JP4445886B2

JP4445886B2 - フローセルユニット及びフローサイトメータ並びに蛍光検出方法

Info

Publication number: JP4445886B2
Application number: JP2005067951A
Authority: JP
Inventors: 弘能林; 成幸中田
Original assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Current assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Priority date: 2005-03-10
Filing date: 2005-03-10
Publication date: 2010-04-07
Anticipated expiration: 2025-03-10
Also published as: JP2006250725A

Description

本発明はフローセルユニット及びフローサイトメータ並びに蛍光検出方法に関し、特に効果的に蛍光を検出するフローセルユニット及びフローサイトメータ並びに蛍光検出方法に関する。

流体中の粒子や細胞などに蛍光色素でラベルした抗体を結合させて、レーザ光等を照射して、反射する散乱光や蛍光を分析・分離するフローサイトメータがある。このフローサイトメータは工業分野において溶媒の分子測定、あるいは医療分野では血液等の診断に用いられている。

図４にフローサイトメータの概略構成を示す。図示のように、一般にフローサイトメータ２００は、石英などの透光体からなるフローセル２０２の中央にサンプルを流下させる１００μｍ程度と微小の試料流路２０４を形成し、この流路にサンプル液２２０の流れとシース液２２２の流れの層流を流通させる。このとき、シース液２２２及びサンプル液２２０は図示しないコンプレッサによりサンプルチューブから押し出される。サンプル側の圧力をシース側の圧力よりも僅かに低い状態にするとシース流に包含されたサンプル液２２０の流径が非常に小さくなり、サンプル中の粒子が一列に並ぶ。これにより一列に並んだ粒子が順番にフローセル２０２中を流れていくことになる。

そして、サンプル液２２０の流れに直交してレーザ光２０６をサンプル液２２０に照射する。レーザ光２０６はレーザ発光源２０８から絞りレンズ２１０を介してサンプル液２２０の試料流路２０４の照射スポット２１２に照射させている。このときレーザビームを横切るように粒子は一個ずつ順番に流れていく。

サンプル液２２０中に微粒子が存在するとレーザ光２０６が散乱する。また、微粒子に予め蛍光色素を付与しておくとレーザ光２０６の照射によって微粒子が蛍光を発する。レーザ発光源２０８の側向位置には発生した散乱光や蛍光を集光する集光レンズ２１４が配置されている。さらに、集光レンズ２１４によって集光した光を測定する検出器２１６が配置されている。検出器２１６で測定した散乱光や蛍光をデータ処理器２１８で解析することによってフローセル２０２を通過した個々の微粒子の種類を特定する。

前記フローサイトメータ２００に用いるフローセル２０２の形状は一般に加工が容易であること、あるいは低コスト化等を考慮して矩形に加工した透光体を用いている（例えば特許文献１）。
特開平６−３２３９８２号公報

しかしながら、レーザ照射によって発光する蛍光は照射スポットを中心に放射状に発光する。従来のフローサイトメータによって集光される光はレンズの半径とレンズと細胞の距離が成す一立体角分、すなわち蛍光集光レンズ側でしか集光していない。このため、僅かに発光する蛍光をできるだけ多く集光しなければならないにも拘らず、集光量が少ないという問題があった。

また、特許文献１に示すような従来、一般的に用いられている矩形形状のフローセルは、照射スポットで発光した蛍光がセルの境界面で折れ曲がってしまう。このため、レンズ集光角度が小さくなり集光レンズに集光させる集光範囲が狭まって蛍光の集光効率が悪いという問題があった。

そこで、上記従来技術の問題点を改善するため、本発明は、発光した蛍光を効率よく集光することを目的としている。

本発明に係るフローセルユニットは、球面を備えた透光体からなるセル本体と、レーザ光の照射方向と直交方向であって、集光レンズと対向する前記球面の一部に設けた反射部と、前記セル本体に貫通して設けた試料流路を中心として前記反射部と対向した前記球面に設けた半透鏡部と、を備え、前記反射部と前記半透鏡部の間でサンプルから発光した蛍光を反射させて、前記サンプルに照射して、前記蛍光を誘導放出により増幅させることを特徴としている。

この場合において、前記反射部と前記半透鏡部とは、前記セル本体の表面に設けるようにするとよい。前記反射部と前記半透鏡部とは、前記セル本体の表面にミラー蒸着又は誘電体多層膜コーティングを施してあるとよい。前記セル本体は、レーザ照射位置に平面を有しているとよい。前記平面は、前記試料流路の軸心線と同軸方向に形成するとよい。

本発明のフローサイトメータは、前記フローセルユニットを備えていることを特徴としている。
本発明に係る蛍光検出方法は、球面を備えた透光体からなるフローセル本体に設けた試料流路にレーザ光を照射してサンプルから放射した蛍光を検出する方法であって、前記レーザ光の照射方向と直交方向であって、集光レンズと対向する球面に設けた反射部と、前記集光レンズ側の球面に設けた半透鏡部との間で、前記サンプルから発光した蛍光を反射させて前記サンプルに照射して、前記蛍光を誘導放出により増幅させて検出器に入射することを特徴としている。

上記のごとくなっている本発明は、セル本体で放射された蛍光を反射させて、再度サンプルに照射して、発光した蛍光を増幅させて、対向する光検出器に入射させている。このため、検出される蛍光の増大効果を図ることが可能となる。これまで、発光する一部の集光レンズ側の蛍光をいかに効率良く集光することができるかが集光の課題となっていたが、本発明は、レーザ照射部から放射状に発光する蛍光を集光レンズ側の蛍光のみならず、集光レンズと対向する位置の蛍光も集光することによって集光効率を高めることができる。

フローセルユニットのセル本体は、球形状に形成するのが望ましい。球形状に形成することにより、レンズの集光角度が屈折することなく放射状に拡大されるので、蛍光の集光効率を大幅に向上させることが可能となる。

また、フローセルユニットの反射部と半透鏡部とはミラー蒸着又は誘電体多層膜コーティングを施してあることが望ましい。セル本体に反射部を容易に形成することができるとともに、球面によって効率良く放射状に発光する蛍光を反射させることができる。

セル本体にはレーザ照射位置に平面を有していることが望ましい。平面にレーザ光を照射することによって曲面に比べ容易にレーザ絞りレンズで計画された照射スポット寸法、位置にレーザ照射することができる。

試料流路は、前記セル本体の中心を通ることが望ましい。これにより試料は球状セル中心で発光するため、蛍光はセルと空気境界で屈折することなく光を空気中で最大限集光することが可能となる。

セル本体の平面は、前記試料流路の軸心線と同軸方向に形成していることが望ましい。これにより容易にレーザ絞りレンズで計画された照射スポット寸法、位置にレーザ照射が可能となる。

本発明に係る蛍光検出方法及びフローセルユニット並びにフローサイトメータの実施形態を添付の図面に沿って以下詳細に説明する。
図１はフローサイトメータの構成概略を示す図である。図２はフローセルユニットの構成概略を示す図である。図２（１）はセル本体の平面図を示す。同図（２）同図（１）のＡ−Ａ断面図を示す。同図（３）はセル本体の斜視図である。

図１に示すようにフローサイトメータ１０は、サンプル液を導入してレーザ光１１を照射するフローセルユニット１２と、このフローセルユニット１２のレーザ照射側に設置した絞りレンズ１４と前記フローセルユニット１２の集光側に設置した集光レンズ１６と、集光した蛍光を電子信号に変換する光電子倍増管１８とを基本的な構成としている。

フローセルユニット１２は、図２に示すように球面を備えた透光体からなるセル本体１０２と、このセル本体１０２に貫通して設けた試料流路１０４と、球面の一部に設けた反射部１０６と、試料流路１０４を中心として反射部１０６と対向した球面に設けた半透鏡部１０８とを基本的な構成としている。

セル本体１０２は石英ガラスなどの透光体によってその形状を球形状に形成してある。また、セル本体１０２の球形軸心には、直径方向に貫通した試料流路１０４を形成してある。さらに、実施形態に係るセル本体１０２は、レーザ照射位置と、試料流路１０４を軸中心とした対称位置とに一対の平面１１０を有している。平面１１０は、レーザ光１１が境界面で屈曲することなく試料流路１０４に照射できるように試料流路１０４側面と平行に形成してある。なお、平面１１０はレーザ照射側（１１０ａ）のみ形成するようにしてもよい。

試料流路１０４には、セル本体１０２上部に設置したフローチャンバー１１２からサンプル液１１４とシース液１１６が図示しないコンプレッサによって圧送され、試料流路１０４の上方から下方に流下している。

反射部１０６は、レーザ照射方向と直交方向の球面であって、後述する集光レンズ１６と対向する面に金属蒸着させた凹面状のミラーコーティング又は誘電体多層膜コーティングである。なお、球面に形成する金属蒸着によるミラーコーティングは、発生した蛍光が減衰することなく反射される作用を備えればこれに限定されるものではない。

実施形態に係る半透鏡部１０８は、入射光束の一部を反射し、一部を透過する反射鏡であり、具体的には入射した蛍光の一部を反射し、後述する増幅した蛍光の一部を透過するハーフミラーをいう。半透鏡部１０８は、試料流路１０４を中心として前記反射部１０６と対向した球面、すなわち集光レンズ１６側に金属蒸着させた透過率が数パーセントの凹面状のミラーコーティングである。半透鏡部１０８は、前述の反射部よりも反射の強さを弱めて一部の蛍光を集光レンズ１６側に放射するようにしている。

絞りレンズ１４は、サンプル液１１４の流れに直交した方向から照射するレーザ光１１の光路に設置している。絞りレンズ１４は、図示しないレーザ発光源からの分散したレーザ照射をレンズによって絞り照射スポット１５に照射させている。そして照射スポット１５を通過したレーザ光１１は前方散乱光１９となり第２集光レンズ３０によって集光される。集光した前方散乱光１９は光検出器３２に導入し、この検出信号に基づいて蛍光及び散乱光を計測している。また、前方散乱光１９の強度は、流れるサンプルの大きさを測定する情報として利用することができる。すなわち粒子に光をあてたときに散乱光の角度やパターンが異なることを利用したミー散乱理論により、例えば粒子径を測定することができる。

集光レンズ１６は、図２（１）に示すようにレーザ光が照射する試料流路１０４の側向位置であって同一平面状に配置している。集光レンズ１６は、試料流路１０４のレーザ照射によって発光した蛍光を集光する。

光電子倍増管１８は、前記集光レンズ１６と同様にレーザ光が照射する試料流路１０４の側向位置に配置している。光電子倍増管１８は、光電面で光を電子に変換し、電子倍増管で増幅し、電流として信号を出力する。そして検出器２０に出力信号を送信している。

検出器２０では、サンプル液１１４が照射スポット１５を通過することによって散乱された散乱光や、サンプル液１１４に標識した蛍光色素から蛍光を計測する。

上記構成によるフローサイトメータ１０の蛍光検出方法について以下説明する。フローチャンバー１１２からセル本体１０２の中央に形成した試料流路１０４にサンプル液１１４及びシース液１１６の層流を流通させる。そして、図示しないレーザ発光源から照射したレーザ光１１を絞りレンズ１４によって絞り照射スポット１５に照射する。このときレーザ光１１はサンプル液１１４の流れと直交方向から照射させる。

サンプル中に微粒子が存在するとレーザ光１１が散乱する。また、蛍光色素を付与した微粒子にレーザ光１１を照射すると蛍光を発する。この散乱光及び蛍光は照射スポット１５から放射状に発光する。

照射スポット１５を通過したレーザ光１１は前方散乱光１９となり第２集光レンズ３０によって集光させる。集光した前方散乱光１９は光検出器３２に導入し、この検出信号に基づいて蛍光及び散乱光を計測している。

図３はフローセルユニット内の蛍光を増幅させる説明図である。フローセルユニット１２内の照射スポット１５を通過するサンプル液１１４中の微粒子４０にレーザ光１１を照射すると、微粒子４０中の原子又は分子はレーザ光１１の光を吸収して基底状態から励起状態になる。そしてレーザ照射による光の過剰供給によって微粒子４０中の励起状態の原子又は分子が増加する。微粒子４０中の原子又は分子は、エネルギーの高い励起状態から安定な基底状態に戻ろうとする際にエネルギーを放出し、これが蛍光となる。発光した蛍光はセル本体１０２の球面の形成した反射部１０６と半透鏡部１０８間で反射する。例えば、半透鏡部１０８側で発光した蛍光は、半透鏡部１０８で一部反射され再度微粒子に入射する。また反射部１０６側で発光した蛍光は反射部１０６で反射される。このとき反射部１０６あるいは半透鏡部１０８で反射した蛍光が再度微粒子４０に入射すると、励起状態の原子又は分子はこの入射した光に誘発されてエネルギーを誘導放出効果によって連鎖的に放出する。

そうすると連鎖的に放出した蛍光は大きなエネルギーとなって増幅し、数パーセントの透過性がある半透鏡部１０８から抜け出して集光レンズ１６に出射する。このときセル本体１０２は球体状に形成している。このため、照射スポット１５から放射状に発する蛍光はフローセルと空気のなす境界面で折れ曲がることなく直線上に延び集光レンズ１６に集光される。

そして集光レンズ１６で集光した蛍光を光電子倍増管１８に導入する。光電子倍増管１８では光電面で光を電子に変換し、電子倍増管で増幅し、電流として検出器２０に出力信号を出力する。検出器２０では、サンプル液１１４が照射スポット１５を通過することによって散乱された散乱光や、サンプル液１１４に標識した蛍光色素から蛍光を計測する。さらに計測結果は図示しないデータ処理器に出力され、データ処理器では散乱光や蛍光を解析することによってセル本体１０２を流下したサンプル液１１４の特性を得る。

このようなフローサイトメータでは、フローセルユニット１２内で発光する蛍光をミラー間で誘導放出効果により増幅させるとともに、集光レンズ１６側の半透鏡部１０８とこの半透鏡部１０８に対向する位置に設置した反射部１０６の２立体角分の蛍光を、集光レンズ１６に集光させているので、微弱な蛍光の集光効率を高めることができる。

実施形態に係るフローサイトメータの構成概略を示す図である。フローセルユニットの構成概略を示す図である。フローセルユニット内の蛍光を増幅させる説明図である。従来のフローサイトメータの計測装置の説明図である。

符号の説明

１０………フローサイトメータ、１１………レーザ光、１２………フローセルユニット、１４………絞りレンズ、１５………照射スポット、１６………集光レンズ、１８………光電子倍増管、２０………検出器、３０………第２集光レンズ、３２………光検出器、４０………微粒子、１０２………セル本体、１０４………試料流路、１０６………反射部、１０８………半透鏡部、１１０………平面、１１２………フローチャンバー、１１４………サンプル液、１１６………シース液、２００………フローサイトメータ、２０２………フローセル、２０４………試料流路、２０６………レーザ光、２０８………レーザ発光源、２１０………絞りレンズ、２１２………照射スポット、２１４………集光レンズ、２１６………検出器、２１８………データ処理器、２２０………サンプル液、２２２………シース液。

Claims

球面を備えた透光体からなるセル本体と、
レーザ光の照射方向と直交方向であって、集光レンズと対向する前記球面の一部に設けた反射部と、
前記セル本体に貫通して設けた試料流路を中心として前記反射部と対向した前記球面に設けた半透鏡部と、
を備え、
前記反射部と前記半透鏡部の間でサンプルから発光した蛍光を反射させて、前記サンプルに照射して、前記蛍光を誘導放出により増幅させることを特徴とするフローセルユニット。
請求項１に記載のフローセルユニットにおいて、
前記反射部と前記半透鏡部とは、前記セル本体の表面に設けてあることを特徴とするフローセルユニット。
請求項１又は請求項２に記載のフローセルユニットにおいて、
前記反射部と前記半透鏡部とは、前記セル本体の表面にミラー蒸着してあることを特徴とするフローセルユニット。
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のフローセルユニットにおいて、
前記セル本体は、レーザ照射位置に平面を有していることを特徴とするフローセルユニット。
請求項１乃至請求項４のいずれか１に記載のフローセルユニットにおいて、
前記平面は、前記試料流路の軸心線と同軸方向に形成していることを特徴とするフローセルユニット。
請求項１乃至請求項５のいずれか１に記載のフローセルユニットを備えていることを特徴とするフローサイトメータ。
球面を備えた透光体からなるフローセル本体に設けた試料流路にレーザ光を照射してサンプルから放射した蛍光を検出する方法であって、
前記レーザ光の照射方向と直交方向であって、集光レンズと対向する球面に設けた反射部と、前記集光レンズ側の球面に設けた半透鏡部との間で、前記サンプルから発光した蛍光を反射させて前記サンプルに照射して、前記蛍光を誘導放出により増幅させて検出器に入射することを特徴とする蛍光検出方法。