JPH0996603A - 流動細胞分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 精度のよい安定した測定が可能な流動細胞分
析装置を提供する。 【解決手段】 シースフロー３１内の細胞３０に光を照
射し、透過光および前方散乱光２８をともにそれぞれレ
ンズ２０，８および光電検出器２１，１０で検出し、信
号処理回路２２で処理する。ここで照射光７の照射位置
がシースフロー３１の中心部からずれた場合は、光電検
出器２１からの出力信号が低下するため、この低下分を
補正回路２３で補正する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は流動細胞分析装置
に関し、特に高速で流れる細胞浮遊液を流体力学的に集
束させ、該箇所にレーザ光などを照射し、散乱光や蛍光
を逐次検出して細胞粒子の性質、構造を解析するように
した、いわゆるフローサイトメータを含む流動細胞分析
装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】バイオテクノロジーの発展に伴い、医
学、生物学などの分野で、細胞の自動分析および分別を
行なう装置の要求が高まっている。このような細胞の分
析を行なう流動細胞分析装置の代表的なものとしてフロ
ーサイトメータが知られている。たとえば、レーザを光
源とするフローサイトメトリを適用した流動細胞分析装
置は、細胞等の分析対象の粒子を、細胞整列手段である
フローセル内で１列にして流し、この流れてくる粒子に
レーザ光を照射する。粒子により生じる前方散乱光や蛍
光などを検出して電気信号に変換し、これらの電気信号
に基づいて細胞の分析が行なわれる。その結果多数の細
胞を高速で分析することができる。

【０００３】図５は一般的なフローサイトメータ２００
の要部を示す模式図である。図５を参照して、容器中に
あり、細胞を含むサンプル液１は、別の溶液中にあるシ
ース液２とともにエアポンプ３によってフローセル４に
導かれる。フローセル４の内部では、シース液２がサン
プル液１を円筒状に包み込むさや状のシースフローが形
成される。このシースフローは細胞をフローセルの中心
軸に沿って１つ１つ正確に流すための手段として形成さ
れるものである。フローセル４の下部には、レーザ光源
５から試射され、集束レンズ６によって絞り込まれたレ
ーザ光７が照射される。サンプル液１に含まれる細胞
は、多くの場合蛍光染料や蛍光ラベルモノクロナール抗
体などの蛍光物質で蛍光標識されており、細胞がレーザ
光７中を通過するとき、散乱光と蛍光が発生する。

【０００４】散乱光は集光レンズ８とビームブロック９
からなる集光光学系を経て、たとえばフォトダイオード
などの光検出器１０で検出される。一方、蛍光について
は、赤色蛍光は集光レンズ１１、ハーフミラー１２、集
光レンズ１３、フィルタ１４からなる集光光学系で集め
られて、光検出器１５により検出される。緑色蛍光はこ
れとは別経路のハーフミラー１２から集光レンズ１６、
フィルタ１７で集められ、光検出器１８により検出され
る。通常、蛍光の光検出器１５，１８には、微弱光の検
出が可能な光電子増倍管が用いられる。散乱光を検出す
る光検出器１０、赤色蛍光を検出する光検出器１５およ
び緑色蛍光を検出する光検出器１８からの信号は、それ
ぞれ信号処理回路１９に送られ、ここで散乱光と蛍光の
強度を分析することにより細胞の同定が行なわれる。

【０００５】上記の例では、光源にレーザ光源５を使用
しているが、これよりも安価な水銀ランプやキセノンラ
ンプを用いた装置もある。また、蛍光の測定を３色や４
色に細分して測定する装置や、散乱光の９０°方向成分
を測定する装置もある。さらに細胞識別機能に加えて、
識別した細胞を分取、ソーティングする機構を備えたセ
ルソータと呼ばれる装置もある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来の流動細胞分析装
置としてのフローサイトメータは上記のように構成され
ていた。図６は図５においてフローセル４のレーザ光７
の透過平面における透過状態とその強度分布を示す図で
ある。図６において左側に示したのはレーザ光がシース
フロー３１の中央部を照射した状態（Ａ）と点線で示す
ように中央部からずれた状態（Ｂ）におけるレーザ光７
の強度分布を示す。

【０００７】図６を参照して、レーザ光７の強度分布は
通常は特性Ａに示すようにガウス分布を呈している。検
体であるシース液２で包まれた細胞３０は、シースフロ
ー３１の中央部を通過するから、細胞３０に対してレー
ザ光７が照射されるとき、レーザ光７の光軸位置がシー
スフロー３１の中央部に一致すれば、細胞３０には強度
の最も強い光が入射し、効率のよい測定ができる。

【０００８】しかしながら、レーザ光７の光軸がシース
フロー３１の中心部からＢのように相対的にずれると、
細胞３０に照射されるレーザ光７の強さは、ガウス分布
に従って弱いものとなり、得られる散乱光や蛍光も弱く
なる。このように、従来の流動細胞分析装置において
は、レーザ光の光軸がシースフローの中心からずれると
同一細胞を測定しても同一の光検出信号が得られなくな
り、測定精度に限界があるという問題があった。

【０００９】この発明は上記のような問題点を解消する
ためになされたもので、照射光の入射時の変動による測
定値のばらつきを除去して、精度のよい安定した測定が
可能な流動細胞分析装置を提供するものである。なお、
照射光の光源としては、レーザ光源，水銀ランプ，キセ
ノンランプ等従来と同じ光源が使用できる。

【００１０】

【課題を解決するための手段】請求項１に係る、高速に
流れる細胞浮遊液に所定の強度分布を持った照射光を照
射し、集光光学系を介して細胞からの散乱光または蛍光
を受光して細胞分析を行なう流動細胞分析装置は、照射
光の細胞浮遊液の透過光成分を検出して細胞が通過して
いないときの透過光量を検知する透過光量検知手段と、
透過光量検知手段からの出力をもとに受光される散乱光
または蛍光の出力を補正するための補正手段とを含む。

【００１１】請求項１の流動細胞分析装置においては、
細胞が通過していないときの透過光量を検出し、その透
過光量をもとに受光される散乱光または蛍光の出力を補
正する。その結果、照射光の入射位置変動による影響が
排除でき、精度の高い安定した細胞の測定が可能な流動
細胞分析装置が提供できる。

【００１２】請求項２に係る、高速に流れる細胞浮遊液
に所定の強度分布を持った照射光を照射し、集光光学系
を介して前記照射光による前記細胞からの散乱光または
蛍光を受光して細胞分析を行なう流動細胞分析装置は、
照射光の細胞浮遊液の透過光成分を検出して、細胞が通
過していないときの透過光量を検知する透過光量検知手
段と、透過光の強度分布の中心位置を検出して検出され
た中心位置により前記照射光の集光光学系に対する位置
ずれを検知する位置ずれ検知手段と、透過光量検知手段
および位置ずれ検知手段からの出力をもとに、受光され
る散乱光および蛍光の出力を補正するための補正手段と
を含む。

【００１３】請求項２の流動細胞分析装置においては、
細胞が通過していないときの透過光の強度分布の中心位
置を検出して、検出された中心位置により照射光の集光
光学系に対する位置ずれを検知し、この位置ずれをもと
に、受光される散乱光および蛍光の出力を補正する。そ
の結果、照射光の集光光学系に対する位置ずれ量を検出
できるとともに、散乱光で蛍光の出力を補正し、照射光
の入射位置変動による影響を排除して精度の高い安定し
た回析が可能な流動細胞分析装置が提供できる。

【００１４】請求項３に係る流動細胞分析装置において
は、請求項１または２の透過光量検知手段は照射光を照
射方向の前方散乱光成分と透過光成分に分割するための
光分割手段を含み、透過光量の検出は前方散乱光成分と
透過光成分に基づいて行なう。

【００１５】請求項３に係る流動細胞分析装置において
は、透過光量の検出が光分割手段で分割された前方散乱
光成分と透過光成分に基づいて行なわれるため、より正
確な分析が可能になる。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下この発明の実施の形態を図面
を参照して説明する。図１はこの発明に係る流動細胞分
析装置の要部１００を示す模式図であり、図４の点線で
囲んだ部分に相当する。

【００１７】図１を参照して、図示のないレーザ光源か
らの平行なレーザ光７がレンズ２７によりシースフロー
３１の細胞３０を照射し、側方散乱光または蛍光を集光
レンズ１１と光電変換器１８で受光・検出することは図
５に示した従来の場合と同様である。ここで、前方散乱
光は図５においては詳述しなかったが、図１に示すよう
にある散乱角を有する散乱光２８を検出するのが一般的
であり、通常は図１に示すようにたとえばスリット２９
を介して所定の散乱角を有する散乱光２８をレンズ８と
光電検出器１０を用いて受光および検出を行なってい
る。

【００１８】通常はこの前方散乱のみを検出するのであ
るが、本願発明では、スリット２９を介してレンズ２０
と光電検出器２１で受光・検出される透過光を検出して
いる。各光電検出器１０，１８，２１の出力は信号処理
回路２２および補正回路２３に入力される。なお、この
発明に係る流動細胞分析装置はさらに、補正回路２３に
接続された光電検出器１０，１８，２１の出力を記憶す
る記憶回路２４や補正回路２３によって補正されたデー
タを表示する表示部２５を含む。

【００１９】図２は各光電検出器１０，１８，２１の出
力信号を示す図である。ここでＦＳＣ（forward scatte
ring light）は前方散乱光の出力であり、ＳＳＣ（side
scattering Light ）は側方散乱光の出力であり、ＦＴ
Ｍ（forward transmitting light）は透過光の出力を示
し、横軸は時間を示す。細胞３０のシースフロー３１内
での通過に従って各出力波形は時刻Ｔ１，Ｔ２，Ｔ３で
変動する。信号処理回路２２では、前方散乱光出力ＦＳ
Ｃと側方散乱光出力ＳＳＣについては時刻Ｔ１，Ｔ２，
Ｔ３でピーク値を検出する。透過光出力ＦＴＭでは、細
胞の通過のない時間（Ｔ４およびＴ６）でサンプリング
検出してそれぞれのデータとする。

【００２０】ここで、時刻Ｔ５で照射光の入射位置が変
動し、図５のＢに示したようにその中心軸がずれたとす
ると、各出力は図２の時刻Ｔ５以降のようになり、前方
散乱光出力ＦＳＣおよび側方散乱光出力ＳＳＣのピーク
値は減少するとともに、透過光出力ＦＴＭはベースの出
力が低下するとともに細胞通過による立下がりピークも
減少する。

【００２１】そこで、補正回路２３では、時刻Ｔ３にお
ける前方散乱光出力ＦＳＣと側方散乱光出力ＳＳＣのピ
ーク値を時刻Ｔ４における透過光出力ＦＴＭと時刻Ｔ６
における透過光出力ＦＴＭで補正する。補正の方法はた
とえば、単純に透過光出力ＦＴＭの信号比率で各ピーク
値を補正してもよい。また、予め照射光の入射位置の変
動と透過光出力ＦＴＭと側方散乱光出力ＳＳＣおよび前
方散乱光出力ＦＳＣの変動の較正関数を求め、該較正関
数により補正することも可能である。

【００２２】ここで単純に透過光出力ＦＴＭ信号の比率
で各ピーク値を補正するとは、図２においてＦＴＭの基
準値からの値ａと中心軸がずれた後のＦＴＭの値ｂとか
らｃ＝ａ／ｂを演算し、得られたｃを用いてデータの補
正を行なうことを言う。

【００２３】さらに、ＦＴＭの出力が極端に低下した場
合で、所定のしきい値以下の場合は照射光軸とシースフ
ロー軸のずれ量が大きく、精度のよい測定が困難である
と警報を発することも可能である。

【００２４】補正された結果は記憶回路２４に刻々と記
憶され、最終的に正規化された前方散乱光、側方散乱光
および蛍光による情報がたとえばヒストグラムデータと
して表示部に表示される。

【００２５】次に他の実施形態として透過光ＦＴＭを検
出する光電検出器としてリニアＣＣＤを用いた場合につ
いて説明する。なお、他の構成は先の実施形態と同じで
あるので装置の要部は図１と同じである。したがってそ
の説明は省略する。

【００２６】図３は光電検出器としてリニアＣＣＤ２１
を用いた場合のレーザ光の検出状態を示す図である。図
３に示すように、レーザ光７の中心がフローの中心を通
っている場合に細胞が通過していない時点での検出器２
１（リニアＣＣＤ）の出力はＡ′のようになる。ここ
で、レーザ光７の中心がｒだけ位置ずれを起こすと、リ
ニアＣＣＤ２１の出力は点線で示すＢ′のようになる。
ここで、Ａ′のピーク値をＩ０とし、この位置でのＢ′
の光強度をＩｒとすると、ｒとガウス分布から知り得る
値であるＩ０／Ｉｒの値をＩｒに乗ずれば、Ｉ０を求め
ることが可能である。ここで、Ｒは検出器２１（リニア
ＣＣＤ）の出力で測定することが可能である。

【００２７】図４はこの実施形態における各光電検出器
の出力信号を示す。ここで透過光ＦＴＭだけは図２の場
合と異なり、図３のＲ軸０での透過光の出力を示す。細
胞のシースフロー内での通過に従って時刻Ｔ１１、Ｔ１
２、Ｔ１３で各出力が変動する。信号処理回路２２で
は、ＦＳＣとＳＳＣについては時刻Ｔ１１，Ｔ１２，Ｔ
１３でのピーク値を検出し、ＦＴＭでは細胞の通過のな
い時間（Ｔ１４およびＴ１５）でサンプリング検出して
それぞれのデータとする。

【００２８】ここで、時刻Ｔ１５で照射光の入射位置が
変動し、中心軸がずれたとすると、各出力は図４のＴ１
５以降のようになり、ＦＳＣおよびＳＳＣのピーク値は
減少するとともに、ＦＴＭはベースの出力が低下すると
ともに、細胞通過による立下りピークも減少する。

【００２９】そこで、補正回路２３では、時刻Ｔ１３に
おけるＦＳＣおよびＳＳＣのピーク値を時刻Ｔ１４にお
けるＦＴＭと時刻Ｔ１６におけるＦＴＭで補正する。こ
の補正の方法は前述のＩ０／Ｉｒガウス分布から求めて
補正することができる。

【００３０】さらに、ＦＴＭの出力が極端に低下した場
合、所定のしきい値以下の場合は、先の実施形態と同様
に照射光軸とシースフロー軸のずれが大きく精度のよい
測定が困難であると警報を発することも可能である。

【００３１】補正された結果は先の実施形態と同様に記
憶回路２４に刻々と記憶され、最終的に補正化された前
方散乱光、側方散乱光、および蛍光による情報がたとえ
ばヒストグラムデータとして表示部２５に表示される。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明に係る流動細胞分析装置の要部を示す
模式図である。

【図２】レーザ光の光軸がずれた場合の各光電検出器か
らの出力信号の変化状態を示す図である。

【図３】光電検出器としてリニアＣＣＤを用いた場合の
透過光の検出状態を示す図である。

【図４】光電検出器としてリニアＣＣＤを用いた場合の
出力信号の変化状態を示す図である。

【図５】従来の流動細胞分析装置を示す模式図である。

【図６】レーザ光の光軸位置がシースフローからずれた
状態のレーザ光の強度分布を示す図である。

【符号の説明】

４ フローセル ５ レーザ光源 ６ 集束レンズ ７ レーザ光 ８ 集光レンズ ９ ビームブロック １０ 光検出器 １１ 集光レンズ １２ ハーフミラー １３ 集光レンズ １４ フィルタ １５ 光検出器 １６ 集光レンズ １７ フィルタ １８ 光検出器 １９ 信号処理回路 ２０ 集光レンズ ２１ 光電検出器 ２２ 信号処理回路 ２３ 補正回路 ２４ 記憶回路 ２５ 表示部 ２９ スリット ３０ 細胞 ３１ シースフロー １００ 流動細胞分析装置 ２００ フローサイトメータ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 高速に流れる細胞浮遊液に所定の強度分
   布を持った照射光を照射し、集光光学系を介して前記照
   射光による前記細胞からの散乱光または蛍光を受光して
   細胞分析を行なう流動細胞分析装置であって、 前記照射光の細胞浮遊液の透過光成分を検出して、細胞
   が通過していないときの透過光量を検知する透過光量検
   知手段と、 前記透過光量検知手段からの出力をもとに前記受光され
   る散乱光または蛍光の出力を補正するための補正手段と
   を含む、流動細胞分析装置。
2. 【請求項２】 高速に流れる細胞浮遊液に所定の強度分
   布を持った照射光を照射し、集光光学系を介して前記照
   射光による前記細胞からの散乱光または蛍光を受光して
   細胞分析を行なう流動細胞分析装置であって、 前記照射光の細胞浮遊液の透過光成分を検出して、前記
   細胞が通過していないときの透過光量を検知する透過光
   量検知手段と、 前記透過光の強度分布の中心位置を検出して検出された
   中心位置により前記照射光の前記集光光学系に対する位
   置ずれを検知する位置ずれ検知手段と、 前記透過光量検知手段および位置ずれ検知手段からの出
   力をもとに、前記受光される散乱光および蛍光の出力を
   補正するための補正手段とを含む、流動細胞分析装置。
3. 【請求項３】 前記透過光量検知手段は前記細胞を透過
   した照射光を分割する光分割手段を含み、前記透過光量
   の検知は、前記光分割手段によって分割された前方散乱
   光成分と透過光成分に基づいて検知する、請求項１また
   は請求項２のいずれかに記載の流動細胞分析装置。