JP4698766B2 - 蛍光検出装置および蛍光検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、この蛍光から得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置および蛍光検出方法に関する。

医療、生物分野で用いられるフローサイトメータは、光を照射することにより測定対象物の発する光を受光して、測定対象物の種類を特定し、分析する装置である。
具体的には、フローサイトメータは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質を含む混濁液を蛍光試薬でラベル化し、圧力を与えて毎秒１０ｍ以内程度の速度で管路内を流れるシース液に測定対象物を流してラミナーシースフローを形成する。このフロー中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光をラベルとして識別することで測定対象物を特定する。

このフローサイトメータでは、例えば、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。特に、医療分野において、蛋白質同士の相互作用に関する研究が盛んに行われ、ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）が効率よく利用されている。ＦＲＥＴは、レーザ光の照射によって励起された第１分子のエネルギーが第２分子を励起することにより、第1分子のエネルギーが第２分子のエネルギーに移動することをいう。

下記特許文献１には、蛍光検出情報の不確定要素を除外して、定量的にＦＲＥＴ効率を測定することを可能とする検出方法および装置が記載されている。
当該検出方法及び装置は、レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して測定対象サンプルについて照射し、このときの測定対象サンプルの蛍光を複数の検出センサで受光することにより、測定対象サンプルの蛍光の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集する。

特開２００７−２４０４２４号公報

しかし、上記公報に記載される検出方法および装置では、測定対象サンプルが発する蛍光の蛍光強度のダイナミックレンジが広いので、蛍光を受光する受光素子の出力が飽和状態となり、蛍光の位相情報が得られない場合がある。
一方、光電子増倍管（ＰＭＴ）の場合、加速電圧を制御してゲイン調整をすることにより、一般に受光素子の出力の飽和を防止することができる。しかし、このゲイン調整は、ＰＭＴ内部で電子を加速させる加速電圧を制御し、電子走行時間が変化するため、蛍光の位相情報が正しく得られないといった問題がある。このため、較正用のテーブルを用意しておくといった煩雑さがある。
このような受光素子の出力の飽和の問題は、ＦＲＥＴを用いた蛍光検出に限られない。

また、ＰＭＴやアバランシェフォトダイオード等の素子の受光面の前面に減光フィルタを設け、求められる蛍光強度に応じて減光フィルタを用いて機械的に光強度を調整することにより、受光素子の出力の飽和を防止することができる。しかし、この方法は、レーザ光の照射される測定位置を測定対象サンプルが通過する数１０ｍ秒等の短時間内に調整することは難しい。

そこで、本発明は、測定位置にある測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、この蛍光から得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置および蛍光検出方法において、従来と異なる方法により、受光部の出力の飽和を改善することを目的とする。

上記目的は、測定位置を通過する測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、この蛍光から得られる蛍光信号の信号処理を行う、フローサイトメータに用いる以下の蛍光検出装置により達成される。
すなわち、蛍光検出装置は、
（Ａ）測定対象物に照射するレーザ光を出射するレーザ光源部と、
（Ｂ）レーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、
（Ｃ）前記レーザ光源部から出射するレーザ光の強度を時間変調させるために、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部と、
（Ｄ）時間変調したレーザ光を測定対照物に照射することにより前記受光部で出力され、増幅された蛍光信号から、前記変調信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出し、さらに、前記蛍光信号から蛍光強度を算出する処理部と、を有し、
（Ｅ）前記受光部は、前記測定対象物の測定位置と蛍光の受光面との間に、蛍光を集光するレンズを有し、さらに、前記受光部は、前記レンズを通過した前記蛍光について、均一な光強度の分布を有する光束を形成させる手段と、この手段により形成された蛍光の前記光束を、複数の領域に分けて別々に受光する受光素子と、前記複数の領域毎に別々に分けて得られる部分蛍光信号を加算して１つの蛍光信号を出力する信号加算器と、前記部分蛍光信号を前記信号加算器に供給するか否かを行うスイッチング回路と、を有し、
（Ｆ）前記スイッチング回路は、前記複数の領域毎に設けられ、
（Ｇ）前記処理部は、前記蛍光強度が所定の閾値を越える場合、前記スイッチング回路による前記部分蛍光信号の前記信号加算器への供給数を制限する。

前記処理部は、前記蛍光強度が所定の閾値を越える場合、前記スイッチング回路による前記部分蛍光信号の前記信号加算器への供給数を制限するとともに、前記供給数が制限されない場合に比べて大きな係数を用いて前記蛍光強度の値を補正することが好ましい。
前記受光部には、前記部分蛍光信号が前記スイッチング回路に供給される前に、前記複数の領域毎に前記部分蛍光信号をゲイン調整するゲイン調整器が設けられ、前記部分蛍光信号のゲインが揃えられていることが好ましい。

前記受光部は、前記レンズと前記受光面の間に、拡散板を備え、前記レンズにより前記蛍光を前記拡散板上で結像させる構成であることが好ましい。
前記受光部は、前記レンズと前記受光面の間に、入射した蛍光を壁面で反射させる、前記レンズの光軸に平行に設けられた筒状の光導波管を備える構成であることも同様に好ましい。
あるいは、前記受光部の前記レンズは、集光した蛍光を略平行光とすることにより、均一な光強度の分布を有する光束を持つ蛍光を形成する、ことも同様に好ましい。

さらに、上記目的は、測定位置を通過する測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、この蛍光から得られる蛍光信号の信号処理を行う、フローサイトメータで行う蛍光検出方法により、達成される。
すなわち、蛍光検出方法は、
（Ｈ）測定対象物に照射するレーザ光の強度を所定の周波数の変調信号で時間変調させて測定対象物に照射するステップと、
（Ｉ）測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を、光強度の分布が均一な光束とし、前記蛍光の光束を、複数の領域に分けて受光することにより、複数の部分蛍光信号を生成するステップと、
（Ｊ）前記複数の部分蛍光信号の少なくとも一部を加算して１つの蛍光信号を生成するステップと、
（Ｋ）生成した前記蛍光信号を増幅し、増幅した前記蛍光信号から、前記変調信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出するステップと、
（Ｌ）前記蛍光信号から算出される測定対象物の蛍光の蛍光強度が所定の閾値を越える場合、前記部分蛍光信号の加算数を制限し、前記供給数が制限されない場合に比べて大きな係数を用いて前記蛍光強度の値を補正するステップと、を有する。

上述の蛍光検出装置および蛍光検出方法では、レンズを通過した蛍光を、均一な光強度の分布を有する光束にした後、蛍光の光束を、複数の領域に分けて複数の領域で別々に受光する。上述の蛍光検出装置および蛍光検出方法は、均一な光強度の分布を持つ蛍光を、複数の受光面に分散させて受光するので、受光部における受光素子の出力の飽和を改善することができる。
また、スイッチング回路が用いられる場合、最初、スイッチング回路の全てをオン動作させたときに出力される蛍光強度が所定の閾値を越える場合、スイッチング回路の一部をオフに切り替えることができる。このため、処理部内での信号レベルをスイッチング回路にて自在に抑制することができるので、処理部内で処理可能な蛍光強度のダイナミックレンジを従来よりも大きく取ることができ、広いダイナミックレンジで蛍光緩和時間を算出することができる。

本発明の一実施形態である蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータのレーザ光源部の一例の構成を示す図である。 図１に示すフローサイトメータの受光部の一例の概略の構成を示す図である。 図１に示すフローサイトメータの制御・処理部の一例の概略の構成を示す図である。 図１に示すフローサイトメータの分析装置の一例の概略の構成を示す図である。 図３に示す受光部の別の例の概略の構成を示す図である。 図３に示す受光部のさらに別の例の概略の構成を示す図である。

以下、本発明の蛍光検出装置および蛍光検出方法を、添付図面に示された実施形態に基づいて説明する。

（実施形態）
図１は、蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。フローサイトメータ１０は、信号処理装置２０と分析装置（コンピュータ）８０とを有する。信号処理装置２０は、測定対象とする蛍光染色された蛍光蛋白質等の試料１２が蛍光検出のための測定位置を通過するとき、レーザ光の照射を受けて試料１２中の蛍光色素が発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理をする。分析装置８０は、信号処理装置２０で得られた処理結果から試料１２中の測定対象物の蛍光緩和時間の算出および測定対象物の分析を行なう。

信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、制御・処理部２８と、管路３０とを有する。
制御・処理部２８は、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及び試料１２からの蛍光信号を処理する信号処理部を含む。管路３０は、高速流を形成するシース液に含ませて試料１２を流してラミナーシースフローを形成する。
管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料１２が特定の試料か否かを見つけ出し、他の試料から分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。

レーザ光源部２２は、所定の波長のレーザ光を出射する。レーザ光が管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズが設けられ、この集束位置が試料１２の蛍光を調べる測定位置となる。

図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
レーザ光源部２２は、レーザ光源２２ａと、レンズ２２ｂと、レーザドライバ２２ｃとを有する。
レーザ光源２２ａは、３５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視光帯域内の所定の波長を有し、強度変調したレーザ光を出射する。レーザ光源２２ａは、例えば、赤色のレーザ光を強度が一定のＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調しながら出射する。あるいは、緑色のレーザ光を強度が一定のＣＷレーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調しながら出射する。あるいは、例えば、青色のレーザ光を、強度が一定のＣＷレーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調しながら出射する。
レンズ２２ｂは、レーザ光を管路３０中の測定位置に集束させる。レーザ光は、直径数１０μｍ程度のビームとして試料１２に照射する。レーザドライバ２２ｃは、制御・処理部２８から供給された信号を用いてレーザ光源２２ａを駆動する信号を生成する。

レーザ光源２２ａとして例えば半導体レーザが用いられる。レーザ光は、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力である。一方、レーザ光の強度を変調する周波数（変調周波数）は、その周期が試料１２の蛍光色素の蛍光緩和時間に比べてやや長い、例えば１０〜５０ＭＨｚである。

レーザ光源２２ａは、レーザ光が蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光によって励起される蛍光色素は測定しようとする試料１２に付着されており、試料１２が測定対象物として管路３０の測定位置を通過する際、測定位置でレーザ光の照射を受けて特定の波長で蛍光を発する。

受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定位置を通過する試料１２によってレーザ光が前方散乱することにより、試料１２が測定位置を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、制御・処理部２８に供給され、制御・処理部２８において試料１２が管路３０中の測定位置を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。

一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直な、測定位置を通る平面と、管路３０中の試料１２の流れ方向に対して垂直な、測定位置を通る平面との交線上の位置に配置されており、測定位置において試料１２が発する蛍光を受光する光電子増倍管を備える。

図３は、受光部２６の一例の概略の構成を示す構成図である。図３に示す受光部２６は、レンズ２６ａと、拡散板２６ｂと、バンドパスフィルタ２６ｃと、ＰＭＴ（光電子増倍管）２６ｄ₁〜ｄ_n（ｎは、１以上の整数）と、ゲイン調整器２６ｅ₁〜ｅ_n（ｎは、１以上の整数）と、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_n（ｎは、１以上の整数）と、信号加算回路（パワー・コンバイナ）２６ｇと、レンズアレイ２６ｈ₁〜ｈ_n（ｎは、１以上の整数）とを有する。

レンズ２６ａは、試料１２が発する蛍光を集光するレンズである。
拡散板２６ｂは、レンズ２６により拡散板２６ｂの面で結像した蛍光を拡散する板部材である。拡散板２６ｂは、透明基板に入射した光が乱反射するように、表面が凹凸状に形成されたシート状のものや、透明基板中に乱反射を引き起こす微粒子等を分散させたシート状のものが用いられる。拡散板２６ｂに入射した蛍光は、均一な光強度の分布を持った拡散光となって拡散板２６ｂから出射する。

バンドパスフィルタ２６ｃは、ＰＭＴ２６ｄ₁〜ｄ_nの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタバンクである。透過する蛍光の波長帯域は、蛍光の波長帯域に対応して設定されている。
レンズアレイ２６ｈ₁〜ｈ_nは、バンドパスフィルタ２６ｃを通過した蛍光の光束のうち、後述する複数のＰＭＴ２６ｄ₁〜ｄ_nの受光面の間隙や仕切部に位置する部分も効率よく受光されるように集光する。また、ＰＭＴ２６ｄ₁〜ｄ_nの仕切部に入射した蛍光によって仕切部内を電子が走り、走行時間の長い電子に基づいた不要な蛍光信号が生成される。したがって、レンズアレイ２６ｈ₁〜ｈ_nは、ＰＭＴ２６ｄ₁〜ｄ_nの受光面に対応し、仕切部に蛍光が入射しないように、間隔や大きさが設定されている。

ＰＭＴ２６ｄ₁〜ｄ_nは、蛍光の蛍光信号を出力する部分で、蛍光の光束を、複数の領域に分けて複数の領域で別々に受光する。ＰＭＴ２６ｄ₁〜ｄ_nは、ＰＭＴを複数個束ねて形成されたものであるが、多チャンネルＰＭＴを用いてもよい。受光部２６では、ＰＭＴの替わりにアバランシェフォトダイオードを用いてもよい。
ゲイン調整器２６ｅ₁〜ｅ_nは、電流−電圧変換部と電圧調整部とを有する。電流−電圧変換部は、ＰＭＴ２６ｄ₁〜ｄ_nの出力は電流であるので、信号の加算処理を可能とするために電流を電圧に変換する。電圧調整部は、電圧増幅アンプの増幅率あるいは可変抵抗器の抵抗値の調整により電圧を調整する。これにより、一定の光強度の分布の光が入射しても、同じ電圧で蛍光信号が出力するようにゲイン調整される。すなわち、各領域の蛍光信号がスイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nに供給される前に、領域毎にゲインが調整されて揃えられている。各領域の蛍光信号（以降、部分蛍光信号という）のゲインを調整し領域間でゲインを揃えるのは、後述するように、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nにより部分蛍光信号の加算数を制御するからである。

スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nは、電圧信号となった部分蛍光信号を後述する信号加算回路２６ｇへ供給するか否かの制御のために、各領域の部分蛍光信号の供給のオン／オフ動作を行う。このオン／オフ動作は、後述する分析装置８０の信号制御部８０ｄからの制御信号によって制御される。これにより、信号加算回路２６ｇへ供給する部分蛍光信号数を制限することができる。
信号加算回路２６ｇは、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nを介して供給された部分蛍光信号を加算して、１つの蛍光信号とする。すなわち、複数の領域のうち、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nを介して供給された部分蛍光信号が加算されて１つの蛍光信号が出力される。

スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nのオン／オフ動作の制御信号は、分析装置８０において生成される。具体的には、分析装置８０において算出される蛍光強度が所定の閾値を越える場合、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nに対して部分蛍光信号の信号加算回路２６ｇへの供給数を制限するように制御信号を生成する。スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nのうち、どの位置のスイッチング回路をＯＮにするか、については、特に制限されない。蛍光信号は、拡散板２６ｂによって均一な光強度の拡散光となってＰＭＴ２６ｄ₁〜ｄ_nで受光されて得られた信号であり、しかも、各領域の部分蛍光信号のゲインが揃うように調整された信号であるからである。
信号加算回路２６ｇで生成された１つの蛍光信号は、制御・処理部２８の信号処理部４２内のアンプ５４に供給される。
なお、本実施形態では、ゲイン調整器２６ｅ₁〜ｅ_nおよびスイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nを設けるが、均一な光強度の光束を持った光を受光したＰＭＴ２６ｄ₁〜ｄ_nが出力する各電流が揃っている場合、ゲイン調整器２６ｅ₁〜ｅ_nを省略し、スイッチング回路を通して各電流を選択的に加算した後、電圧に変換する構成を用いることもできる。電流の加算は、スイッチング回路を用いるだけなので簡素な構成とすることができる。
また、本実施形態では、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nのオン／オフ動作は、分析装置８０の信号制御部８０ｄからの制御信号によって制御される。しかし、フローサイトメータ１０の操作者が、蛍光強度の算出結果の出力を参照しながら、マニュアル入力により、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nの中でオンあるいはオフにするスイッチング回路を設定してもよい。

制御・処理部２８は、図４に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、コントローラ４４と、を有する。信号生成部４０及びコントローラ４４は、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部を形成する。
信号生成部４０は、レーザ光の強度を所定の周波数で変調（振幅変調）するための変調信号を生成する部分である。具体的には、信号生成部４０は、発振器４６、パワースプリッタ４８及びアンプ５０，５２を有し、生成される変調信号を、アンプ５０を介してレーザ光源部２２のレーザドライバ２２ｃに供給するとともに、アンプ５２を介して信号処理部４２に供給する。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、信号加算回路２６ｇから出力される蛍光信号を検波するための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の正弦波信号であり、１０〜５０ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。

信号処理部４２は、信号加算回路２６ｇから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射により試料１２が発する蛍光の位相遅れに関する情報を抽出する部分である。信号処理部４２は、アンプ５４と、ＩＱミキサ５８と、ローパスフィルタ６０と、アンプ６２と、を有する。アンプ５４は、信号加算回路２６ｇから出力される蛍光信号を増幅する。ＩＱミキサ５８は、増幅された蛍光信号を信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号を受け、この変調信号を参照信号として増幅された蛍光信号と合成する。ローパスフィルタ６０は、ＩＱミキサ５８で処理された結果をフィルタリングして、直流成分を含む低周波成分を取り出す。アンプ６２は、低周波成分の信号を増幅する。

ＩＱミキサ５８は、信号加算回路２６ｇから供給される蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号を参照信号として合成する装置である。具体的には、ＩＱミキサ５８は、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、蛍光信号のｃｏｓ成分と高周波成分を含む処理信号を生成するとともに、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算して、蛍光信号のｓｉｎ成分と高周波成分を含む処理信号を生成する。このｃｏｓ成分を含む処理信号及びｓｉｎ成分を含む処理信号は、ローパスフィルタ５０に供給される。ローパスフィルタ５０では、上記処理信号から蛍光信号のｃｏｓ成分とｓｉｎ成分が取り出され、この蛍光信号のｃｏｓ成分（以降、Ｒｅ成分データという）とｓｉｎ成分（以降、Ｉｍ成分データという）がアンプ６２で増幅されて、分析装置８０に供給される。

コントローラ４４は、信号生成部４０に所定の周波数の正弦波信号を生成させるように制御するとともに、受光部２４から供給された検出信号を用いて、試料１２の処理開始のトリガ信号を生成し、ＩＱミキサ５８に出力する。これにより、ＩＱミキサ５８は、試料１２の測定位置のタイミングを知り、蛍光信号の処理を開始する。

分析装置８０は、供給されたＲｅ成分データ（蛍光信号のｃｏｓ成分）およびＩｍ成分データ（蛍光信号のｓｉｎ成分）を用いて蛍光の位相遅れθおよび蛍光強度の値を求める。さらに、分析装置８０は、この蛍光強度の値が予め設定された範囲からはずれるとき、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nにより、信号加算回路２６ｇへ供給する部分蛍光信号の数を制限する制御信号を生成し、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nへ供給する。

図５は、分析装置８０の概略の構成を示す図である。分析装置８０は、蛍光強度信号生成部８０ａと、蛍光強度算出部８０ｂと、位相遅れ算出部８０ｃと、信号制御部８０ｄと、蛍光緩和時間算出部８０ｅとを有する。これらの各部分は、コンピュータが実行可能なプログラムを実行することで形成されるモジュールである。すなわち、分析装置８０は、コンピュータ上で、ソフトウェアを起動することにより各機能が生成される。分析装置８０には、この他に、ＡＤ変換器８０ｆを備える。

蛍光強度信号生成部８０ａは、アンプ６２から供給され、ＡＤ変換器８０ｆでデジタル信号とされたＲｅ成分データとＩｍ成分データとを二乗加算して平方根を求めることにより、蛍光強度信号を算出する部分である。算出された蛍光強度信号は蛍光強度算出部８０ｂに送られる。なお、蛍光強度信号は、試料１２がレーザ光の測定点を通過する期間に連続して供給されるＲｅ成分データとＩｍ成分データを用いて算出される時系列データである。

蛍光強度算出部８０ｂは、蛍光強度信号生成部８０ａから出力される時系列データの蛍光強度信号から、試料１２が測定位置を通過する期間中の蛍光強度の値を求める。上述したスイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nのオン動作の数が制限されている場合、蛍光強度算出部８０ｂは、このオン動作の数の情報を用いて、蛍光強度の値を求める。オン動作の数が制限されている場合、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nがすべてオンの場合に比べて、大きな補正係数の値を用いて蛍光強度の値を求める。求める値は、蛍光強度の各時間毎の値でもよいし、あるいは、測定位置を通過する期間中の１つの積分値でもよい。試料１２の測定位置の通過は、受光部２４から供給される検出信号により知ることができる。こうして求められた蛍光強度の値は、信号制御部８０ｄに供給される。
位相遅れ算出部８０ｃは、アンプ６２から供給され、ＡＤ変換器８０ｆでデジタル信号とされて供給されたＲｅ成分データとＩｍ成分データを用いてｔａｎ^-1(Ｉｍ／Ｒｅ)（ＩｍはＩｍ成分データの値、ＲｅはＲｅ成分データの値である）を算出することで、位相遅れθを算出する部分である。算出された位相遅れθは信号制御部８０ｄに供給される。また、蛍光緩和時間算出部８０ｅに供給される。

蛍光緩和時間算出部８０ｅは、位相遅れ算出部８０ｃから供給された位相遅れθを用いて、蛍光緩和時間τをτ＝｛１／（２πｆ）｝・ｔａｎθに従って求める。蛍光緩和時間τを、上記式に従って求めることができるのは、蛍光は、略１次遅れの緩和応答に従うからである。なお、変調信号の周波数ｆは、予め固定されている。

信号制御部８０ｄは、蛍光強度算出部８０ｂから供給された蛍光強度の値が、予め設定された範囲に入るか否かを判定し、判定結果に応じて、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nの制御信号を生成する。上記値が予め設定された範囲に入る場合、蛍光強度の算出結果と蛍光緩和時間の算出結果を出力する指示を、蛍光強度算出部８０ｂおよび蛍光緩和時間算出部８０ｅに与える。
すなわち、信号制御部８０ｄは、蛍光強度算出部８０ｂから供給された蛍光強度の値が予め設定された範囲に入らない場合、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nのスイッチオフにする数を求め、これに応じて制御信号を生成する。具体的には、蛍光強度が所定の閾値を越える場合、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nによる部分蛍光信号の信号加算器２６ｇへの供給数を制限する。

信号制御部８０ｄにおける蛍光強度の判定結果に応じて、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nのオン／オフ動作が実行される。算出された蛍光強度、蛍光緩和時間τ、時系列データの蛍光信号および位相遅れのデータが、図示されない出力装置へ出力される。

このようなフローサイトメータ１０では、まず、試料１２に照射するレーザ光の強度を所定の周波数の変調信号で時間変調させて、測定位置にて試料１２に照射する。次に、試料１２にレーザ光を照射することにより試料１２が発する蛍光を、受光部２６は、拡散板２６ｂを用いて光強度の分布が均一な光束とし、この蛍光の光束を、ＰＭＴ１２６ｄ₁〜ｄ_nにおいて、複数の領域に分けて受光する。これにより、複数の領域毎の部分蛍光信号を生成する。信号加算回路２６ｇでは、生成された複数の領域毎の部分蛍光信号の少なくとも一部を加算して１つの蛍光信号を生成する。制御・処理部２８および分析装置８０では、生成した蛍光信号から、変調信号を用いて試料１２の蛍光のＲｅ成分データとＩｍ成分データを取り出し、このＲｅ成分データとＩｍ成分データを用いて、蛍光緩和時間を算出する。そのとき、蛍光信号から算出される試料１２の蛍光の蛍光強度が所定の閾値を越える場合、ＰＭＴ１２６ｄ₁〜ｄ_nにて生成される領域毎の部分蛍光信号の加算数を制限する。

以上のように、フローサイトメータ１０の受光部２６は、レンズ２６ａと拡散板２６ｂとを備え、受光部２６は、レンズ２６ａを通過した蛍光を、拡散板２６ｂを用いて均一な光強度の分布を有する光束を形成させた後、蛍光の光束を、ＰＭＴ２６ｄ₁〜ｄ_nにより、複数の領域に分けて複数の領域で別々に受光する。したがって、蛍光を均一な光強度の分布を持つ光として、複数の受光面に分散させて受光させるので、ＰＭＴ２６ｄ₁〜ｄ_nにおける出力の飽和を改善することができる。
また、最初、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nの全てをオン動作させ、分析装置８０で算出される蛍光強度が閾値を越える場合、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nの一部をオフに切り替えることができる。このため、信号処理部４２および分析装置８０内での信号レベルを自在に抑制することができるので、信号処理部４２および分析装置８０内で処理可能な蛍光強度のダイナミックレンジを従来よりも大きく取ることができ、広いダイナミックレンジで蛍光緩和時間を算出することができる。受光する蛍光の強度分布は、光束内で均一であるので、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nによりオフにする部分蛍光信号の数の情報だけを得ればよく、どのスイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nをオフにするかを知る必要はない。

（実施形態の変形例１）
図６は、図３に示す受光部２６の変形例である受光部１２６の構成を示す図である。受光部１２６は、受光部２６と同様に、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直な、測定位置を通る平面と、管路３０中の試料１２の移動方向に対して垂直な、測定位置を通る平面との交線上に配置されており、測定位置において試料１２が発する蛍光を受光する光電子増倍管を備える。

受光部１２６は、試料１２からの蛍光を集光するレンズ１２６ａと、バンドパスフィルタ１２６ｃと、光導波管１２６ｉと、ＰＭＴ（光電子増倍管）１２６ｄ₁〜ｄ_n（ｎは、１以上の整数）と、ゲイン調整器１２６ｅ₁〜ｅ_n（ｎは、１以上の整数）と、スイッチング回路１２６ｆ₁〜ｆ_n（ｎは、１以上の整数）と、信号加算回路１２６ｇと、レンズアレイ１２６ｈ₁〜ｈ_n（ｎは、１以上の整数）とを有する。
レンズ１２６ａと、バンドパスフィルタ１２６ｃと、ＰＭＴ（光電子増倍管）１２６ｄ₁〜ｄ_n（ｎは、１以上の整数）と、ゲイン調整器１２６ｅ₁〜ｅ_nと、スイッチング回路１２６ｆ₁〜ｆ_nと、信号加算回路１２６ｇと、レンズアレイ１２６ｈ₁〜ｈ_nは、レンズ２６ａと、バンドパスフィルタ２６ｃと、ＰＭＴ（光電子増倍管）２６ｄ₁〜ｄ_n（ｎは、１以上の整数）と、ゲイン調整器２６ｅ₁〜ｅ_nと、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nと、信号加算回路２６ｇと、レンズアレイ２６ｈ₁〜ｈ_nと同様の構成及び機能を持つのでその説明は省略する。

光導波管１２６ｉは、レンズ１２６ａの結像位置より受光面側に設けられ、蛍光の光束が拡散する状態でバンドパスフィルタ１２６ｃを通過した後入射される。光導波管１２６ｉは、多角柱（例えば、６角柱）の筒形状を成し、多角柱の壁面は完全反射面となっている。
レンズ１２６ａを通過し、結像位置を通過した蛍光は、その光束を拡散させつつ、光導波管１２６ｉの壁面で反射させながら、レンズアレイ２６ｈ₁〜ｈ_nに到達するので、レンズアレイ２６ｈ₁〜ｈ_nに到達したとき、蛍光は、種々の方向に進む均一な光強度の分布を持つ拡散光となる。この均一な光強度の分布を持つ蛍光をレンズアレイ１２６ｈ₁〜ｈ_nにて集光し、ＰＭＴ１２６ｄ₁〜ｄ_nに受光させる。光導波管１２６ｉは、例えば、エドモンドオプティックス社製のＴＥＣＳＰＥＣ（登録商標）ライトパイプが挙げられる。

以上のように、受光部１２６は、図３に示す受光部２６と同様に、レンズ１２６ａと光導波管１２６ｉとを備え、受光部１２６は、レンズ１２６ａを通過した蛍光を、光導波管１２６ｉを用いて均一な光強度の分布の光束を形成させた後、蛍光の光束を、ＰＭＴ１２６ｄ₁〜ｄ_nにより、複数の領域に分けて複数の領域で別々に受光する。したがって、蛍光を均一な光強度の分布を持つ光として、複数の受光面に分散させて受光させるので、ＰＭＴ１２６ｄ₁〜ｄ_nにおける出力の飽和を改善することができる。
また、最初、スイッチング回路１２６ｆ₁〜ｆ_nの全てをオン動作させたとき、分析装置８０で算出される蛍光強度が閾値を越える場合、スイッチング回路１２６ｆ₁〜ｆ_nの一部はオフに切り替えることができる。このため、信号処理部４２および分析装置８０内での信号レベルを自在に抑制することができる。その結果、信号処理部４２および分析装置８０内で処理可能な蛍光強度のダイナミックレンジを従来よりも大きく取ることができ、広いダイナミックレンジで蛍光緩和時間を算出することができる。なお、分析装置８０は蛍光強度を算出するとき、スイッチング回路１２６ｆ₁〜ｆ_nのオン動作の数の情報を用いて、蛍光強度を算出する。

（実施形態の変形例２）
図７は、図３に示す受光部２６の変形例である受光部１３６の構成を示す図である。受光部１３６は、受光部２６と同様に、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直な、測定位置を通る平面と、管路３０中の試料１２の移動方向に対して垂直な、測定位置を通る平面との交線上に配置されており、測定位置において試料１２が発する蛍光を受光する光電子増倍管を備える。

受光部１３６は、試料１２からの蛍光を集光させるレンズ１３６ａと、バンドパスフィルタ１３６ｃと、ＰＭＴ（光電子増倍管）１３６ｄ₁〜ｄ_n（ｎは、１以上の整数）と、ゲイン調整器１３６ｅ₁〜e_n（ｎは、１以上の整数）と、スイッチング回路１３６ｆ₁〜ｆ_n（ｎは、１以上の整数）と、信号加算回路１３６ｇと、レンズアレイ１３６ｈ₁〜ｈ_n（ｎは、１以上の整数）とを有する。
レンズ１３６ａと、バンドパスフィルタ１３６ｃと、ＰＭＴ（光電子増倍管）１３６ｄ₁〜ｄ_n（ｎは、１以上の整数）と、ゲイン調整器１３６ｅ₁〜ｅ_nと、スイッチング回路１３６ｆ₁〜ｆ_nと、信号加算回路１３６ｇと、レンズアレイ１３６ｈ₁〜ｈ_nは、レンズ２６ａと、バンドパスフィルタ２６ｃと、ＰＭＴ（光電子増倍管）２６ｄ₁〜ｄ_n（ｎは、１以上の整数）と、ゲイン調整器２６ｅ₁〜ｅ_nと、スイッチング回路２６ｆ₁〜ｆ_nと、信号加算回路２６ｇと、レンズアレイ２６ｈ₁〜ｈ_nと同様の構成及び機能を持つのでその説明は省略する。

なお、レンズ１３６ａの主点の位置と試料１２の測定位置とを結ぶ線分がレンズ１３６ａの光軸上に位置し、この線分の距離がレンズの焦点距離に略一致するようにレンズ１３６ａ（レンズ）は位置決めされている。したがって、試料１２の発する蛍光は、レンズ１３６ａを通過することにより、均一な光強度の分布を持つ略平行な光束を形成する。この略平行光束の蛍光は、複数の領域に分けてＰＭＴ１３６ｄ₁〜ｄ_nにより複数の領域で別々に受光される。なお、この例では、蛍光を略平行な光束とするが、完全に平行な光束には限定されない。蛍光は、少なくとも、ＰＭＴ１３６ｄ₁〜ｄ_nの受光面に略均一に光束が広がるようになっているとよい。

以上のように、受光部１３６は、図３に示す受光部２６と同様に、レンズ１３６ａを通過した蛍光を、均一な光強度の分布を持つ略平行な光束を形成させた後、蛍光の光束を、ＰＭＴ１３６ｄ₁〜ｄ_nにより、複数の領域に分けて複数の領域で別々に受光する。したがって、均一な光強度の分布を持つ蛍光を、複数の受光面に分散させて受光させるので、ＰＭＴ１３６ｄ₁〜ｄ_nのそれぞれにおける出力の飽和を改善することができる。
また、最初、スイッチング回路１３６ｆ₁〜ｆ_nの全てをオン動作させたとき、分析装置８０で算出される蛍光強度が閾値を越える場合、スイッチング回路１３６ｆ₁〜ｆ_nの一部をオフに切り替えることができる。このため、信号処理部４２および分析装置８０内での信号レベルを自在に抑制することができる。その結果、信号処理部４２および分析装置８０内で処理可能な蛍光強度のダイナミックレンジを従来よりも大きく取ることができ、広いダイナミックレンジで蛍光緩和時間を算出することができる。なお、分析装置８０にて蛍光強度を算出するとき、スイッチング回路１３６ｆ₁〜ｆ_nのオン動作の数の情報を用いて、蛍光強度を算出する。

以上、本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。

１０ フローサイトメータ
１２ 試料
２２ レーザ光源部
２２ａ レーザ光源
２２ｂ レンズ
２２ｃ レーザドライバ
２４，２６，１２６，１３６ 受光部
２６ａ、１２６ａ，１３６ａ レンズ
２６ｂ 拡散板
２６ｃ，１２６ｃ，１３６ｃ バンドパスフィルタ
２６ｄ₁〜ｄ_n，１２６ｄ₁〜ｄ_n，１３６ｄ₁〜ｄ_n 光電子増倍管
２６ｅ₁〜ｅ_n，１２６ｅ₁〜ｅ_n，１３６ｅ₁〜ｅ_n ゲイン調整器
２６ｆ₁〜ｆ_n，１２６ｆ₁〜ｆ_n，１３６ｆ₁〜ｆ_n スイッチング回路
２６ｇ，１２６ｇ，１３６ｇ 信号加算回路
２６ｈ₁〜ｈ_n，１２６ｈ₁〜ｈ_n，１３６ｈ₁〜ｈ_n レンズアレイ
１２６ｉ 光導波管
２８ 制御・信号処理部
３０ 管路
３２ 回収容器
４０ 信号生成部
４２ 信号処理部
４４ コントローラ
４６ 発振器
４８ パワースプリッタ
５０，５２，５４，６２ アンプ
５８ ＩＱミキサ
６０ ローパスフィルタ
８０ 分析装置
８０ａ 蛍光強度信号生成部
８０ｂ 蛍光強度算出部
８０ｃ 位相遅れ算出部
８０ｄ 信号制御部
８０ｅ 蛍光緩和時間算出部

Claims (7)

1. 測定位置を通過する測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、この蛍光から得られる蛍光信号の信号処理を行う、フローサイトメータに用いる蛍光検出装置であって、
   測定対象物に照射するレーザ光を出射するレーザ光源部と、
   レーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、
   前記レーザ光源部から出射するレーザ光の強度を時間変調させるために、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部と、
   時間変調したレーザ光を測定対照物に照射することにより前記受光部で出力され、増幅された蛍光信号から、前記変調信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出し、さらに、前記蛍光信号から蛍光強度を算出する処理部と、を有し、
   前記受光部は、前記測定対象物の測定位置と蛍光の受光面との間に、蛍光を集光するレンズを有し、さらに、前記受光部は、前記レンズを通過した前記蛍光について、均一な光強度の分布を有する光束を形成させる手段と、この手段により形成された蛍光の前記光束を、複数の領域に分けて別々に受光する受光素子と、前記複数の領域毎に別々に分けて得られる部分蛍光信号を加算して１つの蛍光信号を出力する信号加算器と、前記部分蛍光信号を前記信号加算器に供給するか否かを行うスイッチング回路と、を有し、
   前記スイッチング回路は、前記複数の領域毎に設けられ、
   前記処理部は、前記蛍光強度が所定の閾値を越える場合、前記スイッチング回路による前記部分蛍光信号の前記信号加算器への供給数を制限する、ことを特徴とする蛍光検出装置。
2. 前記処理部は、前記蛍光強度が所定の閾値を越える場合、前記スイッチング回路による前記部分蛍光信号の前記信号加算器への供給数を制限するとともに、前記供給数が制限されない場合に比べて大きな係数を用いて前記蛍光強度の値を補正する、請求項１に記載の蛍光検出装置。
3. 前記受光部には、前記部分蛍光信号が前記スイッチング回路に供給される前に、前記複数の領域毎に前記部分蛍光信号をゲイン調整するゲイン調整器が設けられ、前記部分蛍光信号のゲインが揃えられている、請求項１または２に記載の蛍光検出装置。
4. 前記受光部は、前記レンズと前記受光面の間に、拡散板を備え、前記レンズにより前記蛍光を前記拡散板上で結像させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
5. 前記受光部は、前記レンズと前記受光面の間に、入射した蛍光を壁面で反射させる、前記レンズの光軸に平行に設けられた筒状の光導波管を備える、請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
6. 前記受光部の前記レンズは、集光した蛍光を略平行光とすることにより、均一な光強度の分布を有する光束を持つ蛍光を形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
7. 測定位置を通過する測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、この蛍光から得られる蛍光信号の信号処理を行う、フローサイトメータで行う蛍光検出方法であって、
   測定対象物に照射するレーザ光の強度を所定の周波数の変調信号で時間変調させて測定対象物に照射するステップと、
   測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を、光強度の分布が均一な光束とし、前記蛍光の光束を、複数の領域に分けて受光することにより、複数の部分蛍光信号を生成するステップと、
   前記複数の部分蛍光信号の少なくとも一部を加算して１つの蛍光信号を生成するステップと、
   生成した前記蛍光信号を増幅し、増幅した前記蛍光信号から、前記変調信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出するステップと、
   前記蛍光信号から算出される測定対象物の蛍光の蛍光強度が所定の閾値を越える場合、前記部分蛍光信号の加算数を制限し、前記供給数が制限されない場合に比べて大きな係数を用いて前記蛍光強度の値を補正するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。

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