JPH0552897B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、フローサイトメータ等において、測
光用対物レンズの合軸状態の判定を可能とした粒
子解析装置に関するものである。

［従来の技術］ フローサイトメータ等に用いられる従来の粒子
解析装置では、フローセルの中央部の例えば70μ
ｍ×20μｍの微小な矩形断面を有する流通部内
を、シース液に包まれて通過する血球細胞などの
検体に照射光を照射し、その結果生ずる前方及び
側方散乱光により、検体の形状・大きさ・屈折率
等の粒子的性質を得ることが可能である。また、
蛍光剤により染色され得る検体に対しては、照射
光とほほ直角方向の側方散乱光から検体の蛍光を
検出することにより、検体を解析するための重要
な情報を求めることができる。

フローサイトメータ等において正確な測定を行
うためには、検体粒子以外の物体からの疑似信号
が混入しないように、測光用の対物レンズにより
正確に検体粒子或いはその極く近傍のみを集光さ
せると共に、検体粒子の流れの軸と光軸とを正確
に一致させなければならない。そのために、測光
用対物レンズの光軸調整及び焦点調整を行う必要
があるが、従来装置においては測定前に標準サン
プルを流しながら、操作者が目視により手動で光
軸調整及び焦点調整を行つているので、操作が繁
雑である上に、操作者によつて個人差が生じ、十
分に正確な光軸調整及び焦点調整を行うことが困
難である。

また、測定中に光軸及び焦点の移動が生じた場
合に、その確認が不可能なため、測定途中で疑似
信号が混入したか否かを判別できず、データの信
頼性についての不安がある。

更に、ノズルやフローセル等を交換するごとに
光軸及び焦点調整を必要とし、測定に手間が掛か
る欠点がある。また、蛍光測定を行う場合に微弱
な蛍光信号を強化する必要があるが、そのために
蛍光を検出する光電検出器をフオトマルにするこ
と・蛍光剤の発光効率を向上させること・照射光
源のパワーを増大させること・対物レンズの集光
効率を向上させること等が考えられている。蛍光
剤の発光効率は現在のところ盛んに研究されてお
り、照射光源のパワーの増大は製造コストを無視
すれば相当に増大させることができるが、反面で
極端にパワーを増大させ過ぎると検体粒子を傷付
けることにもなり良い方法とは云い難い。

測光用対物レンズの集光効率の向上は、対物レ
ンズの開口数を上げれば達成されるが、その代償
として焦点深度が浅くなるという逆効果を伴うこ
とになる。焦点深度が浅くなれば、流通部と対物
レンズとの間の距離が僅かに移動しただけでも、
検体粒子からの信号だけでなく他の物体からの信
号が混入してしまい、正確な測定を行うことがで
きない。このように、従来装置では焦点調整が繁
雑である上に、十分な蛍光信号強度が得られず、
解析精度が向上しないという欠点がある。

［発明の目的］ 本発明の目的は、測光用対物レンズの検体粒子
に対する合軸状態を検出し、光軸調整を容易にし
かも正確に行い得ると共に、十分な蛍光信号強度
を得ることによつて測定精度を向上させ得る粒子
解析装置を提供することにある。

［発明の概要］ 上述の目的を達成するための本発明の要旨は、
フローセル内の流通部を流れる検体粒子に光ビー
ムを照射する照射光学系と、前記光ビームの検体
粒子への照射によつて発生する光を測定用対物レ
ンズを介して測光する測光光学系と、前記測光用
対物レンズの合軸状態を検出するために前記測光
光学系内に設けた合軸検出手段とを備えたことを
特徴とする粒子解析装置である。

［発明の実施例］ 本発明を図示の実施例に基づいて詳細に説明す
る。

第１図は粒子解析装置の構成図であり、フロー
セル１の中央部の紙面に垂直の流通部２内を検体
粒子Ｓが通過し、この流れと直交する方向にレー
ザー光源３が配置されている。このレーザー光源
３から出射されたレーザー光Ｌの光軸Ｏ上に、検
体粒子Ｓに対してレーザー光源３側に２組のシリ
ンドリカルレンズを直交させて成る結像レンズ４
が配置されている。また、検体粒子Ｓに対してレ
ーザー光源３と反対側の光軸Ｏ上に、遮光板５、
集光レンズ６、光電検出器７が順次に配列されて
いる。

また、レーザー光Ｌの光軸Ｏ及び検体粒子Ｓの
流れの中心方向のそれぞれとほぼ直交する方向
に、測光用対物レンズ８を含むオートフオーカス
及びオートアライメントユニツト（以下AF・
AAユニツトと云う）９、集光レンズ１０、絞り
板１１、集光レンズ１２、ダイクロイツクミラー
等から成る波長選別手段１３，１４，１５が順次
に配列され、光路に対して斜設されたこれらの波
長選別手段１３，１４，１５により反射された方
向の光軸上に、バリヤフイルタ１６・光電検出器
１７、バリヤフイルタ１８・光電検出器１９、バ
リヤフイルタ２０・光電検出器２１がそれぞれ配
置されている。そして、これらの光電検出器１
７，１９，２１には、例えば微弱光を増強して検
出することが可能なフオトマルが使用されてい
る。

従つて、レーザー光源３から出射されたレーザ
ー光Ｌは、２組のシリンドリカルレンズを直交さ
せた結像レンズ４により任意の長径・短径の結像
ビームに成形され、流通部２内を流れる検体粒子
Ｓに照射される。検体粒子Ｓに照射され散乱され
た散乱光のうち、前方散乱光は遮光板５によつて
検体粒子Ｓが無い位置を通過した照射光が取り除
かれ、集光レンズ６を介して光電検出器７に集光
され、検体粒子Ｓの性状が測定される。

また、各種蛍光剤により染色された検体粒子Ｓ
については、側方散乱光としてAF.AAユニツト
９内の対物レンズ８を介して、集光レンズ１０に
より絞り板１１に集光される。側方散乱光及び蛍
光は、検体粒子Ｓに共役な位置に設置されたこの
絞り板１１を通過させることにより、雑音の少な
い測光信号を得ることができる。絞り板１１を通
過後の光束を集光レンズ１２により平行光束と
し、適当な分光特性を持たせた波長選別手段１３
によつて側方散乱光と蛍光とに分光し、側方散乱
光はバリヤフイルタ１６及び光電検出器１７で検
出され、検体粒子Ｓ内部の顆粒性が観測できる。
一方、蛍光は波長選別手段１３を通過し、波長選
別手段１４によつて例えば緑色蛍光と赤色蛍光と
に分光され、緑色蛍光はバリヤフイルタ１８を介
して光電検出器１９で検出され、赤色蛍光は波長
選別手段１５とバリヤフイルタ２０を介して光電
検出器２１で検出され、検体粒子の生化学的性質
が観測される。

なお、蛍光を選別する波長選別手段１４，１５
としては緑赤二色のダイクロイツクミラーが使用
されているが、例えば波長を連続的に分光できる
分光プリズム或いは回折格子等の波長選別手段を
用いてもよい。また、光源３と結像レンズ４との
間に、ビームエキスパンダ又はビームコンプレツ
サ等のビーム径可変手段を挿入することもでき
る。

ここで微弱光の集光効率を上げ、なおかつ正確
に合焦・合軸状態を得ることのできるAF・AA
ユニツト９について、第２図以下に説明する。第
２図はフローセル１とAF・AAユニツト９を側
方から見た断面図、第３図はフローセル１の水平
断面図であり、AF・AAユニツト９内の中央に
は測光用対物レンズ８が設置され、下部には光源
２２がフローセル１に光を照射するように設置さ
れ、光源２２の光軸上に開口２３、凸レンズ２４
が順次に配置されている。また、フローセル１の
流通部２の前面２ａと後面２ｂとによつて反射さ
れた光の光路上に、凸レンズ２５、分割素子２６
が順次に配置されている。

この場合に、対物レンズ８は流通部２の中心に
焦点が合う状態で、流通部２からの集光光束が対
物レンズ８によつて平行光束になるように配置さ
れており、この状態のとき合軸用光学系２２〜２
６は、流通部２の前面２ａ及び後面２ｂを検出す
るように配置されている。即ち、光源２２により
凸レンズ２４を介して、開口２３を通過した光束
を前面２ａ及び後面２ｂに投影し、前面２ａ及び
後面２ｂでそれぞれ反射された開口２３の２つの
開口像が、凸レンズ２５を介して分割素子２６上
にそれぞれ結像される。

分割素子２６としては４分割素子が使用されて
おり、第２図に示す状態では対物レンズ８は合焦
しているため、このときの開口２３の２つの開口
像Ｍ１，Ｍ２が第４図ｂに示すように分割素子２
６の４分割面の及びを組み合わせた面と、
及びを組み合わせた面とに同一の大きさで結像
される。分割素子２６の面、、、の出力
をそれぞれP1、P2、P3、P4とすると、合焦時に
はP1＋P2＝P3＋P4の関係となるように分割素子
２６が配置されている。従つて、第４図ａ，ｃに
示すようにP1＋P2≠P3＋P4となつた場合には、
対物レンズ８が合焦していないことが判る。

このように、分割素子２６の出力からP1＋P2
＝P3＋P4を満足したときには、必ず対物レンズ
８は流通部２の中心に合焦し、常に対物レンズ８
からは検体粒子Ｓの像の平行光束が得られること
になる。また、集光レンズ１０の集光位置に絞り
板１１が配置されているので、AF・AAユニツ
ト９の光軸に沿つた移動によつて合焦したときに
は、流通部２は絞り板１１と共役関係になり、検
体粒子Ｓによる散乱光が正確に絞り板１１の位置
に集光される。

このようにして焦点調整が可能であるが、４分
割素子２６を使用しているため、同一の光学系に
より同時に光軸調整を実行することが可能とな
る。流通部２の中心と光軸とが一致しているとき
の流通部２における照射光Ｎの位置が、第５図ｂ
となるようにAF・AAユニツト９を配しておけ
ば、第５図ａ及びｃに示すように照射光Ｎがずれ
て、斜線のように流通部２からはみ出した場合に
は合軸していないことが判る。

第５図ａ〜ｃの状態はそれぞれ第６図における
ａ〜ｃの分割素子２６の面上の光像分布に相当
し、分割素子２６の出力の関係は合軸している場
合にはP1＋P4＝P2＋P3となり、合軸していない
場合にはP1＋P4≠P2＋P3となる。第６図ｂは合
焦・合軸が同時に満された場合の分割素子２６の
面上での開口像Ｍ１，Ｍ２の分布を示している。
このときには分割素子２６の出力は、P1＋P2＝
P3＋P4であると同時にP1＋P4＝P2＋P3である
から、ｂからも直ちに判るようにP1＝P2＝P3＝
P4となる。

第６図ａ及びｃは合焦でありながら、第５図ａ
及びｃに示すように合軸していない場合であり、
これらの場合には斜線で示した流通部２からはみ
出した部分からは光が反射されないので、分割素
子２６の出力は、P2＋P3＜P1＋P4又はP1＋P4
＜P2＋P3となり、合焦・合軸条件P1＝P2＝P3＝
P4が成立しない。従つて、４分割素子２６から
の出力を比較し、それらが全て等しいか否かによ
り合焦・合軸状態を同時に判別できることにな
る。

ここで、対物レンズ８と集光レンズ１０とは、
その間が平行光束になるように組み合わされてい
るため、フローセル１等の交換時等にフローセル
１の中心軸の位置が光軸上及び先軸から若干ずれ
て移動しても、AF・AAユニツト９を移動させ
て、分割素子２６の合焦・合軸位置に開口２３の
開口像Ｍ１，Ｍ２を結像させるだけで焦点及び光
軸を合わせることができる。

このように、実施例では容易にしかも正確に合
焦・合軸を検出し、更に調整ができるので、精度
の良い測定が可能であると共に、正確なピントを
保持させたまま測光用対物レンズ８の開口数を上
げ、光学系の集光効率を向上させて、信号強度を
増大させることができることになる。

なお、合焦・合軸用光源２２から出力する光の
波長は、フローセル１内での散乱等により測定に
影響を及ぼさないように、レーザー光源３の波長
や蛍光の波長と分離している方が好ましいので、
赤外光源を使用することが好適である。

また、分割素子２６の出力信号によつて駆動さ
れる機構を設け、分割素子２６の所定位置に開口
２３の開口像Ｍ１，Ｍ２が結像されるまで、
AF・AAユニツト９を駆動機構により光軸上を
探索移動させ、合軸及び合焦した信号により駆動
機構を停止させるようにすれば、自動的に合軸及
び合焦状態が得られる。即ち、焦点調整について
はAF・AAユニツト９を光軸に沿つて、光軸調
整についてはAF・AAユニツト９を光軸の左右
に移動すればよいことになる。

また、AF・AAユニツト９の駆動機構が停止
した状態の信号、或いは合焦・合軸時の分割素子
２６の出力信号により、粒子解析装置の測定開始
信号を発するようにすれば、対物レンズ８が合焦
及び合軸していないときには、不正確な測定が行
われないで済む。更に、分割素子２６の所定位置
に開口２３の開口像が結像したことを知らせる合
焦・合軸信号を表示する手段を設けることもで
き、手動でAF・AAユニツト９を操作する場合
には、合焦・合軸信号が出力した時点で測定を始
めるようにすればよい。

なお、AF・AAユニツト９内の合焦・合軸検
知用光学系の配置は実施例だけに限らず、例えば
光源２２を対物レンズ８の上方に配置してもよ
い。また実施例においては、側方散乱光の測光光
学系内にAF・AAユニツト９を設置した場合を
説明したが、前方散乱光用の測光光学系において
も、遮光板５と集光レンズ６との間にAF・AA
ユニツトを配置し、同様の効果を得ることができ
る。このようなAF・AAユニツトを側方・前方
の両測光光学系に設置すれば、更に良好な結果が
得られる。

［発明の効果］ 以上説明したように本発明に係る粒子解析装置
光学系は、測光光学系内に光軸を検出できる光軸
検出手段を設置することによつて、測光用対物レ
ンズの光軸調整を容易にかつ正確に行うことを可
能として測定精度を向上させ、対物レンズの開口
数を増すこともでき、これによつて蛍光測光強度
を向上させ、高精度な解析を可能としている。

また必要に応じて、光軸及び焦点検出手段を駆
動する機構を設けることにより、全自動的に光軸
及び焦点調整を行うことも可能である。更に、合
焦・合軸信号表示機構を設けることによつて、手
動でも容易に光軸及び焦点調整を行うことを可能
とし、また合焦・合軸状態においてのみ装置が可
動する機構を設けこともできる。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明に係る粒子解析装置の一実施例を
示し、第１図は光学系の構成図、第２図はAF・
AAユニツトを側方から見た光学系配置図、第３
図はフローセルの水平断面図、第４図ａ，ｂ，ｃ
は合焦検出時の分割素子上の光像分布の説明図、
第５図ａ，ｂ，ｃは合軸検出時の流通部における
照射光の説明図、第６図ａ，ｂ，ｃは合焦・合軸
検出時の分割素子上の光像分布の説明図である。 符号１はフローセル、２は流通部、２ａは前
面、２ｂは後面、３はレーザー光源、４は結像レ
ンズ、８は測光用対物レンズ、９はAF・AAユ
ニツト、１０，１２は集光レンズ、１１は絞り
板、１３，１４，１５は波長選別手段、１６，１
８，２０はバリヤフイルタ、１７，１９，２１は
光電検出器、２２は光源、２３は開口、２４，２
５は凸レンズ、２６は分割素子である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ フローセル内の流通部を流れる検体粒子に光
   ビームを照射する照射光学系と、前記光ビームの
   検体粒子への照射によつて発生する光を測光用対
   物レンズを介して測光する測光光学系と、前記測
   光用対物レンズの合軸状態を検出するために前記
   測光光学系内に設けた合軸検出手段とを備えたこ
   とを特徴とする粒子解析装置。