JPH02304333A - 流動細胞分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は流動細胞分析装置に係り、特に白血球の分類に
好適な流動細胞分析装置に関する。

〔従来の技術〕

従来、懸濁液サンプル中の粒子を速く効率的に識別でき
る方法の１つに流動細胞測定法がある。

この方法では９粒子の懸濁液、典型的には血液サンプル
中の細胞がフローセルの微小断面の流路を通して流され
、そこで血液サンプル中の個々の粒子が一つもしくは複
数の光線によりその焦点中で照らされる。そして個々の
粒子に対する光１ｉＡ（群）の相互作用の結果が、一つ
もしくは複数の光検出装置により検出される。通常、光
検出装置は特定の散乱角度における光の散乱または特定
の波長の蛍光を測定するように設計されている。粒子の
分析精度を向上させるため、フローセル内の流れをつく
る方法としてシースフロ一方式が採用され、この方式に
よれば微小断面流路の中の中心部分のみを血液サンプル
が流れる。また、個々の粒子に照射される光の量が一様
になるように楕円形状の光線が用いられる。このように
して、フローセルを流れる個々の粒子は、散乱光、蛍光
もしくは他の光学的または電気的特性に関連した一つ以
上の特性により特徴づけられる。それらの特性によって
、個々の粒子は検出器で測定される光の強さまたは他の
特性を軸とする特徴空間の中に写像される。理想的には
サンプル中の異なった種類の粒子が特徴空間の中の重複
しない領域に写像され、特徴空間におけるその写像に基
づいて個々の粒子の種類が推定できるとよい。

一般的に、２つの型の光散乱測定が流動細胞測定におい
て行なわれる。一つは、入射光線に対して小さな角度（
約１°〜１５°）で行われる光強度の測定であり、この
種光散乱は前方散乱と呼ばれる。他の一つは、入射光線
に対して直角に近い角度（約６５°〜１１５°）の範囲
で行われる光強度の測定であり、この種の光散乱は直交
光散乱または側方散乱と呼ばれる。前方散乱と側方散乱
を同時に測定することにより、流動細胞の大きさ。

形状に関する情報がそれぞれ得られ１例えば、白血球を
リンパ球、単球、顆粒球の３種に分類できる。

また、サイトメトリー９　（１９８８）　ｐｐ３９−４
３によれば、前方散乱の測定を２種類の集光角度範囲（
１，５°〜２．５ｍ及び３′〜１ｏ°）で行うことによ
って、白血球をリンパ球、単球、顆粒球の３種に分類で
き、側方数′乱と同時に偏光解消度を同時に測定するこ
とにより顆粒球をさらに好中球と好酸球に分類できるこ
とが示されている（他の公知例、特開昭６３−１１３３
４５号公報）。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術では、流動細胞を分析するのに前方散乱と
側方散乱を同時に測定するために２つ以上の方向に検出
用の光学系を配置する必要があり、光軸の調整が複雑な
上に装置が大型化する欠点があった。また、前方散乱の
みで複数種類の流動細胞を検出する方法では、集光角度
のわずかの違いが結果に大きく影響するため、高精度の
分類はできなかった。また特に、高速に分析をするため
には、流動細胞を含むサンプルの流量を大きくする必要
があり、フローセルの中でサンプルの流れる断面積が広
くなり５個々の粒子の流れる位置が一定でなくなる。そ
のため、それぞれの粒子に対し。

散乱光集光の条件が等価でなくなり、分析の精度を著し
く低下させる原因となっていた。また１分析の精度を上
げるために観測点を一様に照射するよう出力の大きいレ
ーザを光源に用いる必要があり、装置が高価になる欠点
があった。

本発明の目的は、所定の散乱角度の前方散乱光に制限し
て測定するに用いるスリットを設けて測定精度を向上さ
せ、またフローセル中のサンプルの流れに対して直角方
向に長い他のスリットを設けてサンプルの流量の増加に
対応して散乱光の測定を可能にすることにより、小型で
精度の高い流動細胞分析装置を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成するために、本発明の流動細胞分析装置
は、フローセル中を流れる被検粒子にレーザ光を照射し
、該被検粒子を集光レンズにより結像させ、該結像、を
通じて被検粒子が発散する散乱光を光検出器により所定
散乱角で測定し、測定した結果から被検粒子を分析する
流動細胞分析装置において、前記集光レンズによる被検
粒子の結像面に該被検粒子の流れと直角方向に長辺を配
した第１スリットを設け、さらに前記所定散乱角で進行
する散乱光の経路に前記レーザ光の光軸に関し前記第１
スリットに平行に第２スリットを設けたことを特徴とし
ている。

第１スリットは長方形、ないしは長手方向の中央部で幅
が狭く、端部で広い鼓形のものが好まし　。

い。また第１スリットが長方形の場合、その前面または
後面に光濃度板を設けるのもよく、この際用いる光濃度
板は中央部で低い透過率を、側部で高い透過率を有する
ものがよい。

〔作用〕

流動細胞のサンプルの流量を大きくするとフローセルの
中で個々の流動細胞の粒子が通過する位置が一定でなく
なり、集光用レンズの結像面においても粒子の像の位置
は一定でなくなる。すなわち粒子の通過する位置がフロ
ーセルの中心から横にずれると粒子の像も結像面で横に
ずれる。本発明の流動細胞分析装置において、結像面に
置かれた第１スリットはサンプルの流れと直交する方向
に長い形状であるため、粒子の像の位置が横にずれても
中央位置と等価にその粒子に作用し、その粒子が検出領
域を通過する際、中央位置を通過するのと同等に粒子か
らの散乱光を透過させる。

第１スリットを透過した散乱光は、第２スリットによっ
て特定の角度の散乱光のみに制限されて光検出器に導か
れる。第２スリットもサンプルの流れと直交する方向に
長い形状をしているため、粒子の通過位置が横にずれて
も等価に作用する。

それによって前方散乱光を精度よく測定し、分析するこ
とができる。従って側方散乱光を検出する必要がなくな
り、装置を小型化することができる。

また、第１スリットの直前または直後に光濃度板を１２
置するか、または中央部が狭く周辺部が広い形状にした
第１スリットを用いることにより、観測点において中心
部で強度が高いレーザ光強度の不均一によって生ずる散
乱光強度の不均一を補正できる。そのため、ａｍ点での
レーザ光強度が不均一でも精度の高い分析ができるので
、出力の小さいレーザを光源に用いることができる。

〔実施例〕

以下１本発明の実施例を図面の第１図〜第６図を用いて
説明する。

第１図は本発明の第１実施例の細胞分析装置の主要部分
の構成を示す図である。レーザ光３の光軸の延長上に収
束レンズ系２、フローセル１、ビームトラップ１１、集
光レンズ系６、第一スリット板７、ハーフミラ−８、第
二スリット板９ａ及び光検出器１０ａが配置されている
。また、ハーフミラ−８から直角方向に、別の第ニスリ
ット９ｂ及び光検出器１０ｂが配置されている。フロー
セル１は細胞をＭ濁した液の流れの方向がレーザ光３の
光軸と直交するように置かれている。

レーザ光３は、レーザ光３を収束する収束レンズ系２を
通りフローセル１の軸上のＷｔ測点５に照射され、観測
点５前方に設けたビームトラップ１１で吸収される。フ
ローセル１の中を細胞を懸濁した液がシースフローを形
成して流されると観測点５において細胞が光を発散する
。観測点５から発散する光は、集光レンズ６により第１
スリット板７の位置に結像し、第１スリット板７に設け
たスリット７ｓを通過する。スリット７ｓを通過した光
はハーフミラ−８で二分割されてそれぞれ第二スリット
板９ａ、９ｂに設けたスリット９ａｓ。

９ｂｓでさらに一定の散乱角のものに制限を受けた後、
光検出器１０ａ、１０ｂで光の強さを検出される。

スリット９ａｓ、９ｂｓは、ハーフミラ−８を通ったレ
ーザ光３の光軸から少しずれた位置にスリット７ｓと光
軸に関して平行にし７てあり、そのずれの量はそれぞれ
精密に設定される。第一スリット７ｓと第ニスリット９
ａｓ、９ｂｓの位置関係によって、ａａ点５から特定の
角度範囲に発散する光のみが光検出器１０ａ、　１ｏｂ
に到達する。

第１スリット７ｓは横方向に長い長方形形状をしており
、その横幅は、観測点５における細胞懸濁液が流れる領
域の結像の範囲よりも広い。また、スリット９ａｓ、９
ｂｓの隙間も長方形形状をしており、その横幅はスリッ
ト７Ｓを通過した光が通る範囲より広い。そのため、細
胞が観測点５を通過する位置が左右にずれても細胞から
発散する光が第一スリット７ｓと第ニスリット９ａｓ、
９ｂｓの上下位置関係によって制限される角度範囲は変
化しない、従って、細胞の通過する位置に関係なく一定
の集光角度範囲で測定できるため、精度の高い測定がで
きる。そのため、側方散乱を用いずに前方散乱の検出の
みで細胞の分析ができ、装置を小型で調整の容易にする
ことができる。また、フローセル中において細胞の通過
する位置が左右にずれても、その細胞から発散する光の
測定が可能なため、細胞の流れる流路の断面積を広くす
ることができ、細胞懸濁液を流す量を多くできるので、
測定に要する時間を短くすることが可能である。第２図
は第１実施例と同じ構成の装置で測定した信号の強度を
示した図である。分析する試料として溶血剤により赤血
球を破壊した血液を用いた。溶血した血液中には白血球
が残されているが、白血球には複数の種類があり１粒子
から発散する散乱光強度を測定すると複数の分画に分か
れる。それぞれの分画の信号強度の平均値を特定の分画
の信号強度の平均値で割った値が第２図の縦軸である。

横軸はレーザ光軸に対する集光角度であり、スリット９
ａｓがレーザ光軸からずれるようにスリット板９ａを動
かして集光角度を変えている。分画１には主にリンパ球
が含まれている。

分画■には主に単球が含まれている。分画■には主に好
中球が含まれている０分画■には主に好塩基球が含まれ
ている。図かられかるように、それぞれの分画の信号強
度の角度依存性は異なり、それを利用して各分画に含ま
れる細胞の数を計数する。この場合、１つの散乱角度で
の検出で４つの分画を良好に分離することは難しく、第
１図に示すように２つの散乱角度で検出することが必要
である。第１実施例の場合は散乱角度が２°付近の散乱
光を検出するようにスリット９ａｓの位置を設定し、散
乱角度が７°〜１０°の散乱光を検出するようにスリッ
ト９ｂｓの位置を設定している。

７°〜１０°の散乱光では分画１．ＩＩと分画■。

■を良好に分離できるが、信号強度の分散が大きいため
分画■と分画■の分離が難しい。また、白血球以外の粒
子と分画Ｉ、Ｈに含まれる白血球の粒子との分、離が難
しい、２°付近の散乱光では分画■と分画■を良好に分
離できるが、それらと分画Ｉ、■の分離が難しい、従っ
て２つの散乱角度で同時に検出することによって互いの
欠点を補い、４つの分画を良好に分離して計数すること
ができる。

第３図は本発明の第２実施例である。この場合は第１ス
リット板７の前に濃度板１２が設置されており、第２ス
リット板９及び光検出器１０は１組だけ設けられている
。濃度板１２の光透過率は中央部が低く、側辺部が高く
なっている。観測点５におけるレーザ光３の強度分布は
第４Ａ図のように中央部が高いため、細胞が通過するさ
いに発散する散乱光強度は細胞が中央部を通過したとき
は強く、細胞が周辺部を通過したときは弱くなる。

散乱光は集光レンズ６によって第１スリット板７の位置
に結像するが、第４Ｂ図で示される透過率分布をもつ濃
度板１２がスリット板７に設けたスリット７ｓの手前に
置かれているために細胞の通過する位置の違いによる散
乱光強度の違いが補正される。そのため、観測点５にお
ける通過位置に対する感度分布は第４Ｃ図に示されるよ
うに平坦な特性になり、分析の精度をあげることができ
る。

また、この実施例の場合はレーザ光を狭い領域に照射し
ても精度よく分析できるため、出力の小さいレーザを光
源として用いることができ、装置を小型化し、コストを
下げることができる。

第５図は、本発明の第３実施例を示す、第４図に示す第
２実施例と異なる点は濃度Ｆｉ１２を用いる代わりに、
第１スリット板７に設けたスリット７ｓのスリット幅を
長手中央部で狭くしたものである。それによって前記濃
度板１２がある場合と同じ効果を得ている。

第６図は１本発明の第４実施例である。観測点５から発
散する散乱光は集光レンズ６によって平行光束となり、
ハーフミラ−１３ａ、１３ｂによって分割され、直角方
向に反射し、第２スリット板９ａ、９ｂで制限されたの
ち結像レンズ１４ａ。

１４ｂによってその前方の第１スリット板７ａ。

７ｂの位置に結像し、第１スリット板７ａ、７ｂ・に設
けたスリット７ａｓ、７ｂｓを通って光検出器１０ａ、
１０ｂで検出される。第２スリット９ａｓ、９ｂｓは、
それぞれ光束の軸心に対称に設けた長方形の２本のスリ
ットで構成されている。

この実施例の場合は、光軸に対して上下に同じ角度をも
って散乱する散乱光を集光するため、光量が多く、測定
精度を上げることができる。また、光束を集光レンズ６
により一旦平行にしているため、その平行部分の長さや
挿入されているハーフミラ−が結像特性に与える影響を
小さくでき、検出系を２段だけでなく更に増やすことも
できる。

また、光検出器１０ａ、１０ｂが同じ方向に並んでいる
ので、無駄なスペースをとらず、装置を小型化すること
ができる６ 〔発明の効果〕 本発明によれば、流動細胞分析装置を、フローセル中を
流れる被検粒子にレーザ光を照射し、被検粒子を集光レ
ンズにより結像させ、その結像面に被検粒子の流れと直
角方向に長辺を配した第１スリットを設け、さらに所定
散乱角で進行する散乱光の経路にレーザ光の光軸に関し
前記第１スリットに平行に第２スリットを設け、第１ス
リットを通過した結像から被検粒子が発散する散乱光を
光検出器により所定散乱角で測定し、測定した結果から
被検粒子を分析するように構成し、そして第１スリット
は、被検粒子の通過位置が横にずれても被検粒子がフロ
ーセルの中央位置を通過するのと等価に作用するため、
流動細胞のサンプルの流量を増やし粒子からの前方散乱
光を増やすことができ、また第２スリットによって特定
の角度の散乱光のみに制限して光検出器に導くので、速
度が早くかつ精度よく前方散乱光を測定し、分析するこ
とができる。

この第１スリットと第２スリットの組み合わせで精度よ
く散乱光の集光角度を制限するため、側方散乱光を検出
する必要がなく、前方散乱光の検出のみで細胞分析を行
うことができ、装置を小型化できる効果がある。

また、散乱光の結像位置に置かれた濃度板または中央部
が狭く端部で広いスリットを用いることによりレーザ光
の強度分布を均等になるよう補正することができるため
、出力の小さいレーザを光源に用いることができ、安価
な流動細胞分析装置を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の第１実施例を示す流動細胞分析装置の
構成図、第２図は第１実施例の装置により分析したデー
タの一例、第３図は第２実施例の構成図、第４Ａ図〜第
４Ｃ図はレーザ光の強度分布と濃度板の作用を説明する
図、第５図、第６図はそれぞれ第３実施例、第４実施例
の構成図である。 １・・・フローセル、２・・・収束レンズ系、３・・・
レーザ光、６・・・集光レンズ、７・・・第１スリット
板、７ｓ・・・第１スリット、８・・・ハーフミラ−１
９，９ａ、９ｂ−第２スリット板、９　ｓ、９　ａ　ｓ
。 ９　ｂ、　ｓ・・・第２スリット、１０・・・光検出器
、１１・・・ビームトラップ、１２・・・濃度板、１３
・・・ハーフミラ−１１４ａ、１４ｂ・・・結像レンズ
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フローセル中を流れる被検粒子にレーザ光を照射し
   、該被検粒子の像を集光レンズにより結像させ、該結像
   を通じて被検粒子が発散する散乱光を光検出器により所
   定散乱角で測定し、測定した結果から被検粒子を分析す
   る流動細胞分析装置において、前記集光レンズによる被
   検粒子の結像面に該被検粒子の流れと直角方向に長辺を
   配した第１スリットを設け、さらに前記所定散乱角で進
   行する散乱光の経路に前記レーザ光の光軸に関し前記第
   １スリットに平行に第２スリットを設けたことを特徴と
   する流動細胞分析装置。 ２、前記第１スリットは長方形なることを特徴とする請
   求項１記載の流動細胞分析装置。 ３、前記第１スリットは長手方向の中央部で幅が狭く、
   端部で広い鼓形であることを特徴とする請求項１記載の
   流動細胞分析装置。 ４、前記第１スリットの前面または後面に光濃度板を設
   けたことを特徴とする請求項２記載の流動細胞分析装置
   。 ５、前記光濃度板は中央部で低い透過率を有し、側部で
   高い透過率を有することを特徴とする請求項４記載の流
   動細胞分析装置。