被放置在激发体积38和前向散射成像系统54之间，以防止未散射的激发束到达前向散射成像系统54。绕过光束阻挡器56边沿的散射光被集中并聚焦在前向散射检测器58的工作元件上。带通滤波器60可以被插在激发体积38和前向散射检测器58之间，以透射激发波长下的光并阻挡处于其他波长的光。
散射激发光可以被用来区分不同的微粒类型。在相对于激发束传播轴呈小角度散射的光的量近似随微粒尺寸而改变，而大角度散射随微粒粒度而改变。通过测量小角度与大角度散射的比值，可以区分特定微粒种类。
由被照射的微粒生成的光脉冲根据发射角和波长被分离。根据发射角进行分离的实现方式是，通过将一些具有明确的集中孔径的透镜放置在相对于激发束传播方向呈不同角度的角度处。波长分离可以通过使脉冲穿过一系列介电带通和/或边沿滤波器来实现。
在集中和分色之后，通过光电倍增管或光电二极管，光脉冲被转化为模拟电脉冲。数据获取系统将该模拟信号转化为用于随后被数字信号处理器或计算机分析的数字数据。
到达检测器的光脉冲的形状和振幅由微粒的光学属性、微粒速率和微粒相对于集中光学系统的位置确定。微粒的光学属性除了由附着到这些微粒的任何探针的吸收和发射特性确定外，还由微粒的尺寸、形状、和透明度确定。对于荧光辐射具有高量子产率的强力吸收探针通常生成最大振幅的脉冲。
在操作中，当微粒被激发束照射时，至少有一个检测器接收光脉冲。微粒和激发束之间的每个相互作用被公知为一个“事件”。在理想情形下，可以从在事件期间生成的检测器脉冲明确地识别微粒。在特定样本中，例如，可通过测量小角度和大角度散射信号的相对量来计数和区分单核细胞、粒细胞和淋巴细胞。在其他样本中，通过测量在微粒经过激发体积时发出的荧光脉冲的形状，可以确定细胞核中的DNA的量。
除了流动室和关联的流控技术，毛细流式细胞仪在性质上与鞘流式仪器相似。样本流体在激发体积中被聚焦光源照射，样本微粒发出和散射的光脉冲被小角度和大角度光学系统——其根据波长分离光脉冲并将它们引导到检测器——集中。因为毛细细胞仪流动室固有的简单性，它们比鞘流式仪器更容易建造和校准。然而，毛细流式仪器中的激发体积的较大横截面限制了它们的测量准确度。
在鞘和毛细流式细胞仪中，都可以通过将检测器脉冲的形状与预定标准比较来计数微粒。在某些情形下，微粒可以在脉冲高度超过门限值时被计数。在其他情形下，脉冲高度和宽度或面积的绘图可以被用来识别和计数不同的微粒类型。在微粒识别过程中可能导致误差的因素包括：相对于平滑层流的偏移、微粒速率的空间差异、光学集中效率的空间差异、多个微粒的同时照射、或该样本的聚合体的形成。这些误差的量通常随激发体积的尺寸而增大，并且在鞘流式仪器中可以被最小化。
对于许多测量，毛细系统提供了足够的测量准确度，并提供了相对于鞘流式系统优越的以下几点：
1.降低的复杂度和成本。鞘流动室是复杂、昂贵且难以严格校准的。毛细流动室是较简单、较廉价且不易被误校准的。
2.样本流体经由毛细管被泵抽出，由此促进了对样本流体中微粒浓度的直接测量。在鞘流式细胞仪中，样本流体和鞘流体在压力下被注入流管，通常通过将含有浓度已知的微粒的样本流体引入该系统来间接测量微粒浓度。
3.无需使用鞘流体和关联的流控技术。对于特定的普通测量——其中测量准确度的降低是可接受的，毛细流式仪器的较简单的流控技术显著节省了成本。
根据Shapiro的(“Practical Flow Cytometry”，第4版，Wiley，Hoboken，2003)“细胞仪的测量精度的常规特征是：将来自‘近乎相同的微粒’的荧光或光散射强度测量值的分布进行累加，并计算差异系数(CV)，其被表达为百分数，是该测量的标准差除以算数均值或平均值所得商的100倍”。较小的CV伴随着提高的准确度。
在典型的测量中，当来自检测器的脉冲的振幅超过预定门限值时，计数增加。相同微粒产生的脉冲振幅的差异导致了测量的计数误差和不想要的CV增大。现有技术毛细细胞仪的CV通常超过鞘流式仪器的CV，因为毛细细胞仪具有较大的激发体积以及来自微粒的光辐射较为远离毛细管轴。
在细胞术中，单一、孤立的样本微粒的照射生成单个峰的检测器脉冲，其一般被称为“单峰脉冲”。两个分离的微粒的同时照射生成具有两个峰的检测器脉冲，其通常被称为“双峰脉冲”。在高微粒浓度下和在横截面直径显著大于微粒横截面的样本流中，两个微粒同时被照射的可能性是实际存在的。
图4A-4B是样本微粒浓度增大时出现的脉冲形状改变的示意性表示。在低浓度，几乎所有事件都对应于单一微粒的照射。增大微粒浓度或毛细流管的横截面面积，就增大了观察到双峰脉冲形态的概率。在图4A中，每个微粒生成一个单峰脉冲，因为在第二微粒进入激发体积之前，第一微粒已经离开了激发体积。在图4B中，当第一微粒的一小部分仍被照射时，第二微粒就进入了激发体积。在这种情形下，检测器输出在这两个脉冲之间不回到零，但是在最大和最小脉冲值之间有显著的差。在图4C中，第一和第二微粒在几乎相同的时刻经过激发体积，最大和最小脉冲振幅之间的差很小。
在特定样本中，细胞、细胞片段和其他残骸可以聚在一起形成聚合体。这些聚合体的尺度通常与所研究的微粒的尺度不同。在鞘流式细胞仪——其中微粒以近似相同的速率经过激发体积——中，脉冲宽度与微粒尺寸强相关，如图5所示。这样，使用如Wersto等人在Cytometry 46：296-306(2001)中描述的脉冲和面积/宽度技术，双峰脉冲和聚合脉冲可以被识别并从分析中排除，该文献的公开内容通过引用全部纳入本说明书以用作一般信息。然而，这种类型的分析不能在常规毛细流式细胞仪中执行，因为脉冲宽度也与微粒速率强相关，如图6所示。在这样的系统中，由流的径向差异和微粒速率导致的脉冲形状差异有效地掩盖了单微粒和聚合体或双微粒的脉冲形状差别。
在某些实施方案中，样本中微粒的浓度可以被调节，以使照射到两个以上的微粒的概率很微小，以及使很少检测到双峰脉冲。在某些情况下，特定生物样本中形成聚合体是难以避免的。
在某些实施方案中，通过将微粒聚集在毛细管轴附近的小区域中，可以提高毛细流式系统的准确度。在这种情形下，毛细流式细胞仪的表现可以近似于鞘流式仪器。例如，授予Goix的美国专利No.6,710,871 B1描述了一种毛细流式细胞仪系统，其中磁场被用来迫使带磁荷的微粒流动在毛细管的被限制的横截面区域内。Kaduchak等人的标题为“Ultrasonic analyte concentration and applicationin flow cytometry”的美国专利申请公开No.2006/0021437描述了用于聚集毛细管轴附近的微粒的超声技术。美国专利No.6,710,871 B1和美国专利申请公开No.2006/0021437通过引用全部纳入本说明书。
在某些实施方案中，使用数值技术，实时地计算样本微粒流经流式细胞仪中的激发体积时所产生的脉冲的导数。当细胞仪在典型的微粒浓度范围和体积流率下运作时，可以从这些导数算出微粒速率，并将其用于修正各脉冲形状以使它们非常近似于一致的速率流中的脉冲形状。算出的速率也可以被用来在单微粒流经具有多个激发体积的毛细仪器时唯一地识别单微粒产生的脉冲。在某些实施方案中，算出的脉冲导数中的过零点的数目可以被用来区分双峰脉冲和单峰脉冲。
在一个具体实施方案中，本发明提供了一种分析来自流式细胞仪的脉冲的方法。在所述流式细胞仪中，流体中的微粒经过电磁辐射的激发体积，并与该电磁辐射相互作用，以生成脉冲形式的信号。时间-依赖脉冲——其指示一个或多个经过电磁辐射的激发体积的微粒的特性——被生成。通过用高于预定值的起点和终点选择脉冲的一部分，确定测量窗口。计算该脉冲在测量窗口上关于时间的一阶导数。
图7是可以被用来计算来自流式细胞仪中检测器的信号的导数的电子系统70的框图。所述流式细胞仪可以是毛细流式细胞仪。该图中的功能性方框利用电子和数字信号处理领域公知的技术和组件。
参考图7，光脉冲被检测器72接收，生成电信号——其被可编程增益放大器放大并被模拟输出总线74传输到模数转换器(ADC)76。模拟总线74也可以运送来自其他放大检测器78、压力感应器、或其他传感器的信号。举例说，模拟总线74可以将四个或五个已放大的信号运送到ADC 76。
ADC 76可以，例如，以40kHz的采样频率、16比特的分辨率将信号数字化。来自ADC 76的被交织(interleave)的数字数据可以被存储在微计算机78的存储器中。举例说，所述微处理器可以是Eden 1GHz处理器，其具有512兆字节的随机存取存储器。FIFO缓冲器80和直接存储器存取模块(DMA)82可以被用来有效地将该数据传输处理与微计算机78同时执行的其他处理复合。
来自计算机存储器(未示出)的数字数据——其可以包括用于另一个仪器组件84的操作参数以及用于前向散射检测器可编程放大器及其他可编程放大器的检测器电压设置和增益设置——在DIO总线控制器92的控制下通过DIO总线90被从计算机存储器传输到解码板86和数字输入/输出(DIO)缓冲器88。用于其他组件的放大器设置和数字控制设置被从DIO缓冲器88发送到各仪器组件。从被DIO总线90传输到解码板模块86的数据生成模拟控制信号。
被交织的ADC数据被微计算机78从存储器中读出，并被去交织到缓冲器中——每个被测量参数对应一个缓冲器。举例说，来自检测器72的数据可以被存储在单一的、被去交织的缓冲器中。替换性地，来自其他检测器的数据可以被存储在其他存储器中。
上采样滤波器通常被应用于该去交织数据。合适的滤波器包括现有信号处理技术中公知的8x和16x上采样低通滤波器。这样的滤波器提供了改进的采样内插值，改进了对峰值的估计，拒绝了一些高频噪声。
为了算出脉冲的导数，可以通过确定那些脉冲强度与峰强度的比值等于一预定值的点来限定测量窗口。继而，为这个窗口中的每个数据点计算导数。
可以借助于一些在存在——一般由流式细胞仪检测器生成的——噪声信号的情况下既快速又稳定的任意现有数值技术，利用微处理器78执行导数的计算。例如，可以使用Savitsky-Golay方法计算导数，该方法如Abraham Savitsky和Marcel J.E.Golay于1964年在Analytical Chemistry第36卷1627-1639页发表的“Smoothing andDifferentiation of Databy Simplified Least Squares Procedures”所述，该文献的公开内容通过引用全部纳入本说明书。这个方法在导数缓冲器中针对每个数据点有序地执行局部多项式回归，并使用多项式拟合来估计原始信号的一阶导数。这将(通过回归进行的)数据平滑与导数估计滤波器结合起来。
例如，9点Savitsky-Golay滤波器(n＝9)与二次多项式(k＝2)结合使用。通过依次将一些有序的9数据点组乘以下列系数{86，-142，-193，-126，0，126，193，142，-86}，计算与具体数据点的导数成比例的值。第一计算使用数据点1-9，第二计算使用数据点2-10，第三计算使用数据点3-11，等等，直到预定计算窗口内的所有数据点的缩放的导数值被算出。输入数据点从去交织输入缓冲器中获取，该导数计算的结果存储在导数输出缓冲器中。
图8图示了一脉冲形状和一根据本发明的一个实施方案计算的导数脉冲形状。在图8中，时间-依赖信号和该时间-依赖信号的一阶导数是由可从Guava Technologies，Inc.，Hayward，California获取的毛细流式细胞仪的前向散射信道产生的。T1和T2是检测器信号与预设门限水平交叉的起点和终点。脉冲宽度由T1和T2之差限定。Z1是一阶导数过零点。它与脉冲信号极大值重合。
Savitsky-Golay滤波器是用于从数字数据组计算一阶导数的大量合适的数值方法之一。在替换性的实施方案中，可以使用替换性的、具有合适的速度、准确度和稳定性的数值技术来近似得出导数。
在某些实施方案中，从例如由一些脉冲的1/4强度点限定的测量窗口内的导数数据，可以算出微粒速率。测量窗口中的导数的最大和最小值被识别，微粒速率从下面的等式估计出：
V = α · k P
其中V等于微粒速率，α是导数的最大值α＝max[Abs(导数)]，Abs是绝对值函数，k是缩放因子——其取决于激发激光束的形状，P是脉冲高度。对于高斯激光束 k = e · BW 4 , 其中BW是该束的宽度的1/e2。以上适用于比BW小的微粒。有时，噪声或其他作用调制了脉冲形状，有利的是，从导数最大值和最小值的平均来计算α。在一个优选实施方案中，α从下面的公式算出： α = Abs ( max ) - Abs ( min ) 2 . 然而，也有许多其他计算α的方法。
用于脉冲和面积/宽度计算的基于导数的速率修正
流式细胞仪经常被用于DNA细胞周期分析。在这种测量中，通过用DNA专用染料给样本细胞染色并使它们经过流式细胞仪的激发体积，处于细胞周期的G1、S和G2+M阶段的样本细胞的相关片断被确定。给定微粒的核中DNA的尺寸和量取决于该微粒的细胞周期阶段，因此，不同阶段的微粒产生的脉冲具有不同的形状。使用如Wersto等人于2001年在Cytometry第46卷296-306页发表的“DoubletDiscrimination in DNA Cell-Cycle Analysis”所述的公知技术，可以根据脉冲的振幅、面积和宽度来分析脉冲，该文献的公开内容通过引用全部纳入本说明书。用于脉冲形状分析的替换性技术在美国专利No.4,021,117和No.3,938,038中有描述，这两个文献的公开内容通过引用全部纳入本说明书。现有的用于鞘流式细胞仪中脉冲形状分析的电子和数值信号处理技术将被统称为“脉冲和面积/宽度技术”。
当样本含有非零浓度的具有额外DNA材料的聚合微粒时，细胞周期测量的准确度降低。在鞘流式细胞仪中，使用脉冲和面积/宽度技术，聚合脉冲可以被识别。这些技术建立在这样的事实上：聚合体的尺寸和DNA量通常与处于各种细胞周期的单细胞的尺寸和DNA量不同。
在鞘流式细胞仪系统中，面积和宽度的测量可以直接从各脉冲做出，因为细胞以恒定速率经过激光束。在毛细流式细胞仪中，微粒速率随距毛细管轴的径向距离而改变。在典型的毛细系统中，例如，最远处的微粒的速率可能是在毛细管轴附近行进的微粒的速率的三分之一，各脉冲的面积和宽度严重依赖于微粒距流管轴的径向距离。
使用本发明的速率测量方法，可以从脉冲的导数算出微粒的速率，微粒形状可以相应地经过速率修正。一旦已经执行速率修正，则可以使用常规脉冲和面积/宽度技术来分析脉冲。在鞘流式仪器中，与速率修正脉冲分析关联的误差与在未修正脉冲分析中获得的误差相当。
速率修正可以简单地通过将给定脉冲的宽度和面积值乘以算出的微粒速率来完成。例如，通过测量计算窗口的时间宽度(输入脉冲的1/4最大值点之间的时间)来确定未修正脉冲宽度，面积通过对计算窗口上的未修正强度数据进行积分来确定。对这两类值的速率修正通过将未修正数据乘以算出的速率来做出。
基于导数的双峰脉冲区分
由于典型的毛细流式细胞仪中的流管具有相对较大的横截面积，一次同时照射一个以上的样本微粒的概率经常是非零的。图8是由孤立的单微粒生成的检测器信号及该检测信号的一阶导数的绘图。图9是两个微粒的同时照射生成的检测器信号及该检测器信号的一阶导数的绘图。
图8和图9中表示的信号由可从GuavaTechnologies，Inc.，California获取的毛细流式细胞仪的前向散射检测器产生。含有Guava
Figure G2007800434333D00141
珠的样本被激发。Guava
Figure G2007800434333D00142
珠是浓缩的、具有已知浓度的荧光珠悬浮液。在使用中，这样的珠可以被稀释，以产生具有已知浓度的珠悬浮液。单峰脉冲和双峰脉冲的持续时间是信号与预设门限交叉的时刻T1和T2之差。导数信号在每个极大值和极小值处过零——对于单峰脉冲是一次、对于双峰脉冲是三次。导数过零点在图8中被标注为Z1，在图9中被标注为Z1、Z2和Z3。在两个以上微粒被同时照射的罕见事件下，导数信号被期待过零(2n-1)次，其中n是被同时照射的微粒的数目。
通过使用本发明的技术计算输入信号的导数，并确定该导数接近等于零的次数，可以区分双峰脉冲和单峰脉冲。单峰脉冲具有一个零点，双峰脉冲具有三个。
替换性地，可以通过计算每个脉冲的最大导数值和宽度来区分双峰脉冲和单峰脉冲。对于给定微粒尺寸，单峰脉冲的上升沿的最大导数和单峰脉冲的宽度以如下方式随速率缩放：这两个参数的比值近似独立于微粒速率。然而，在双峰脉冲的情形下，上升沿导数随速率变化的方式与单峰脉冲情形相同，但脉冲宽度超过了单峰脉冲情形，超过量与两个微粒在流动方向上的距离成正比。因此，可以通过计算脉冲宽度与最大导数的比值来识别双峰脉冲和单峰脉冲。单峰脉冲对应于比预定的双峰脉冲门限值小的脉冲宽度-导数比值。根据本发明的实时导数计算可以被用来计算上升沿导数的最大值，而脉冲宽度-导数比值可以被用来区分双峰脉冲和单峰脉冲。
多源流式细胞仪中基于速率的微粒跟踪
在特定测量中，需要用两个或更多激发波长照射样本微粒。这通常通过以下方式实现：将来自不同激光的输出束聚焦在沿流动方向的不同点，以使为每个激光创建分离的激发体积。来自每个体积的光脉冲根据波长和角度被不同的光学系统集中和分离。
在测量两个或更多激发体积中的单个微粒的情形下，需要将在每个激发体积中发出的脉冲与产生这些脉冲的单微粒关联。在所有微粒以近似相同的速率行进的鞘流式仪器中，可以通过设置对应于不同激发体积之间的通行时间的时间门来实现这种关联。例如，上游体积中的微粒生成的脉冲的上升沿可用于在时间上以以下方式控制下游激发体积中的数据收集：识别和记录由触发微粒生成的脉冲。然而，这种逼近可能不能被用在微粒速率与距毛细管轴的距离强烈关联的常规毛细流式细胞仪中。在最好的情形下，微粒在激发体积之间行进所需的时间是可变的，而在最坏的情形下，两个微粒经过激发体积的顺序在微粒向下游行进时被反转。
图10是两个微粒经过具有两个激发体积的毛细流动室的示意性图示。微粒1号以第一速率行进在毛细管壁附近，微粒2号以充分大于第一速率的第二速率行进在轴附近。在该图示中，微粒1号在微粒2号之前经过第一激发体积，但在它们流动在激发体积之间时，更快地移动的微粒2号追上并超过了微粒1号。结果是，微粒2号在微粒1号之前经过第二激发体积(以及所有其他下游激发体积)。一种简单的、被经过第一激发体积的微粒产生的脉冲的上升沿触发的电子时间门可能会错过第二激发体积中的脉冲的一段，在脉冲在第二体积中被记录的情形下，不可能确定该脉冲是否是由触发该门的相同微粒产生的。
本发明可以被用来计算微粒在流经第一激发体积时的速率，和该微粒从第一激发体积到达下游激发体积所需的时间。使用速率数据，微粒在经过下游激发体积时产生的脉冲可以被关联到第一体积中的脉冲。因为触发脉冲和时间门之间的间隔从触发微粒的速率准确地计算而来，所以错过脉冲或不准确地将下游激发体积中的脉冲与触发脉冲关联的概率非常低。
因为微粒的速率在微粒流经激发体积时近似恒定，所以，通过对所有区域产生的脉冲执行速率计算，也可以识别特定微粒产生的脉冲。假如第一激发体积中的脉冲的上升沿触发了第二激发体积中的测量窗口——该窗口足够宽以包括第一和第二激发体积之间的所有可能的通行时间，则该窗口期间产生的具有近似相等的导数值(速率)的脉冲可以被认为是由同一个微粒生成的。
实施例1
这个实施例阐明了根据本发明的面积和宽度数据的速率修正。图11A-11B图示了来自可从Guava Technologies获取的毛细细胞仪的未修正面积和宽度数据。这个数据通过使被核DNA染色剂碘化丙啶(PI)染色的哺乳动物细胞以125μl/sec的平均体积流率经过该仪器来产生。
碘化丙啶(PI)在细胞周期分析中被用作核DNA染色剂，以区分处于细胞周期不同阶段的细胞。静止细胞(G0/G1)含有每条染色体的两个副本。当细胞周期开始时，细胞合成染色体DNA(S阶段)。来自DNA嵌入染料PI的荧光强度增大，直到所有染色体DNA都加倍(G2/M阶段)。在这个状态下，G2/M细胞的荧光强度是G0/G1群体的二倍。G2/M细胞最终分裂成两个细胞。
对于在细胞周期不同阶段中尺寸相同的微粒，图11B中的宽度数据应被尖锐地峰化，图11A中的面积数据应具有显示不同阶段中DNA内容的定性形式。然而，因为微粒以不同的速率经过激发体积，所以图11B中的未修正的宽度柱状图形成宽阔的峰，而图11A中的未修正面积柱状图的形状不是显示不同阶段DNA内容的定性形式。
图12A-12B示出了图11A-11B在根据本发明的实时速率修正之后的修正数据。图12B中的速率修正宽度数据的柱状图是狭窄的、定义明确的峰，而图12A中的速率修正面积的柱状图定性地显示了周期阶段。图12A-12B的速率修正数据可以随后使用Wersto等人的技术来分析，以消除双峰脉冲和聚合脉冲。
对流式细胞术领域技术人员显而易见的是，根据本发明的导数和微粒速率的实时计算可以被用于本公开所详述应用以外的应用。此外，显而易见，可以使用不偏离本发明精神的多种数值技术来计算导数。例如，可以通过使用对应于更高次的多项式拟合的Savitsky-Golay滤波器，和/或每次计算使用更多数据点，如Abraham Savitsky和Marcel J.E.Golay于1964年在Analytical Chemistry 36卷1627-1639页发表的“Smoothing and Differentiation of Data bySimplified Least Squares Procedures”所述，来实施本发明。
数字数据处理或流式细胞术领域技术人员应认识到，本发明也可以使用与图7所示不同的电子组件来实施。特别地，脉冲导数的计算可以由专用数字信号处理电路来执行，该电路被微处理器或其他控制单元控制。数字电子和信号处理领域公知的多种组件组合可以被用来将模拟信号转换为数字信号并计算该数字信号的导数。使用适当的线缆，多种电子组件可以被置入或连接到流式细胞术仪器。例如，图7所示的ADC/CIO卡和微处理器功能可以被置入两个分离的电子底盘(chassis)，这两个电子底盘彼此物理分离并与毛细流式细胞仪物理分离。

Claims (23)

1.一种分析来自流式细胞仪的脉冲的方法，在所述流式细胞仪中，流体中的微粒经过电磁辐射的激发体积，并与该电磁辐射相互作用，以生成脉冲形式的信号，该方法包含下列步骤：
生成时间-依赖脉冲，其指示一个或多个经过电磁辐射的激发体积的微粒的特性；
通过用高于预定值的起点和终点选择该脉冲的一部分来确定测量窗口；和
计算该脉冲在测量窗口上关于时间的一阶导数。
2.权利要求1的方法，其中时间-依赖脉冲是从一个或多个微粒经过激发体积时与电磁辐射相互作用的光散射生成的。
3.权利要求1的方法，其中时间-依赖脉冲是从一个或多个微粒经过激发体积时与电磁辐射相互作用的荧光生成的。
4.权利要求1的方法，其中时间-依赖脉冲是通过使微粒经过毛细流式细胞仪中的激发体积而生成的。
5.权利要求1的方法，其中测量窗口的确定是通过该脉冲部分的起点或终点的振幅与该脉冲峰处的振幅的一比值来确定的。
6.权利要求1的方法，其还包含，识别该脉冲中一阶导数接近零值的点，其表示了该脉冲中的峰。
7.权利要求1的方法，其还包含，识别一阶导数的最大值，计算所识别的最大值与脉冲部分的宽度的比值，并使用算出的比值区分单峰脉冲和双峰脉冲。
8.权利要求1的方法，其还包含，识别测量窗口内一阶导数接近零值的点的数目，该数目指示同时与激发辐射相互作用的微粒的数目。
9.权利要求1的方法，其还包含，使用一阶导数从下列等式计算经过激发体积的微粒的速率：
V = α · k P
其中V等于微粒的速率，α是导数的最大值α＝max[Abs(导数)]，Abs是绝对值函数，P是脉冲高度，k是缩放因子。
10.权利要求9的方法，其中k通过下式算出：
k = e · BW 4
其中BW是电磁辐射宽度的1/e2。
11.一种分析来自毛细流式细胞仪的脉冲的方法，在所述毛细流式细胞仪中，流体中的微粒经过电磁辐射束的激发体积，并与该电磁辐射相互作用，以生成脉冲形式的信号，该方法包含下列步骤：
生成时间-依赖脉冲，其指示一个经过毛细流式细胞仪中的激发体积的微粒的特性；
通过用高于预定值的起点和终点选择该脉冲的一部分来确定测量窗口；
测量该脉冲部分的值，包括该脉冲部分的宽度、高度或面积；
计算该脉冲振幅在测量窗口上关于时间的一阶导数；
使用算出的一阶导数来计算经过激发体积的微粒的速率；和
使用算出的微粒速率来修正该脉冲部分的测量值。
12.权利要求11的方法，其中速率从下列等式算出：
V = α · k P
其中V等于微粒的速率，α是导数的最大值α＝max[Abs(导数)]，Abs是绝对值函数，P是脉冲高度，k是缩放因子。
13.权利要求12的方法，其中k通过下式算出：
k = e · BW 4
其中BW是电磁辐射宽度的1/e2。
14.权利要求12的方法，其中测量值的修正通过将测量值乘以已修正的微粒速率来做出。
15.一种分析来自毛细流式细胞仪的脉冲的方法，在所述毛细流式细胞仪中，流体中的微粒经过部分由电磁辐射束限定的毛细管中的激发体积，并与该电磁辐射相互作用，以生成脉冲形式的信号，该方法包含下列步骤：
生成时间-依赖脉冲，其指示一个或多个经过毛细管中的激发体积的微粒的特性；
通过用高于预定值的起点和终点选择该脉冲的一部分来确定测量窗口；
计算该脉冲在测量窗口上关于时间的一阶导数；
确定该一阶导数在测量窗口内接近零值的次数(n)；和
使用所确定的次数(n)来区分脉冲，其中，当n为1时是单峰脉冲，当n为3时是双峰脉冲，当n为5时是三峰脉冲。
16.权利要求15的方法，其中时间-依赖脉冲是从一个或多个微粒经过毛细管中的激发体积时与电磁辐射相互作用的光散射生成的。
17.权利要求15的方法，其中时间-依赖脉冲是从一个或多个微粒经过毛细管中的激发体积时与电磁辐射相互作用的荧光生成的。
18.一种分析来自毛细流式细胞仪的脉冲的方法，在所述毛细流式细胞仪中，流体中的微粒经过部分由两个或更多电磁辐射束限定的两个或更多激发体积，并与该两个或更多电磁辐射相互作用，以生成脉冲形式的信号，该方法包含下列步骤：
生成经过毛细管中的第一激发体积的第一微粒的第一时间-依赖脉冲；
计算第一时间-依赖脉冲在测量窗口上的一阶导数；
使用第一时间-依赖脉冲的第一一阶导数计算第一微粒的第一速率；
生成经过毛细管中的第二激发体积的第二微粒的第二时间-依赖脉冲；
计算第二时间-依赖脉冲在测量窗口上的一阶导数；
使用第二时间-依赖脉冲的第二一阶导数计算第二微粒的第二速率；和
通过比较算出的第一和第二速率，将第一和第二时间-依赖脉冲相关联。
19.权利要求18的方法，其中第一和第二时间-依赖脉冲是从第一和第二微粒经过第一和第二激发体积时与第一和第二电磁辐射相互作用的光散射生成的。
20.权利要求18的方法，其中第一和第二时间-依赖脉冲是从第一和第二微粒经过第一和第二激发体积时与第一和第二电磁辐射相互作用的荧光生成的。
21.一种用于分析微粒的设备，其包含：
毛细管；
光源；
光学系统，其将电磁辐射从光源引导到毛细管，以在毛细管中形成激发体积；
用于使流体中的微粒经过激发体积的装置，在所述激发体积中这些微粒与电磁辐射相互作用，以散射光和/或发出荧光。
用于检测脉冲形式的荧光的装置；和
用于计算该荧光脉冲在测量窗口上关于时间的一阶导数的装置。
22.权利要求21的设备，其还包含，用于检测脉冲形式的散射光的装置，和用于计算该散射光脉冲在测量窗口上关于时间的一阶导数的装置。
23.权利要求21的设备，其还包含，用于使用算出的一阶导数来计算微粒速率的装置。
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