JP2749912B2

JP2749912B2 - 検体測定装置及び検体測定方法

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Publication number: JP2749912B2
Application number: JP1325001A
Authority: JP
Inventors: 勇二伊藤; 良行東家; 厚志斉藤; 達也川▲崎▼
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Priority date: 1989-12-15
Filing date: 1989-12-15
Publication date: 1998-05-13
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Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はサンプル中の個々の検体に光を照射し光学的
測定を行なうことで検体の解析や抗原抗体反応の測定等
を行なう検体検査装置に関する。

［従来の技術］従来の検体検査装置の一例としてフローサイトメータ
の構成を第６図に示す。

適切な反応時間及び濃度に調整され、更に必要に応じ
て蛍光試薬等で染色処理されたサンプル液は、第５図の
サンプル液容器115に入れられる。また、蒸留水や生理
食塩水等のシース液は、シース液容器114に入れられ
る。サンプル液容器115及びシース液容器114は各々不図
示の加圧機構により加圧される。そして、シースフロー
原理により、フローセル104内でサンプル液がシース液
に包まれて細い流れに収斂され、フローセル104内の流
通部のほぼ中央部を通過する。この時、サンプル液に含
まれる検体である個々の被検粒子は分離されて１粒或い
は１塊ずつ順次流れる。この被検粒子の流れに対して、
レーザ光源101から出射されたレーザ光が、母線方向が
各々流通部方向、流通部方向と直交したシリンドリカル
レンズ102、103の組によって任意の形状に収斂され照射
される。被検粒子に照射される光ビームの形状は、一般
には流れに対して直交する方向に長径を有する楕円形状
であることが好ましい。これは個々の被検粒子の流れの
位置が流体中で若干変動しても、被検粒子に均一の強度
で光ビームが照射されるようにするためである。

被検粒子に光ビームが照射されると散乱光が生じる。
前記散乱光の内、光路前方方向に発する前方散乱光は集
光レンズ105、光検出器106によって測光される。なお照
射された光ビームが直接、光検出器106に入射するのを
防ぐため、光路中集光レンズ105の手前には光吸収性の
微小なストツパ100が設けられ、照射光源からの直接
光、及び被検粒子を光透過した透過光を除去するように
なっている。これにより被検粒子からの散乱光のみを測
光することができる。

また前記散乱光の内、レーザ光軸及び被検粒子の流れ
にそれぞれ直交する側方方向に発する光は集光レンズ10
7で集光される。集光された光はダイクロイツクミラー1
08で反射され、散乱光の波長即ちレーザ光の波長（Ar⁺
レーザであれば488nm）を選択的に透過させるバンドパ
スフイルタ121を経て光検出器111にて側方散乱光が測光
される。また被検粒子が蛍光染色されている場合には、
散乱光と共に発生する複数色の蛍光を測光するため、集
光レンズ107によって集光され、ダイクロイツクミラー1
08を通過した蛍光の内、ダイクロイツクミラー109、緑
色蛍光波長用（530nm付近）のバンドパスフイルタ122、
光検出器112の組によって緑色蛍光が検出され、また全
反射ミラー110、赤色蛍光波長用（570nm付近）のバンド
パスフイルタ123、光検出器113の組によって赤色蛍光が
検出される。光検出器106、111、112、113の信号は各々
演算回路116に入力され、該演算回路116において、粒子
の種類や性質等の解析、あるいは抗原抗体反応の測定等
の演算が行なわれる。

［発明が解決しようとする課題］しかしながら、従来は複数色の蛍光を測光するのに各
蛍光毎に専用の光検出器を使用している。これまでは赤
色蛍光と緑色蛍光の２色、あるいはこれに黄色蛍光を加
えた３色を同時に測光する構成が一般的であったが、近
年、更なる多色化の要望が高まり、新たな蛍光剤の開発
も進んでいる。これにより同時に使用する蛍光チヤンネ
ル数が増加すると、それに応じて光検出器の数も増加し
てしまうことになる。即ち、光学配置が複雑化し、フオ
トマル等の高価な光検出器が多数必要となってしまう問
題点があった。

本発明は以上の課題を解決すべくなされたもので、光
検出器の数以上の測定パラメータが得られる検体測定装
置の提供を目的とする。

［課題を解決するための手段］上述の課題を解決する本発明は、サンプル中の個々の
検体を順次流す手段と、第１、第２の照射光ビームを検
体の流れ方向に間隔を置いて第１の位置と第２の位置に
照射する手段と、前記第１、第２の被検位置を通過する
検体から発するそれぞれの光を受光する共通の光検出手
段と、検体が前記第１の位置を通過する際には検体から
発する第１の光学特性の光を選択的に前記光検出器に導
き、検体が前記第２の位置を通過する際には検体から発
する第２の光学特性の光を選択的に前記光検出器に導く
選択手段とを有することを特徴とする。

［実施例］以下、本発明の実施例の基本的な構成図を第１図及び
第２図を用いて説明する。なお、基本形態を説明した後
に、より詳細な幾つかの実施例を後に説明する。第１図
は本発明の実施例の基本的構成図であり、第２図は第１
図を上方から見た図で、側方光学系を詳細に表わしてい
る。

図中１は検体である生体細胞やラテツクス粒子等の被
検粒子をシースフロー方式により１個ずつ順に流すため
のフローセルで被検粒子が紙面上方から下方に向けて流
れている。2,3はレーザ光源であり、この分野では一般
的なAr⁺レーザ、He−Neレーザ、色素レーザ、半導体レ
ーザ等様々な光源が利用できる。４は照射光ビームをフ
ローセル部の被検領域に結像する集光レンズであり、レ
ーザ光源２及び３からのレーザビームをそれぞれフロー
セル中の1a,1bの位置に結像する。結像ビームの形状と
しては流れに直交する方向に長径を持つ楕円形状が好ま
しい。ここで両照射位置1a,1bの間の距離は100μｍ程度
とする。ビーム直進方向に配置される部材５は光ストツ
パ、６は前方散乱光を集光する集光レンズ、７は視野絞
り、８は前方散乱光を検知する光検出器であり、またビ
ーム直進方向と直交する方向に配置される部材11は側方
散乱光を集光する集光レンズ、21a,21b,31a,31bは被検
粒子より生じた側方散乱光及び蛍光を色分解するための
ダイクロイツクミラー、25,35,45は側方散乱光及び蛍光
を検知するための光検出器であり、該光検出器としては
検出感度の高いフオトマルチプライヤが好適である。

レーザ光源２より出射されたレーザ光は集光レンズ４
により集光され被検領域1aに照射される。この被検領域
1aに被検粒子が通過すると該被検粒子によって光散乱が
起き、この時被検粒子が蛍光染色されていれば蛍光も励
起されて散乱光と共に発生する。前記発生する散乱光の
内の一部は光路前方方向に進み前方散乱光となる。この
前方散乱光は前記レーザ光の０次光を遮断するストツパ
５、集光レンズ６、及び視野絞り７を経て、光検出器８
により強度検出され前方散乱信号が得られる。

一方、被検粒子より励起される前記蛍光は、前記散乱
光の一部である側方散乱光と共に集光レンズ11で集光さ
れる。集光された光は集光レンズ12、視野絞り13、集光
レンズ14を経てダイクロイツクミラー21a,21bに至る。
視野絞り13は1a,1bの両位置からの光を通過させる程度
の大きさの開口を有している。ここで互いに異なる特性
を有するダイクロイツクミラー21a,21bで色分解され反
射した前記側方散乱光及び蛍光は、前記反射光の特性に
応じたバンドパスフィルタ22a,22bを経て、メカニカル
シヤツタ等の光束を遮断し得るシヤツタ23a,23bに至
る。該シヤツタ23a,23bは互いに独立に駆動可能な高速
シヤツタであれば良く、使用できるシヤツタとしてはメ
カニカルシヤツタ以外にも液晶シヤツタやAO、あるいは
ポツケルセル等の様々なものが使用可能である。

次に実施例の装置の電気的処理手順について説明す
る。

光検出器８で得られた信号はアナログ処理回路51と比
較回路52に接続されている。そしてアナログ処理回路51
の出力は、順次A/Dコンバータ53に接続され、また光検
出器25、35、45の出力も同様にアナログ処理回路61、6
2、63、A/Dコンバータ64、65、66に接続され、各A/Dコ
ンバータの出力は一つのCPU回路67に導かれ、そのCPU回
路67にはメモリ68が接続されている。また前述の比較回
路52には基準電圧V₀が共に入力され、その出力はシヤツ
タ制御回路54に接続されており、更にシヤツタ制御回路
54の出力は23a,23b,33a,33b,43a,43bの各シヤツタに接
続されている。シヤツタの駆動は、シヤツタへの印加電
圧が０の場合はシヤツタが開いて光を透過し、一定電圧
V₁を印加することでシヤツタが閉じて光を遮断する。

被検粒子が1aの地点を通過しレーザ光を横切る時に光
検出器８で得られる前方散乱光強度の出力信号は第３図
（ａ）に示すような信号となる。また第３図（ｂ）は光
検出器25、35、45の出力、すなわち側方散乱光強度ある
いは蛍光検出強度の出力信号である。ここで前記第３図
（ａ）に示す光検出器８の出力信号と閾値である基準信
号V₀を比較器52で比較することで第３図（ｃ）のような
タイミングパルスが得られる。

ここで被検粒子が1aを通過する時、レーザ光L1による
散乱光及び蛍光がシヤツタ23a,33a,43aのみを通過し、
また粒子が1bを通過する時、レーザ光L2による散乱光及
び蛍光がシヤツタ23b,33b,43bのみを通過するようにす
るため、23a,33a,43aの各シヤツタの駆動信号は、第３
図（ｄ）のようにタイミングパルスの立ち下がりで再び
シヤツタを閉じ、23b,33b,43bの各シヤツタの駆動信号
の立ち上がりで再びシヤツタを開くように、シヤツタ制
御回路54により作り出される。また23b,33b,43bの各シ
ヤツタの駆動信号も前記シヤツタ制御回路54にて作られ
る。これは第３図（ｅ）のようにタイミングパルス信号
（ｃ）の立ち下がりから、２本のレーザ間を被検粒子が
通過するのに要する時間よりも僅かに短いt₁秒後、すな
わち被検粒子が1bの直前に来た時点でシヤツタを開け、
そして被検粒子が1bを通過し終る時間t₂秒後に再びシヤ
ツタが閉じるようなタイミングの信号となる。以上の制
御信号で各シヤツタの開閉が制御され、被検粒子が1aの
位置を通過する際にはシヤツタ22a,32a,42a開き、22b,3
2b,42bが閉じ、続いて同一被検粒子が1bの位置を通過す
る際には各シヤツタの開閉が反転する。

一方、光検出器25、35、45の各出力は、アナログ処理
回路61、62、63にそれぞれにおいてレーザ光照射域を被
検粒子が通過する際に生じるパルス信号のピーク値、面
積積分値等が計測される。更にそれらの出力であるアナ
ログ信号はA/Dコンバータ64、65、66のそれぞれにより
デジタル信号に変換され、更に変換された各デジタル信
号はCPU回路67に入力されたメモリ68に記憶される。こ
うしてメモリ68に蓄積された測定データを基に、粒子解
析回路69にて粒子の種類や性質等の解析や、抗原抗体反
応の検出等の演算を行ない、その結果はCRTやプリンタ
等の出力部70に出力される。

さて次に本発明に係る測定原理について説明する。

通常はシヤツタ23a,33a,43aが開、23b,33b,43bが閉の
状態となっている。

ここで被検粒子が被検領域1aを通過する時には、シヤ
ツタ23aの光路が選択されるため、被検領域1aにある被
検粒子によって生じた散乱光及び蛍光の内、ダイクロイ
ツクミラー21aで反射し、バンドパスフイルタ22aを経
た、特定の波長（バンドパスフイルタ22aの波長）を有
する光のみが光検出器25に選択的に到達し検知されるこ
とになる。同様にダイクロイツクミラー21a,21bを透過
した散乱光及び蛍光は、互いに異なる波長特性を有する
ダイクロイツクミラー31a,31bで色分解され、反射した
光は同様にシヤツタ33a,33bに至るが、ここではシヤツ
タ33aに至った光のみが選択される。よって光検出器35
ではダイクロイツクミラー21aを透過してダイクロイツ
クミラー31aで反射し、バンドパスフイルタ32aを経た特
定の波長（バンドパスフイルタ32aの波長）の光のみが
検知されることになる。更にダイクロイツクミラー31a,
31bを透過した光は、ミラー41a,41bで反射し、互いに異
なる波長特性を有するバンドパスフイルタ42a,42bを経
てシヤツタ44a,44bに至るが、シヤツタ44aがに至った光
のみが選択される。よって光検出器45ではダイクロイツ
クミラー21a,31a及びバンドパスフイルタ42aを透過した
特定の波長（バンドパスフイルタ42aの波長）の光のみ
が検知されることになる。

一方、前記被検領域1aを通過した被検粒子が移動し、
所定時間の後に被検領域1bに至る時点では、制御回路に
てシヤツタを開閉を駆動して、先とは逆にシヤツタ23a,
33a,43aが閉、23b,33b,43bが開の状態となり、被検領域
から光検出器に至る光路が切換えられる。よってこの切
換えられた光路中に配されるバンドパスフイルタ22b,32
b,42bで選別される特定波長の光が各検出器でそれぞれ
検知される。

以上のように、各々の光検出器の手前に配置される２
分割のシヤツタの開閉が被検粒子の通過に同期して制御
されるようになっている。これは換言すれば、被検領域
から光検出器に至る光路が２分割されて、被検粒子の通
過に同期して光路が切換えられるような構成となってい
る。よって第１のレーザ光による光信号と第２のレーザ
光による光信号を時系列的に区別してサンプリングする
ことが可能となり、同一の光検出器、アナログ処理系を
用いて、各検出器につき２種類の光信号を測定すること
ができる。すなわち、側方系に３個の光検出器を備える
本実施例の装置においては、これら検出器で６種類の異
なるパラメータの蛍光及び側方散乱光を得ることができ
る。

なお、以上の説明では側方の光検出器の数が３個の実
施例を示したが、検出器の個数はこれに限定されるもの
では無い。１個であれば一般的な従来例と同様、２色の
蛍光を単一の光検出器で得ることができる。この時ダイ
クロイツクミラーは不要であるため装置構成が非常に簡
略なものとなる。又、光検出器の数が４個以上であれば
更に多くのパラメータを得ることができる。なお、測定
する各パラメータは必ずしも異なる光学特性である必要
はなく、同一の光学特性の光を複数検出することで測定
値の信頼性をより高めるようにしても良い。

また、更なる発展形態としては、照射光の照射位置、
及びダイクロイツクミラー、バンドパスフイルタ、シヤ
ツタの分割数を３以上とすることで、光検出器の数を増
やすことなく更に多くの種類のパラメータを得ることが
できる。例えば３分割するのであれば、光の照射位置を
流れ方向に３か所に行ない、シヤツタ等の形状は第５図
のように均等に３分割したものとすれば良い。

さて、以上は本発明の実施例の装置の基本的構成を説
明したものであるが、より具体的な幾つかの実施例を以
下説明する。なお、使用できる蛍光の種類及び組合わせ
がこれらに限定されるものではないことは言うまでもな
い。

［実施例１］実施例１では、被検粒子を３種類の蛍光で染色して、
２個の光検出器で側方４チャンネル検出するものであ
る。これに前方散乱光のパラメータを加えた計５種類の
測定パラメータを得ることができる。なお光検出器45を
含む検出光学系は本実施例では使用しないためこれは省
略しても良い。

第１図、第２図において、レーザ光源２及び３に波長
488nmの２個の同一Ar⁺レーザ光源を用いる。なお、レー
ザ光源を２個用意せずに第４図のように単一の光源から
のレーザビームをハーフミラーと全反射ミラーを用いて
光学的に２光束に分けるような構成としても良い。この
時、２本のレーザビームの強度比を変えて各蛍光剤の励
起効率に適した強度とすると更に好ましい。

被検粒子を染色する蛍光の種類は、波長488nmの励起
光で励起される蛍光を選択する。例えばFITC（530nm）,
PE（570nm）,duochrome（610nm）の３種類の蛍光で染色
するものとすると、被検粒子からは488nm,530nm,570nm,
610nmの４種類の波長の光が同時に発生することにな
る。なお、duochromeは直接488nmの波長では励起されな
いが、一旦PEが励起されて発生する蛍光（570nm）でduo
chromeが励起されるという段階的な励起過程を有する。

ダイクロイツクミラー21a,21b,31a,31bの光分別波長
をぞれぞれ、510nm,590nm,450nm,650nm程度に設定し、
バンドパスフイルタ22a、22b,32a,32bとしてそれぞれ53
0nm,488nm,570nm,610nm付近の波長の光を選択的に透過
させる特性のものを用いて、それぞれの光学系でFITC,S
S（側方散乱光）,PE,duochromeの強度検出を行なう。

被検粒子が1aの位置を通過する時、上記４種類の光が
発生するが、この時シヤツタ23a,33aが開いて、23b,33b
が閉じているため、検出器25においてはバンドパスフイ
ルタ22aで選択されたFITCの蛍光強度が検出され、検出
器35においてはバンドパスフイルタ32aで選択されたPE
の蛍光強度が検出される。次に同一被検粒子が1bの位置
を通過する時には、シヤツタ23a,33aが閉じ、23b,33bが
開くように制御されており、検出器25においてはバンド
パスフイルタ22bで選択されたSS強度が検出され、検出
器35においてはバンドパスフイルタ32bで選択されたduo
chromeの蛍光強度が検出される。

こうして２個の検出器で４種類の異なる光学特性の光
の測定値を得ることができる。これに光検出器８で得ら
れる前方散乱光強度を加えて、計５種類の測定パラメー
タが得られる。

［実施例２］次に側方６チャンネル検出が可能な実施例２を説明す
る。

第１図、第２図において、レーザ光源２として波長48
8nmのAr⁺レーザ光源を、またレーザ光源３として波長60
0nmの色素レーザ光源を用いる。なお、レーザ光源とし
て複数波長の光を同時に出力するマルチ発振レーザ光源
を用い、先の第４図でのハーフミラーの代わりにダイク
ロイツクミラーを配置した構成として、単一の光源で異
なる波長の複数ビームを得るようにしても良い。

被検粒子を染色する蛍光の種類は、波長488nmの励起
光で励起される蛍光、及び波長600nmで励起される蛍光
を選択する。例えば488nmに適したものとしてFITC（530
nm）,PE（570nm）を用い、600nmに適したものとしてTR
（610nm）,APC（660nm）を用い、計４種類の蛍光で染色
する。

ダイクロイツクミラー21a,21b,31a,31bの光分別波長
をそれぞれ、570nm,605nm,550nm,630nm程度に設定し、
バンドパスフイルタ22a、22b,32a,32b,42a,42bとしてそ
れぞれ488nm、600nm、530nm、610nm,570nm,660nm付近の
波長の光を選択的に透過させる特性のもの選択する。

被検粒子がAr⁺レーザ光が照射される1aの位置を通過
する時、488nmの照射光でFITC,PEが励起され、488nm,53
0nm,570nmの３種類の光が発生する。この時シヤツタ22
a,32a,43aが開いて、22b,32b,43bが閉じているため、検
出器25にてSS（488nm）が、検出器35でFITCが、検出器4
5でPEがそれぞれ検出される。次に所定時間の後に同一
の被検粒子が色素レーザ光が照射される1bの位置を通過
する時は、600nmの照射光でTR,APCが励起され、600nm,6
10nm,660nmの３種類の光が発生する。この時点では、先
とは逆にシヤツタ22a,32a,42aが閉じ、22b,32b,42bが開
くように制御されているため、検出器25にてSS（600n
m）が、検出器35でTRが、検出器45でAPCがそれぞれ検出
される。

さて、本実施例においては各シヤツタは必ずしも必要
ではない。1a位置に照射されるAr⁺レーザ光では488nm,5
30nm,570nmの光しか発生せず、シヤツタが無くても各光
検出器ではこれらの波長の光のみが選択的に検出され
る。又、1b位置に照射される色素レーザ光では600nm,61
0nm,660nmの光しか発生しないため、シヤツタが無くて
も各光検出器ではこれらの波長の光のみが選択的に検出
される。すなわち、照射光波長、蛍光の種類、波長選択
特性の組合わせによっては、シヤツタが無くてもそれぞ
れのパラメータを区別して検出することができるのであ
る。

これを一般化すると、各照射光の波長を異ならせ、光
検出器の手前に配置されるバンドパスフイルタ等の第１
の波長選択部材及び第２の波長選択部材の特性を、第１
の波長選択部材では第１の照射光で発生して第２の照射
光では発生しない波長の光を選択する特性を持たせ、第
２の波長選択部材では第２の照射光で発生して第１の照
射光では発生しない波長の光を選択する特性を持たせる
ことでシヤツタは不要となる。

以上のように本実施例では側方３個の検出器で６チャ
ンネル検出が可能で、これに前方散乱光を加えた計７種
類の異なる光学特性の光が検出可能となる。

［発明の効果］以上本発明によれば、光検出器の数以上の種類のパラ
メータを得ることができる。これにより従来と同等の性
能がよりコンパクト・低コストで実現できる。また従
来、光学配置的に困難であった４種類以上の光学特性の
異なる光の検出も容易に行なえる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図は本発明の実施例の構成図、第３図は各部の信号波形図、第４図は照射系の変形例、第５図はシヤツタの配置の変形例を示す図、第６図は従来の検体検査装置の構成図、であり、図中の主な符号は、１……フローセル、２、３……レーザ光源、８……光検出器、７、13……視野絞り、 21a,21b,31a,31b,41a,41b……ダイクロイツクミラー、 22a,22b,32a,32b,42a,42b……バンドパスフイルタ、 23a,23b,33a,33b,43a,43b……シヤツタ、 25、35、45……光検出器、

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】サンプル中の個々の検体を順次流す手段
と、第１、第２の照射光を検体の流れ方向に間隔を置いて第
１の位置と第２の位置に照射する手段と、前記第１、第２の被検位置を通過する検体から発するそ
れぞれの光を受光する共通の光検出手段と、検体が前記第１の位置を通過する際には検体から発する
第１の光学特性の光を選択的に前記光検出器に導き、検
体が前記第２の位置を通過する際には検体から発する第
２の光学特性の光を選択的に前記光検出器に導く選択手
段と、を有することを特徴とする検体測定装置。
【請求項２】前記選択手段は、前記各被検位置から前記
光検出器まで光路を第１、第２の光路に分割して、検体
が前記第１の被検位置を通過する際には前記第１の光路
を選択し、検体が前記第２の被検位置を通過する際には
前記第２の光路を選択する請求項（１）記載の検体測定
装置。
【請求項３】前記選択手段は、光路中前記光検出器の手
前に光路を分割するように配置される第１の光学選択部
材と第１のシャッタ、及び第２の光学選択部材と第２の
シャッタの組であり、被検粒子が前記第１の位置を通過
する際には前記第１のシャッタを開けて前記第２のシャ
ッタを閉じ、被検粒子が前記第２の位置を通過する際に
は前記第１のシャッタを閉じて前記第２のシャッタを開
けるように制御する請求項（２）記載の検体測定装置。
【請求項４】前記第１、第２の照射光は単一の光源から
の光ビームを光学的に２光束に分割したものである請求
項（１）記載の検体測定装置。
【請求項５】前記第１、第２の照射光はそれぞれ異なる
波長の光である請求項（１）記載の検体測定装置。
【請求項６】前記選択手段は、光路中前記光検出器の手
前に光路を分割するように配置される第１の光学選択部
材及び第２の光学選択部材であり、前記第１の光学選択
部材は前記第１の照射光で発生して前記第２の照射光で
は発生しない波長の光を選別する特性を有し、前記第２
の光学選択部材は前記第２の照射光で発生して前記第１
の照射光では発生しない波長の光を選別する特性を有す
る請求項（５）記載の検体測定装置。
【請求項７】前記検体は複数種の蛍光で染色される請求
項（１）記載の検体測定装置。
【請求項８】サンプル中の個々の検体を順次流す行程
と、複数の照射光を検体の流れ方向に間隔を置いて照射する
行程と、各照射位置を通過する検体から発する異なる波長の光
を、共通の光検出器にて時系列的に受光する行程と、を有することを特徴とする検体測定方法。