JP5052318B2

JP5052318B2 - 蛍光検出装置

Info

Publication number: JP5052318B2
Application number: JP2007319256A
Authority: JP
Inventors: 弘能林
Original assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Current assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Priority date: 2007-12-11
Filing date: 2007-12-11
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2027-12-11
Also published as: JP2009145044A

Description

本発明は、測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置に関する。

医療、生物分野で用いられるフローサイトメータには、レーザ光を照射することにより測定対象物の蛍光色素からの蛍光を受光して、測定対象物の種類を識別する蛍光検出装置が組み込まれている。特に、近年、タンパク質等の細胞内から発する微弱な蛍光を測定することが試みられている。この微弱な蛍光の蛍光強度を求め、蛍光強度の頻度分布を求めることで、所定の蛍光が発せられたか否か、また、異なる微弱な蛍光が存在するか等を分析することができる。
細胞内から発する微弱な蛍光を測定し、正確な結論を導き出すために、計測分解能を向上させることの他に、ＳＮ比の向上が必要となっている。

下記特許文献１には、蛍光の集光レンズと対向した位置に反射部を設け、反射部で反射した蛍光を集光レンズに入射させて蛍光検出を行う方法を記載している。
当該文献では、蛍光の集光レンズと対向した位置に反射部を設け、反射部で反射した蛍光を集光レンズに入射させて、蛍光検出を行うので、蛍光を効率よく集光効率を高めることができる、とされている。

特開２００６−２５０６８５号公報

しかし上記特許文献１に記載される装置では、タンパク質等の細胞内から発する微弱な蛍光に対して、ＳＮ比の向上が十分に見られなかった。

そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、タンパク質等の細胞から発する微弱な蛍光に対して、ＳＮ比が十分に向上し、効率よく計測できる蛍光検出装置を提供することを目的とする。

本発明者は、タンパク質等の細胞等の試料を含ませて流すシース液が、レーザ光の照射によって微弱な蛍光を発し、この蛍光が試料から発する蛍光の測定時のＳＮ比を低下させる原因であることを見出し、シース液が発する微弱な蛍光を排除することを目指し、本発明に至っている。

すなわち、本発明は、測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置であって、測定対象物が流れる流路が形成されたフローセル体と、流路中の測定点を通過する測定対象物に対してレーザ光を照射するレーザ光源部と、レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を集光レンズを通して受光して受光信号を出力する受光部と、前記受光部から出力した受光信号から、蛍光強度の出力値を出力する処理部と、を有し、
前記受光部には、前記集光レンズの光軸を前記受光部の蛍光受光面に向けて延長した光路上の前記集光レンズの焦点位置に、ピンホールが設けられ、前記フローセル体を挟んで前記受光部と反対側の前記フローセル体の表面には、第１の球面レンズが設けられ、この第１の球面レンズの球面には反射膜が設けられ、さらに、前記集光レンズの光軸に対して垂直であり、前記流路中の測定点を通る平面上で、前記第１の球面レンズの焦点位置が動くように、前記第１の球面レンズを移動させる第１の移動機構を備えることを特徴とする蛍光検出装置を提供する。

また、前記フローセル体を挟んで前記ピンホールの側の前記フローセル体の表面には、第２の球面レンズが設けられ、さらに、前記集光レンズの光軸に対して垂直であり、前記流路中の測定点を通る平面上で、前記第２の球面レンズの焦点位置が動くように、前記第２の球面レンズを移動させる第２の移動機構を備えることが好ましい。

また、前記第１の球面レンズまたは前記第２の球面レンズは、前記フローセル体の表面に、マッチングオイルを介して設けられていることが好ましい。
さらに、前記第１の球面レンズ及び前記第２の球面レンズの移動は、測定対象物が前記測定点を通過する位置に応じて調整され、さらに、前記集光レンズ及び前記ピンホールも、前記測定対象物が前記測定点を通過する位置に応じて調整されることが好ましい。

本発明の蛍光検出装置の受光部には、集光レンズの光軸を受光部の蛍光受光面に向けて延長した光路上の集光レンズの焦点位置に、ピンホールが設けられている。すなわち受光部は、共焦点光学系を形成するので、測定対象物を囲む周囲の蛍光等を効率よく取り除くことができる。
さらに、フローセル体を挟んで受光部と反対側のフローセル体の表面には、反射膜が設けられた第１の球面レンズが設けられ、この球面レンズの焦点位置が動くように、第１の球面レンズを移動機構により移動させることができるので、測定対象物が流路内で測定点からずれた位置を通過するときでも、第１の球面レンズの位置調整をすることにより、受光部と反対側に向けて発する蛍光は測定対象物の蛍光の発光位置に再帰する。このため、この再帰した蛍光を、測定対象物から受光部に向けて発する蛍光と重ねることができ、蛍光の強度を高め、これにより、微弱な蛍光を効率よく取り込むことができ、測定時のＳＮ比をより向上させることもできる。

さらに、フローセル体を挟んでピンホールの側のフローセル体の表面には、第２の球面レンズが設けられ、この第２の球面レンズの焦点位置が動くように、第２の球面レンズを移動させることができるので、測定対象物が流路内で測定点からずれた位置を通過するときでも、第２の球面レンズの位置調整をすることにより、ピンホールの位置で蛍光が集束するように構成することができ、共焦点光学系を形成する。このため、測定対象物を囲む周囲の蛍光等を効率よく取り除くことができる。

以下、本発明の蛍光検出装置を詳細に説明する。
図１は、本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、レーザ光を測定対象とする細胞等の試料１２に照射し、試料１２中の一部分から発する蛍光を検出して信号処理する信号処理装置（蛍光検出装置）２０と、信号処理装置２０で得られた処理結果から試料１２中の測定対象物の分析を行なう分析装置８０とを有する。

信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、試料１２の蛍光強度の出力値を出力する処理部２８と、所定の強度でレーザ光を照射させ、各処理の動作の制御管理を行う制御部２９と、高速流を形成するシース液に含ませて試料１２を流す管路３０と、管路３０の端に接続され、試料１２のフローを形成し、このフローの経路にレーザ光の測定点をつくるフローセル体３１と、を有する。フローセル体３１の出口側には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の特定の細胞等を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。

レーザ光源部２２は、波長の異なる３つのレーザ光、例えばλ₁＝４０５ｎｍ、λ₂＝５３３ｎｍおよびλ₃＝６５０ｎｍ等のレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、フローセル体３１中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置が試料１２の測定点となっている。

図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
レーザ光源部２２は、３５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視光の、レーザ光を出射する部分で、主に赤色のレーザ光Ｒを所定の強度でレーザ光として出射するＲ光源２２ｒ、緑色のレーザ光Ｇを所定の強度でレーザ光として出射するＧ光源２２ｇおよび青色のレーザ光Ｂを、所定の強度でレーザ光として出射するＢ光源２２ｂと、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射するダイクロイックミラー２３ａ₁、２３ａ₂と、レーザ光Ｒ，ＧおよびＢからなるレーザ光を管路３０中の測定点に集束させるレンズ系２３ｃと、Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂのぞれぞれを駆動するレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂと、供給された信号をレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂに分配する各パワースプリッタ３５と、を有して構成される。
これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。

ダイクロイックミラー２３ａ₁は、レーザ光Ｒを透過し、レーザ光Ｇを反射するミラーであり、ダイクロイックミラー２３ａ₂は、レーザ光ＲおよびＧを透過し、レーザ光Ｂを反射するミラーである。
この構成によりレーザ光Ｒ，ＧおよびＢが合成されて、測定点を通過する試料１２を照射する照射光となる。

レーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂは、処理部２８及び制御部２９に接続されて、レーザ光Ｒ，Ｇ，Ｂの出射の強度が調整されるように構成される。

Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂは、レーザ光Ｒ、ＧおよびＢが蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｒ、ＧおよびＢによって励起される蛍光色素は測定しようとする生体物質等の試料１２に付着されており、測定対象物としてフローセル体３１の測定点を通過する際、測定点でレーザ光Ｒ、ＧおよびＢの照射を受けて特定の波長で蛍光を発する。

受光部２４は、管路３０及びフローセル体３１を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定点を通過する試料１２によってレーザ光が前方散乱することにより試料１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、処理部２８に供給され、処理部２８において試料１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。

一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつフローセル体３１の流路中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料１２が発する蛍光を受光する光電変換器を備える。
図３は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。

図３に示す受光部２６は、試料１２からの蛍光を集束させる集束レンズ２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂ_１，２６ｂ_２と、バンドパスフィルタ２６ｃ_１〜２６ｃ_３と、光電子倍増管等の光電変換器２７ａ〜２７ｃと、ピンポール板２６ｄ₁〜２６ｄ_３を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光をピンポール板２６ｄ₁〜２６ｄ_３に集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー２６ｂ_１，２６ｂ_２は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ_１〜２６ｃ_３でフィルタリングして光電変換器２７ａ〜２７ｃで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂ_１，２６ｂ_２の反射波長帯域および透過波長帯域が設定されている。

バンドパスフィルタ２６ｃ_１〜２６ｃ_３は、各光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、蛍光色素の発する蛍光の波長帯域に対応して設定されている。
ピンホール板２６ｄ₁〜２６ｄ_３は、集束レンズ２６ａの結像位置にピンホールを有するように設けられた板である。すなわち、集束レンズ２６ａとピンホールによって共焦点光学系を形成している。ピンホールが集束レンズ２６ａの結像位置に来るようにピンホール板２６ｄ₁〜２６ｄ_３を配置することで、シース液から発する極微弱な蛍光を排除して試料１２から発する蛍光を各光電変換器２７ａ〜２７ｃは効率よく取り込むことができる。この点は後述する。ピンホールの大きさは、試料１２の大きさに対して、１〜５倍の範囲であることが好ましい。

光電変換器２７ａ〜２７ｃは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。

制御部２９は、所定の強度でレーザ光を照射させ、処理部２８における各処理の動作の制御管理を行う部分である。
処理部２８は、所定の信号処理を行って蛍光強度の出力値を分析装置８０に出力する部分である。

分析装置８０は、処理部２８から供給される出力値を用いて、フローセル体３１の測定点を通過する試料１２中に含まれる生体物質の種類等を特定し、試料１２中に含まれる生体物質の分析を行う装置である。こうして、分析装置８０は、例えば、試料１２中に含まれる生体物質の種類のヒストグラムや各種特性を短時間に求める。

管路３０の下端はフローセル体３１が接続されている。フローセル体３１は、本発明の特徴とする部分である。図４（ａ）は、フローセル体３１の構成と、試料１２から発する蛍光の光路とを説明する図である。図４（ｂ）は、フローセル体３１の斜視図である。
フローセル体３１は、直方体形状の透明性を有する部材であり、石英等によって作られている。
フローセル体３１の側面からレーザ光が入射され、フローセル体３１の内部を通過し、フローセル体３０に設けられた、管路３０から縦方向に延びる流路３１ｂの中心で集束するようになっており、この集束位置が測定点Ｐとなっている。この測定点Ｐは、レーザ光源部２２のレンズ系２３ｃの焦点位置でもある。

ここで、レーザ光が入射するフローセル体３１の受光部２６側の側面には、測定点Ｐを曲率中心位置とする球体の一部分の形状を成す球面レンズ３１ａが設けられている。
一方、流路３１ｂを挟んで、球面レンズ３１ａが設けられた側と反対側の、フローセル体３１の側面には、球面レンズ３１ｃが設けられ、球面レンズ３１ｃの球形状のレンズ表面には、反射膜３１ｄが設けられ、反射レンズ３１ｅを形成している。

球面レンズ３１ａは、図５（ａ）に示すように、石英等の透明性を有する板状部材３１ｆに球面形状に盛り上った凸部を有し、この凸部が球面レンズ３１ａとなっている。板状部材３１ｆは、図５（ｂ）に示すように、縁部が枠体３６で覆われ、図示されないＸ−Ｙステージに取り付けられ、図中のＸ方向（水平方向）及びＹ方向（垂直方向）に自在に位置調整できるようになっている。球面レンズ３１ａは、マッチングオイルを介してフローセル体３１の側面上を摺動するように構成されている。球面レンズ３１ａの位置調整では、球面レンズ３１ａの曲率中心位置が流路３１ｂ中の測定点Ｐ（レーザ光が集束する点）を通るＸ方向及びＹ方向に平行な平面上を移動するようになっている。すなわち、受光部２６の集光レンズ２６ａの光軸に対して垂直であり、流路３１ｂ中の測定点Ｐを通る平面上で、球面レンズ３１ａの焦点位置が動くようになっている。

反射レンズ３１ｅも、図５（ａ）に示すように、石英等の透明性を有する板状部材３１ｆに球面形状に盛り上った凸部を有し、この凸部がレンズとなっている。この凸部の表面には、反射膜３１ｄが設けられている。反射レンズ３１ｅの板状部材３１ｆも、縁部が枠体３６で覆われ、図示されないＸ−Ｙステージに取り付けられ、Ｘ方向（水平方向）及びＹ方向（垂直方向）に自在に位置調整できるようになっている。反射レンズ３１ｅも、マッチングオイルを介してフローセル体３１の側面を摺動するように構成されている。すなわち、受光部２６の集光レンズ２６ａの光軸に対して垂直であり、流路３１ｂ中の測定点Ｐを通る平面上で、反射レンズ３１ｅの曲率中心位置が動くようになっている。

このように、フローセル体３１の側面に反射レンズ３１ｅを設け、位置調整可能に構成することで、試料１２内の同じ位置から反射レンズ３１ｅの側に発した蛍光を、反射レンズ３１ｅで反射させ、試料１２の蛍光位置に再帰させることで、同じ位置から集束レンズ２６ａに向かって発する蛍光と重ねることができ、この蛍光を光電変換器２７ａ〜２７ｃで測定することができる。
管路３０やフローセル体３１の微妙な形状のゆがみや、管路３０とフローセル体３１との接続部分の微妙なずれ等によって、シース液内を流れる試料１２が、流路３１ｂの測定点Ｐの位置からＸ方向に偏って流れる場合が生じる。この場合においても、反射レンズ３１ｅの位置をＸ方向に調整することで、試料１２内の同じ位置から反対方向に発する蛍光を重ねることができる。さらに、反射レンズ３１ｅの位置をＹ方向に調整することで、蛍光を試料１２の蛍光位置に確実に再帰させることができる。
試料１２内の同じ位置から発し、反対方向に発する蛍光を反射レンズ３１ｅを用いて再帰させて、試料１２から発する蛍光と重ねるのは、ピンホール板２６ｄ₁〜２６ｄ₃のピンホールを通過する試料１２の微弱な蛍光を強めるためである。

なお、ピンホールを設けるのは、試料１２を流すシース液の発する微弱な蛍光を排除し、試料１２から発する微弱な蛍光を効率よく取り込むためである。すなわち、集束レンズ２６ａとピンホールとで構成した共焦点光学系により、外乱光であるシース液の発する微弱な蛍光を排除し、試料１２から発する微弱な蛍光を効率よく取り込む。

さらに、球面レンズ３１ａについても、位置調整可能に構成することで、試料１２が流路３１ｂの中心からＸ方向に位置ずれして通過しても、球面レンズ３１ａを位置ずれに応じて位置調整することによって、ピンホールの位置で蛍光が集束して通過することを可能にするためである。さらに、球面レンズ３１ａの位置をＹ方向に調整することにより、ピンホールの位置で蛍光が確実に集束して通過することができる。
球面レンズ３１ａの位置調整ができず、球面レンズ１２の焦点位置が流路３１ｂの測定点Ｐに固定されており、試料１２が流路３１ｂの中心からＸ方向に位置ずれして通過する場合、球面レンズ３１ａの焦点位置が通過する試料１２の位置にないので、球面レンズ３１ａの作用によって、ピンホールの手前側あるいは奥側の位置で蛍光が集束する場合がある。この場合、理想的な共焦点光学系を形成しないので、試料１２から発する微弱な蛍光を効率よく取り込むことはできない。

このため、試料１２の通過する位置に応じて、図６に示すように球面レンズ３１ａ、反射レンズ３１ｅ、及び集束レンズ２６ａ、ピンホール板２６ｄ_３を含む受光系２６を位置調整することで、ピンホールの位置で蛍光を集束させることができる。この場合、ピンホールにおける蛍光が集束する位置は、ピンホールの中心から位置ずれせず通過する。この場合、理想的な共焦点光学系を形成するので、試料１２から発する微弱な蛍光を最も効率よく取り込むことができる。

以上、本発明の蛍光検出装置について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。

本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。本発明の蛍光検出装置に用いられるレーザ光源部の一例を示す概略構成図である。本発明の蛍光検出装置に用いられる受光部の一例を示す概略構成図である。（ａ）及び（ｂ）は、本発明の蛍光検出装置に用いられるフローセル体を説明する図である。（ａ）及び（ｂ）は、本発明の蛍光検出装置に用いられる球面レンズの一例を説明する図である。本発明の蛍光検出装置において、試料が流路の中心からずれて流れるときの球面レンズ及び反射レンズの位置と、蛍光の光路を説明する図である。

符号の説明

１０フローサイトメータ
１２試料
２０信号処理装置
２２レーザ光源部
２２ｒＲ光源
２２ｇＧ光源
２２ｂＢ光源
２３ａ₁，２３ａ₂，２３ｂ₁，２３ｂ₂ ダイクロイックミラー
２３ｃレンズ系
２４，２６受光部
２６ａ集束レンズ
２６ｃ₁，２６ｃ₂，２６ｃ₃ バンドパスフィルタ
２７ａ〜２７ｃ光電変換器
２８処理部
２９制御部
３０管路
３１フローセル体
３１ａ，３１ｃ球面レンズ
３１ｂ流路
３１ｄ反射膜
３１ｅ反射レンズ
３１ｆ板状部材
３２回収容器
３４ｒ，３４ｇ，３４ｂレーザドライバ
３５パワースプリッタ
３６枠体
８０分析装置

Claims

測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置であって、
測定対象物が流れる流路が形成されたフローセル体と、
流路中の測定点を通過する測定対象物に対してレーザ光を照射するレーザ光源部と、
レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を集光レンズを通して受光して受光信号を出力する受光部と、
前記受光部から出力した受光信号から、蛍光強度の出力値を出力する処理部と、を有し、
前記受光部には、前記集光レンズの光軸を前記受光部の蛍光受光面に向けて延長した光路上の前記集光レンズの焦点位置に、ピンホールが設けられ、
前記フローセル体を挟んで前記受光部と反対側の前記フローセル体の表面には、第１の球面レンズが設けられ、この第１の球面レンズの球面には反射膜が設けられ、
さらに、前記集光レンズの光軸に対して垂直であり、前記流路中の測定点を通る平面上で、前記第１の球面レンズの焦点位置が動くように、前記第１の球面レンズを移動させる第１の移動機構を備えることを特徴とする蛍光検出装置。
前記フローセル体を挟んで前記ピンホールの側の前記フローセル体の表面には、第２の球面レンズが設けられ、
さらに、前記集光レンズの光軸に対して垂直であり、前記流路中の測定点を通る平面上で、前記第２の球面レンズの焦点位置が動くように、前記第２の球面レンズを移動させる第２の移動機構を備える請求項１に記載の蛍光検出装置。
前記第１の球面レンズまたは前記第２の球面レンズは、前記フローセル体の表面に、マッチングオイルを介して設けられている請求項２に記載の蛍光検出装置。
前記第１の球面レンズ及び前記第２の球面レンズの移動は、測定対象物が前記測定点を通過する位置に応じて調整され、さらに、前記集光レンズ及び前記ピンホールも、前記測定対象物が前記測定点を通過する位置に応じて調整される、請求項２に記載の蛍光検出装置。