JP2009529134A - 流体中の微細オブジェクトのフォトルミネセンス、吸光度、及び回折度を測定する装置及び方法 - Google Patents

Abstract

測定容器ＣＭ内の流体におけるフォトルミネセンスを測定する装置。少なくとも２つの光学系Ｃｉからの２つの励起ビームが測定容器ＣＭ内の流体に同時に照射される。光学系群Ｃｉの系軸Ｘｉは互いの軸間で、測定容器ＣＭの回りで１８０°以外の非ゼロの鈍角をなすように位置する。フォトルミネセンスの測定値は、検出素子群ＣＥｉが同時に捕捉する放射ビームから得られるデータを統合することで推定される。光学系群Ｃｉは、第１光学系Ｃｂの光源Ｓｂからの励起ビームと、第２光学系Ｃａの検出素子ＣＥａが捕捉する放射ビームとの間に少なくとも一つの部分重なりビームＦＣｂ_ａが生じるように配置される。部分重なりビームＦＣｂ_ａから励起波長光を検出する少なくとも一つの減衰光検出素子ＤＴａが少なくとも一つの光源Ｓａの近傍に設けられ、吸光度及び／又は回折度の測定値は、減衰光検出素子ＤＴａが検出する光から得られるデータから推定される。

Description

本発明は概して、測定容器内の流体中のフォトルミネセンスを測定する装置及び方法に関する。

この種の装置及び方法は、流体中、例えば生物学的流体中の微細オブジェクト（または粒子）をカウントするために特に使用される。詳細には、同装置は、発光ダイオード（ＬＥＤ）のような部分的にコヒーレントな光源を、流体に含まれる分子、例えば蛍光分子を励起する手段として使用される。

フォトルミネセンスによる発光は放出現象であり、放出現象はほぼ等方的に生じ、かつ既に光エネルギーによって励起されている励起分子が、当該分子の基底状態に戻るときに生じ、この励起は分子に固有の波長で生じる。蛍光による発光は必ず、励起周波数よりも低い周波数で生じる。測定は通常、入射光の励起軸から離れて、かつ検出器に向けて注目スペクトル帯域のみを通過させる有色フィルタを介して行なわれる。

本発明は特に、生体分子、例えばタンパク質または核酸に標識を付けることにより発生する信号のような非常に弱いフォトルミネセンス信号の検出を可能にする光学手段及び光電子手段の開発に関する。

動物生物学では、フォトルミネセンス信号の測定は、開業医が診断を行なう、特に細胞診を行なうために非常に有用であり、細胞診では、造血幹細胞のような、あるいは血液に現われたり、または他の或る生物学的液体に現われたりする他の要素のような非常に少ない細胞株を検出し、カウントすることができれば非常に有用である。

光の放出が自然に起こる、または分子プローブによって生じるかどうかに関係なく、生物学的要素のフォトルミネセンス測定はフローサイトメトリーの分野において、自動細胞診装置の中で、特に血液細胞学に関して広く使用される。

使用する分子プローブは、生体染色色素または超生体染色色素であり、各生体染色色素は、核酸を介在させる色素のように、或る特定タイプの分子に対して固有の親和性を有する。これらの分子プローブは、抗体と当該抗体に移植された色素分子との組み合わせ、一般には、単独の、または繋がった、あるいはナノ結晶の蛍光色素との組み合わせを含む種類の免疫プローブとすることもできる。抗体は特に分子に、または抗原または抗原決定基として知られる分子部分に結合する性質を持ち、これらの分子と結合する抗体は、フォトルミネセンスを測定することによりカウントされる。

免疫プローブを用いることにより標識を付ける方法は、細胞学的同定に、特にフローサイトメトリー法を援用する形で広く使用される。
このような測定に必要な感度を実現するために、励起光源は、十分に大きいエネルギーを供給して、標識化された各生物学的要素が励起ビームの前を通過するときに、当該生物学的要素を十分に高い感度で検出することができるようにする必要がある。

この電力を実現するために、ほとんどの血球計算器またはこれらの蛍光技術を利用する装置では、ガス光源、固体光源、または他の光源を使用するか、或いはレーダイオードのような半導体光源、及び例えば、ダイオード励起の固体（ＤＰＳＳ）光源のような他のレーザ関連機器のいずれを使用するかに関係なく、レーザタイプの光源が使用される。

レーザタイプの光源は、非常に高い空間コヒーレンスを有し、高電力を供給するが、レーザビームのガウス分布は測定ポイントでの光照射野の均一性に影響する。複雑であり、ゆえに高価になる光学系を利用して、測定ポイントで０．５％未満の均一性を持つ照射野を実現する必要がある。

従って、レーザ光源の使用には、費用が嵩むという大きな不具合があり、特に色素または複数帯域を使用し、かつコストが法外に高くなる紫外線（ＵＶ）励起発光装置を用いる場合には、費用が嵩むという大きな不具合があり、これは、このような装置の使用が生物学的分析の困難な分野における非常に特殊な環境に限定されることを意味する。

レーザダイオードは安価であり、かつ高い空間コヒーレンスに関連する高い電力密度を実現するという利点をもたらすが、使用可能な波長が、ＬＥＤが発する波長よりも狭い波長に限定される。

これに関して、例えば国際公開第ＷＯ ００／５７１６１号の文献では、低い空間コヒーレンスを有するＬＥＤのような光源が流動血球計算器に使用されている。
図１は、低い空間コヒーレンスを有するアークランプまたはＬＥＤのような光源を普通利用する装置を示している。このような装置を使用してフォトルミネセンスを測定容器ＣＭの中で測定することができ、測定容器には、容器の中心部分に注入される分析用の流体、例えば生物学的流体が収容される。提案される光学系は通常、落射蛍光モード設定（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｏｄｅ ｓｅｔｕｐ）と言われる。この装置は、励起ビームを生成する光源Ｓと、フォトルミネセンスによって放出されるビーム光を検出する素子（例えば、光検出器ＰＤ）とを備える。

励起ビームまたは励起光、或いは励起放射光という用語は、分析対象の流体を照射するために使用される光源からの光を指すために使用される。
放射ビームまたは放射光、或いは放出放射光という用語は、励起ビームと、分析対象の流体に含まれる微細オブジェクトとの非弾性相互作用から生じる光、例えば蛍光またはフォトルミネセンスによって放出される光を指すために使用される。

このような落射蛍光装置では、光源Ｓによって生成される励起ビーム、及び光検出器ＰＤによって検出される放射ビームは同軸上に存在する、すなわち「系」の軸Ｘに沿って伝搬するので、同じ光学系は、光の放射、及び受信の両方に使用することができる。

装置は、励起ビームと放射ビームとを分離するダイクロイックプレートＰＣを有する。
有利な点として、装置は更に２つのフィルタＦ１及びＦ２を有し、これらのフィルタは、光源Ｓから測定容器ＣＭに向かって放出される光、及び光源Ｓから放出される励起光と、測定容器ＣＭに収容される流体の中の微細オブジェクトとの非弾性相互作用により生じる蛍光（種々の波長を有することができる）をそれぞれフィルタリングする。

光学ユニットＬ１及びＬ２によって、励起ビーム及び放射ビームは、これらがフィルタＦ１及びＦ２、及びダイクロイックプレートＤＣを通過するときに平行ビームとなる。大きな開口数を有するレンズまたは光学ユニットＬ２によって、励起ビームの焦点を、測定容器ＣＭの測定ポイントＭを中心とする小さい容積に合わせることができる。

流体内の微細オブジェクトから放出され、励起ビームによって照射されるポイントＭを通過する蛍光は、レンズＬ２により集光されて平行ビームとされ、プレートＤＣを通過してフィルタＦ２でフィルタリングされ、その後レンズＬ３により集光された後に光検出器ＰＤによって受信される。

一般に、使用される蛍光色素に対して選択される中心波長で得られる励起ビームの電力は小さい。このため、先行技術による装置では判別機能が低下するので、これらの装置の適用分野が制限される。これらの装置は、例えば非常に多くのエピトープ（抗体が抗原を認識して結合する構造単位）、または蛍光に対して高い効率性を示す標識に対応する強い蛍光信号しか検出することができない。

先行技術による装置が呈する問題を解決するために、本発明の主たる目的は、フォトルミネセンスを測定し、吸光度及び／又は回折度を測定する高精度の、高感度の、かつ安価な装置を提案することにある。

本装置は少なくとも２つの光学系を備え、各光学系は、空間コヒーレンスが低くかつ励起ビームを測定容器に向けて「系」の軸に沿って供給する光源、及びその系軸を中心とするフォトルミネセント放射ビームを検出する（または、捕捉する）検出素子（または、捕捉素子）の両方を含み、これらの光学系群は同時に動作し、かつそれらの系軸が測定容器の回りで１８０°以外の非ゼロの鈍角を互いの軸間でなすように位置し、フォトルミネセンスの測定値は、検出素子群が同時に検出する放射ビームから得られるデータを統合することにより推定される。本発明によれば、これらの光学系群は、第１光学系の光源の励起ビームと、第２光学系の検出素子によって検出される放射ビームとの間に少なくとも一つの部分重なりビームが発生するように配置される。本装置には更に、複数の光源のうちの少なくとも一つの光源の近傍に位置して、励起波長の光を前記部分重なりビームの中から検出する少なくとも一つの消光検出素子が設けられ、吸光度及び／又は回折度の測定値は、消光検出素子が検出する光から得られるデータに基づいて推定される。

本発明は特に、光学系の数を増やして各光学系に空間コヒーレンスの低い光源を使用し、受信される放射ビーム群を一括結合することを提案する。光学系の数が「ｎ」である場合、この構成によって測定ポイントでの励起電力を、単一の光学系を使用する場合の「ｎ」倍の大きさにすることができ、更には、受けるフォトルミネセント放出電力（ｐｈｏｔｏ−ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｐｏｗｅｒ）を、単一の光学系から受ける場合よりもｎ^２倍の大きさにすることができる。この理由は、「ｎ」個の光学系から同時に電力を受けるからである。落射蛍光に使用される光学系の数「ｎ」を増やすと、装置の検出感度が確実に、ほぼｎ^２倍という非常に大きい倍数だけ高くなるという現象は、フォトルミネセント放射光の等方的な性質である。従って、コヒーレンスの低い光源を使用することが可能になり、悪影響を及ぼして感度を低下させるということは全くない。

更に、同時に動作する２つの光学系からの２つの励起ビームによって測定ボリュームが励起され、かつ蛍光により放出される光が等方的であると仮定すると、蛍光放射ビームは２つの光学系の両方の検出素子によって同時に収集される。両方の光学系は落射蛍光装置である、すなわち、放出及び受光が同じ光学系を利用する共通の軸に沿って行なわ、かつ両方の光学系がこれらの系がなす角度が厳密に鈍角となるように配置されるので、各光学系が受信する蛍光放射ビームには、他の光学系からの励起ビームに対して角度ずれが発生する。

従って、受信される蛍光放射ビームは、直接光照射する結果としてほとんど干渉を受けることがなく、かつ２つの励起ビームが、先行技術による装置におけるような単一の励起ビームの代わりに使用されているので、強度も２倍になる。従って、本発明の装置は精度が更に高くなり、かつ感度が更に高くなる。

更に、２つの光学系が測定容器の回りで互いに鈍角をなすので、重なり度が低い状態の重なりビームを形成することにより、最も低い強度の干渉光を生成しながら最大電力を確実に容器に到達させることができる。

本発明は、光を重なりビームから検出する消光検出素子を使用することを提案し、この光は、重なりビームを通過する微細オブジェクトによる吸光度及び／又は回折度を表わす強度変化を示唆する。適切な検出素子を使用することにより、この吸光度を定量化することができる。

本発明の一つの実施形態では、本装置は奇数個の光学系を有し、これらの光学系群は、対をなす互いの系軸が測定容器の回りで１８０°以外の非ゼロの鈍角を互いの軸間でなすように配置される。

特定の特徴によれば、これらの光学系群は、これらの系軸が測定容器の回りで同じ角度をなすように配置される。
好ましくは、光学系の数は３である。本装置が３つの光学系を有する場合、これらの光学系群は、それらの系軸が測定容器の回りで同じ角度を互いの軸間でなすように測定容器の回りに配置される。

この特定の特徴は、各検出素子が測定容器ＣＭから受信する各蛍光放射ビームの強度を、単一の光学系を使用して励起を行なう場合と比べて３倍にすることを可能にしながら、測定容器の回りの空間バルクを小さくするように作用する。

更に、大きい開口数を持つ励起ビーム及び放射ビームを使用することにより、光学系の測定容器の回りの１２０°の位置で重なりビームを形成することができる。これにより、容器中の蛍光色素を励起する電力をそれに応じて大きくすることができるという利点が得られる。

更に、このような開口数の大きな光源を使用することにより、非常に均一な光照射野が得られる。従って、３つの光学系を使用することにより、有利な相乗効果が得られる。
更に、３つの光学系を使用することにより、光学系間の角度、利用可能な光電力、重なり性、光照射野の均一性、コスト、及び感度の点で好ましい構成が得られる。

しかしながら、３光学系構成の利点の多くは、重なりビームの有無、及び消光検出素子の有無とは無関係である。更に、この構成は、消光を測定することなく、低い空間コヒーレンスを有する光源を使用して蛍光を測定するために、かつ重なりビームの有無に関係なく完璧な形で用いることができる。

有利な実施形態では、放射ビーム検出素子群は共通の光検出器に、または共通の光検出器群に接続される。
この実施形態によって、共通の光検出器内に直接収容される検出素子群によって同時に受信される蛍光信号を統合することが可能になる。この場合、データが単一の光検出器を使用して取得されるため、データを直接結合することができる。この特徴は、光信号の光加算を実行するために役立つ。光検出器は単一の波長に対する感度が概して高い。従って、単一の光検出器の使用は、フォトルミネセンス波長を一つだけ予測する場合に一層適することになり、一つのフォトルミネセンス波長は単一の励起波長にほぼ対応する。

これとは異なり、検出素子群に対応する１つの光検出器を使用することにより、複数のフォトルミネセンス波長を検出することができる。従って、この構成は、複数の波長での励起に更に正確に対応する複数のフォトルミネセンス波長を予測する場合に一層適する。例えば、この構成は、３つの光学系の全てが必ずしも同じ波長の光を放出する訳ではない構成に対応する。

両方の構成では、光検出器は光信号の光加算を実行する。
有利な点として、光検出器（群）は、フォトルミネセンス測定値を、光検出器（群）から受信するデータに基づいて推定するためのデータプロセッサ手段に接続される。

一つの実施形態では、消光検出素子は光検出器に接続され、光検出器自体は、吸光度及び／又は回折度の測定値を、光検出器から受信するデータに基づいて推定するためのデータプロセッサ手段に接続される。

本発明の特定の特徴によれば、放射ビーム検出素子群及び／又は消光ビーム検出素子群は、円形断面または矩形断面の光ファイバである。
本発明の別の特定の特徴によれば、光源は、空間コヒーレンスが低いＬＥＤを含み、ＬＥＤは、励起ビームを一様にする光学素子に接続される。

有利な点として、光学素子は導光体、例えば光ファイバである。
本発明の一つの実施形態では、測定容器は、光学系群が配置される平面において多面体断面を有し、多面体は、該多面体の面が各光学系の軸に直交するような多面体である。

３つの光学系が容器の回りに等間隔の角度で配置されるように使用される場合、容器は正三角形の断面を呈する。
別の実施形態では、測定容器は円筒体である。

有利な点として、各光学系は、測定容器の幾何学的形状によって上記各種ビームに生じる収差を補正する収差補正手段を含む。
本発明の特に有利な適用形態では、流体は生物学的流体である。

この適用形態では、本発明の装置は、蛍光に標識されている生物学的要素を検出およびカウントするために使用することができる。多数の用途が、特にフローサイトメトリーの分野に、更に詳細には末梢血サンプルに含まれる、または骨髄に実際に含まれる、或いは他のいずれかの生物学的液体に含まれる生物学的細胞を同定し、計数するために存在する。

本発明は更に、測定容器内の流体におけるフォトルミネセンスを測定し、吸光度及び／又は回折度を測定する方法を提供する。本方法では、少なくとも２つの光学系から供給される少なくとも２つの励起ビームが測定容器内の流体に同時に照射され、各光学系は、空間コヒーレンスが低くかつ前記励起ビームを測定容器に向けて「系」の軸に沿って供給する光源、及びその系軸を中心として流体から放射されるフォトルミネセンス放射ビームを受信する検出素子の両方を含み、これらの光学系群は、それらの系軸が測定容器の回りで１８０°以外の非ゼロの鈍角を互いの軸間でなすように位置し、フォトルミネセンスの測定値は、検出素子群が同時に検出する放射ビームから得られるデータを統合することにより推定される。本発明によれば、これらの光学系群は、第１光学系の光源からの励起ビームと、少なくとも一つの第２光学系の検出素子によって検出される放射ビームとの間に部分重なりビームが発生するように配置され、少なくとも一つの励起光波長は部分重なりビームの中から、複数の光源のうちの少なくとも一つの光源の近傍に配置される少なくとも一つの「消光」検出素子によって検出され、吸光度及び／又は回折度の測定値は、消光検出素子が検出する光から得られるデータに基づいて推定される。

図２は、円筒形測定容器ＣＭの中を測定する本発明のフォトルミネセンス測定装置の図である。装置は３つの同様の光学系Ｃａ，Ｃｂ，及びＣｃを備え、各光学系は、該当する軸Ｘａ，Ｘｂ，及びＸｃを中心としている。これらの軸Ｘａ．Ｘｂ，及びＸｃは互いの軸間で、１８０°とは異なる非ゼロの角度をなしている。図２に示す好適な実施形態では、光学系Ｃａ，Ｃｂ，及びＣｃは、測定容器ＣＭの回りで等間隔の角度で分散配置されるので、これらの角度は同じであり、１２０°に等しい。これらの光学系は、落射蛍光装置（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｅｔｕｐ）として知られる光学系であり、落射蛍光装置では、同じ光学系を使用して光を放出し、光を受信する。このような装置では、測定容器に向かって放出される光の軸、及び測定容器から受信する光の軸は一致する。

図を分かり易くするためにｉ＝ａ，ｂ，またはｃとした場合に、使用する複数の光学系Ｃｉの間に類似性があるとすると、以下の説明ではインデックスｉ＝ａ，ｂ，またはｃは、これらのインデックスを使用することが理解のために必要である場合にのみ指定される。なお、装置の原理を示す図２のみが、インデックス参照符号の全てを含んでいる。

各光学系Ｃｉは、測定容器ＣＭに向かう連続線によって表わされる励起ビームを放出する光源Ｓｉと、蛍光によって放出され、かつ部分的に破線によって表わされるビームを、軸Ｘｉに沿った励起ビームと同じ軸上で検出する検出素子ＣＥｉと、を有する。

有利である、特に安価であるという理由で有利である実施形態では、光源Ｓｉは、空間コヒーレンスが非常に低い高輝度ＬＥＤである。
複数の高輝度ＬＥＤは集積回路として構成される。これらの集積回路は、電気を半導体接合に供給するために使用される電気コンタクトが設けられるために一様ではなくなるゾーンを集積回路の表面に含むことが知られている。従って、結果として得られるビームは一様ではなく、ダイオードの像を測定ボリュームに投影したとき、検査対象の微細オブジェクトを正確に判別することができない。

それゆえ、生物学的分析の分野では、一様性が低いこのような励起ビームを用いて正しい結果をもたらす血液分析器を実現することはできない。
従って、図２に示すように、ＬＥＤ光源Ｓｉは、励起光の照射野の一様性を高める機能を持つ対応する光学素子ＥＯｉと結合されるので有利である。好適には、光学素子ＥＯｉは、導光体、例えば光ファイバ、または非撮像型の光ビーム変換手段のような特殊な光学素子である。例えば、段階屈折率または傾斜屈折率を持ち、かつ円形または矩形の断面を有するファイバを使用することができる。

光源Ｓｉを光学素子ＥＯｉと結合させるために、ダイオードを含む集積回路の放出ゾーンが導光用光学素子ＥＯｉの入射面に配置される。このような結合は安価であり、かつ簡単に実現できる。集積回路の温度は１００℃超の値に達する恐れがあるので、このような温度に耐える性質を持つ材料、例えばシリカを使用することが適切である。

これ以外の場合は、樹脂材料により作製される導光体ＥＯを使用することができ、この使用は、シリカにより、または合成ルビーにより作製されるガラスビーズレンズのような特殊な光学系を、導光体ＥＯと集積回路との間に挿入することにより行なわれる。ビーズレンズは更に、励起光の照射野の一様性を、例えばビーズレンズの集光面に集積回路を配置することにより高めることができる。この場合、導光体ＥＯは平行ビームで照射され、光源の各ポイントから、ファイバに入射される波が放出される。

導光体ＥＯから出て行く励起ビームの発散は、導光体の開口数によって表わされ、この開口数は、光ファイバの場合には、導光路部分と、導光路部分を取り囲むクラッドとの間の屈折率差の関数である。

例えば、導光体ＥＯは、９４０マイクロメートル（μｍ）の直径、及び０．２２の光学開口数を有するシリカ光ファイバとすることができる。各ファイバに入力される電力は１．５ミリワット（ｍＷ）であり、合計で４．５ｍＷの電力が測定容器ＣＭに供給される。光ファイバは、ＯＳＲＡＭ商標（Ｇｏｌｄｅｎ Ｄｒａｇｏｎ製の）のＬＥＤと接触するように配置され、このＬＥＤには、２０００ミリアンペア（ｍＡ）の電流が供給される。

この例では、集積回路に供給される電力は、製造業者が指定するデータを上回るので、特に励起ビームを連続照射モードで使用するときに接合部を冷却する手段を設けることが適切である。低い熱抵抗を持ち、かつペルチェ効果素子に隣接する放熱器により構成される冷却回路を、例えば本発明の装置に用いることができる。

全体を均等に分割して測光を行なう場合において、消光信号のような補助手段によってパルスが駆動されるパルス条件下、またはコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）原理を使用する手段として知られるような電気インピーダンス変換器によってパルスが駆動されるパルス条件下で光源を使用する場合には冷却処理を省略可能である。

従って、消光測定または電気測定、例えば抵抗またはインピーダンスの測定は、本発明のフォトルミネセンス測定装置から見て、測定容器ＣＭの中の流体の流動方向の上流側で行なわれる。図２では、この流動方向は図の平面に直交する。このようにして、放射ビームに関するアナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）がインピーダンス特性の測定を行なうことによって作動する場合、励起ビームの照射の開始を、検出される微細オブジェクトがインピーダンスセンサから出た後、測定ポイントＭに位置する光学測定ポイントに達するまでに要する時間だけ遅延させると有利である。

この時間は既知である。なぜなら、この時間は、２つの測定ポイントの間の距離を、流体流の速度「ｖ」で除算した比として与えられ、この速度自体が制御対象であるために判明しているからである。流体流の移動は、装置に付加され、かつステッパーモータまたは空気圧式アクチュエータ（図には示されない）を含む油圧系によって可能になる。

各光学系Ｃｉでは、導光体ＥＯｉからの励起ビームは、コリメータＬ１ｉによって平行になる。次に、励起ビームは、吸光スペクトルまたは検出されることになる蛍光成分のスペクトルによって最適帯域が決定される帯域通過フィルタであるフィルタ素子Ｆ１ｉによってフィルタリングされるので有利である。

次に、フィルタリングされたビームはダイクロイックフィルタＤＣｉに入射し、ダイクロイックフィルタは、励起ビームを測定容器ＣＭに向けて反射する機能、及び測定容器ＣＭから落射蛍光装置の軸に沿って伝搬して光検出器ＰＤに、フィルタＦ２ｉ及びセンサ素子ＣＥｉを通って向かう蛍光放射ビームを透過する機能を有する高域通過フィルタである。次に、光学系Ｌ２ｉが、光ファイバＥＯｉの出射面を測定容器ＣＭに結像するように動作する。

図３は、測定容器ＣＭ中で得られる水平方向のポイントＭを中心とする光照射野の強度ＩＬの正規化分布を示している。高い空間的一様性を、ポイントＭの幅、この例では３００μｍに亘って観察することができる。この結果は、大きな開口数の励起ビームを使用することに一部起因して得られる。

図４は、スペクトル特性の例を示し、ゲインＧを、或る適用形態におけるフィルタＦ１及びＦ２の波長、及びダイクロイックプレートＤＣで選択される光の波長の関数として詳細にプロットし、この適用形態では、チアゾールオレンジ色素、または同じ分光特性を有する他のいずれかの色素によって着色される微細オブジェクトを測定する。連続線として示される吸光特性、及び図５の破線として示される蛍光特性を有する色素は、例えば網状赤血球の差分カウントに使用され、このような適用形態は、本発明の主要な適用形態のうちの一つである。本発明を利用して、核を有する細胞、または他の生物学的要素を検出することもできる。図５に概要を示すように、励起は、４８８ナノメートル（ｎｍ）を中心とする狭い帯域に亘って行なわれ、蛍光は、５３０ｎｍを中心とする３０ｎｍの幅を有する帯域に亘って測定される。

従って、図４では、フィルタＦ１は４７０ｎｍの励起波長を中心とする１５ｎｍの帯域幅のフィルタであり、フィルタＦ２は５４０ｎｍの蛍光放射波長を中心とする２０ｎｍの帯域幅のフィルタである。フィルタＦ２は一つのチャネルだけを通過するようにフィルタリングを行なう。しかしながら、複数の蛍光を測定することが望ましい場合、マルチチャネルフィルタを使用すると有利である。ダイクロイックフィルタＤＣの通過帯域の立ち上がりが非常に急峻であり、約１０ｎｍで最小透過率から最大透過率になる。このフィルタは、励起波長を反射しながら蛍光放射波長を通過させるように機能する高域通過フィルタである。このようなフィルタは、例えば製造元のＯＭＥＧＡ社及びＳＥＭＲＯＣＫ社から入手することができる。

更に、測定容器ＣＭに供給される光電力が大きくなると、強い蛍光現象が起きることが知られている。従って、光学ユニットＬ１及びＬ２により構成される光学アセンブリの倍率Ｇｒはこの電力を決定するパラメータである。

導光体ＥＯが矩形断面（ａｘｂ）を有する場合、計数チャンバに投影される像は、サイズ（ａ／Ｇｒ）ｘ（ｂ／Ｇｒ）を示す。単一の導光体の内部の光電力をＰと表記すると、導光体ＥＯの出射面の光強度はＰ／（ａｘｂ）となる。

この像では、励起ビームを集光することにより、（Ｇｒ）^２Ｐ／（ａｘｂ）に等しい光強度が発生する、すなわち光強度は、導光体ＥＯの出射面での強度の（Ｇｒ）^２倍の大きさである。

従って、倍率Ｇｒをできる限り大きくすることが有利であり、従って光学ユニットＬ２が大きい開口数を有することが有利である。
図２の装置の場合、互いから１２０°だけ離れた位置に配置される３つの光学系を使用することにより、測定ボリュームを持つ各微細オブジェクトは３つの励起ビームを受けるので、オブジェクトの蛍光色素を３倍の強度で励起することができるという利点がある。

蛍光が等方的に放射されるとした場合に測定ボリュームを単一の励起ビームによって励起する状況を考察すると、蛍光放射ビームは３つの光学ユニットＬ２ａ，Ｌ２ｂ，Ｌ２ｃによって収集される。各光学系Ｃｉでは、放射ビームはダイクロイックプレートＤＣｉを透過し、次にフィルタＦ２ｉを援用してフィルタリングされる。次に、放射ビームを光学ユニットＬ３ｉを援用して検出素子ＣＥｉに集光する。

検出素子ＣＥａ，ＣＥｂ，ＣＥｃは導光体、例えば光ファイバとすると有利であり、各光ファイバでは、一方の端部がレンズＬ３ａ，Ｌ３ｂ，またはＬ３ｃのうちの一つのレンズの焦点に配置され、他方の端部が、単一の光検出器ＰＤの検出表面を指し、この光検出器は光電子増倍管、単なるフォトダイオード、またはアバランシェ増倍型フォトダイオードとすることができる。

光検出器ＰＤは、３つの検出素子ＣＥａ，ＣＥｂ，及びＣＥｃの各々からの放射ビームを同時に受信するので、３つの光ファイバＣＥａ，ＣＥｂ，及びＣＥｃで伝送する光エネルギーを合計する。

本発明の装置は３つの励起ビームを同時に供給するので、同じ論理的根拠をこれらの励起ビームの各ビームに対して導くことができる。従って最終的に、図１に示す種類の先行技術による機構と比べると、感度の増大が（３^２）＝９倍に達する。

従って、このアセンブリが収集する光の量は、別々に設けられる複数の系の各々が収集する光の量の合計よりも大きくなり、この事実は、２つの光学系を本発明の原理に従って使用する場合にも当てはまる。

更に、本発明の全ての装置におけるように、図２の装置における複数の励起ビームは互いにずれている。この理由は、落射蛍光装置では、１８０°とは異なる非ゼロの鈍角が使用されるからである。この構成によって、励起ビーム及び放射ビームが完全に重なってしまう現象を防止して、光検出器ＰＤでの主要なノイズ源を構成するシーンの背景光を最小にする。

測定容器のいずれかの辺で互いに対向する４つの光学系を配置した構成の方形断面容器を使用する状況について考察すると、４つの反対側の面が分析対象の微細オブジェクトを照射し、従って蛍光を刺激するために設けられる。しかしながら、このような構成は好ましくない。なぜなら、励起ビームと放射ビームとの１００％の重なりが生じ、寄生光の強さが本発明の装置におけるよりも強くなる影響が直接的に現われるからである。このような寄生光によって、ＤＣ（直流）成分Ｉ_ｂがバリアントσ^２＝２ｑＩ_ｂＢで特徴付けられるランダムな光電気ノイズとともに現われる。ここで、ｑは電子の電荷であり、Ｂは受信機回路の通過帯域である。

Ｉ_ｂが小さくなると、測定装置の識別能力が高まる。Ｉ_ｂは本発明の装置において最小になる。この理由は、励起ビームは重なることがない、または部分的にしか重ならないからである。

有利な点として、図２の装置は更に、空間フィルタＤ、例えば検出素子ＣＥの前面に配置される簡易ピンホール群を有する。このフィルタリングによる効果は、例えば測定容器ＣＭの複数の壁での寄生反射のような不所望の所定の信号が除去されることである。従って、フィルタリングによる効果によって、成分Ｉ_ｂを除去することができるので、信号対雑音比を大きくすることができる。

このような空間フィルタリングによる別の効果は、Ｍを中心とする測定ボリューム「ｖ」が小さくなることであり、このボリュームは励起ビーム群の交点によって定義される。図６は、円形導光体ＯＥに対応するこのような測定ボリュームを示している。このボリューム「ｖ」は、図２に示す原理に従って、互いから１２０°の位置に配置される３つの励起ビームの交点の全てに対応する。

図７は、三角形測定容器ＣＭを使用する本発明の装置の第１の実施形態を示す斜視図である。測定容器ＣＭは、容器の面が、互いに対して１２０°の位置に位置する光学系Ｃａ，Ｃｂ，Ｃｃの軸Ｘａ，Ｘｂ，Ｘｃと直交するように構成される。

各光学系Ｃｉにおいて、ダイクロイックプレートＤＣは励起ビームと放射ビームとの交点で４５°の角度で配置され、当該プレートは図４に示すスペクトル透過特性を示す。
図７に示す実施形態は、単一の蛍光波長を検出およびカウントするものであり、３つの光学系Ｃａ，Ｃｂ，Ｃｃを本発明の原理に従って使用する。この装置は特に、全末梢血液のサンプルに含まれる網状赤血球を検出およびカウントするために使用される。この図では、光学系の照射平面における微細オブジェクトの通過経路が、測定容器ＣＭを貫通する直線を形成する一連のビーズによって表わされる。

この実施形態では、３つの放射ビームは、単一の光検出器ＰＤに導く導光体により構成される３つの検出素子ＣＥａ，ＣＥｂ，ＣＥｃによって検出される。各放射ビームは、ダイクロイックプレートＤＣと光学ユニットＬ３との間に配置されることが好ましい干渉フィルタ（図示せず）と、ダイクロイックプレートＰＣとを使用してスペクトルフィルタリングされる。

或る変形例では、スペクトルフィルタリングは、検出素子ＣＥａ，ＣＥｂ，ＣＥｃの３つの出射面と、感光性検出器ＰＤとの間に位置する干渉フィルタによって行なわれる。
測定容器が三角形であるこの実施形態では、各光学系Ｃａ，Ｃｂ，Ｃｃに、測定容器ＣＭの各面が構成する厚い表面によって生じる光収差を補正する手段を組み込むと有利である。従って、光学ユニットＬ２は、第１に、０．６よりも大きくなり得るビームの大きな開口数に関連する幾何学収差に関して補正され、第２に、厚い表面を通過する現象に関連する、特に測定容器ＣＭの表面、及び測定ポイントＭに到達するまでに伝搬するときに通過する流体の厚さを通過する現象に関連する幾何学収差に関して補正されると有利である。

幾何学収差として知られる種々のタイプの収差が、測定ポイントＭでの電力密度を下げる原因であることが知られている。球面収差は、これらの環境下で補正する必要のある主要な収差である。測定容器ＣＭの形状は不変であるので、種々の溶液を用いて球面収差を、この技術分野の当業者の知識を用いて補正することができる。

図８は、適合させた曲率及び屈折率を持つ一連のレンズを用いる形の補正の一例を示し、この場合、２つの連続するレンズの間の隙間も、変えることができる寸法パラメータである。

図８では、補正は、正三角形断面を持つ測定容器ＣＭに対して行なわれる。この測定容器は、例えば２．５ｍｍのガラス、及び１．５ｍｍのシリカの壁により作製される３つの平板表面を結合することにより形成される。

従って、図７に示す例では、光学ユニットＬ１は４８８ｎｍでの色収差を最小にする色消しダブレットであり、光学ユニットＬ２は、図８の表面を含む接触ダブレット（ｔｏｕｃｈｉｎｇ ｄｏｕｂｌｅｔ）を含む一連の４つのレンズにより作製される。最後に、光学ユニットＬ３は平凸レンズである。

なお、非球面レンズを使用して同様の収差または他の種類の収差を補正することもできる。
説明したレンズは、容器のガラス壁により構成される厚い表面、及び測定容器ＣＭの壁と微細オブジェクト、例えば細胞の通過経路との間をポイントＭを通って延びる水の厚さを通り過ぎることにより生じる幾何収差及び色収差を補正する。

次に、励起ビームが空気／ガラスの第１界面を通過し、続いてガラス／水の第２界面を通過し、第２界面によって光の量が考察対象の界面でのフレネル透過率に等しい値を乗じた値にまで小さくなる。

多層の誘電体を形成する処理を行なって、考察対象の界面での光の反射を最小にすることができる。図９は、放射ビームの透過率を材料−空気界面への入射角の関数として、すなわち４８８ｎｍの波長でｎ＝１．４６の屈折率を持つ材料の場合の入射角の関数として示している。

内部全反射現象によって、放射ビームの開口数が小さくなることが分かる。測定容器の透明壁の屈折率を「ｎ」と表記する場合、反射角によって幾何学角度が値θに限定されるので、ｓｉｎθ＝１／ｎとなる。従って、図２に概要が示される円筒形または球形の測定容器を使用することにより、測定容器ＣＭの幾何学形状によって生じる収差を小さくすることができることが分かる。

なお、光学ユニットＬ１及びＬ２によって構成される光学アセンブリは、幾何収差だけでなく、励起スペクトル帯域に関連する色収差を補正することにより最適化することができる。

更に、光学ユニットＬ２及びＬ３によって構成される光学アセンブリは、第１に、蛍光の波長が長波長の方にオフセットされた波長を中心とするものであること、第２に、この光の検出が有限幅のスペクトル帯域に亘って行われるということを考慮して色収差を補正することにより最適化することができる。

従って、励起ビーム及び放射ビームの光学特性を、例えば軸上で、かつ照射野の周縁部で計算される収差を、３つの基本波長、すなわち、０．４６０μｍ（青）、０．５００μｍ（緑）、及び０．６００μｍ（赤）で±２０μｍ未満に制限することにより最適化することが有用である。

図７の装置では、蛍光放射ビームは３つの検出素子ＣＥａ，ＣＥｂ，ＣＥｃによって収集され、これらの検出素子は、一括することにより単一ビームを生成する導光体であり、単一ビームは光電子検出器ＰＤに入射し、光電子検出器は光電子増倍管、または実際にはアバランシェ増倍型フォトダイオードとすることができる。

光検出器ＰＤは、当該検出器が検出し、かつ３つの光ファイバから放射される光エネルギーを合計する。次に、蛍光がこの技術分野の当業者が持つ知識に基づいて、特に装置が事前に校正された後に計算される。こうして、測定ボリューム「ｖ」の中で生成される蛍光の測定値が得られる。

図１０は、本発明の装置の第２の実施形態の斜視図であり、この装置は、複数の蛍光波長を測定容器ＣＭに収容された流体の中で測定する。
測定容器ＣＭに収容される微細オブジェクトを再度、３つの光学系Ｃａ，Ｃｂ，Ｃｃの光源Ｓｉから、光スペクトルフィルタ（図示せず）、及びダイクロイックセパレータプレートＤＣを使用するフィルタリング手段を経由して供給される３つの励起ビームによって照射する。各光学系Ｃｉでは、ダイクロイックプレートＤＣｉは光源Ｓｉから供給される光を、光学ユニットＬ２ｉが前記光を集中する測定容器ＣＭに向けて反射する。これとは異なり、ダイクロイックプレートＤＣｉは照射される微細オブジェクトから放出される長い波長成分を透過するので、この波長成分は、光ファイバのような導光体であることが好ましい検出素子ＣＥａ，ＣＥｂ，ＣＥｃに向かって伝搬する。

次に、３つの検出素子ＣＥａ，ＣＥｂ，ＣＥｃは共通のスペクトル検出ユニット上で結合され、当該ユニットは、例えば回折格子ＤＧ及び「ｎ」個の光検出器ＰＤ１〜ＰＤｎにより構成される。「ｎ」個の光検出器は空間中に回折格子ＤＧに対向して配置されるので、これらの光検出器の各々は、或る帯域の波長を検出および測定し、各帯域は、容器ＣＭの中を通り過ぎる生物学的要素から放射される蛍光の複数の目標波長のうちの一つの波長に対応する。これらの光検出器ＰＤ１〜ＰＤｎは、複数のフォトダイオードの中から選択される検出器とする、例えば一列に、または細片状に配置され、かつ任意の接合のアバランシェ降伏によるアバランシェ増倍型フォトダイオード、光電子増倍管、例えばマトリクス状に、または一列に配置される電荷結合素子（ＣＣＤ）型のマルチ光センサの中から選択される検出器とすることができる。

従って、異なる蛍光強度が複数の異なる波長帯域に関して得られる。異なる波長の蛍光が含まれるのは、検出オブジェクトに差異が生じるからである、または使用される複数の波長が放射時に含まれるからであり、波長が前記複数の数だけ含まれることによって、複数の異なる波長の蛍光が発生する。

この特定のスペクトル検出アセンブリの複数の利点のうちの一つの利点は、当該アセンブリを異なる波長の蛍光に適合させることができ、かつ装置を、異なる特徴を持つオブジェクトを、装置を変更することなく検出するために容易に使用することができることである。更に、各光検出器の位置は、目標波長、及び検出帯域の幅の両方に影響する。

或る変形例では、３つの検出素子ＣＥａ，ＣＥｂ，ＣＥｃは単一の検出アセンブリ上で結合され、当該アセンブリは、例えばセパレータプレート、可能であれば、光ビームを複数の光検出器ＰＤ１〜ＰＤｎの間で共有するダイクロイックプレートにより構成される。

測定を行なう前に、放射ビームを、使用する蛍光プローブに適合させた干渉フィルタによってフィルタリングすることができる。
本発明の好適な実施形態では、複数の光学系のうちの少なくとも一つの光学系、例えば図２のＣａは、所謂「消光（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）」検出素子ＤＴを含み、消光検出素子は光源、この場合は注目系ＣａのＳａに近接して配置される。この消光検出素子ＤＴは、光源Ｓａと波長に関して同じ特性を有する光を検出するために設けられる。従って、容器ＣＭから放出され、光源Ｓａに向かって進むこの光はダイクロイックプレートＤＣによって反射される。消光検出素子ＤＴは、光検出器ＰＤＴに接続される。

図１１は、光源Ｓａに近接する消光検出素子ＤＴａに関して使用可能な所定数の位置を示し、これらの位置は、光源Ｓａが生成するビームが確実に一様になるように作用する光学素子ＥＯａを選択することにより決定される。

このような消光検出素子ＤＴは、重なりビームとも表記される励起ビームと放射ビームとの交点の観察に利用される。
幾何学的な観点から言うと、これらの交点は、光学ユニットＬ２ｉの瞳面に集光し、かつ測定チャンバＣＭの中心を指す６個のコーンビームが交差する交点に対応し：これらの重なりビームまたは重なりボリュームＦＣを図１２に示す。レンズＬ２の開口数を有するこれらの要素レンズは十分に大きい。

図１２Ａは、容器上で３つの光学系Ｃａ，Ｃｂ，及びＣｃの軸Ｘａ，Ｘｂ，及びＸｃにマークを付した構成の測定容器ＣＭを切断したときの水平断面である。系Ｃａが受信する光学系Ｃｂ及びＣｃの励起ビームによる励起にそれぞれ対応する重なりビームには、ＦＣｂ_ａ及びＦＣｃ_ａのマークが付される。この表記は、系Ｃｂ及びＣｃが受信する他の重なりビームに使用される。

図１２Ｂは、これらの同じ重なりビームの３次元表示を示している。
このような重なりビームを用いて、測定容器に収容される微細オブジェクトによって生じる吸光度及び回折度の測定を行なう。消光検出素子ＤＴは、これらのビーム光を検出するために設けられる。

図１１Ａでは、光学素子ＥＯａの断面は矩形であり、吸光度を表わす信号を受信する複数の消光検出素子ＤＴａ’、及び回折度を表わす信号を受信する消光検出素子ＤＴａ”を配置するために使用される上側部分を有する方形が描画されている。光源Ｓａのいずれの側にも配置される２つの矩形の消光検出素子ＤＴａ’を使用することにより、重なりビームからの光を検出することができる、というのは、これらのビームが励起ビームのいずれの側にも位置するように構成されるからである。中央の消光検出素子ＤＴａ”を使用することにより、いずれの回折光も検出することができる。この例では、他の光学素子ＥＯｂ及びＥＯｃの断面自体を方形とすると有利であることを理解されたい。

図１１Ｂ及び１１Ｃは、光学素子ＥＯａの断面によって表わされる光源Ｓａに対する円形断面の単一の検出素子ＤＴａの他の２つの位置を示している。
図１３は、吸光度及び／又は回折度の測定を、図７に示すフォトルミネセンス測定装置の中で行なうための原理の概要を示している。説明を行なうために、測定容器ＣＭを、光学系Ｃｂ及びＣｃから供給される２つの励起ビームによって照射すると仮定する。

光源Ｓｂ及びＳｃから供給される励起ビームの開口度は、重なりビームＦＣｂ_ａ及びＦＣｃ_ａが系Ｃａにおける放射ビームと一緒に伝搬するように設定される。
系Ｃａ（図示せず）が検出する蛍光波長を持つ放射ビームはプレートＤＣａを偏向されることなく通過し、光源Ｓｂ及びＳｃから供給され、かつ重なりビームを構成する受信光はダイクロイックプレートＤＣａによって偏向される。図１３には、光源Ｓｂ及びＳｃと同じ波長を有するこれらの重なり光ビームＦＣｂ_ａ及びＦＣｃ_ａのみが示される。これらのビームは測定容器ＣＭから放出され、その後、消光検出素子ＤＴａに向かってダイクロイックプレートＤＣａを経由して伝搬する。消光検出素子ＤＴａは、円形断面を持つ光ファイバとすると有利である。

実際には、消光検出素子（群）ＤＴａに到達するビームには、光源Ｓｂ及びＳｃと同じ波長を有する２つのタイプの光ビームが存在する。ここで、一方のタイプのビームは重なりビームＦＣｂ_ａまたはＦＣｃ_ａの一部を構成し、他方のタイプのビームは重なりビームＦＣｂ_ａまたはＦＣｃ_ａの一部を構成しない。

どの重なりビームＦＣ_ａにも属することがないビームは、測定容器ＣＭの中で回折され、かつ測定容器ＣＭ内での回折を表わす光線ＲＤのみを含む。従って、光線ＲＤは、微細オブジェクトによって励起ビームが測定容器ＣＭ内で回折されてしまう場合を除いては、重なりビームＦＣｂ_ａまたはＦＣｃ_ａによって区切られた角度領域に属することがない。

或る重なりビームＦＣ_ａに、例えば光源Ｓｃの重なりビームＦＣｃ_ａに属するビームは、光源Ｓｂ、Ｓｃ、または光源Ｓａが活性状態になっている場合の光源Ｓａのうちの一つの光源からの回折光線、及び測定容器ＣＭを偏向される、または吸収されることなく通り抜けた後の光源Ｓｃからの重なりビーム光線を含む。

従って、重なりビーム光線は部分的に、回折度でだけでなく吸光度を表わすために利用される、というのは、微細オブジェクトが光を吸収することによる消光現象を重なりビームによって画定される角度領域の中に観察することができるからである。

本発明の複数の利点のうちの一つの利点は、重なりビームＦＣ、及び重なりビームＦＣによって区切られる角度領域において回折される光線ＲＤを観察し、利用することができることである。

本発明の特に有利な特徴によれば、好ましくは円形断面を持つ光ファイバを使用して、消光検出素子ＤＴａを、このような素子が一つしか存在しない場合に具体化する。このような光ファイバの光学特性は、重なりビームＦＣｂ_ａまたはＦＣｃ_ａの一部を構成する光線、及び重なりビームの一部を構成しない光線のファイバへの異なる入射角を利用するために好都合である。図１３に示すように、重なりビームＦＣｂ_ａ及びＦＣｃ_ａの光線はファイバに、ファイバの軸に対して或る角度で入射し、この角度は、これらの重なりビームによって区切られる角度領域に位置する回折光線ＲＤの角度よりも大きい。この角度特性はファイバに沿って維持される、というのは、重なりビームの光線はファイバに沿ってねじ曲がり、かつ階段状の屈折率ラインまたは屈折率傾斜ラインに近接して維持されるのに対し、ファイバの軸に対して小さい角度で入射する他の回折光線は、ファイバの断面全体に観察されることになるからである。

従って、図１４の光ファイバ断面に示すように、ファイバＤＴａの出射光を、各素子がファイバＤＴａの断面の特定部分に関連する構成のマルチ素子フォトディテクター（光検出器）ＰＤＴに向かって放出することにより、ファイバＤＴａの外郭ＣＮＴが連続的に明るくなり、外郭ＣＮＴには微細オブジェクトが通過する瞬間に消光現象が発生し、この消光現象は、オブジェクトが光を吸収することによって生じることが分かる。次に、外郭ＣＮＴに観察される光は、吸光度を表わすとともに、重なりビームの角度領域において理論的にはゼロになることがない回折度を部分的に表わす。

ファイバＤＴａの中心ＣＴＲは、微細オブジェクトが通過するときにのみ照射されるようになり、前記オブジェクトによって回折される光を示すことも分かる。回折が等方的に行なわれると仮定すると、光検出器ＰＤＴをプロセッサ手段に接続して、強度を光ファイバの外郭に観察される光に基づいて推定して吸光度の値を取得することができる。

複数の消光検出素子を、例えば図１１Ａの構成において使用する場合、吸光度に関する測定値を決定するのは消光検出素子ＤＴａ’によって供給される光の存在及び強度であり、回折度に関する測定値を決定するのは消光検出素子ＤＴａ”によって供給される光の存在及び強度である。

重なりビームのこのような使用は、複数の生物学的細胞を、これらの細胞の吸光特性及び／又は回折特性によって変わる形で判別するために特に有利である。詳細には、このような消光測定結果は細胞診目的に利用することができ、この場合、これらの測定結果は、形態的情報または化学的情報として解釈することができる。

等方な回折を更に高精度に制御するために、細胞群を化学剤を使用することにより出来る限り球状にすると有利である。
従って、本発明の装置の上述の例によって、各微細オブジェクト、例えば測定容器ＣＭを通り過ぎる生物学的オブジェクトに同じ波長を持つ３つの光ビームを一緒に照射し、蛍光体から放射される光が落射蛍光装置を使用する方法によって測定される限り、光の放射を高感度細胞から測定することができ、３つの落射蛍光は単一の光検出器で、考察対象の各蛍光波長に関して合成される。

以下に、生物学的要素、特に抗体または他の蛍光化合物によって標識される要素を、本発明のフォトルミネセンス測定を行なうことにより判別およびカウントする方法について説明する。

上に述べたように、生物学的要素の差分同定及び差分カウントは普通、フローサイトメトリー法で行なわれる。この操作を行なうために、血液サンプルを、同定対象の生物学的要素に固有の抗体で培養する。これらの抗体を標識物質に、普通は蛍光色素に結合させる。蛍光色素は普通、特に各抗体を同定するために選択され、従って蛍光色素を測定する操作は、当該蛍光色素が結合する抗体を同定する操作に一致する。従って、複数の異なる抗体を、該当する数の異なる波長を測定することにより同定することが可能になる。

図１０に示す装置では、複数の異なる波長を測定することができる。従って、少なくとも、含まれる波長の数と同じ数の特定標識または抗体を測定することができる。
これらの原理は、非常に多くの用途において使用することができる。以下に、フローサイトメトリーで蛍光標識を用いて検出する全ての方法に適合させるための一般原理について説明する。

上に述べたように、図５のスペクトルはチアゾールオレンジに対応する。このスペクトルは、抗体と結合させて非常に広く使用されるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）色素のスペクトルに対応させることもできる。

図１５は、別の色素、すなわちこれもフローサイトメトリー法において広く使用されるフィコエリトリン−シアニン５タンデムに関する図である。これらの２つの色素を使用して少なくとも２つの異なる抗体を、記載される装置において同定することができる。

生物学的要素を、図７または図１０に示す装置で分析するために、以下のステップを行なう必要がある。すなわち、
・１アリコートの全血液、例えば５０立方ミリメートル（ｍｍ^３）の血液を、標的の生物学的要素に固有の結合抗体と混合するステップ；
・溶液に光が当たらないように溶液を保護しながら、例えば２０分間に亘って溶液を培養するステップであって、この時間は、生物学的要素を完全に標識し、細胞内物質を着色するために十分に長い時間である、ステップ；
・結果として得られ、かつ生物学的要素を含む溶液を測定容器ＣＭに注入して、生物学的要素が連続的に一つずつ、容器ＣＭの中心Ｍを通過して、前記ゾーンを照射する光と相互作用するようにするステップであって、好適には、容器を通り過ぎる要素群の全てのボリュームに対する測定が、フランス特許第２，６５３，８８５号に記載されるインピーダンス測定法を使用して順番に行なわれるように容器ＣＭが配置される、ステップ；及び
・容器ＣＭを通り過ぎる各生物学的要素に対する測定を連続的に行なって、当該要素のボリュームをインピーダンス測定によって求め、当該要素の蛍光を測定するステップ、である。

測定は、使用する装置及び使用する標識によって変わる形で、単一の波長で、または複数の波長で行なうことができる。
上に説明したステップを行なって、網状赤血球を図７の装置を使用して判別およびカウントしている。網状赤血球は、作られたばかりの若い赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）または赤血球（ｒｅｄ ｃｏｒｐｕｓｃｌｅｓ）である。これらの赤血球は、ＲＮＡ（リボ核酸）によって構成され、かつ細胞質内に含まれる網状組織によって特徴付けられる。これらの赤血球の痕跡は、骨髄内で赤芽球段階から網状赤血球段階を経て成熟するときに放出される細胞核の残渣である。この放出から２４時間が経過した後、網状赤血球は骨髄から出て血液に入る。網状赤血球が４８時間を超えて存在することがない末梢血では、リボソームが分解されて網状赤血球を成熟した赤血球にするように作用する。

赤血球の平均寿命は１２０日であるので、通常の再生率は０．８３％になるはずである。一般的に許容される正常な平均割合は０．５％〜１．５％の範囲であり、これらの値は、生後３週間未満の幼児では高くなる（２％〜６％の範囲）。従って、網状赤血球を観察して数えることにより、エリスロポエチンの体内動態に関する情報が得られるので、化学療法後の延髄機能の回復（ｍｅｄｕｌｌａｒ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）をモニタリングするために、組み換えエリスロポエチンというたんぱく質（ｒＨｕＥｐｏ）を用いた治療をモニタリングするために、貧血の検査において、または実際には、出血または溶血を止めようとするために有用なパラメータを提供することができる。

網状赤血球の蛍光強度を測定する場合、フランス特許第２，７５９，１６６号に詳細に記載されているように、全血液サンプルを希釈するステップを、チアゾールオレンジを含む試薬を使用して行なう。

蛍光及びボリューム測定の結果を再構成して、観察対象の生物学的要素の絶対カウント値及び差分カウント値を提供する。
従って、赤血球の数、及び網状赤血球の数及び割合を細胞内ＲＮＡ（リボ核酸）の蛍光強度に基づいて抽出することが可能になる。

更に、未成熟な網状赤血球の割合（ＩＲＦ）を要素群の分布に基づいてこれらの要素の蛍光強度によって変わる形で計算することができる。ほとんどの蛍光要素は最も若いと考えられる。

図１６は、本発明を利用して得られる結果をプロットした網状赤血球群を示す。この図は、インピーダンス測定によって測定された赤血球の位置が、横軸に沿ってプロットされた網状赤血球細胞ボリュームＶＣ（μｍ^３単位）に対して変化し、縦軸に沿ってプロットされたピコワット（ｐＷ）単位の蛍光信号の強度ＩＦに対して変化する様子を示している。

本発明の技術思想の範囲内では、幾つかの変形例及び実施形態がこの技術分野の当業者には容易に想到されると思われる。
本発明を３つの光学系を備える特に有利な構成として上に説明したが、本発明は、２を開始数とし、１８０°以外かつゼロ以外の角度でペアとしてずらした種々の数の光学系を備える形で実装することができる。詳細には、本発明の特徴によって、重なりビームを、上記説明したように、かつ請求範囲に請求されているように利用することができる。蛍光特性も測定される他に、このような特性は異なる微細オブジェクトを判別するために非常に有用である。

光学系の数が３を超える場合、これらの光学系のうちの少なくとも２つの光学系が非鈍角の角度をなす必要があることが分かるが、本発明では、他の光学系とは無関係に、少なくとも一つの光学系ペアが互いに対して鈍角をなす必要がある。このような特徴は特に、重なりビームを観察することにより、本発明による吸光度及び／又は回折度の測定を行なうために必要である。

所定の特定の用途では、光源Ｓａ，Ｓｂ，Ｓｃの波長を変えることを着想することも可能である。従って、測定容器ＣＭを通り過ぎる微細オブジェクトを、２つ以上の波長範囲を有する励起ビームで、または異なる波長を有する励起ビームで照射し、結果として得られる落射蛍光を個々に測定することが可能になる。

検出素子ＣＥａ，ＣＥｂ，ＣＥｃを分離して、これらの検出素子をペアで組み合わせる、または個々にそれぞれマッチング型光検出器に接続するように着想することもできる。更に、他の種々の光検出手段を本発明の装置に使用することができる。

先行技術において公知のフォトルミネセンス測定装置を示す。 本発明のフォトルミネセンス測定装置の原理を示す図である。 図２に示す装置の測定容器における水平方向の光ビームの強度分布を示す。 図２に示す装置に使用されるフィルタの、ダイクロイックプレートのスペクトル特性の例を示す。 チアゾール色素に関して、吸光スペクトルを連続線として示し、蛍光放射スペクトルを破線として示す。 本発明のフォトルミネセンス測定装置によって分析されるボリュームを示す３次元図である。 本発明のフォトルミネセンス測定装置の第１の実施形態の斜視図である。 測定容器の形状に起因する収差を補正する手段を示す。 ガラス／空気界面への入射角によって変わる放射ビームの透過率を示す。 複数のフォトルミネセンス強度値を測定する本発明の装置の第２の実施形態の斜視図である。 図Ａ，Ｂ，及びＣは、本発明の装置における消光検出素子の複数の位置を示す。 図Ａ及びＢは、重なりビームを三角形容器中の図及び斜視図としてそれぞれ示す。 本発明による吸光度及び回折度を測定する原理を示す図である。 消光検出素子として使用される光ファイバの出射口で観察される結果を示す。 フィコエリトリンシアニン５色素に関して、吸光スペクトルを連続線として示し、蛍光放射スペクトルを破線として示す。 図２に示す装置を使用して測定される網状赤血球の集団の特性をプロットした図である。

Claims (15)

1. 測定容器（ＣＭ）内の流体におけるフォトルミネセンスを測定して、吸光度及び／又は回折度を測定する装置において、
   少なくとも２つの光学系（Ｃｉ，ｉ＝ａ，ｂ，ｃ）を備え、各光学系は、空間コヒーレンスが低くかつ励起ビームを前記測定容器（ＣＭ）に向けて系軸（Ｘｉ）に沿って供給する光源、及び前記系軸（Ｘｉ）を中心とするフォトルミネセント放射ビームを検出する検出素子（ＣＥｉ）の両方を含み、前記光学系群（Ｃｉ）は同時に動作しかつそれらの前記系軸（Ｘｉ）が前記測定容器（ＣＭ）の回りで１８０°以外かつゼロ以外の鈍角を互いの軸間でなすように位置し、前記フォトルミネセンスの測定値は、前記検出素子群（ＣＥｉ）が同時に検出する放射ビームから得られるデータを統合することにより推定され、これらの光学系（Ｃｉ）は更に、その第１光学系（Ｃｂ）の光源（Ｓｂ）の励起ビームと、その第２光学系（Ｃａ）の検出素子（ＣＥａ）によって検出される放射ビームとの間に少なくとも一つの部分重なりビーム（ＦＣｂ_ａ）が発生するように配置され、前記装置には更に、複数の前記光源のうちの少なくとも一つの光源（Ｓａ）の近傍に位置して、励起波長の光を前記部分重なりビーム（ＦＣｂ_ａ）の中から検出する少なくとも一つの消光検出素子（ＤＴａ）が設けられ、吸光度及び／又は回折度の測定値は、前記消光検出素子（ＤＴａ）が検出する光から得られるデータに基づいて推定される、装置。
2. 前記装置は奇数個の光学系（Ｃｉ）を有し、該光学系群は、対をなすそれらの系軸（Ｘｉ）が前記測定容器（ＣＭ）の回りで１８０°以外かつゼロ以外の鈍角を互いの軸間でなすように位置していることを特徴とする請求項１記載の装置。
3. 前記光学系群（Ｃｉ）は、それらの系軸（Ｘｉ）が前記測定容器（ＣＭ）の回りで同じ角度を互いの軸間でなすように位置していることを特徴とする請求項２記載の装置。
4. 前記装置は３つの光学系（Ｃｉ）を有し、該光学系群は、それらの系軸（Ｘｉ）が前記測定容器（ＣＭ）の回りで同じ角度を互いの軸間でなすように前記測定容器（ＣＭ）の回りに位置していることを特徴とする請求項２又は請求項３記載の装置。
5. 前記放射ビームを検出する検出素子群（ＣＥｉ）は共通の光検出器（ＰＤ）か、または共通の光検出器群（ＰＤ１，ＰＤｎ）に接続されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の装置。
6. 前記光検出器群の少なくとも１つ（ＰＤ）は、該光検出器群の少なくとも１つ（ＰＤ）から受信するデータに基づいて前記フォトルミネセンス測定値を推定するためのデータプロセッサ手段に接続されることを特徴とする請求項５記載の装置。
7. 前記消光検出素子（ＤＴａ）は光検出器（ＰＤＴ）に接続され、この光検出器は、該光検出器（ＰＤＴ）から受信するデータに基づいて吸光度及び／又は回折度の測定値を推定するためのデータプロセッサ手段に接続されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の装置。
8. 前記放射ビームを検出する検出素子群（ＣＥｉ）及び／又は前記消光検出素子群（ＤＴ）は、円形断面または矩形断面を有する光ファイバであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の装置。
9. 前記光源（Ｓｉ）は、空間コヒーレンスが低いＬＥＤを含み、該ＬＥＤは前記励起ビームを一様にする光学素子（ＥＯｉ）に接続されることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の装置。
10. 前記光学素子（ＥＯｉ）は導光体であることを特徴とする請求項９記載の装置。
11. 前記測定容器（ＣＭ）は、前記光学系群（Ｃｉ）が配置される平面において多面体断面を有し、この多面体は、該多面体の面が各光学系（Ｃｉ）の軸に直交するような多面体であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の装置。
12. 前記測定容器（ＣＭ）は円筒体であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の装置。
13. 前記各光学系（Ｃｉ）は、前記測定容器（ＣＭ）の幾何学的形状によって各種前記ビームに生じる収差を補正する収差補正手段を含むことを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の装置。
14. 前記流体は生物学的流体であることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の装置。
15. 測定容器（ＣＭ）内の流体におけるフォトルミネセンスを測定して、吸光度及び／又は回折度を測定する方法において、
    少なくとも２つの光学系から供給される少なくとも２つの励起ビームが前記測定容器（ＣＭ）内の流体に同時に照射され、各光学系は、空間コヒーレンスが低くかつ前記励起ビームを前記測定容器に向けて系軸に沿って供給する光源、及び前記系軸を中心として前記流体から放射されるフォトルミネセンス放射ビームを受信する検出素子の両方を含み、前記光学系群は、それらの系軸が前記測定容器の回りで１８０°以外かつゼロ以外の鈍角を互いの軸間でなすように位置し、前記フォトルミネセンスの測定値は、前記検出素子群が同時に検出する放射ビームから得られるデータを統合することにより推定され、当該方法では、前記光学系群が、その第１光学系の光源からの励起ビームと、少なくとも一つの第２光学系の検出素子によって検出される放射ビームとの間に部分重なりビームが発生するように配置されており、前記部分重なりビームの中から少なくとも一つの励起光波長が複数の前記光源のうちの少なくとも一つの光源の近傍に配置された少なくとも一つの消光検出素子によって検出され、吸光度及び／又は回折度の測定値は、前記消光検出素子が検出する光から得られるデータに基づいて推定される、方法。

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