JPH0792077A

JPH0792077A - 粒子解析装置

Info

Publication number: JPH0792077A
Application number: JP5261574A
Authority: JP
Inventors: Yasuyuki Numajiri; 泰幸沼尻
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1993-09-24
Filing date: 1993-09-24
Publication date: 1995-04-07

Abstract

(57)【要約】【目的】血球細胞浮遊液に複数のレーザー光を照射
し、退色の影響を受けずに精度よく多項目の粒子的性質
の測定を行う。【構成】フローセル１を流れる被検粒子Ｓに第３のビ
ーム発生光源１３から光ビームを照射し、発生する蛍光
を第３及び第４の光検出器１８、２０により検出し、被
検粒子Ｓの同定を行う。この同定結果に基づいて、第１
の光検出器７による検出の必要がある場合は、この検出
位置よりも下流の位置で、第１の光ビーム発生光源３か
らの光ビームB1をパルス状に照射し、発生する蛍光を第
１の光検出器７により検出する。また、第１の検出位置
より更に下流の位置で、第２の光ビーム発生光源８から
の光ビームB2を照射し、発生する蛍光を第２の光検出器
１２により検出する。これらの測定結果を制御部２１及
び信号処理部２３により解析し、被検粒子Ｓの多項目の
粒子的性質の測定を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、例えばフローサイトメ
ータのように、サンプル中の個々の被検粒子に光ビーム
を照射し、光学的測定法により被検粒子の解析を行う粒
子解析装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】フローサイトメータは高速で流れる細胞
浮遊液等のサンプル液に例えばレーザー光を照射し、そ
の散乱光や蛍光による光電信号を検出し、細胞の性質や
構造を解明する装置であり、細胞化学、免疫学、血液
学、腫瘍学、遺伝学等の分野で使用されている。

【０００３】フローサイトメータに用いられる従来の粒
子解析装置では、フローセルの中央部の例えば２００μ
ｍ×２００μｍの微小な四角形断面を有する流通部内
に、シース液に包まれて血球細胞等の被検粒子を通過さ
せ、この被検粒子にレーザー光等の光ビームを照射し、
被検粒子から発生する前方及び側方散乱光を検出するこ
とにより、被検粒子の形状、大きさ、屈折率等の粒子的
性質を求めることができる。また、蛍光剤により染色可
能な被検粒子に対しては、照射光とほぼ直角方向の側方
散乱光から被検粒子の蛍光を検出することにより、被検
粒子を解析するための重要な情報を求めることができ
る。

【０００４】更に、被検粒子から一度に多くの情報を得
るために、複数のレーザー光源を用い、血球細胞上の複
数の種類の抗原やＤＮＡを、複数の蛍光をマーカーとし
て検出する粒子解析装置も使われている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら上述の従
来の粒子解析装置では、蛍光剤の励起波長は通常は１０
０ｎｍ程度の幅を有するため、３個以上の異なる波長の
レーザー光を照射して解析を行う場合には、相互の励起
波長差が十分大きくとれない。また、２種以上のレーザ
ー光で励起をする際に既に蛍光剤の退色が生じており、
本来得られるべき量の蛍光の検出ができず精度の良い解
析が行えない。

【０００６】本発明の目的は、励起波長の異なる複数の
蛍光剤を用い、波長が異なる複数のレーザー光を照射し
て、被検粒子について多項目の測定をする際に、退色の
影響を受けずに精度の良い測定ができる粒子解析装置を
提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上述の目的を達成するた
めの本発明に係る粒子解析装置は、分離されて１個ずつ
順次に流れる被検粒子の通過を検出し同定を行う同定手
段と、被検粒子の通過を検出する位置よりも下流の位置
で被検粒子に光ビームを照射する第１の光ビーム発生手
段と、前記同定手段の結果に基づいて前記第１の光ビー
ム発生手段を制御する制御手段と、前記第１の光ビーム
の照射により被検粒子から発生する光を検出する第１の
光検出手段と、前記第１の光ビームを照射する位置より
も更に下流の位置で被検粒子に第２の光ビームを照射す
る第２の光ビーム発生手段と、前記第２の光ビームの照
射により被検粒子から発生する光を検出する第２の光検
出手段と、前記同定手段の結果と前記第１及び第２の光
検出手段から発生する信号に基づいて被検粒子の解析を
行う信号処理手段とを有することを特徴とする。

【０００８】

【作用】上述の構成を有する粒子解析装置は、分離され
て１個ずつ順次に流れる被検粒子の通過を検出して同定
を行い、この結果に基づいて、被検粒子の通過を検出す
る位置より下流の位置で第１の光ビームを照射し、発生
する蛍光を第１の光検出手段により検出し、また前記第
１の光検出位置よりも更に下流の位置で第２の光ビーム
による第２の光検出手段により同様の検出を行い、これ
らの検出信号に基づいて信号処理手段において被検粒子
の解析を行う。

【０００９】

【実施例】本発明を図示の実施例に基づいて詳細に説明
する。図１は本実施例の構成図であり、フローセル１の
中心にはフロー部２が形成され、被検粒子Ｓは上から下
にシースフロー方式によってシース液に包まれて流れて
いる。

【００１０】フローセル１の側方には、パルス状の第１
の光ビームB1を発生する第１の光ビーム発生光源３が配
置され、この第１の光ビーム発生光源３とフローセル１
を結ぶ光路O1には結像レンズ４が設けられ、フローセル
１に対する光路O1の後方側には、光路O2上に集光レンズ
５、バンドパスフィルタ６、第１の光検出器７が順次に
配置され、第１の光検出系が構成されている。なお、図
では便宜上、光路O1の延長線上に光路O2があるように描
かれているが、実際には光路O2は光路O1とフローセル１
に対してほぼ直角な方向に設定されている。

【００１１】また、第１の光ビーム発生光源３の下方に
は、第２の光ビームB2を発生する第２の光ビーム発生光
源８が配置され、この第２の光ビーム発生光源８とフロ
ーセル１を結ぶ光路O3には結像レンズ９が設けられ、フ
ローセル１に対する光路O3の後方側には、光路O2と平行
な光路O4が設けられ、その光路O4上に集光レンズ１０、
バンドパスフィルタ１１、第２の光検出器１２が順次に
配置され、第２の光検出系が構成されている。

【００１２】更に、光ビーム発生光源３の上方には、第
３の光ビームB3を発生する第３の光ビーム発生光源１３
が配置され、この第３の光ビーム発生源１３とフローセ
ル１を結ぶ光路O5上には結像レンズ１４が設けられてい
る。フローセル１に対する光路O5の後方側には、光路02
と平行な光路O6上に集光レンズ１５、ダイクロイックミ
ラー１６、バンドパスフィルタ１７、第３の光検出器１
８が配置されている。また、ダイクロイックミラー１６
の反射方向にはバンドパスフィルタ１９、第４の光検出
器２０が配置されている。この第３の光ビーム発生光源
１３から第３の光検出器１８、第４の光検出器２０まで
が、被検粒子Ｓの通過を検出するための第３の光検出系
を構成している。

【００１３】また、第３の光検出器１８及び第４の光検
出器２０の出力は制御部２１に接続され、この制御部２
１の出力はドライバ２２を介して第１の光ビーム発生光
源３に接続されている。更に、制御部２１の出力と第１
の光検出器７、第２の光検出器１２の出力は信号処理部
２３に接続されている。被検粒子Ｓの通過を検出する第
３の光検出系とこの制御部２１とにより、被検粒子Ｓの
通過を検出し同定を行う同定手段を構成している。

【００１４】例えば、被検粒子Ｓとしての試料には人間
の末梢血単核細胞を用い、ＦＩＴＣ(Fluorescein Isoth
iocyanate)標識のＣＤ４抗体、ＰＥ(Phycoerythrin) 標
識のＣＤ８抗体、テキサスレッド標識のＬｅｕ−８抗
体、ＡＰＣ(Allophycocyanin)標識のＣＤ１１ｂ抗体を
反応させる。ＦＩＴＣとＰＥは波長４８８ｎｍのアルゴ
ンイオンレーザーに励起され、それぞれ５２０ｎｍと５
７８ｎｍにピークを持つ蛍光を発生する。テキサスレッ
ドは波長５９６ｎｍ付近のダイレーザーに励起されて波
長６２０ｎｍピークの蛍光を発生し、ＡＰＣは波長６３
３ｎｍのヘリウムネオンレーザーに励起されて波長６６
０ｎｍピークの蛍光を発生する。

【００１５】また、ＣＤ４抗体はヘルパＴ細胞及びイン
デューサＴ細胞と反応し、ＣＤ８抗体はサプレッサＴ細
胞及び細胞傷害性Ｔ細胞と反応する。Ｌｅｕ−８抗体は
Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、顆粒球と反応し、特にＣＤ４抗
体と反応するＴ細胞の内、インデューサＴ細胞とは反応
するが、ヘルパＴ細胞とは反応しない。そして、ＣＤ１
１ｂ抗体はＴ細胞、ＮＫ細胞、好中球、好酸球、単球と
反応し、特にＣＤ８抗体と反応するＴ細胞の内、サプレ
ッサＴ細胞とは反応するが、細胞傷害性Ｔ細胞とは反応
しない。

【００１６】第１の光ビーム発生光源３としては波長５
９６ｎｍのパルス時間１０μＳのダイレーザーを用い、
第２の光ビーム発生光源８としては波長６３３ｎｍのヘ
リウムネオンレーザーを用い、第３の光ビーム発生光源
１３としては波長４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザー
を用いている。

【００１７】第３の光ビーム発生光源１３から発生する
第３の光ビームB3は、結像レンズ４でフローセル１の中
心に集光される。このフローセル１のフロー部２を流れ
る被検粒子ＳがＣＤ４抗原を持っている場合には、その
標識としてのＦＩＴＣが励起され、波長５２０ｎｍの蛍
光が発生する。一方、被検粒子ＳがＣＤ８抗原を持って
いる場合には、その標識としてのＰＥが励起され波長５
７８ｎｍの蛍光が発生する。

【００１８】これらの蛍光は集光レンズ５で集光され、
波長５２０ｎｍの光を反射して波長５７８ｎｍの光を透
過するダイクロイックミラー１６を介し、波長５７８ｎ
ｍの蛍光はバンドパスフィルタ１７を通過して第３の光
検出器１８に入射し、一方、波長５２０ｎｍの蛍光はバ
ンドパスフィルタ１９を通過して第４の光検出器２０に
入射する。バンドパスフィルタ１７、１９はそれぞれ、
波長５７８ｎｍ、波長５２０ｎｍ以外の外光を、第３の
光検出器１８、第４の光検出器２０に入射させないため
のものである。

【００１９】第１の光ビーム発生光源３である波長５９
６ｎｍでパルス時間１０μＳのダイレーザーから発生す
る第１の光ビームB1は、結像レンズ４でフローセル１の
中心に集光される。被検粒子ＳがＬｅｕ−８抗原を持っ
ている場合には、その標識としてのテキサスレッドが励
起され、波長６２０ｎｍの蛍光が発生する。この蛍光は
集光レンズ５で集光され、バンドパスフィルタ６を通過
して第１の光検出器７に入射する。バンドパスフィルタ
６は波長６２０ｎｍ以外の外光を第１の光検出器７に入
射させないためのものである。

【００２０】同様に、第２の光ビーム発生光源８である
波長６３３ｎｍのヘリウムネオンレーザーから発生する
第２の光ビームB2は、結像レンズ９でフローセル１の中
心に集光され、被検粒子ＳがＣＤ１１ｂ抗原を持ってい
る場合には、その標識としてのＡＰＣが励起されて波長
６６０ｎｍの蛍光が発生し、この蛍光は集光レンズ１０
で集光され、バンドパスフィルタ１１を通過して第２の
光検出器１２に入射する。バンドパスフィルタ１１は波
長６６０ｎｍ以外の外光を、第２の光検出器１２に入射
させないためのものである。

【００２１】第３の光検出器１８に入射したＰＥからの
蛍光、又は第４の光検出器２０に入射したＦＩＴＣから
の蛍光は、電気信号に変換され制御部２１に送られる。
制御部２１は、被検粒子Ｓからの蛍光が大きなレベルの
電気信号を出力した場合にのみ、その電気信号を信号処
理部２３に送る。

【００２２】例えば、被検粒子ＳがＣＤ４抗原を持って
いる場合、即ちＦＩＴＣからの蛍光が第４の光検出器２
０に入射して大きなレベルの電気信号が発生する場合に
は、制御部２１は被検粒子Ｓが第１の光ビームB1の照射
位置に到達する所定の遅延時間後に、ドライバ２２にト
リガ信号を送るという制御を行い、信号処理部２３では
同じ所定の遅延時間後に第１の光検出器７からの電気信
号を取り込む動作を行う。そして、ドライバ２２がトリ
ガ信号を受けると、第１の光ビーム発生光源３であるダ
イレーザーから、パルス時間１０μＳ、波長５９６ｎｍ
の第１の光ビームB1が出射される。

【００２３】また、制御部２１は被検粒子ＳがＣＤ８抗
原を持っている場合、即ちＰＥからの蛍光が第３の光検
出器１８に入射して大きなレベルの電気信号が発生する
場合にはその電気信号を信号処理部２３に送り、信号処
理部２３では被検粒子Ｓが第２の光ビームB2の照射位置
に到達する所定の遅延時間後に第２の光検出器１２から
の電気信号を取り込む動作を行う。

【００２４】第１の光検出器７又は第２の光検出器１２
で検出された電気信号は、信号処理部２３に送られＡ／
Ｄ変換されて被検粒子Ｓの解析に用いられる。また、制
御部２１から信号処理部２３に送られた電気信号も、Ａ
／Ｄ変換されて被検粒子Ｓの解析に用いられる。免疫検
査ではヘルパＴ細胞、サプレッサＴ細胞の数の比率が重
要であるが、本実施例ではＦＩＴＣからの蛍光がありテ
キサスレッドからの蛍光が無い被検粒子ＳはヘルパＴ細
胞と判断され、ＰＥからの蛍光がありＡＰＣからの蛍光
もある被検粒子ＳはサプレッサＴ細胞と判断される。

【００２５】通常、ＡＰＣは第１の光ビーム発生光源３
である波長５９６ｎｍ付近のダイレーザーでも或る程度
の励起を受けるが、本実施例の方法によればこのダイレ
ーザーからの照射を受けることはないので退色は起こら
ず、第２の光ビーム発生光源８である波長６３３ｎｍの
ヘリウムネオンレーザーにより励起されて発生する蛍光
を正確に検出することができる。なお、第３の光ビーム
発生光源１３である波長４８８ｎｍのアルゴンイオンレ
ーザーによるテキサスレッド及びＡＰＣの励起は極く僅
かしか起こらないので、これによる退色は殆ど問題とな
らない。

【００２６】本実施例では、第３の光ビーム発生光源１
３、第３及び第４の光検出器１８及び２０、制御部２１
等が被検粒子Ｓから発生する蛍光の波長を検出して被検
粒子Ｓの同定を行う同定手段を構成しているが、被検粒
子Ｓをその大きさにより同定する場合には、一般に知ら
れている散乱光を検出する方法や、被検粒子Ｓが細孔を
通過する時の電気抵抗を検出する方法等を用いることも
できる。

【００２７】また、本実施例では第１の光検出手段によ
り検出を必要とする場合に、被検粒子が第１の光ビーム
の照射位置に達した時に第１のビームB1をパルス状に発
生しているが、逆に第１の光検出手段により検出を必要
としない場合に第１の光ビームB1の発生を中止するよう
にしてもよい。

【００２８】

【発明の効果】以上説明したように本発明に係る粒子解
析装置においては、被検粒子の同定の結果に基づいて、
下流位置での光ビームの照射の有無を制御することによ
り、励起波長の異なる複数の蛍光剤を用い、３個以上の
異なる波長のレーザー光を照射する場合でも、退色の影
響を受けずに多項目の測定を精度良く行うことができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例の構成図である。

【符号の説明】

１フローセル２フロー部３、８、１３光ビーム発生光源７、１２、１８、２０光検出器２１制御部２２ドライバ２３信号処理部

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】分離されて１個ずつ順次に流れる被検粒
子の通過を検出し同定を行う同定手段と、被検粒子の通
過を検出する位置よりも下流の位置で被検粒子に光ビー
ムを照射する第１の光ビーム発生手段と、前記同定手段
の結果に基づいて前記第１の光ビーム発生手段を制御す
る制御手段と、前記第１の光ビームの照射により被検粒
子から発生する光を検出する第１の光検出手段と、前記
第１の光ビームを照射する位置よりも更に下流の位置で
被検粒子に第２の光ビームを照射する第２の光ビーム発
生手段と、前記第２の光ビームの照射により被検粒子か
ら発生する光を検出する第２の光検出手段と、前記同定
手段の結果と前記第１及び第２の光検出手段から発生す
る信号に基づいて被検粒子の解析を行う信号処理手段と
を有することを特徴とする粒子解析装置。
【請求項２】前記同定手段は、被検粒子に光ビームを
照射する第３の光ビーム発生手段と、第３の光ビームの
照射により被検粒子から発生する光を検出する第３の光
検出手段とを含み、該第３の光検出手段の結果に基づい
て被検粒子の同定を行う請求項１に記載の粒子解析装
置。
【請求項３】前記制御手段は、前記同定手段の結果に
基づいて被検粒子に前記第１の光検出手段による検出を
必要とする場合には、被検粒子の通過を検出後に所定の
遅延時間を経て、被検粒子が前記第１の光ビームの照射
位置に達した時に、前記第１の光ビーム発生手段により
パルス状の前記第１の光ビームを発生させる請求項１に
記載の粒子解析装置。
【請求項４】前記制御手段は、前記同定手段の結果に
基づいて被検粒子に前記第１の光検出手段による検出を
必要としない場合には、被検粒子の通過を検出後に所定
の遅延時間を経て被検粒子が前記第１の光ビームの照射
位置に達する前に、前記第１の光ビーム発生手段による
第１の光ビームの発生を中止し、被検粒子が前記第１の
光ビーム照射位置を通過後に、再び前記第１の光ビーム
発生手段により前記第１の光ビームを発生させる請求項
１に記載の粒子解析装置。
【請求項５】被検粒子を流す方式はシースフロー方式
とした請求項１に記載の粒子解析装置。
【請求項６】前記光ビーム発生手段はレーザー光源と
した請求項１に記載の粒子解析装置。