KR101163197B1 - 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법 - Google Patents

형광 검출 장치 및 형광 검출 방법 Download PDF

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미쯔이 죠센 가부시키가이샤
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Abstract

형광 검출 장치 및 형광 검출 방법은, 레이저광을 조사(照射)한 측정 대상물로부터 산란되는 전방(前方) 산란광을 수광(受光)하고, 측정 대상물이 측정점을 통과한 것을 알리고, 또한 집속한 전방 산란광의 집속 위치를 특정하기 위한 검지 신호를 생성한다. 한편, 측정 대상물의 형광을 집광 렌즈를 통하여 수광하여 수광 신호를 출력한다. 출력한 수광 신호와 생성한 검지 신호에 기초하여, 형광 강도의 값을 출력한다. 생성된 검지 신호로부터 집광 위치를 특정하고, 이 특정 위치에 따른 보정 계수를 이용하여 수광 신호를 보정한다.

Description

형광 검출 장치 및 형광 검출 방법{FLUORESCENCE DETECTOR AND FLUORESCENCE DETECTION METHOD}
본 발명은, 유로 중을 흐르는 측정 대상물에 레이저광을 조사(照射)하고, 그때 발하는 형광을 측정하는 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법에 관한 것이다.
의료, 생물 분야에서 이용되는 플로우 사이토미터(Flow Cytometer)에는 레이저광을 조사하는 것에 의하여 측정 대상물의 형광 색소로부터의 형광을 수광(受光)하여, 측정 대상물의 종류를 식별하는 형광 검출 장치가 짜 넣어져 있다.
형광 검출 장치에서 사용하는 레이저광의 광 강도는, 일반적으로 중심이 높고, 그 외측(外側)으로 감에 따라 강도가 저하하는 가우시안 분포를 형성한다. 형광 검출 장치의 형광을 고분해능으로 정확하게 측정하려면, 측정 대상물에 레이저광이 일정한 광 강도로 조사되는 것이 필요하다. 이 때문에, 측정 대상물에는, 가우시안 분포를 이루는 레이저광의 광 강도가 대략 일정한 중심 부분을 조사한다. 그러나, 유로를 흐르는 측정 대상물은, 유로 내에서 미리 설정된 측정점의 중심에 대하여 위치가 어긋나는 것으로부터, 측정 대상물의 위치 어긋남을 가능한한 억제하는 것이 행하여지고 있다. 또한, 레이저광의 광속(光束)을 넓혀, 가우시안 분포의 일정한 광 강도를 가지는 부분을 넓히는 것도 행하여지고 있다.
하기 비특허 문헌 1에는, 플로우 사이토미터가 기재되어 있다. 이 플로우 사이토미터에 있어서, 높은 측정 분해능을 얻으려면, 레이저광의 광 강도가 안정되어 있는 것, 측정 대상물을 포함시켜 흐르게 하는 시스액을 조정하여 흐름의 직경을 작게 하는 것, 및 그 흐름이 층류가 되어 있는 것이 필요하다고 지적되어 있다.
그러나, 높은 측정 분해능을 얻고, 또한, 레이저광을 효율 좋게 사용하려면, 상술의 레이저광의 광 강도가 안정되어 있는 것, 시스액의 흐름의 직경을 작게 하는 것, 및 그 흐름을 층류로 하는 것만으로는 충분하다고는 말할 수 없다.
예를 들어, 레이저광의 광속을 넓혀, 측정 대상물의 측정에 이용하는 일정한 강도를 구비하는 부분을 넓힐 수는 있어도, 레이저광의 외측의 부분은, 측정 대상물의 조사에 이용하고 있지 않기 때문에, 레이저광의 사용 효율이 나쁘다.
http://www.bc-cytometry.com/FCM/fcmprinciple_6-6.html (2007년 12월 6일 검색)
그래서, 본 발명은, 상기 문제점을 해결하기 위하여, 유로 중을 흐르는 측정 대상물에 레이저광을 조사하고, 그때 발하는 형광을 측정하는 형광 검출 장치에 있어서, 레이저광의 사용 효율을 높이고, 얻어진 측정 데이터를 이용하여 고분해능의 결과를 얻을 수 있는 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 유로 중을 흐르는 측정 대상물에 레이저광을 조사하고, 그때 발하는 형광을 측정하는 형광 검출 장치이고, 유로 중의 측정점을 통과하는 측정 대상물에 대하여 레이저광을 조사하는 레이저 광원부와, 측정 대상물로부터의 레이저광의 전방(前方) 산란광을 집광하는 광학계와, 집광한 상기 전방 산란광을 수광하는 것에 의하여, 측정 대상물이 측정점을 통과하는 타이밍을 알리는 것과 함께, 집광한 전방 산란광의 집속 위치를 검지하기 위하여, 상기 레이저광의 광 축의 방향 및 상기 유로 중의 측정 대상물의 흐름의 방향과 직교하는 방향으로 병렬 배치된 복수의 검출기를 구비하는 제1 수광부와, 레이저광이 조사된 측정 대상물의 형광을 집광 렌즈를 통하여 수광하여 수광 신호를 출력하는 제2 수광부와, 상기 제1 수광부로부터 출력한 검지 신호를 트리거 신호로 하고, 상기 제2 수광부로부터 출력한 상기 수광 신호와 상기 검지 신호에 기초하여, 데이터 처리를 개시하고, 형광 강도의 출력값을 출력하는 처리부를 가지고,
상기 처리부는, 상기 제1 수광부로부터 출력된 검지 신호로부터 전방 산란광의 집속 위치를 특정하고, 이 집속 위치로부터, 상기 제2 수광부로부터 출력된 수광 신호를 보정하기 위한 보정 계수를 구하고, 이 보정 계수를 이용하여 상기 수광 신호를 보정하는 것을 특징으로 하는 형광 검출 장치를 제공한다.
상기 처리부는, 측정 대상물에 조사되는 레이저광의 광 강도 분포의 정보를 이용하여 집속 위치와, 수광 신호를 보정하기 위한 보정 계수를 관련지은 보정 테이블을 이용하여, 상기 보정 계수를 구하는 것이 바람직하다.
상기 유로와 상기 제1 수광부의 사이에, 레이저광의 직접광이 상기 제1 수광부에 조사되지 않도록, 상기 광 축 근방의 레이저광을 차폐하는 차폐판이 설치되는 것이 바람직하다.
나아가, 보정된 수광 신호를 이용하여, 형광 강도의 빈도 분포를 작성하는 분석부를 구비하는 것이 바람직하다.
나아가, 상기 제1 수광부에서 생성되는 상기 전방 산란광의 산란광 신호의 강도와 상기 전방 산란광의 집속 위치를 이용하여 측정 대상물의 사이즈를 구하는 분석부를 구비하는 것도 바람직하다.
나아가, 본 발명은, 유로 중을 흐르는 측정 대상물에 레이저광을 조사하고, 그때 발하는 형광을 측정하는 형광 검출 방법이고, 측정 대상물이 유로 중의 측정점을 통과하도록 측정 대상물을 흐르게 하여, 측정 대상물에 대하여 레이저광을 조사하는 스텝과, 측정 대상물이 측정점을 통과할 때, 레이저광의 전방 산란광이 광학계를 통하여 집광하는 집속 위치를 검지하는 검지 신호를 생성하는 스텝과, 레이저광이 조사된 측정 대상물의 형광을, 집광 렌즈를 통하여 수광하여 수광 신호를 출력하는 스텝과, 상기 검지 신호로부터 전방 산란광의 집속 위치를 특정하고, 이 집속 위치로부터, 상기 수광 신호를 보정하기 위한 보정 계수를 구하고, 이 보정 계수를 이용하여 상기 수광 신호를 보정하는 것에 의하여, 형광 강도를 산출하는 스텝을 가지는 것을 특징으로 하는 형광 검출 방법을 제공한다.
그때, 상기 수광 신호를 보정할 때, 측정 대상물에 조사되는 레이저광의 광 강도 분포의 정보를 이용하여 집속 위치와, 수광 신호를 보정하기 위한 보정 계수를 관련지은 보정 테이블을 이용하여, 상기 보정 계수를 구하는 것이 바람직하다.
나아가, 유로 중에 측정 대상물을 순차 복수 흐르게 하고, 보정된 상기 수광 신호를 이용하여, 형광 강도의 빈도 분포를 작성하는 스텝을 가지는 것이 바람직하다.
나아가, 상기 전방 산란광의 산란광 신호의 강도와 상기 전방 산란광의 집속 위치를 이용하여 측정 대상물의 사이즈를 구하는 스텝을 가지는 것도 바람직하다.
본 발명의 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법에 있어서, 측정 대상물로부터의 레이저광의 전방 산란광을 집광하는 것에 의하여, 측정 대상물이 측정점을 통과하는 타이밍을 알리는 제1 수광부는, 집광한 전방 산란광의 집속 위치를 검지하기 위하여, 레이저광의 광 축의 방향 및 상기 유로 중의 측정 대상물의 흐름의 방향과 직교하는 방향으로 병렬 배치된 복수의 검출기를 구비한다. 이 때문에, 처리부에서는, 제1 수광부로부터 출력된 검지 신호로부터 전방 산란광의 집광 위치를 특정하고, 이 집속 위치로부터, 제2 수광부로부터 출력된 수광 신호를 보정하기 위한 보정 계수를 구하고, 이 보정 계수를 이용하여 수광 신호를 보정할 수 있다. 따라서, 가우시안 분포 등의 광 강도를 가지는 레이저광이어도, 광 강도가 일정한 중심부 외에, 그 외측의 급격하게 광 강도가 저하하는 주변부를, 측정 대상물의 조사에 사용할 수 있기 때문에, 레이저광의 사용 효율을 높일 수 있다.
또한, 수광 신호를 보정하기 때문에, 분석부에서 작성하는 형광 강도에 대한 빈도 분포에 있어서, 샤프한(분산이 작은) 빈도 분포를 얻을 수 있다. 이 때문에, 빈도 분포에 있어서, 2개의 피크가 근접하여 존재하는 경우라도, 2개의 피크를 판별할 수 있을 정도로, 고분해능의 결과를 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명의 형광 검출 장치를 이용한 플로우 사이토미터의 개략 구성도이다.
도 2는 본 발명의 형광 검출 장치에 이용되는 레이저 광원부의 일례를 도시하는 개략 구성도이다.
도 3은 본 발명의 형광 검출 장치에 이용되는 제1 수광부의 일례를 도시하는 개략 구성도이다.
도 4는 본 발명의 형광 검출 장치에 이용되는 제2 수광부의 일례를 도시하는 개략 구성도이다.
도 5의 (a) ~ (e)는, 본 발명의 형광 검출 장치의 보정에 관하여 설명하는 도면이다.
이하, 본 발명의 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법을 상세하게 설명한다.
도 1은, 본 발명의 형광 검출 장치를 이용한 플로우 사이토미터(10)의 개략 구성도이다.
플로우 사이토미터(10)는, 레이저광을 측정 대상으로 하는 세포 등의 시료(12)에 조사하고, 시료(12) 중의 일부분으로부터 발하는 형광을 검출하여 신호 처리를 하는 신호 처리 장치(형광 검출 장치, 20)와, 신호 처리 장치(20)에서 얻어진 처리 결과로부터 시료(12) 중의 측정 대상물의 분석을 행하는 분석 장치(80)를 가진다.
신호 처리 장치(20)는, 레이저 광원부(22)와 수광부(24, 26)와 처리부(28)와 제어부(29)와 관로(30)와 플로우 셀체(flow cell體, flow cell body, 31)를 가진다.
처리부(28)는, 시료(12)의 형광 강도의 출력값을 출력한다. 제어부(29)는, 소정의 강도로 레이저광을 조사시키고, 각 처리의 동작의 제어 관리를 행한다. 관로(30)는, 고속 흐름을 형성하는 시스액(sheath fluid)에 포함시켜 시료(12)를 흐르게 한다. 플로우 셀체(31)는, 관로(30)의 단(端)에 접속되고, 시료(12)의 플로우를 형성하며, 이 플로우의 경로에 레이저광의 측정점을 만든다.
플로우 셀체(31)의 출구 측에는, 회수 용기(32)가 설치되어 있다. 플로우 사이토미터(10)에는, 레이저광의 조사에 의하여 단시간 내에 시료(12) 중의 특정의 세포 등을 분리하기 위한 셀(cell)?소터(sorter)를 배치하여 따로따로 회수 용기에 분리하도록 구성할 수도 있다.
레이저 광원부(22)는, 파장이 다른 3개의 레이저광, 예를 들어 λ1=405nm, λ2=533nm 및 λ3=650nm 등의 레이저광을 출사(出射)하는 부분이다. 레이저광은, 플로우 셀체(31)의 유로 중의 소정의 위치에 집속하도록 렌즈계가 설치되고, 이 집속 위치가 시료(12)의 측정점으로 되어 있다.
도 2는, 레이저 광원부(22)의 구성의 일례를 도시하는 도면이다.
레이저 광원부(22)는, R 광원(22r), G 광원(22g), B 광원(22b)과, 다이크로익 미러(Dichroic mirror, 23a1, 23a2)와, 렌즈계(23c)와, 레이저 드라이버(34r, 34g 및 34b)와, 파워 스플리터(35)를 가지고 구성된다.
R 광원(22r), G 광원(22g), B 광원(22b)은, 350nm ~ 800nm의 가시광의, 레이저광을 출사하는 부분이고, R 광원(22r)은, 주로 적색의 레이저광(R)을 소정의 강도로 출사한다. G 광원(22g)은, 녹색의 레이저광(G)을 소정의 강도로 출사한다. B 광원(22b)은, 청색의 레이저광(B)을 소정의 강도로 출사한다.
다이크로익 미러(23a1, 23a2)는, 특정의 파장 대역의 레이저광을 투과하고, 다른 파장 대역의 레이저광을 반사한다.
렌즈계(23c)는, 레이저광(R, G 및 B)으로 이루어지는 레이저광을 관로(30) 중의 측정점에 집속시킨다. 레이저 드라이버(34r, 34g 및 34b)는, R 광원(22r), G 광원(22g) 및 B 광원(22b)의 각각을 구동한다.
파워 스플리터(35)는, 공급된 신호를 레이저 드라이버(34r, 34g 및 34b)에 각각 분배한다.
이들 레이저광을 출사하는 광원으로서 예를 들어 반도체 레이저가 이용된다.
다이크로익 미러(23a1)는 레이저광(R)을 투과하고 레이저광(G)을 반사하는 미러이며, 다이크로익 미러(23a2)는 레이저광(R 및 G)를 투과하고 레이저광(B)을 반사하는 미러이다.
이 구성에 의하여 레이저광(R, G 및 B)이 합성되어, 측정점을 통과하는 시료(12)를 조사하는 조사광으로 된다.
레이저 드라이버(34r, 34g 및 34b)는, 처리부(28) 및 제어부(29)에 접속되어, 레이저광(R, G, B)의 출사의 강도가 조정되도록 구성된다.
R 광원(22r), G 광원(22g) 및 B 광원(22b)은, 레이저광(R, G 및 B)이 형광 색소를 여기(勵起)하여 특정의 파장 대역의 형광을 발하도록, 미리 정해진 파장 대역으로 발진한다. 레이저광(R, G 및 B)에 의하여 여기되는 형광 색소는 측정하려고 하는 생체 물질 등의 시료(12)에 부착되어 있고, 측정 대상물로서 플로우 셀체(31)의 측정점을 통과할 때, 측정점에서 레이저광(R, G 및 B)의 조사를 받아 특정의 파장으로 형광을 발한다.
수광부(24)는, 관로(30) 및 플로우 셀체(31)를 사이에 두고 레이저 광원부(22)와 대향하도록 배치되어 있고, 측정점을 통과하는 시료(12)에 의하여 레이저광이 전방 산란하는 것에 의하여 시료(12)가 측정점을 통과하는 취지의 검출 신호를 출력하는 광전 변환기를 구비한다. 이 수광부(24)로부터 출력되는 신호는, 처리부(28) 및 제어부(29)로 공급되고, 처리부(28)에 있어서 시료(12)가 관로(30) 중의 측정점을 통과하는 타이밍을 알리는 트리거 신호로서 이용된다.
도 3은, 수광부(24)의 일례의 개략의 구성을 도시하는 개략 구성도이다. 도 3에서는, 시료(12)의 흐르는 방향이 지면에 대하여 수직 방향이다.
수광부(24)는, 시료(12)에 닿아 전방 산란하는 레이저광을 집광하는 집광 렌즈(24a)와, 집광한 빛을 검출하는 다채널의 전방 산란광 검출 유닛(24b)과, 차폐판(24c)을 가진다.
집광 렌즈(24a)는, 시료(12)에 조사되어 전방(레이저광의 진행 방향 전방, 도 3 중의 우측 방향)으로 산란한 레이저광을 집광하기 위하여 이용된다.
전방 산란광 검출 유닛(24b)은, 레이저광의 조사 방향과 직교하고, 또한, 시료(12)의 흐르는 방향(도 3 중 지면에 수직 방향)과 직교하는 방향으로, 복수의 검출기(24d)가 병렬 배치되어 있다. 검출기(24d)의 각각은, 검출 신호가 처리부(28) 및 제어부(29)로 출력되도록 접속되어 있다. 검출기(24d)는, 예를 들어, 모두 같은 구성을 한 포토다이오드가 이용된다. 이와 같이, 검출기(24d)를 복수 병렬 배치한 것은, 시료(12)가 미리 설정된 측정점(레이저광의 집속점)의 중심에 대하여 위치가 어긋나 통과할 때의 위치 어긋남의 정보를 얻기 위함이다. 구체적으로는, 시료(12)가, 도 3 중, X 방향으로 위치가 어긋난 경우, 레이저광의 전방 산란광은, 전방 산란광 검출 유닛(24b)의 중심 위치 A보다 도면 중 하측의 위치(도 3 중 화살표의 방향의 위치)에서 집속한다. 시료(12)가, 도 3 중, X 방향과 반대 측 방향으로 위치가 어긋난 경우, 레이저광의 전방 산란광은, 전방 산란광 검출 유닛(24b)의 중심 위치 A보다 도면 중 상측의 위치에서 집속한다. 이 집속 위치는, 시료(12)의 X 방향의 위치 어긋남량에 따라 변화한다. 따라서, 계측한 산란광의 최대 강도가 어느 검출기(24d)에서 검출되었는지에 의하여, 집속 위치를 알 수 있다. 이것으로부터, 측정 대상의 시료(12)가 측정점에 대하여 어느 정도 위치가 어긋나 흘렀는지를 알 수 있다. 측정한 검출기(24d)의 검지 신호가 처리부(28) 및 제어부(29)로 공급된다. 검지 신호는, 검출기(24d) 각각으로부터 출력되기 때문에, 최대값을 나타내는 검지 신호를 특정하는 것으로, 산란광의 최대 강도가 어느 검출기(24d)에서 검출되었는지 알 수 있다. 또한, 검지 신호는, 데이터 처리의 개시를 위하여 트리거 신호로서 이용된다.
차폐판(24c)은, 조사된 레이저광의 직접광이 검출기(24d)에서 수광되지 않도록, 이 직접광을 차폐하기 위하여 이용된다.
한편, 수광부(26)는, 레이저 광원부(22)로부터 출사되는 레이저광의 광 축에 수직인 평면 상의, 시료(12)의 흐름에 직교하는 방향, 즉, 레이저광의 조사 방향에 대하여 수직 방향이고, 또한 플로우 셀체(31)의 유로 중의 시료(12)의 이동 방향에 대하여 수직 방향으로 배치되어 있고, 측정점에서 조사된 시료(12)가 발하는 형광을 수광하는 광전 변환기를 구비한다.
한편, 수광부(26)는, 레이저 광원부(22)로부터 출사되는 레이저광의 출사 방향에 대하여 수직 방향이고, 또한 플로우 셀체(31)의 유로 중의 시료(12)의 이동 방향에 대하여 수직 방향으로 배치되어 있고, 측정점에서 조사된 시료(12)가 발하는 형광을 수광하는 광전 변환기를 구비한다.
도 4는, 수광부(26)의 일례의 개략의 구성을 도시하는 개략 구성도이다.
도 4에 도시하는 수광부(26)는, 시료(12)로부터의 형광 신호를 집속시키는 집속 렌즈(26a)와, 다이크로익 미러(26b1, 26b2)와, 밴드 패스 필터(26c1 ~ 26c3)와, 광전자 배증관 등의 광전 변환기(27a ~ 27c)를 가진다.
집속 렌즈(26a)는, 수광부(26)에 입사한 형광을 광전 변환기(27a ~ 27c)의 수광면에 집속시키도록 구성되어 있다.
다이크로익 미러(26b1, 26b2)는, 소정의 범위의 파장 대역의 형광을 반사시키고, 그 이외는 투과시키는 미러이다. 밴드 패스 필터(26c1 ~ 26c3)로 필터링하여 광전 변환기(27a ~ 27c)로 소정의 파장 대역의 형광을 받아들이도록, 다이크로익 미러(26b1, 26b2)의 반사 파장 대역 및 투과 파장 대역이 설정되어 있다.
밴드 패스 필터(26c1 ~ 26c3 )는, 각 광전 변환기(27a ~ 27c)의 수광면의 전면(前面)에 설치되고, 소정의 파장 대역의 형광만이 투과하는 필터이다. 투과하는 형광의 파장 대역은, 형광 색소가 발하는 형광의 파장 대역에 대응하여 설정되어 있다.
광전 변환기(27a ~ 27c)는, 예를 들어 광전자 배증관을 구비한 센서를 구비하고, 광전면에서 수광한 빛을 전기 신호로 변환하는 센서이다.
제어부(29)는, 소정의 강도로 레이저광을 조사시키고, 수광부(24)로부터 공급된 트리거 신호에 기초하여 처리부(28)에 있어서의 각 처리의 동작의 제어 관리를 행하는 부분이다.
처리부(28)는, 소정의 신호 처리를 행하여 형광 강도의 출력값을 분석 장치(80)로 출력하는 부분이다.
처리부(28)에서는, 수광부(24)로부터 공급된 검지 신호에 기초하여 소정의 데이터 처리를 개시한다. 처리부(28)는, 수광부(24)로부터 공급된 검출 신호 중, 최대의 값을 취하는 것이, 어느 검출기(24d)로부터의 것인지 특정하며, 이것에 의하여 전방 산란광의 집속 위치를 특정하고, 이 특정 위치로부터, 수광부(26)로부터 출력된 수광 신호를 보정하기 위한 보정 계수를 구하고, 이 보정 계수를 이용하여 수광 신호를 보정한다.
처리부(28)는, 검출기(24d)의 집속 위치로부터 레이저광의 강도를 구하고, 이 강도에 따른 보정 계수를 구하는 처리를 일괄하여 행하기 때문에, 미리 기억되어 있는 보정 테이블을 이용하여 보정을 행한다. 이 보정 테이블은, 시료(12)에 조사되는 레이저광의 광 강도 분포의 정보를 이용하여 집속 위치와, 수광 신호를 보정하기 위한 보정 계수를 관련지어 설정된 것이다.
도 5의 (a) ~ (e)는, 수광 신호의 보정을 행할 필요성을 설명하는 도면이다.
본 발명에서는, 수광 신호는, 후술하는 분석 장치(80)에 있어서, 도 5의 (d)에 도시하는 바와 같은 형광 강도에 대한 시료(12)의 빈도 분포를 산출하고, 이 빈도 분포로부터, 특정의 형광이 측정되었는지 여부를 판별하기 위하여 사용한다. 이때, 형광이 2종류 존재하는 경우, 빈도 분포에 있어서 2개의 피크를 형성한다. 이 2개의 피크의 형광 강도가 근접하고 있을 때, 이 2개의 피크를 판별할 수 있기 위해서는, 피크의 폭이 좁은 것(분산이 작은 것)이 필요하다. 도 5의 (e)와 같이, 1개의 피크의 피크 폭이 넓을(분산이 큰) 경우, 2개의 피크는 판별할 수 없다. 도 5의 (e)는, 상술의 보정을 하지 않는 경우의 빈도 분포이다.
도 5의 (a)에 도시하는 바와 같이, 시료(12)의 통과하는 위치 A ~ C 등에 따라, 이 위치에 있어서의 레이저광의 광 강도 분포의 역수의 분포를 가지는 보정 계수를 이용하여, 이 보정 계수를 수광 신호에 곱셈한다. 시료(12)의 위치는, 도 5의 (c)와 같이, 분포를 가지고 흩어지지만, 상술한 바와 같이 보정 계수를 이용하여 수광 신호를 보정하기 때문에, 보정을 하지 않는 경우의 빈도 분포인 도 5의 (e)에 대하여, 도 5의 (d)와 같이 피크의 폭이 좁아진다.
이와 같이, 수광 신호에 대하여 보정을 하는 것은, 도 5의 (d)와 같이 피크의 폭을 좁게 하여, 빈도 분포에 있어서의 분해능을 향상시키기 위함이다.
보정은 단순하게 보정 계수를 수광 신호에 곱셈하는 것이다. 이것은, 형광의 강도가 조사되는 레이저광의 광 강도에 따라 선형적으로 변화하는 부분을 호적하게 이용하기 때문이다. 그러나, 본 발명에서는 이것에 한정되지 않는다. 적어도 형광의 강도가 조사되는 레이저광의 광 강도와 대응 관계에 있고, 이 관계를 이용하여 보정 계수를 정하면 된다.
분석 장치(80)는, 처리부(28)로부터 공급되는 보정된 수광 신호를 이용하여, 도 5의 (d)와 같은 빈도 분포를 작성하고, 플로우 셀체(31)의 측정점을 통과하는 시료(12) 중에 포함되는 생체 물질의 종류 등을 특정하여, 시료(12) 중에 포함되는 생체 물질의 분석을 행하는 장치이다.
이와 같은 형광 검출 장치(20)에서는, 시료(12)가 레이저광에 의하여 조사되었을 때, 시료(12)로부터 발하는 전방 산란광을, 전방 산란광 검출 유닛(24b)의 검출기(24d)로 검출한다. 검출기(24d)가 생성하는 검지 신호에 의하여, 전방 산란광의 집속 위치를 알 수 있기 때문에, 이 집속 위치에 기초하여, 처리부(28)가 보유하는 보정 테이블을 이용하여 보정 계수가 구하여진다. 이 보정 계수를 수광부(26)의 수광 신호에 곱셈하는 것에 의하여, 수광 신호는 보정된다.
보정된 수광 신호는, 분석 장치(80)로 공급되어, 도 5의 (d)에 도시하는 바와 같은 빈도 분포가 작성된다.
형광 검출 장치(20)에서는, 처리부(28)에 있어서, 레이저광의 광 강도의 분포를 이용한 보정 테이블을 이용하여 수광 신호의 보정을 행하기 때문에, 분석 장치(80)에서는, 피크 폭이 좁은 빈도 분포를 얻을 수 있다. 한편, 레이저광에 광 강도 분포가 존재하여도, 이 분포를 이용하여 보정하기 때문에, 종래와 같이, 일정의 광 강도를 가지는 레이저광의 중심부만을 형광의 측정에 사용할 필요는 없어, 종래 측정에 이용되지 않았던 레이저광의 중심 부분의 외측 부분도 형광의 측정에 사용할 수 있다. 이 때문에, 레이저광을 효율 좋게 사용할 수 있다.
또한, 시료(12)가 흐르는 위치를 찾을 수도 있다. 검출기(24d)의 검출 신호로부터 시료(12)의 위치에 있어서의 레이저광의 광 강도가 기지(旣知)로 되어 있다. 한편, 전방 산란광의 광 강도는, 시료(12)의 위치에 있어서의 레이저광의 광 강도와 시료(12)의 사이즈의 곱셈한 결과로서 얻어지는 것이기 때문에, 기지의 레이저광의 광 강도를 이용하여, 측정된 시료(12)의 개략의 사이즈를 알 수도 있다. 이와 같은 측정된 시료(12)의 개략의 사이즈의 산출 처리를, 분석 장치(80)는 행하여도 무방하다. 이때, 수광부(24)에서 생성되는 전방 산란광의 산란광 신호의 강도와, 전방 산란광의 집속 위치를 이용하여 시료(12)의 사이즈를 구한다. 구체적으로는, 전방 산란광의 집속 위치는 기지로 되기 때문에, 이 집속 위치로부터 시료(12)가 통과하는 측정점의 위치 어긋남을 구하여, 이 위치가 어긋난 시료(12)의 조사되는 레이저광의 광 강도를 알 수 있다. 이 레이저광의 광 강도와, 전방 산란광의 산란광 신호의 강도로부터 시료(12)의 사이즈를 구할 수 있다.
이상, 본 발명의 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법에 관하여 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않고, 본 발명의 주지를 일탈하지 않는 범위에 있어서, 여러 가지의 개량이나 변경을 하여도 무방한 것은 물론이다.
10: 플로우 사이토미터 12: 시료
20: 신호 처리 장치 22: 레이저 광원부
22r: R 광원 22g: G 광원
22b: B 광원 23a1, 23a2, 26b1, 26b2: 다이크로익 미러
23c: 렌즈계 24, 26: 수광부
24a: 집광 렌즈 24b: 전방 산란광 검출 유닛
24c: 차폐판 24d: 검출기
26a: 집속 렌즈 26c1, 26c2, 26c3: 밴드 패스 필터
27a ~ 27c: 광전 변환기 28: 처리부
29: 제어부 30: 관로
31: 플로우 셀체 32: 회수 용기
34r, 34g, 34b: 레이저 드라이버 35: 파워 스플리터
80: 분석 장치

Claims (9)

  1. 유로 중을 흐르는 측정 대상물에 레이저광을 조사(照射)하고, 그때 발하는 형광을 측정하는 형광 검출 장치이고,
    상기 유로 중의 측정점을 통과하는 측정 대상물에 대하여 레이저광을 조사하는 레이저 광원부와,
    측정 대상물로부터의 레이저광의 전방(前方) 산란광을 집광하는 광학계와, 집광한 상기 전방 산란광을 수광(受光)하는 것에 의하여, 측정 대상물이 측정점을 통과하는 타이밍을 알리는 것과 함께, 집광한 상기 전방 산란광의 집속 위치를 검지하기 위하여, 상기 레이저광의 광 축의 방향 및 상기 유로 중의 측정 대상물의 흐름의 방향과 직교하는 방향으로 병렬 배치된 복수의 검출기를 구비하는 제1 수광부와,
    레이저광이 조사된 측정 대상물의 형광을 집광 렌즈를 통하여 수광하여 수광 신호를 출력하는 제2 수광부와,
    상기 제1 수광부로부터 출력한 검지 신호를 트리거 신호로 하여, 상기 제2 수광부로부터 출력한 상기 수광 신호와 상기 검지 신호에 기초하여, 데이터 처리를 개시하고, 형광 강도의 출력값을 출력하는 처리부를 가지고,
    상기 처리부는, 상기 제1 수광부로부터 출력된 검지 신호로부터 전방 산란광의 집속 위치를 특정하고, 이 집속 위치로부터, 상기 제2 수광부로부터 출력된 수광 신호를 보정하기 위한 보정 계수를 구하고, 이 보정 계수를 이용하여 상기 수광 신호를 보정하는 것을 특징으로 하는 형광 검출 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 처리부는, 측정 대상물에 조사되는 레이저광의 광 강도 분포의 정보를 이용하여 집속 위치와, 수광 신호를 보정하기 위한 보정 계수를 관련지은 보정 테이블을 이용하여, 상기 보정 계수를 구하는 형광 검출 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 유로와 상기 제1 수광부의 사이에, 레이저광의 직접광이 상기 제1 수광부에 조사되지 않도록, 상기 광 축 근방의 레이저광을 차폐하는 차폐판이 설치되는 형광 검출 장치.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    나아가, 상기 유로 중에 측정 대상물을 순차 복수 흐르게 하고, 보정된 상기 수광 신호를 이용하여, 형광 강도의 빈도 분포를 작성하는 분석부를 구비하는 형광 검출 장치.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    나아가, 상기 제1 수광부에서 생성되는 상기 전방 산란광의 산란광 신호의 강도와 상기 전방 산란광의 집속 위치를 이용하여 측정 대상물의 사이즈를 구하는 분석부를 구비하는 형광 검출 장치.
  6. 유로 중을 흐르는 측정 대상물에 레이저광을 조사하고, 그때 발하는 형광을 측정하는 형광 검출 방법이고,
    측정 대상물이 상기 유로 중의 측정점을 통과하도록 측정 대상물을 흐르게 하여, 측정 대상물에 대하여 레이저광을 조사하는 스텝과,
    측정 대상물이 측정점을 통과할 때, 레이저광의 전방 산란광이 광학계를 통하여 집광하는 집속 위치를 검지하는 검지 신호를 생성하는 스텝과,
    레이저광이 조사된 측정 대상물의 형광을, 집광 렌즈를 통하여 수광하여 수광 신호를 출력하는 스텝과,
    상기 검지 신호로부터 전방 산란광의 집속 위치를 특정하고, 이 집속 위치로부터, 상기 수광 신호를 보정하기 위한 보정 계수를 구하고, 이 보정 계수를 이용하여 상기 수광 신호를 보정하는 것에 의하여, 형광 강도를 산출하는 스텝을 가지는 것을 특징으로 하는 형광 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 수광 신호를 보정할 때, 측정 대상물에 조사되는 레이저광의 광 강도 분포의 정보를 이용하여 집속 위치와, 수광 신호를 보정하기 위한 보정 계수를 관련지은 보정 테이블을 이용하여, 상기 보정 계수를 구하는 형광 검출 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    나아가, 상기 유로 중에 측정 대상물을 순차 복수 흐르게 하고, 보정된 상기 수광 신호를 이용하여, 형광 강도의 빈도 분포를 작성하는 스텝을 가지는 형광 검출 방법.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    나아가, 상기 전방 산란광의 산란광 신호의 강도와 상기 전방 산란광의 집속 위치를 이용하여 측정 대상물의 사이즈를 구하는 스텝을 가지는 형광 검출 방법.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120103659A (ko) * 2010-01-15 2012-09-19 미쯔이 죠센 가부시키가이샤 형광 측정 장치 및 형광 측정 방법
US9442059B2 (en) 2011-05-12 2016-09-13 Xy, Llc UV diode laser excitation in flow cytometry
US9746412B2 (en) 2012-05-30 2017-08-29 Iris International, Inc. Flow cytometer
CN108593529A (zh) * 2012-06-06 2018-09-28 索尼公司 微粒测量装置及其数据处理方法
CN104736995B (zh) 2012-12-03 2017-07-25 富士电机株式会社 粒子束形成装置
CN103063626A (zh) * 2012-12-13 2013-04-24 江西科技师范大学 一种光路自动校正的细胞激光激发检测装置及其方法
CN103300863B (zh) * 2013-06-19 2014-09-10 张英泽 外科手术用激光尺
CN103881707A (zh) * 2013-12-30 2014-06-25 安徽师范大学 一种磷光能量转移体系，其合成方法，用途以及单链脱氧核糖核苷酸的检测方法
EP3372985A4 (en) * 2015-10-28 2019-09-18 The University Of Tokyo ANALYSIS DEVICE
EP3457021B1 (en) * 2016-05-13 2020-09-23 Panasonic Semiconductor Solutions Co., Ltd. Light source device and lighting device
JP7026337B2 (ja) * 2017-08-29 2022-02-28 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 光観測装置
CN108489947B (zh) * 2018-03-22 2021-02-09 深圳大学 一种荧光寿命的测量方法及装置
CN109230757B (zh) * 2018-08-20 2020-05-08 山东中烟工业有限责任公司 高速卷接机的水松纸和盘纸拼接头检测装置及方法
US10908065B2 (en) * 2018-09-17 2021-02-02 Inguran, Llc Light collection from objects within a fluid column
JP7260308B2 (ja) * 2019-01-24 2023-04-18 リオン株式会社 流体中浮遊物質測定用フローセル及び粒子計数装置
KR102458411B1 (ko) * 2020-11-30 2022-10-26 에스팩 주식회사 입자 계수 장치 및 방법
CN114993897B (zh) * 2022-07-18 2022-11-18 广东省麦思科学仪器创新研究院 气溶胶颗粒束束宽及颗粒分布的检测装置、套装和方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006226698A (ja) 2005-02-15 2006-08-31 Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd 強度変調したレーザ光による蛍光検出装置

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4643566A (en) * 1984-07-20 1987-02-17 Canon Kabushiki Kaisha Particle analyzing apparatus
JPS6129738A (ja) * 1984-07-20 1986-02-10 Canon Inc 粒子解析装置及び粒子解析方法
JPS61128140A (ja) * 1984-11-27 1986-06-16 Canon Inc 粒子解析装置
JP2749928B2 (ja) * 1990-01-26 1998-05-13 キヤノン株式会社 検体測定方法及び検体測定装置
EP0448931B1 (en) * 1990-01-26 1996-04-03 Canon Kabushiki Kaisha Method for measuring a specimen by the use of fluorescence light
US5315122A (en) * 1992-08-25 1994-05-24 Becton, Dickinson And Company Apparatus and method for fluorescent lifetime measurement
JPH0996603A (ja) * 1995-09-29 1997-04-08 Sumitomo Electric Ind Ltd 流動細胞分析装置
JP2004001569A (ja) * 2003-08-22 2004-01-08 Citizen Watch Co Ltd プリントギャップ調整機構

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006226698A (ja) 2005-02-15 2006-08-31 Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd 強度変調したレーザ光による蛍光検出装置

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