JP2720069B2

JP2720069B2 - 流動細胞分析装置

Info

Publication number: JP2720069B2
Application number: JP1125530A
Authority: JP
Inventors: 功夫山崎; 博大木; 亮三宅; 香織保田
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1989-05-18
Filing date: 1989-05-18
Publication date: 1998-02-25
Anticipated expiration: 2013-02-25
Also published as: JPH02304333A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は流動細胞分析装置に係り、特に白血球の分類
に好適な流動細胞分析装置に関する。

〔従来の技術〕

従来、懸濁液サンプル中の粒子を速く効率的に識別で
きる方法の１つに流動細胞測定法がある。この方法で
は、粒子の懸濁液、典型的には血液サンプル中の細胞が
フローセルの微小断面の流路を通して流され、そこで血
液サンプル中の個々の粒子が一つもしくは複数の光線に
よりその焦点中で照らされる。そして個々の粒子に対す
る光線（群）の相互作用の結果が、一つもしくは複数の
光検出装置により検出される。通常、光検出装置は特定
の散乱角度における光の散乱または特定の波長の蛍光を
測定するように設計されている。粒子の分析精度を向上
させるため、フローセル内の流れをつくる方法としてシ
ースフロー方式が採用され、この方式によれば微小断面
流路の中の中心部分のみを血液サンプルが流れる。ま
た、個々の粒子に照射される光の量が一様になるように
楕円形状の光線が用いられる。このようにして、フロー
セルを流れる個々の粒子は、散乱光、蛍光もしくは他の
光学的または電気的特性に関連した一つ以上の特性によ
り特徴づけられる。それらの特性によって、個々の粒子
は検出器で測定される光の強さまたは他の特性を軸とす
る特徴空間の中に写像される。理想的にはサンプル中の
異なった種類の粒子が特徴空間の中の重複しない領域に
写像され、特徴空間におけるその写像に基づいて個々の
粒子の種類が推定できるとよい。

一般的に、２つの型の光散乱測定が流動細胞測定にお
いて行なわれる。一つは、入射光線に対して小さな角度
（約１゜〜15゜）で行われる光強度の測定であり、この
種光散乱は前方散乱と呼ばれる。他の一つは、入射光線
に対して直角に近い角度（約65゜〜115゜）の範囲で行
われる光強度の測定であり、この種の光散乱は直交光散
乱または側方散乱と呼ばれる。前方散乱と側方散乱を同
時に測定することにより、流動細胞の大きさ、形状に関
する情報がそれぞれ得られ、例えば、白血球をリンパ
球、単球、顆粒球の３種に分類できる。

また、サイトメトリー９（1988）pp39−43によれば、
前方散乱の測定を２種類の集光角度範囲（1.5゜〜2.5゜
及び３゜〜10゜）で行うことによって、白血球をリンパ
球、単球、顆粒球の３種に分類でき、側方散乱と同時に
偏光解消度を同時に測定することにより顆粒球をさらに
好中球と好酸球に分類できることが示されている（他の
公知例、特開昭63−113345号公報）。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術では、流動細胞を分析するのに前方散乱
と側方散乱を同時に測定するために２つ以上の方向に検
出用の光学系を配置する必要があり、光軸の調整が複雑
な上に装置が大型化する欠点があった。また、前方散乱
のみで複数種類の流動細胞を検出する方法では、集光角
度のわずかの違いが結果に大きく影響するため、高精度
の分類はできなかった。また特に、高速に分析をするた
めには、流動細胞を含むサンプルの流動を大きくする必
要があり、フローセルの中でサンプルの流れる断面積が
広くなり、個々の粒子の流れる位置が一定でなくなる。
そのため、それぞれの粒子に対し、散乱光集光の条件が
等価でなくなり、分析の精度を著しく低下させる原因と
なっていた。また、分析の精度を上げるために観測点を
一様に照射するよう出力の大きいレーザを光源に用いる
必要があり、装置が高価になる欠点があった。

本発明の目的は、所定の散乱角度の前方散乱光に制限
して測定するに用いるスリットを設けて測定精度を向上
させ、またフローセル中のサンプルの流れに対して直角
方向に長い他のスリットを設けてサンプルの流量の増加
に対応して散乱光の測定を可能にすることにより、小型
で精度の高い流動細胞分析装置を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成するために、本発明の流動細胞分析装
置は、フローセル中を流れる被検粒子にレーザ光を照射
し、該被検粒子を集光レンズにより結像させ、該結像を
通じて被検粒子が発散する散乱光を光検出器により所定
散乱角で測定し、測定した結果から被検粒子を分析する
流動細胞分析装置において、前記集光レンズによる被検
粒子の結像面に該被検粒子の流れと直角方向に、該被検
粒子を含む懸濁液流れの結像の幅より長い第１スリット
を設け、さらに前記所定散乱角で進行する散乱光の経路
に前記レーザ光の光軸に関し前記第１スリットに平行
に、第１スリットの透過光が通る幅より長い第２スリッ
トを設けたことを特徴としている。

第１スリットは長方形、ないしは長手方向の中央部で
幅が狭く、端部で広い鼓形のものが好ましい。また第１
スリットが長方形の場合、その前面または後面に光濃度
板を設けるのもよく、この際用いる光濃度板は中央部で
低い通過率を、側部で高い透過率を有するものがよい。

〔作用〕

流動細胞のサンプルの流量を大きくするとフローセル
の中で個々の流動細胞の粒子が通過する位置が一定でな
くなり、集光用レンズの結像面においても粒子の像の位
置は一定でなくなる。すなわち粒子の通過する位置がフ
ローセルの中心から横にずれると粒子の像も結像面で横
にずれる。本発明の流動細胞分析装置において、結像面
に置かれた第１スリットはサンプルの流れと直交する方
向に長い形状であるため、粒子の像の位置が横にずれて
も中央位置と等価にその粒子に作用し、その粒子が検出
領域を通過する際、中央位置を通過するのと同等に粒子
からの散乱光を透過させる。

第１スリットを透過した散乱光は、第２スリットによ
って特定の角度の散乱光のみに制限されて光検出器に導
かれる。第２スリットもサンプルの流れと直交する方向
に長い形状をしているため、粒子の通過位置が横にずれ
ても等価に作用する。それによって前方散乱光を精度よ
く測定し、分析することができる。従って前方散乱光を
検出する必要がなくなり、装置を小型化することができ
る。

また、第１スリットの直前または直後に光濃度板を設
置するか、または中央部が狭く周辺部が広い形状にした
第１スリットを用いることにより、観測点において中心
部で強度が高いレーザ光強度の不均一によって生ずる散
乱光強度の不均一を補正できる。そのため、観測点での
レーザ光強度が不均一でも精度の高い分析ができるの
で、出力の小さいレーザを光源に用いることができる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を図面の第１図〜第６図を用い
て説明する。

第１図は本発明の第１実施例の細胞分析装置の主要部
分の構成を示す図である。レーザ光３の光軸の延長上に
収束レンズ系２、フローセル１、ビームトラップ11、集
光レンズ系６、第一スリット板７、ハーフミラー８、第
二スリット板9a及び光検出器10aが配置されている。ま
た、ハーフミラー８から直角方向に、別の第二スリット
9b及び光検出器10bが配置されている。フローセル１は
細胞を懸濁した液の流れの方向がレーザ光３の光軸と直
交するように置かれている。

レーザ光３は、レーザ光３を収束する収束レンズ系２
を通りフローセル１の軸上の観測点５に照射され、観測
点５前方に設けたビームトラップ11で吸収される。フロ
ーセル１の中を細胞を懸濁した液がシースフローを形成
して流されると観測点５において細胞が光を発散する。
観測点５から発散する光は、集光レンズ６により第１ス
リット板７の位置に結像し、第１スリット板７に設けた
スリット7sを通過する。スリット7sを通過した光はハー
フミラー８で二分割されてそれぞれ第二スリット板9a,9
bに設けたスリットas,9bsでさらに一定の散乱角のもの
に制限を受けた後、光検出器10a,10bで光の強さを検出
される。

スリット9as,9bsは、ハーフミラー８を通ったレーザ
光３の光軸から少しずれた位置にスリット7sと光軸に関
して平行にしてあり、そのずれの量はそれぞれ精密に設
定される。第一スリット7sと第二スリット9as,9bsの位
置関係によって、観測点５から特定の角度範囲に発散す
る光のみが光検出器10a,10bに到達する。

第１スリット7sは横方向に長い長方形形状をしてお
り、その横幅は、観測点５における細胞懸濁液が流れる
領域の結像の範囲よりも広い。また、スリット9as,9bs
の隙間も長方形形状をしており、その横幅はスリット7s
を通過した光が通る範囲より広い。そのため、細胞が観
測点５を通過する位置が左右にずれても細胞から発散す
る光が第一スリット7sと第二スリット9as,9bsの上下位
置関係によって制限される角度範囲は変化しない。従っ
て、細胞の通過する位置に関係なく一定の集光角度範囲
で測定できるため、精度の高い測定ができる。そのた
め、側方散乱を用いずに前方散乱の検出のみで細胞の分
析ができ、装置を小型で調整の容易にすることができ
る。また、フローセル中において細胞の通過する位置が
左右にずれても、その細胞から発散する光の測定が可能
なため、細胞の流れる流路の断面積を広くすることがで
き、細胞懸濁液を流す量を多くできるので、測定に要す
る時間を短くすることが可能である。第２図は第１実施
例と同じ構成の装置で測定した信号の強度を示した図で
ある。分析する試料として溶血剤により赤血球を破壊し
た血液を用いた。溶血した血液中には白血球が残されて
いるが、白血球には複数の種類があり、粒子から発散す
る散乱光強度を測定すると複数の分画に分かれる。それ
ぞれの分画の信号強度の平均値を特定の分画の信号強度
の平均値で割った値が第２図の縦軸である。横軸はレー
ザ光軸に対する集光角度であり、スリット9asがレーザ
光軸からずれるようにスリット部9aを動かして集光角度
を変えている。分画Ｉには主にリンパ球が含まれてい
る。分画IIには主に単球が含まれている。分画IIIには
主に好中球が含まれている。分画IVには主に好塩基球が
含まれている。図からわかるように、それぞれの分画の
信号強度の角度依存性は異なり、それを利用して各分画
に含まれる細胞の数を計数する。この場合、１つの散乱
角度での検出で４つの分画を良好に分離することは難し
く、第１図に示すように２つの散乱角度で検出すること
が必要である。第１実施例の場合は散乱角度が２゜付近
の散乱光を検出するようにスリット9asの位置を設定
し、散乱角度が７゜〜10゜の散乱光を検出するようにス
リット9bsの位置を設定している。７゜〜10゜の散乱光
では分画I,IIと分画III,IVを良好に分離できるが、信号
強度の分散が大きいため分画IIIと分画IVの分離が難し
い。また、白血球以外の粒子と分画I,IIに含まれる白血
球の粒子との分離が難しい。２゜付近の散乱光では分画
IIIと分画IVを良好に分離できるが、それらと分画I,II
の分離が難しい。従って２つの散乱角度で同時に検出す
ることによって互いの欠点を補い、４つの分画を良好に
分離して計数することができる。

第３図は本発明の第２実施例である。この場合は第１
スリット板７の前に濃度板12が設置されており、第２ス
リット板９及び光検出器10は１組だけ設けられている。
濃度板12の光透過率は中央部が低く、側辺部が高くなっ
ている。観測点５におけるレーザ光３の強度分布は第4A
図のように中央部が高いため、細胞が通過するさいに発
散する散乱光強度は細胞が中央部を通過したときは強
く、細胞が周辺部を通過したときは弱くなる。散乱光は
集光レンズ６によって第１スリット板７の位置に結像す
るが、第4B図で示される透過率分布をもつ濃度板12がス
リット板７に設けたスリット7sの手前に置かれているた
めに細胞の通過する位置の違いによる散乱光強度の違い
が補正される。そのため、観測点５における通過位置に
対する感度分布は第4C図に示されるように平坦な特性に
なり、分析の精度をあげることができる。また、この実
施例の場合はレーザ光を狭い領域に照射しても精度よく
分析できるため、出力の小さいレーザを光源として用い
ることができ、装置を小型化、コストを下げることがで
きる。

第５図は、本発明の第３実施例を示す。第４図に示す
第２実施例と異なる点は濃度板12を用いる代わりに、第
１スリット板７に設けたスリット7sのスリット幅を長手
中央部で狭くしたものである。それによって前記濃度板
12がある場合と同じ効果を得ている。

第６図は、本発明の第４実施例である。観測点５から
発散する散乱光は集光レンズ６によって平行光束とな
り、ハーフミラー13a,13bによって分割され、直角方向
に反射し、第２スリット板9a,9bで制限されたのち結像
レンズ14a,14bによってその前方の第１スリット板7a,7b
の位置に結像し、第１スリット板7a,7bに設けたスリッ
ト7as,7bsを通って光検出器10a,10bで検出される。第２
スリット9as,9bsは、それぞれ光束の軸心に対称に設け
た長方形の２本のスリットで構成されている。この実施
例の場合は、光軸に対して上下に同じ角度をもって散乱
する散乱光を集光するため、光量が多く、測定精度を上
げることができる。また、光束を集光レンズ６により一
旦平行にしているため、その平行部分の長さや挿入され
ているハーフミラーが結像特性に与える影響を小さくで
き、検出系を２段だけでなく更に増やすこともできる。
また、光検出器10a,10bが同じ方向に並んでいるので、
無駄なスペースをとらず、装置を小型化することができ
る。

〔発明の効果〕

本発明によれば、流動細胞分析装置を、フローセル中
を流れる被検粒子にレーザ光を照射し、被検粒子を集光
レンズにより結像させ、その結像面に被検粒子の流れと
直角方向に長辺を配した第１スリットを設け、さらに所
定散乱角で進行する散乱光の経路にレーザ光の光軸に関
し前記第１スリットに平行に第２スリットを設け、第１
スリットを通過した結像から被検粒子が発散する散乱光
を光検出器により所定散乱角で測定し、測定した結果か
ら被検粒子を分析するように構成し、そして第１スリッ
トは、被検粒子の通過位置が横にずれても被検粒子がフ
ローセルの中央位置を通過するのと等価に作用するた
め、流動細胞のサンプルの流量を増やし粒子からの前方
散乱光を増やすことができ、また第２スリットによって
特定の角度の散乱光のみに制限して光検出器に導くの
で、速度が早くかつ精度よく前方散乱光を測定し、分析
することができる。

この第１スリットと第２スリットの組み合わせで精度
よく散乱光の集光角度を制限するため、側方散乱光を検
出する必要がなく、前方散乱光の検出のみで細胞分析を
行うことができ、装置を小型化できる効果がある。

また、散乱光の結像位置に置かれた濃度板または中央
部が狭く端部で広いスリットを用いることによりレーザ
光の強度分布を均等になるよう補正することができるた
め、出力の小さいレーザを光源に用いることができ、安
価な流動細胞分析装置を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の第１実施例を示す流動細胞分析装置の
構成図、第２図は第１実施例の装置により分析したデー
タの一例、第３図は第２実施例の構成図、第4A図〜第4C
図はレーザ光の強度分布と濃度板の作用を説明する図、
第５図、第６図はそれぞれ第３実施例、第４実施例の構
成図である。１……フローセル、２……収束レンズ系、３……レーザ
光、６……集光レンズ、７……第１スリット板、7s……
第１スリット、８……ハーフミラー、9,9a,9b……第２
スリット板、9s,9as,9bs……第２スリット、10……光検
出器、11……ビームトラップ、12……濃度板、13……ハ
ーフミラー、14a,14b……結像レンズ。

フロントページの続き (72)発明者保田香織茨城県勝田市市毛882番地株式会社日立製作所那珂工場内 (56)参考文献特開昭61−93932（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−231244（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−153448（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−37235（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−294335（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−223543（ＪＰ，Ａ) 特開昭64−53131（ＪＰ，Ａ) 実開昭63−126853（ＪＰ，Ｕ) 実開昭59−68319（ＪＰ，Ｕ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】フローセル中を流れる被検粒子にレーザ光
を照射し、該被検粒子の像を集光レンズにより結像さ
せ、該結像を通じて被検粒子が発散する散乱光を光検出
器により所定散乱角で測定し、測定した結果から被検粒
子を分析する流動細胞分析装置において、前記集光レン
ズによる被検粒子の結像面に該被検粒子の流れと直角方
向に、該被検粒子を含む懸濁液流れの結像の幅より長い
第１スリットを設け、さらに前記所定散乱角で進行する
散乱光の経路に前記レーザ光の光軸に関し前記第１スリ
ットに平行に、該第１スリットの通過光が通る幅より長
い第２スリットを設けたことを特徴とする流動細胞分析
装置。
【請求項２】前記第１スリットは長方形なることを特徴
とする請求項１記載の流動細胞分析装置。
【請求項３】前記第１スリットは長手方向の中央部で幅
が狭く、端部で広い鼓形であることを特徴とする請求項
１記載の流動細胞分析装置。
【請求項４】前記第１スリットの前面または後面に光濃
度板を設けたことを特徴とする請求項２記載の流動細胞
分析装置。
【請求項５】前記光濃度板は中央部で低い透過率を有
し、側部で高い透過率を有することを特徴とする請求項
４記載の流動細胞分析装置。