JPS61280548A - 粒子解析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、フローサイトメータ等において、合焦状態の
判定を可能とした粒子解析装置に関するものである。

［従来の技術］ フローサイトメータ等に用いられる従来の粒子解析装置
では、フローセルの中央部の例えば２００　ｇｍＸ　２
００　ｐｍの微小な矩形断面を有する流通部内を、シー
ス液に包まれて通過する血球細胞などの検体にレーザー
光等の照射光を照射し、その結果として生ずる前方及び
側方散乱光により、検体の形状・大きさ中屈折率等の粒
子的性質を得ることが可能である。また、蛍光剤により
染色され得る検体に対しては、照射光とほぼ直角方向の
側方散乱光から検体の蛍光を検出することにより、検体
を解析するための重要な情報を求めることができる。

フローサイトメータ等において正確な測定を行うために
は、検体粒子以外の物体からの疑似信号が混入しないよ
うに、測光用の対物レンズにより正確に検体粒子或いは
その極〈近傍のみを集光させなければならない、そのた
めに、測光用対物レンズの焦点調整を行う必要があるが
、従来装置においては測定前に標準サンプルを流しなが
ら操作者が目視により手動で焦点調整を行っているので
、操作が繁雑である上に、操作者によって個人差が生じ
、十分に正確な焦点調整を行うことが困難であるのが現
状である。

また、測定中に焦点の移動が生じた場合に、その確認が
不可能なため、測定途中で疑似信号が混入したか否かを
判別できず、データの信頼性についての不安も有してい
る。

更に、ノズルやフローセル等を交換するコトニ焦点調整
を必要とし、測定に手間が掛かる欠点がある。また、蛍
光測定を行う場合に微弱な蛍光信号を強化する必要があ
るが、そのために蛍光を検出する光電検出器をフォトマ
ルにすること・蛍光剤の発光効率を向上させること・照
射光源のパワーを増大させること・・測光用対物レンズ
の集光効率を向上させること等が考えられている。測光
用対物レンズの集光効率の向上は、対物レンズの開口数
を上げれば達成されるが、その代償として焦点深度が浅
くなるという逆効果を伴うことになる。焦点深度が浅く
なれば、流通部と対物レンズとの間の距離が僅かに変動
しただけでも、検体粒子からの信号だけてなく、他の物
体からの信号が混入してしまい、正確な測定を行うこと
ができない、このように、従来装置では焦点調整が繁雑
である上に、十分な蛍光信号強度が得られず、解析精度
が向上しないという欠点を有している。

このような欠点を除去するために、先に水出願人は特願
昭６０−７０４０号を出願した。この装置は測光対物レ
ンズと別の光路から合焦用光束をフローセル流通部前面
及び後面に照射し、その反射光を分割型素子の光電検出
器で把え、分割型素子におけるそれぞれの出力信号が同
じ大きさになるまで、測光用対物レンズと合焦光学系と
を同時に移動させることにより合焦させる方式のもので
ある。

この装置においては、通常は十分に精度の良い合焦状態
が得られるが、分割素子による出方信号の大きさを比較
して合焦状態を測定しているために、フローセル流通部
の内部が相当に汚れて反射強度が減少した場合等には、
出方信号の大きさの比較が困難になることがある。

［発明の目的］ 本発明の目的は、焦点調整を正確に行い高精度な解析を
可能とすると共に、容易に操作できる粒子解析装置を提
供することにある。

［発明の概要］ 上述の目的を達成するための本発明の要旨は、ブローセ
ルの流通部を流れる検体粒子に光ビームを照射する照射
光学系と、該光ビームが検体粒子によって散乱された散
乱光を測定する測光光学系とを備え、前記流通部に少な
くとも２つの指標光束を投射し１位置検出素子で得られ
る前記流通部の前後の境界面による少なくとも計４個の
指標反射像の出力パターン信号により合焦状態を検出す
る焦点検出手段を設けたことを特徴とする粒子解析装置
である。

［発明の実施例］ 本発明を図示の実施例に基づいて詳細に説明する。

第１図、第２図は粒子解析装置の構成図であり、第１図
は紙面内を検体粒子Ｓが流れている状態を示したフロー
セル及び流通部と、側方散乱光の検出光学系及び合焦用
光学系を示し、第２図は第１図を°■−■断面から見た
図、即ち紙面を垂直に検体粒子Ｓが流れている状態のフ
ローセル流通部、レーザー照射光学系、前方散乱光検出
光学系及び側方散乱の光検出光学系の一部を示したもの
である。フローセル部１にサンプル液湾入口Ａ、シース
液流入口Ｂが接続され、フローセル部１の先端のオリフ
ィスから高速層流となったシース液に包まれて流体力学
的焦点合わせが行われた検体粒子Ｓが流出し、フローセ
ル流通部２においてレーザー光照射が行われた後に、末
端部Ｃからドレインとして排出されるようになっている
。

レー・ザー光源３から出射されたレーザー光りは、光軸
０１に沿って結像レンズ系を介してフローセル流通部２
を通過し、集光レンズ５を経て光電検出器６に至るよう
になっている。

また、検体粒子Ｓの流れの中心軸Ｚ、及びレーザー光り
の光軸０１のそれぞれにほぼ直交する方向の光軸０２に
沿って、凸レンズ７舎凹レンズ８から成る測光用対物レ
ンズ系９、グイクロイックミラー等の波長選別手段１０
、凸レンズ１１、絞り１２、凸レンズ１３、波長選別手
段１４及び１５、反射鏡１６が順次に配列されている。

そして、側方散乱光の光軸０２に対して斜設された波長
選別手段１４．１５及び反射鏡１６により反射される方
向の光路上に、凸レンズ１７１１バリヤフイルタ１８・
光ファイバ１９の一端、凸レンズ２０ｅバリヤフイルタ
２１−光ファイバ２２の一端、凸レンズ２３１１バリヤ
フイルタ２４・光ファイバ２５の一端がそれぞれ対応し
て配置されている。

そして、これらの光ファイバ１９．２２．２５の他端り
、Ｅ、Ｆには図示しない光電検出器がそれぞれ接続され
ている。これらの光電検出器としては、微弱光を増倍し
て検出することが可能なフォトマルが通常使用されてい
る。

更に、光軸０２に対して斜設された波長選別手段１０の
反射側には、順次に凸レンズ２８、ハーフミラ−２７、
第１図（ａ）に示すように２個の開口を有する開口絞り
２８、（ｂ）に示すように１個のスリット孔を有する開
口絞り２９、及び合焦用光＠３０が配されている。また
、光路中に傾設されたハーフミラ−２７の反射側には順
次にバントハスフィルタ３１、（Ｃ）に示すアレイセン
サ３２が配置されている。

結像レンズ系４としては、通常２組のシリンドリカルレ
ンズを直交させたものが用いられ、これによりレーザー
光りは任意の長径・短径の結像ビームに成形され、検体
粒子Ｓに照射される。

レーザー光りの検体粒子Ｓによる散乱光のうち、前方散
乱光は集光レンズ５を介して光電検出器６に集光され、
検体粒子Ｓの性状が測定される。光電検出器６における
出力信号の強度は検体粒子Ｓの大きさと相関しているの
で、前方散乱光は通常検体粒子Ｓの大きさの決定に用い
られる。

また、各種蛍光剤により染色された検体粒子Ｓについて
は、側方散乱光として測光用対物レンズ系９及び凸レン
ズ１１により絞り１２に集光される。なお、絞り１２は
検体粒子Ｓに共役な位置に設置されており、側方散乱光
及び蛍光をこの絞り１２を通過させることにより、雑音
の少ない測光信号を得ることができる。蛍光染色された
検体粒子Ｓについての測定の際には、通常Ａｒ”の４８
８ｎｍのレーザー光が用いられ、検体粒子Ｓは緑色又は
赤色の蛍光を発する０例えば、ＤＮＡ量検出用のＰＩ（
ヨウ化プロプイウム）によって染色された検体粒子Ｓは
赤色の蛍光を発し、細胞膜表面抗原検出用のＦＩＴＣ（
フルオレセインイソシアン酸ｔｈｊりに染色された検体
粒子Ｓは緑色の蛍光を発し、アクリジンオレンジで蛍光
染色された゛検体粒子ＳのＤＮＡからの蛍光は赤色を呈
することが知られている。また、Ａｒ”レーザーの波長
で９０″方向に散乱される光の量は検体粒子Ｓの内部の
複雑性を反映することが知られている・近年、各種蛍光
プローブ即ち細胞内核酸、タンパク質等に結び付く蛍光
染料が開発されており、検査目的に応じて使い分けられ
るようになってきているが、通常では側方散乱光を適当
に波長選別し、それぞれの測定値を得るようにしている
。即ち、絞り１２を通過後の光束を凸レンズ１３により
平行光束とし、適当な分光特性を持たせたグイクロイッ
クミラー等の波長選別手段１４によって側方散乱光と蛍
光とに分光し、側方散乱光は凸レンズ１７．バリヤフィ
ルタ１８、光ファイ／＜１９を介して光電検出器で検出
され、検体粒子Ｓ内部の顆粒性が観測される。レーザー
光源としてＡｒ″′４８８ｎｍレーザー光が用いられた
場合には、波長選別手段１４は４８８ｎｍよりも長波長
の光を通す特性を有するものとし、バリヤフィルタ１８
は４８８ｎｍの光を通すバンドパスフィルタとすればよ
い。

一方、蛍光は波長選別手段１４を通過し１例えば緑色反
射、赤色透過の特性を有するグイクロイックミラー等の
波長選別手段１５によって緑色蛍光と赤色蛍光に分光さ
れ、緑色蛍光は凸レンズ２０、緑色のみを通すバンドパ
スフィルタであるバリヤフィルタ２１及び光ファイバ２
２を介して光電検出器で検出される。また、赤色蛍光は
反射鏡１６と凸レンズ２３、赤色を通すバンドパスフィ
ルタであるバリヤフィルタ２４及び光ファイバ２５を介
して光電検出器で検出され、検体粒子Ｓの生化学的性質
が観測される。

なお、通常蛍光を選別する波長選別手段１５としては緑
赤二色のグイクロイックミラーが使用されているが、例
えば波長を連続的に分光できる分光プリズム或いは回折
格子等の波長選別手段を用いてもよい、また、反射鏡１
６は赤色のみを反射するグイクロイックミラーとしても
支障はない。

次に、測光用対物レンズ系９゛の合焦状態を検出する手
段について説明する０合焦用光源３０の波長は流通部２
内での散乱光の測定に影響を及ぼさないように、レーザ
ー光源３の波長や蛍光の波長と分離している方が望まし
いので、赤外光源を使用することが好適である。従って
、光源３０は赤外域の光を発するものとし、波長選別手
段１０は赤外光を反射し、可視域の光を通す特性を有す
るものとする。

第１図（ｂ）に示すスリット状の開口絞り２９を通過し
た光源３０からめ光束は、（ａ）に示す開口絞り２８に
よって２木の光束に絞られた後に、ハーフミラ−２７、
凸レンズ２６を介して波長選別手段１０によって対物レ
ンズ系９側に反射される。そして、対物レンズ系９によ
ってフローセル流通部２に集光され、２つの指標光束は
流通部２の前面及び後面でそれぞれ反射されて計４個の
反、射像となる。これらの反射光は対物レンズ系９によ
って再び屈折された後に、波長選別手段１０によって反
射され、凸レンズ２６を介してハーフミラ−２７によっ
て反射され、バリヤフィルタ３１を介してアレイセンサ
３２上に開口絞り２９の２つの像が結像される。なお、
バリヤフィルタ３１は光源３０の波長域の光のみを通過
させる特性を有するものを使用しているので、外乱の影
響を少　　。

なくすることができる。

ここで、開口絞り２９は流通部２の照射時に流通部２内
に入る大きさの高さと幅のスリット孔を有しており、ア
レイセンサ３２は光学的に凸レンズ２６と等価な位置に
あり、対物レンズ系９が合焦時には、アレイセンサ３２
は流通部２と光学的に共役になるように配されている。

また、アレイセンサ３２と開口絞り２９とは光学的に等
位置に配されており、対物レンズ系９が合焦状態で流通
部２の中央に焦点が合っているときには、合焦用光束は
細い光束の状態で流通部２の前面及び後面に照射され、
第３図（ａ）に示すように各指標光束は前面と後面とで
反射されて重なり合い、アレイセンサ３２から２本の鮮
明なピーク状のパターン信号が得られることになる。一
方、対物レンズ系９が非合焦状態で流通部２の前面又は
後面に焦点が合っている場合には、第３図（ｂ）に示す
ようにアレイセンサ３２上には３本のピークが形成され
、流通部２に全く焦点が合っていないときには（Ｃ）に
示す拡りを持ったパターン信号が得られることになる。

フローセル流通部２が清浄な状態で測定を開始しても、
測定を繰り返すうちに、流通部２の内部にサンプル液に
よる汚れが付着し、流通部２の前面及び後面の反射面が
清浄な状態でなくなる。このような状態になると反射強
度が減少し、流通部２からの反射光を受光する光電検出
器を分割素子等で構成し、そこで得られる出力の大小に
よって合焦状態を判定する方式では、この大小の比較が
困難となる。しかし本実施例においては、アレイセンサ
３２上に得られたパターン信号のピークのみに注目して
いればよいので、反射強度に殆ど影響されずに合焦検出
を行うことができることになる。

このようにして得られた合焦検出信号を例えばオシロス
コープに表示することにより、手動で対物レンズ系９を
動かして合焦することができる。

また、この合焦検出信号によって駆動される機構、例え
ばサーボ系によるモータ駆動機構等を設け、アレイセン
サ３２上に２本のピークを有する信号波形が得られるま
で、対物レンズ系９を含む合焦系を駆動機構により測光
光学系光軸上を探索移動させ５合焦波形の信号により駆
動機構を停止させるようにすれば、自動的に合焦状態が
得られ更に操作性が良くなる。

また、合焦駆動機構の停止した状態の信号、或いはアレ
イセンサ３２の合焦時出力信号により粒子解析装置の測
定開始信号を発するようにすれば、合焦していないとき
には不正確な測定が行われないで済む、なお、対物レン
ズ系９及び合焦光学系を駆動させる代りに、アレイセン
サ３２の信号により、フローセル部１を手動又は自動で
駆動して焦点調整を行うことも可能である。また、開口
絞り２８における開口は２個ではなく、それ以上の数と
してもよい。

以上の説明では合焦検出について述べたが、本装置を合
軸検出についても利用することができる。即ち、合軸時
の出力信号波形の中心値の設定された中心位置からのず
れによって合軸か否かを判定することも可能である。

［発明の効果］ 以上説明したように本発明に係る粒子解析装置は、出力
パターン信号により位置検出が可能な焦点検出素子を有
する焦点検出手段を設けることによって、フローセル流
通部の内面の汚れ等の外乱に影響されずに、常に測光用
対物レンズの焦点調整を容易にかつ正確に行うことを可
能とし、測定精度を向上させ対物レンズの開口数を増す
こともでき、これによって蛍光測定強度を向上させ、高
精度な解析を可能としている。

また所望によっては、焦点検出手段を駆動する機構を設
けることによって、全自動的に焦点調整を行うことも可
能となり、更に合焦状態にのみ装置が可動する機構を設
けて、測定操作を更に容易にすることもできる。

【図面の簡単な説明】 図面は本発明に係る粒子解析装置の一実施例を示すもの
であり、第１図は側方から見た光学系配置図、第２図は
上方から見た光学系配置図、第３図（ａ）　、　（ｂ）
　、　（ｃ）は合焦検出素子上の光像分布の説明図であ
る。 符号１はフローセル部、２は流通部、３はレーザー光源
、４は結像レンズ系、５．１１．１３．１７．２０．２
３．２６は集光レンズ、６は光電検出器、７は凸レンズ
、８は凹レンズ、９は対物レンズ系、１０，１４．１５
は波長選別手段、１２．２８．２９は絞り、ｉａは反射
鏡、１８．２１．２４．３１はバリヤフィルタ、１９．
２２．２５は光ファイバ、３ｏは合焦用光源、３２はア
レイセンサである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フローセルの流通部を流れる検体粒子に光ビームを
   照射する照射光学系と、該光ビームが検体粒子によって
   散乱された散乱光を測定する測光光学系とを備え、前記
   流通部に少なくとも２つの指標光束を投射し、位置検出
   素子で得られる前記流通部の前後の境界面による少なく
   とも計４個の指標反射像の出力パターン信号により合焦
   状態を検出する焦点検出手段を設けたことを特徴とする
   粒子解析装置。 ２、前記合焦状態は前記少なくとも計４個の指標反射像
   が２個ずつ合成されたパターン信号が分離して識別でき
   る場合に合焦とするようにした特許請求の範囲第１項に
   記載の粒子解析装置。 ３、前記焦点検出手段と前記測光光学系とは、測光用対
   物レンズを共有するようにした特許請求の範囲第１項に
   記載の粒子解析装置。 ４、前記焦点検出手段は散乱光の測光に使用する波長領
   域外の波長域の光を使用するようにした特許請求の範囲
   第１項に記載の粒子解析装置。 ５、前記焦点検出手段と前記測光光学系との光路を第１
   の光分割部材により分割し、該第１の光分割部材は前記
   焦点検出手段使用波長域と測光波長域とを分割する特性
   を有する波長選択性反射部材とした特許請求の範囲第４
   項に記載の粒子解析装置。 ８、前記焦点検出手段において、第２の光分割部材を介
   して指標投影光学系及び指標検知光学系に分割した特許
   請求の範囲第１項に記載の粒子解析装置。 ７、前記指標投影光学系内に少なくとも第１、第２の２
   個の開口絞りを設置した特許請求の範囲第６項に記載の
   粒子解析装置。 ８、前記第１の開口絞りは、流通部の幅内に入る指標像
   を流通部に投影するための１個のスリット孔を有するよ
   うにした特許請求の範囲第７項に記載の粒子解析装置。 ９、前記第２の開口絞りは２分割された開口を有するも
   のとした特許請求の範囲第７項に記載の粒子解析装置。