JP4489146B2 - 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 - Google Patents
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Description
例えば、レーザ光の光束を拡げて、測定対象物の測定に用いる一定の強度を備える部分を拡げることはできても、レーザ光の外側の部分は、測定対象物の照射に用いていないため、レーザ光の使用効率が悪い。
前記処理部は、前記第1の受光部から出力された検知信号のうち、最大値を示す検知信号を特定することにより、前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記第2の受光部から出力された受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正し、
前記分析部は、前記第1の受光部にて生成される前記前方散乱光の検知信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求める、ことを特徴とする蛍光検出装置を提供する。
さらに、補正された受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成する分析部を備えることが好ましい。
また、受光信号を補正するので、分析部で作成する蛍光強度に対する頻度分布において、シャープな(分散が小さい)頻度分布を得ることができる。このため、頻度分布において、2つのピークが近接して存在する場合でも、2つのピークを判別できる程度に、高分解能の結果を得ることができる。
12 試料
20 信号処理装置
22 レーザ光源部
22r R光源
22g G光源
22b B光源
23a1,23a2,26b1,26b2 ダイクロイックミラー
23c レンズ系
24,26 受光部
24a 集光レンズ
24b 前方散乱検出ユニット
24c 遮蔽板
24d 検出器
26a 集束レンズ
26c1,26c2,26c3 バンドパスフィルタ
27a〜27c 光電変換器
28 処理部
29 制御部
30 管路
31 フローセル体
32 回収容器
34r,34g,34b レーザドライバ
35 パワースプリッタ
80 分析装置
図1は、本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ10の概略構成図である。
フローサイトメータ10は、レーザ光を測定対象とする細胞等の試料12に照射し、試料12中の一部分から発する蛍光を検出して信号処理をする信号処理装置(蛍光検出装置)20と、信号処理装置20で得られた処理結果から試料12中の測定対象物の分析を行なう分析装置80とを有する。
処理部28は、試料12の蛍光強度の出力値を出力する。制御部29は、所定の強度でレーザ光を照射させ、各処理の動作の制御管理を行う。管路30は、高速流を形成するシース液に含ませて試料12を流す。フローセル体31は、管路30の端に接続され、試料12のフローを形成し、このフローの経路にレーザ光の測定点をつくる。
フローセル体31の出口側には、回収容器32が設けられている。フローサイトメータ10には、レーザ光の照射により短時間内に試料12中の特定の細胞等を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
レーザ光源部22は、R光源22r、G光源22g、B光源22bと、ダイクロイックミラー23a1、23a2と、レンズ系23cと、レーザドライバ34r,34gおよび34bと、パワースプリッタ35と、を有して構成される。
R光源22r、G光源22g、B光源22bは、350nm〜800nmの可視光の、レーザ光を出射する部分で、R光源22rは、主に赤色のレーザ光Rを所定の強度で出射する。G光源22gは、緑色のレーザ光Gを所定の強度で出射する。B光源22bは、青色のレーザ光Bを所定の強度で出射する。
ダイクロイックミラー23a1、23a2は、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射する。
レンズ系23cは、レーザ光R,GおよびBからなるレーザ光を管路30中の測定点に集束させる。レーザドライバ34r,34gおよび34bは、R光源22r、G光源22gおよびB光源22bのぞれぞれを駆動する。
パワースプリッタ35は、供給された信号をレーザドライバ34r,34gおよび34bにそれぞれ分配する。
これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。
この構成によりレーザ光R,GおよびBが合成されて、測定点を通過する試料12を照射する照射光となる。
受光部24は、試料12に当たって前方散乱するレーザ光を集光する集光レンズ24aと、集光した光を検出する多チャンネルの前方散乱光検出ユニット24bと、遮蔽板24cと、を有する。
前方散乱光検出ユニット24bは、レーザ光の照射方向と直交し、かつ、試料12の流れる方向(図3中紙面に垂直方向)と直交する方向に、複数の検出器24dが並列配置されている。検出器24dのそれぞれは、検出信号が処理部28及び制御部29に出力されるように接続されている。検出器24dは、例えば、いずれも同じ構成をしたフォトダイオードが用いられる。このように、検出器24dを複数並列配置したのは、試料12が予め設定された測定点(レーザ光の集束点)の中心に対して位置ずれして通過するときの位置ずれの情報を得るためである。具体的には、試料12が、図3中、X方向に位置ずれした場合、レーザ光の前方散乱光は、散乱光検出ユニット24bの中心位置Aより図中下側の位置(図3中矢印の方向の位置)で集束する。試料12が、図3中、X方向と反対側方向に位置ずれした場合、レーザ光の前方散乱光は、散乱光検出ユニット24bの中心位置Aより図中上側の位置で集束する。この集束位置は、試料12のX方向の位置ずれ量に応じて変化する。したがって、計測した散乱光の最大強度がどの検出器24dで検出されたかによって、集束位置を知ることができる。これより、測定対象の試料12が測定点に対してどのくらい位置ずれして流れたかを知ることができる。測定した検出器24dの検知信号が処理部28及び制御部29に供給される。検知信号は、検出器24dそれぞれから出力されるので、最大値を示す検知信号を特定することで、散乱光の最大強度がどの検出器24dで検出されたか、知ることができる。また、検知信号は、データ処理の開始のためにトリガー信号として用いられる。
遮蔽板24cは、照射されたレーザ光の直接光が検出器24dで受光されないように、この直接光を遮蔽するために用いられる。
図4は、受光部26の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
レンズ系26aは、受光部26に入射した蛍光を光電変換器27a〜27cの受光面に集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー26b1,26b2は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ26c1〜26c3でフィルタリングして光電変換器27a〜27cで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー26b1,26b2の反射波長帯域および透過波長帯域が設定されている。
処理部28は、所定の信号処理を行って蛍光強度の出力値を分析装置80に出力する部分である。
処理部28では、受光部24から供給された検知信号に基づいて所定のデータ処理を開始する。処理部28は、受光部24から供給された検出信号のうち、最大の値を取るものが、どの検出器24dからのものであるか特定し、これによって前方散乱光の集束位置を特定し、この特定位置から、受光部26から出力された受光信号に補正をするための補正係数を求め、この補正係数を用いて受光信号を補正する。
処理部28は、検出器24dの集束位置からレーザ光の強度を求め、この強度に応じた補正係数を求める処理を一括して行うために、予め記憶されている補正テーブルを用いて補正を行う。この補正テーブルは、試料12に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けて設定されたものである。
本発明では、受光信号は、後述する分析装置80において、図5(d)に示すような蛍光強度に対する試料12の頻度分布を算出し、この頻度分布から、特定の蛍光が測定されたか否かを判別するために使用する。このとき、蛍光が2種類存在する場合、頻度分布において2つのピークを形成する。この2つのピークの蛍光強度が近接しているとき、この2つのピークが判別できるためには、ピークの幅が狭いこと(分散が小さいこと)が必要である。図5(e)のように、1つのピークのピーク幅が広い(分散が大きい)場合、2つのピークは判別できない。図5(e)は、上述の補正をしない場合の頻度分布である。
補正は単純に補正係数を受光信号に乗算するものである。これは、蛍光の強度が照射されるレーザ光の光強度に応じて線形的に変化する部分を好適に用いるからである。しかし、本発明ではこれに限定されない。少なくとも蛍光の強度が照射されるレーザ光の光強度と対応関係にあり、この関係を用いて補正係数を定めるとよい。
補正された受光信号は、分析装置80に供給されて、図5(d)に示すような頻度分布が作成される。
又、試料12の流れる位置を調べることもできる。検出器24dの検出信号から試料12の位置におけるレーザ光の光強度が既知となっている。一方、前方散乱光の光強度は、試料12の位置におけるレーザ光の光強度と試料12のサイズの乗算した結果として得られるものなので、既知のレーザ光の光強度を用いて、測定された試料12の概略のサイズを知ることもできる。このような測定された試料12の概略のサイズの算出処理を、分析装置80は行ってもよい。このとき、受光部24にて生成される前方散乱光の散乱光信号の強度と、前方散乱光の集束位置とを用いて試料12のサイズを求める。具体的には、前方散乱光の集束位置は既知となるので、この集束位置から試料12が通過する測定点の位置ずれを求め、この位置ずれした試料12の照射されるレーザ光の光強度を知ることができる。このレーザ光の光強度と、前方散乱光の散乱光信号の強度とから試料12のサイズを求めることができる。
Claims (7)
- 流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置であって、
流路中の測定点を通過する測定対象物に対してレーザ光を照射するレーザ光源部と、
測定対象物からのレーザ光の前方散乱光を集光する光学系と、集光した前記前方散乱光を受光することによって、測定対象物が測定点を通過するタイミングを知らせるとともに、集光した前方散乱光の集束位置を検知するために、前記レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器と、を備える第1の受光部と、
レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を集光レンズを通して受光して受光信号を出力する第2の受光部と、
前記第1の受光部から出力した検知信号をトリガー信号として、前記第2の受光部から出力した前記受光信号と前記検知信号とに基づいて、データ処理を開始し、蛍光強度の出力値を出力する処理部と、
測定対象物のサイズを求める分析部と、を有し、
前記処理部は、前記第1の受光部から出力された検知信号のうち、最大値を示す検知信号を特定することにより、前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記第2の受光部から出力された受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正し、
前記分析部は、前記第1の受光部にて生成される前記前方散乱光の検知信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求める、ことを特徴とする蛍光検出装置。 - 前記処理部は、測定対象物に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けた補正テーブルを用いて、前記補正係数を求める請求項1に記載の蛍光検出装置。
- 前記流路と前記第1の受光部との間に、レーザ光の直接光が前記第1の受光部に照射されないように、前記光軸近傍のレーザ光を遮蔽する遮蔽板が設けられる請求項1または2に記載の蛍光検出装置。
- さらに、流路中に測定対象物を順次複数流し、補正された前記受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成する分析部を備える請求項1〜3のいずれか1項に記載の蛍光検出装置。
- 流路中を流れる測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出方法であって、
測定対象物が流路中の測定点を通過するように測定対象物を流して、測定対象物に対してレーザ光を照射するステップと、
測定対象物が測定点を通過するとき、レーザ光の前方散乱光が光学系を通して集光する集束位置を、前記レーザ光の光軸の方向及び前記流路中の測定対象物の流れの方向と直交する方向に並列配置された複数の検出器を用いて、検知する検知信号を生成するステップと、
レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を、集光レンズを通して受光して受光信号を出力するステップと、
前記複数の検出器が出力する前記検知信号のうち、最大値を示す検知信号を特定することにより、前記前方散乱光の集束位置を特定し、この集束位置から、前記受光信号を補正するための補正係数を求め、この補正係数を用いて前記受光信号を補正することにより、蛍光強度を算出するステップと、
前記前方散乱光の検知信号の強度と前記前方散乱光の集束位置とを用いて測定対象物のサイズを求めるステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。 - 前記受光信号を補正するとき、測定対象物に照射されるレーザ光の光強度分布の情報を用いて集束位置と受光信号を補正するための補正係数とを関係付けた補正テーブルを用いて、前記補正係数を求める請求項5に記載の蛍光検出方法。
- さらに、流路中に測定対象物を順次複数流し、補正された前記受光信号を用いて、蛍光強度の頻度分布を作成するステップを有する請求項5または6に記載の蛍光検出方法。
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