JP4540509B2 - 蛍光検出方法及びフローセルユニット並びにフローサイトメータ - Google Patents

Description

本発明は蛍光検出方法及びフローセルユニット並びにフローサイトメータに関し、特に効果的に蛍光を検出する蛍光検出方法及びフローセルユニット並びにフローサイトメータに関する。

流体中の粒子や細胞などに蛍光色素でラベルした抗体を結合させて、レーザ光等を照射して、反射する散乱光や蛍光を分析・分離するフローサイトメータがある。このフローサイトメータは工業分野において溶媒の分子測定、あるいは医療分野では血液等の診断に用いられている。

図４にフローサイトメータの概略構成を示す。図示のように、一般にフローサイトメータ２００は、石英などの透光体からなるフローセル２０２の中央にサンプルを流下させる１００μｍ程度と微小の試料流路２０４を形成し、この流路にサンプル液２２０の流れとシース液２２２の流れの層流を流通させる。このとき、シース液２２２及びサンプル液２２０は図示しないコンプレッサによりサンプルチューブから押し出される。サンプル側の圧力をシース側の圧力よりも僅かに低い状態にするとシース流に包含されたサンプル液２２０の流径が非常に小さくなり、サンプル中の粒子が一列に並ぶ。これにより一列に並んだ粒子が順番にフローセル２０２中を流れていくことになる。

そして、サンプル液２２０の流れに直交してレーザ光２０６をサンプル液２２０に照射する。レーザ光２０６はレーザ発光源２０８から絞りレンズ２１０を介してサンプル液２２０の試料流路２０４の照射スポット２１２に照射させている。このときレーザビームを横切るように粒子は一個ずつ順番に流れていく。

サンプル液２２０中に微粒子が存在するとレーザ光２０６が散乱する。また、微粒子に予め蛍光色素を付与しておくとレーザ光２０６の照射によって微粒子が蛍光を発する。レーザ光が照射する照射スポット２１２の側向位置には発生した散乱光や蛍光を集光する集光レンズ２１４が配置されている。さらに、集光レンズ２１４によって集光した光を測定する検出器２１６が配置されている。検出器２１６で測定した散乱光や蛍光をデータ処理器２１８で解析することによってフローセル２０２を通過した個々の微粒子の種類を特定する。

前記フローサイトメータ２００に用いるフローセル２０２の形状は一般に加工の容易であること、あるいは低コスト化等を考慮して矩形に加工した透光体を用いている（例えば特許文献１）。
特開平６−３２３９８２号公報

しかしながら、レーザ照射によって発光する蛍光は照射スポットを中心に放射状に発光する。従来のフローサイトメータによって集光される光はレンズの半径とレンズと細胞の距離が成す一立体角分、すなわち蛍光集光レンズ側でしか集光していない。このため、僅かに発光する蛍光をできるだけ多く集光しなければならないにも拘らず、集光量が少ないという問題があった。

また、特許文献１に示すような従来、一般的に用いられている矩形形状のフローセルは、照射スポットで発光した蛍光がセルの境界面で折れ曲がってしまう。このため、レンズ集光角度が小さくなり集光レンズに集光させる集光範囲が狭まって蛍光の集光効率が悪いという問題があった。

そこで、上記従来技術の問題点を改善するため、本発明は、発光した蛍光を効率よく集光することを目的としている。

本発明に係る蛍光検出方法は、レーザ照射位置を平面とする球形状のフローセル本体の球形軸心に設けた試料流路にレーザ光を照射し、放射された蛍光を直に集光するとともに、集光レンズと対向側の前記フローセル本体の表面にミラー蒸着して形成した反射部により前記蛍光を反射させて集光し光検出器に入射させて、前記放射された蛍光を検出することを特徴としている。

本発明に係るフローセルユニットは、レーザ照射位置を平面とする球形状の透光体からなるセル本体と、前記セル本体の球形軸心に貫通して設けた試料流路と、集光レンズと対向側の球面の表面にミラー蒸着して発光する蛍光を前記集光レンズに反射させる反射部と、を有することを特徴としている。
この場合において、前記平面は、前記試料流路の軸心線と同軸方向に形成していることを特徴としている。
本発明のフローサイトメータは、前記フローセルユニットを備えていることを特徴としている。

上記のごとくなっている本発明は、放射された蛍光を試料流路の側面で反射させて、対向する光検出器に入射させている。このため、検出される蛍光の増大効果を図ることが可能となる。これまで、発光する一部の集光レンズ側の蛍光をいかに効率良く集光することができるかが集光の課題となっていたが、本発明は、レーザ照射部から放射状に発光する蛍光を集光レンズ側の蛍光のみならず、集光レンズと対向する位置の蛍光も集光することによって集光効率を高めることができる。

フローセルユニットのセル本体は、球形状に形成するのが望ましい。球形状に形成することにより、レンズの集光角度が屈折することなく放射状に拡大されるので、蛍光の集光効率を大幅に向上させることが可能となる。また、フローセルユニットの反射部はミラー蒸着してあることが望ましい。セル本体に反射部を容易に形成できるとともに、球面によって効率良く放射状に発光する蛍光を反射させることができる。

セル本体には試料流路の両側の対向位置に平面を有していることが望ましい。平面にレーザ光を照射することによって曲面に比べ容易にレーザ絞りレンズで計画された照射スポット寸法、位置にレーザ照射することができる。

セル本体の平面は、前記試料流路の軸心線と同軸方向に形成していることが望ましい。これにより曲面に比べ容易にレーザ絞りレンズで計画された照射スポット寸法、位置にレーザ照射が可能となる。

本発明に係る蛍光検出方法及びフローセルユニット並びにフローサイトメータの実施形態を添付の図面に沿って以下詳細に説明する。
図１はフローサイトメータの構成概略を示す図である。図２はフローセルユニットの構成概略を示す図である。図２（１）はセル本体の平面図を示す。同図（２）はセル本体の側面図を示す。同図（３）は同図（１）のＡ−Ａ断面図を示す。

図１に示すようにフローサイトメータ１０は、サンプル液を導入してレーザ光１１を照射するフローセルユニット１２と、このフローセルユニット１２のレーザ照射側に設置した絞りレンズ１４と前記フローセルユニット１２の集光側に設置した集光レンズ１６と、集光した蛍光を電子信号に変換する光電子倍増管１８とを基本的な構成としている。

フローセルユニット１２は、図２に示すように透光体からなるセル本体１０２と、このセル本体１０２に貫通して設けた試料流路１０４と、この試料流路１０４の側面に設けた反射部１０６とを備えている。

セル本体１０２は石英ガラスなどの透光体によってその形状を球形状に形成してある。また、セル本体１０２の球形軸心には、直径方向に貫通した試料流路１０４を形成してある。さらに、実施形態に係るセル本体１０２は、レーザ照射位置と、試料流路１０４を軸中心とした対称位置とに一対の平面１１０を有している。平面１１０は、レーザ光１１が試料流路１０４に照射できるように試料流路１０４側面と平行に形成してある。なお、平面１１０はレーザ照射側（１１０ａ）のみ形成するようにしてもよい。

試料流路１０４には、セル本体１０２上部に設置したフローチャンバー１１２からサンプル液１１４とシース液１１６が図示しないコンプレッサによって圧送され、試料流路１０４の上方から下方に流下している。

反射部１０６は、レーザ照射方向と直交方向の球面であって、後述する集光レンズ１６と対向する面に金属蒸着させたミラーコーティングである。このミラーコーティングは発生した蛍光が減衰することなく反射されるようにしている。

絞りレンズ１４は、サンプル液２２０の流れに直交した方向から照射するレーザ光１１の光路に設置している。絞りレンズ１４は、図示しないレーザ発光源からの分散したレーザ照射をレンズによって絞り照射スポット１５に照射させている。そして照射スポット１５を通過したレーザ光１１は前方散乱光１９となり第２集光レンズ３０によって集光される。集光した前方散乱光１９は光検出器３２に導入し、この検出信号に基づいて蛍光及び散乱光を計測している。また、前方散乱光１９の強度は、流れるサンプルの大きさを測定する情報として利用することができる。すなわち粒子に光をあてたときに散乱光の角度やパターンが異なることを利用したミー散乱理論により、例えば粒子径を測定することができる。

集光レンズ１６は、図２（１）に示すようにレーザ光が照射する試料流路１０４の側向位置であって同一平面状に配置している。集光レンズ１６は、試料流路１０４のレーザ照射によって発光した蛍光を集光する。

光電子倍増管１８は、前記集光レンズ１６と同様にレーザ光が照射する試料流路１０４の側向位置に配置している。光電子倍増管１８は、光電面で光を電子に変換し、電子倍増管で増幅し、電流として信号を出力する。そして図示しない検出器に出力信号を送信している。

図３はレンズ集光角度の説明図である。同図中の点線はセル本体の形状が矩形であり、そのレンズ集光角度を示している。また、実線はセル本体が球形状であり、そのレンズ集光角度を示している。
ここで開口数（ＮＡ）はセル本体１０２の形状に大きく依存している。この開口数とは、最大入射角度（受入角を２θとする）を頂角とする円錐で表すことができ、次式の関係が成立する。

なお、sinθは０＜sinθ＜１の範囲であり、sinθ＝９０°のときに円錐が大きく広がって開口数（ＮＡ）が最大となる。そうすると本実施形態の場合、集光レンズ１６と直交する直線ｌ_１、すなわちセル本体の半径と、試料流路１０４からの放射線との成す角がθに相当し、この集光角度が大きくなると、集光面積も増大する関係にある。

よって、セル本体が矩形の場合には、境界面で折れ曲がってしまい、集光角度が狭まり、集光レンズに集光されるのは図中のＥに示す範囲であり、集光面積が小さい。すなわち集光効率が悪くなる。

一方、セル本体を球面状に形成すると、放射状に拡散する蛍光は放射方向を直交する境界面で折れ曲がることなくそのまま直線上に放射する。よって、集光角度が大きくなり、図中のＦに示す範囲の蛍光を集光レンズ１６で集光することができ、集光効率が良い。

上記構成によるフローサイトメータの蛍光検出方法について以下説明する。フローチャンバー１１２からセル本体１０２の中央に形成した試料流路１０４にサンプル液１１４及びシース液１１６の層流を流通させる。そして、図示しないレーザ発光源から照射したレーザ光１１を絞りレンズ１４によって絞り照射スポット１５に照射する。このときレーザ光１１はサンプル液１１４の流れと直交方向から照射される。

サンプル中に微粒子が存在するとレーザ光１１が散乱する。また、蛍光色素を付与した微粒子にレーザ光１１を照射すると蛍光を発する。この散乱光及び蛍光は照射スポット１５から放射状に発光する。

レーザ光１１の光路の側向位置であってその同一平面状には集光レンズ１６と反射部１０６が設置されている。これにより、集光レンズ１６には照射スポット１５からの蛍光が直接集光される。このときセル本体１０２は球体状に形成している。このため、照射スポット１５から放射状に発する蛍光は境界面で折れ曲がることなく直線上に延び集光レンズ１６に集光される。

一方、集光レンズ１６と対向する側面に形成した反射部１０６によって、照射スポット１５から発する蛍光は反射され、一端照射スポット１５に戻るとともに対面する集光レンズ１６に集光される。このように、放射状に発する蛍光を集光レンズ１６で集光するとともに反射部１０６で反射させて集光させているので、２立体角分の蛍光を集光することができる。

そして集光レンズ１６で集光した蛍光を光電子倍増管１８に導入し、光電面で光を電子に変換し、電子倍増管で増幅し、電流として図示しない検出器に出力信号を送信している。

実施形態に係るフローサイトメータの構成概略を示す図である。 フローセルユニットの構成概略を示す図である。 レンズ集光角度の説明図である。 従来のフローサイトメータの計測装置の説明図である。

符号の説明

１０………フローサイトメータ、１１………レーザ光、１２………フローセルユニット、１４………絞りレンズ、１５………照射スポット、１６………集光レンズ、１８………光電子倍増管、３０………第２集光レンズ、３２………光検出器、１０２………セル本体、１０４………試料流路、１０６………反射部、１１０………平面、１１２………フローチャンバー、１１４………サンプル液、１１６………シース液、２００………フローサイトメータ、２０２………フローセル、２０４………試料流路、２０６………レーザ光、２０８………レーザ発光源、２１０………絞りレンズ、２１２………照射スポット、２１４………集光レンズ、２１６………検出器、２１８………データ処理器、２２０………サンプル液、２２２………シース液。

Claims (4)

1. レーザ照射位置を平面とする球形状のフローセル本体の球形軸心に設けた試料流路にレーザ光を照射し、
   放射された蛍光を直に集光するとともに、集光レンズと対向側の前記フローセル本体の表面にミラー蒸着して形成した反射部により前記蛍光を反射させて集光し光検出器に入射させて、
   前記放射された蛍光を検出することを特徴とする蛍光検出方法。
2. レーザ照射位置を平面とする球形状の透光体からなるセル本体と、
   前記セル本体の球形軸心に貫通して設けた試料流路と、
   集光レンズと対向側の球面の表面にミラー蒸着して発光する蛍光を前記集光レンズに反射させる反射部と、
   を有することを特徴とするフローセルユニット。
3. 前記平面は、前記試料流路の軸心線と同軸方向に形成していることを特徴とする請求項２に記載のフローセルユニット。
4. 請求項２又は請求項３に記載のフローセルユニットを備えていることを特徴とするフローサイトメータ。

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