EP1991855A2 - Dispositif et procédé de mesure de photoluminescence, d'absorption et de diffraction d'objets microscopiques dans un fluide - Google Patents

Dispositif et procédé de mesure de photoluminescence, d'absorption et de diffraction d'objets microscopiques dans un fluide

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Publication number
EP1991855A2
EP1991855A2 EP07731079A EP07731079A EP1991855A2 EP 1991855 A2 EP1991855 A2 EP 1991855A2 EP 07731079 A EP07731079 A EP 07731079A EP 07731079 A EP07731079 A EP 07731079A EP 1991855 A2 EP1991855 A2 EP 1991855A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
light
excitation
measurement
optical
optical systems
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07731079A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Nerin
Benoît MERCHEZ
Jean-Philippe Gineys
Didier Lefevre
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Horiba ABX SAS
Original Assignee
Horiba ABX SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Horiba ABX SAS filed Critical Horiba ABX SAS
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N15/10—Investigating individual particles
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    • G01N15/1434—Optical arrangements
    • G—PHYSICS
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    • G01N15/1425—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry using an analyser being characterised by its control arrangement
    • G01N15/1427—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry using an analyser being characterised by its control arrangement with the synchronisation of components, a time gate for operation of components, or suppression of particle coincidences
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    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
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    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1486—Counting the particles

Definitions

  • the present invention relates to the general field of devices and methods for measuring photoluminescence in a fluid present in a measuring vessel. Such devices and methods are in particular intended for counting microscopic objects in a fluid, for example a biological fluid. More specifically, the invention relates to devices based on the use of partially coherent light sources, such as a light emitting diode, as means for exciting molecules, for example fluorescent, present in a fluid.
  • partially coherent light sources such as a light emitting diode
  • Photoluminescence is a substantially isotropic radiative phenomenon induced during the return to the ground state of a molecule excitable and excited by a light energy at a wavelength of its own.
  • the emission of fluorescence light is always at a frequency lower than that of excitation.
  • the measurement is generally performed outside the excitation axis by the incident light and through a color filter transmitting only the spectral band of interest to the detector.
  • the invention is particularly interested in the development of optical and optoelectronic means for the detection of very weak photoluminescence signals such as those derived from the labeling of biomolecules, proteins or nucleic acids, for example.
  • very weak photoluminescence signals such as those derived from the labeling of biomolecules, proteins or nucleic acids, for example.
  • the measurement of photoluminescence signals is particularly useful to the practitioner to develop a diagnosis and more specifically a cytological diagnosis for which the detection and counting of rare cell lines such as hematopoietic stem cells or other elements of the blood or blood. another biological fluid will be particularly useful.
  • Photoluminescence measurements of biological elements are widely used in the fields of flow cytometry and automated cytology including hematology.
  • the molecular probes used may be vital or supravital dyes having an intrinsic affinity for a particular type of molecule such as nucleic acid intercalating dyes. They may also be immunological probes such as conjugated products composed of an antibody on which is grafted a dye molecule, usually a fluorochrome, alone or in tandem, or sometimes a nano crystal.
  • the antibody will be able to bind specifically to molecules or portions of molecules called antigens or antigenic determinants that it will be possible to count down by photoluminescence measurement.
  • the mode of labeling by the implementation of immunological probes has become widely used for cytological identification, in particular using flow cytometry techniques.
  • the excitation light sources must be able to deliver sufficient energy so that each labeled biological element can be detected with sufficient sensitivity as it passes in front of the excitation beam.
  • Laser-type sources provide very good spatial coherence and power, but the Gaussian structure of the laser beam affects the homogeneity of the light field at the measurement point. It is necessary to implement a complex optics, thus expensive, to obtain a homogeneity of this field greater than 0.5% at the measurement point.
  • laser sources therefore has the major disadvantage of the cost which can, in the case in particular of ultraviolet, dye or multiband excitation beam devices, be prohibitive and reserve their use for very specific devices in fields point of biological analysis.
  • Laser diodes less expensive, have the advantage of having a high power density related to their high spatial coherence, but the choice of wavelengths is more limited compared to the choices provided by the light emitting diodes.
  • FIG. 1 represents such a device generally using sources of low spatial coherence, such as arc lamps or light-emitting diodes.
  • a device can be used for a photoluminescence measurement in a measurement vessel CM at the center of which is injected a fluid, for example biological, to be analyzed.
  • the proposed optical system is generally called editing in epifluorescence mode.
  • the device comprises a light source S for generating an excitation beam and an element, for example a photodetector PD, for capturing the light of a photoluminescence emission beam.
  • beam or light or excitation radiation is intended to mean the light coming from the light source serving to illuminate the fluid to be analyzed.
  • beam or light or emission radiation is meant the light resulting from the inelastic interaction of the excitation beam with microscopic objects present in the fluid to be analyzed, such as fluorescence or photoluminescence lights.
  • the excitation beam generated by the light source S and the emission beam captured by the photodetector PD are coaxial along an axis called axis of the system X, the same optics allowing the emission and reception of lights.
  • the device comprises a DC dichroic plate for dissociating the excitation and emission beams.
  • the device further comprises two filters F1 and F2 respectively intended to filter the light of the source S emitted towards the measurement vessel CM and the fluorescence light or lights resulting from the inelastic interaction of the excitation light emitted by the source S with microscopic objects of the fluid present in the measurement vessel CM.
  • Optics L1 and L3 allow the excitation and emission beams to be parallel beams as they pass through the filters F1 and F2 and the dichroic plate DC.
  • a lens or an optical combination L2 with a large numerical aperture makes it possible to focus the excitation beam on a small volume centered at a measuring point M of the measurement vessel CM.
  • the fluorescence light from a microscopic object present in the fluid and passing at the point M illuminated by the excitation beam is focused in a parallel beam by the lens L2, transmitted through the DC blade, filtered by the filter F2 and received by the PD photodetector after focusing by the lens L3.
  • the power of the excitation beam obtained at the selected central wavelength relative to the fluorochrome used is low. This also reduces the discrimination capabilities of known devices whose fields of application are restricted. They are indeed limited to the detection of high fluorescence signals, for example corresponding to a large number of epitopes or to high fluorescence yield markers.
  • the main object of the present invention is thus to overcome the drawbacks presented by the devices of the prior art by proposing a device for measuring photoluminescence and measuring absorbance and / or diffraction that is precise, sensitive and inexpensive, comprising at least two optical systems each including a low spatial coherence light source sending an excitation beam to the measurement vessel along an axis of the system and a photoluminescence emission beam capture element centered on the axis of the system , said optical systems operating simultaneously and being positioned so that their axes form between them a non-zero and distinct obtuse angle of 180 ° around the measurement vessel, said photoluminescence measurement being deduced from a coupling of data obtained from the beams emission captured simultaneously by the capture elements.
  • the optical systems are positioned such that there is at least one partial overlap beam between the source excitation beam of a first optical system and the emission beam captured by the capture element of a second optical system and that the device is provided with at least one so-called extinction capture element in the vicinity of at least one of the sources for sensing light at the wavelength of the excitation in the partial recovery beam, a measurement absorbance and / or diffraction being deduced from data obtained from the light captured by the extinguishing capture element.
  • the invention proposes in particular to multiply the number of optical systems, using a source of low spatial coherence, while coupling the transmitted transmission beams.
  • This allows, for n optical systems, that the excitation power at the measurement point is n times greater than for a single system and allows the received photoluminescence emission power to be n 2 times greater than for a single system since it is received on n optical systems simultaneously.
  • fluorescence emission beams are collected simultaneously by the two capture elements of the two. optical systems.
  • the two systems are mounted epifluorescence, that is to say that emission and reception are along the same axis using the same optics, and that the two systems are arranged so as to make an angle strictly obtuse, the fluorescence emission beam received by each optical system is angularly offset from the excitation beam of the other optical system.
  • the received fluorescence emission beam is then little parasitized by direct light illumination and also twice as intense since two excitation beams are used instead of a single excitation beam as this is the case in the devices of the prior art.
  • the device according to the invention is therefore more precise and more sensitive.
  • the two optical systems between them an obtuse angle around the measuring tank, the existence of a covering beam, insofar as its extent is reduced, ensures that the maximum power arrives in the tank while by generating a minimum of stray light.
  • the invention proposes to use an extinction capture element capable of capturing the light of the covering beam which reveals changes in intensity indicative of absorption and / or diffraction by a microscopic object having passed through the beam. recovery took place.
  • a suitable capture element makes it possible to quantify this absorption.
  • the device comprises an odd number of optical systems positioned so that, in pairs, their axes make between them non-zero obtuse angles and distinct from 180 ° around the measurement vessel.
  • the optical systems are positioned so that their axes form between them identical angles around the measurement vessel.
  • the number of optical systems is equal to three.
  • the device then comprises three optical systems positioned around the measuring vessel such that their axes form between them identical angles around the measuring vessel.
  • This particular feature makes it possible to limit the steric hindrance around the measurement vessel while multiplying by three the intensity of each fluorescence emission beam received by each capture element from the measurement vessel CM with respect to a excitation with a single optical system.
  • the 120 ° positions around the measuring chamber of the optical systems and the need for a cover beam require the use of excitation and emission beams having large numerical apertures.
  • the implementation of three optical systems represents a preferred configuration in terms of angles between the optical systems, available light power, recovery, uniformity of the light field, cost and sensitivity.
  • the capture elements of the emission beam are connected to the same photodetector or the same set of photodetectors.
  • This implementation makes it possible to sum the fluorescence signals received simultaneously by the capture elements directly within the common photodetector. The data is then coupled immediately upon acquisition by the same photodetector. This characteristic makes it possible to perform an optical addition of the light signals.
  • Photodetectors are generally sensitive to a single wavelength. The use of a single photodetector is therefore rather suitable when a single wavelength of photoluminescence is expected, which generally corresponds to a single excitation wavelength.
  • the use of the same set of photodetectors for the capture elements makes it possible to detect several wavelengths of photoluminescence. This will therefore be better suited when several photoluminescence wavelengths are expected, which more generally corresponds to an excitation on several wavelengths. This will correspond for example to a configuration where the three optical systems do not necessarily emit each light of the same wavelength. In all cases, the photodetectors perform an optical addition of the light signals.
  • the photodetector or photodetectors are connected to data processing means able to deduce the photoluminescence measurement from the data received from the photodetector (s).
  • the extinction capture element is connected to a photodetector, itself connected to data processing means able to deduce an absorbance and / or diffraction measurement from the data received in from the photodetector.
  • the capture elements of the emission and / or extinction beams are optical fibers of circular or rectangular section.
  • the light sources include a light coherence electroluminescent diode coupled to an optical element intended to render the excitation beam homogeneous.
  • the optical element is a light conductor, for example an optical fiber.
  • the measurement vessel has a polyhedral section in the plane where the optical systems are placed, the polyhedron being such that its faces are perpendicular to the axes of the optical systems.
  • the tank thus has an equilateral triangular section.
  • the measuring vessel is cylindrical.
  • each optical system includes aberration correction means for correcting the aberrations introduced by the geometry of the measurement vessel on the different beams.
  • the fluid is a biological fluid.
  • a device according to the invention can be used for the detection and counting of fluorescently labeled biological elements.
  • the Applications are numerous in the field of flow cytometry in particular and more particularly for the identification and counting of biological cells in peripheral blood samples or bone marrow or any other biological fluid.
  • the invention also relates to a method for measuring photoluminescence and measuring absorbance and / or diffraction in a fluid present in a measuring vessel, characterized in that the fluid in the measuring vessel simultaneously receives at least two beams of excitation from two optical systems each comprising a low spatial coherence light source sending said excitation beam to the measurement vessel along an axis of the system and a capture element for receiving a fluorescence emission beam centered on the axis of the system from the fluid, said optical systems being positioned so that their axes form between them a non-zero and distinct obtuse angle of 180 ° around the measurement vessel, said photoluminescence measurement being deduced from a coupling of data obtained from the emission beams captured simultaneously by the capture elements.
  • the optical systems are positioned in such a way that there is a partial overlap beam between the excitation beam of the source of a first optical system and the emission beam captured by the capture element.
  • at least one light at the wavelength of the excitation is picked up in the partial overlap beam by at least one so-called extinction capture element placed in the vicinity of at least one sources, an absorbance and / or diffraction measurement being deduced from data obtained from the light captured by the extinction capture element.
  • FIG. 1 represents a photoluminescence measuring device as known from the prior art
  • FIG. 2 is a block diagram of a device for measuring a photoluminescence according to the invention
  • FIG. 3 represents the profile of the intensity of the light field in the horizontal direction in the measurement vessel of a device according to FIG. 2;
  • FIG. 4 gives examples of spectral characteristics of filters and of dichroic plate as implemented in a device according to FIG. 2;
  • FIG. 6 illustrates in three dimensions the volume analyzed by a photoluminescence measuring device according to the invention
  • FIG. 7 represents in perspective a first embodiment of a device for measuring a photoluminescence according to the invention.
  • FIG. 8 represents means for correcting the aberrations due to the geometry of the measurement vessel
  • FIG. 9 represents the transmission coefficient of the emission beam as a function of the angle of incidence on a glass / air interface
  • FIG. 10 represents in perspective a second embodiment of a device for measuring a plurality of photoluminescences according to the invention.
  • FIGS. 11a, 11b and 11c show several positions for an extinction capture element in a device according to the invention
  • FIGS. 12a and 12b show the overlapping bundles, respectively in a triangular tank and in perspective
  • FIG. 13 schematically illustrates the principle of the absorption and diffraction measurements according to the invention
  • FIG. 14 illustrates the result observed at the output of an optical fiber used as an extinction capture element
  • FIG. 15 represents the absorption spectra, in solid lines, and emission, in dashed line, in fluorescence of the dye Phycoerythrin Cyanine 5;
  • FIG. 16 is a diagram bearing the characteristics of a population of reticulocytes measured by means of a device according to FIG. 2. Detailed description of an embodiment
  • FIG. 2 diagrammatically represents a photoluminescence measuring device in a cylindrical measurement vessel CM according to the invention.
  • This device comprises three optical systems Ca, Cb, and Cc similar and each centered on an axis Xa, Xb, Xc. These axes Xa, Xb, Xc make non-zero and distinct angles of 180 ° between them.
  • the optical systems Ca, Cb, and Cc being regularly distributed around the measurement vessel CM these angles are identical and equal to 120 °.
  • These are optical systems called epifluorescence assemblies, in which the same optics are used for the emission and reception of light. In these assemblies, the axes of the light emitted towards the measurement vessel and the light received from the measuring vessel are merged.
  • Each optical system Ci comprises a source Si, for emitting an excitation beam, schematized in solid line, to the measurement vessel CM, and a capture element CEi, for capturing fluorescence emission beams, partially schematized in FIG. dashed line, coaxial with the excitation beam along the axis Xi.
  • the sources Si are electroluminescent diodes of high brightness and low spatial coherence.
  • high-brightness light-emitting diodes are integrated circuits which comprise, on their surfaces, inhomogeneous zones due to the presence of electrical contacts serving to supply current to the semiconductor junction.
  • the beam obtained is then not homogeneous and to project the image of the diode into a measurement volume does not allow precise discrimination of the microscopic objects analyzed.
  • the electroluminescent diodes Si are therefore advantageously coupled with an optical element EOi whose function is to render the excitation light field homogeneous.
  • the optical element EOi is advantageously a light conductor, for example an optical fiber, or a specific optical element such as a non-imaging optical beam transformer.
  • gradient or index jump fibers of circular or rectangular section may be used.
  • the emitting area of the integrated circuit comprising the diode may be placed on the input face of the light-conducting optical element EOi.
  • Such coupling is economical and simple to perform.
  • the temperature of the integrated circuit can reach values greater than 100 ° C., it is advisable to use materials bearing such temperatures, for example silica.
  • plastic EO light conductors by inserting a specific optics, such as a glass ball lens, silica or synthetic ruby, between the light conductor EO and the integrated circuit.
  • a specific optics such as a glass ball lens, silica or synthetic ruby
  • the ball lens can further improve the homogeneity of the excitation light field by placing, for example, the integrated circuit in the focal plane of the ball lens.
  • the light conductor EO is illuminated in parallel beam, each point of the source emitting a coupled wave in the fiber.
  • the divergence of the excitation beam at the output of a light conductor E0 is given by its numerical aperture which, in the case of an optical fiber, is a function of the difference in index between the guiding portion and the sheath which the envelope.
  • the light conductor EO is a silica optical fiber with a diameter of 940 ⁇ m and a numerical aperture of 0.22.
  • the coupled power in each fiber is 1.5 mW making a total of 4.5 mW in the CM measuring vessel.
  • the optical fiber is placed in contact with a light emitting diode OSRAM brand (Golden Dragon type) powered by a current of 2000 mA.
  • the power supply of the integrated circuit can be well beyond the manufacturer data, it is advisable to provide means for cooling the junction especially when the excitation beam is used in continuous lighting mode.
  • a cooling circuit composed of a radiator of low thermal resistance coupled to a Peltier effect element is for example implemented in a device according to the invention.
  • cooling can be avoided when the light source is used in pulses triggered by an auxiliary means such as an optical extinction signal or an electrical impedance transducer of the type called Coulter effect.
  • Extinguishing or electrical measurements are then performed upstream of the photoluminescence measuring device according to the invention in the direction of flow of the fluid flow in the measurement vessel CM.
  • this direction of flow is perpendicular to the plane of the figure.
  • the triggering of the excitation beams is advantageously delayed by the travel time of the detected microscopic object to go from the sensor of the detector. Impedance at the optical measurement point located at the measuring point M.
  • each optical system Ci the excitation beam coming from the light conductor EOi is made parallel by a collimation optic LIi.
  • This excitation beam is advantageously then filtered by a filter element FIi which is a bandpass filter defined by the absorption spectra or spectra of the fluorescent compound (s) to be detected.
  • a filter element FIi which is a bandpass filter defined by the absorption spectra or spectra of the fluorescent compound (s) to be detected.
  • FIG. 3 represents a normalized profile of the intensity IL of the light field centered at the point M in the horizontal direction as obtained in the measurement vessel CM. There is a good spatial homogeneity over the width of the M point which is, there, 300 microns.
  • FIG. 4 describes an example of spectral characteristics, in this case gains G as a function of the wavelength, for the filters F1 and F2 and for the dichroic plate DC in an application intended for the measurement of colored microscopic objects using the orange thiazole dye or any other dye with the same spectrometric characteristics.
  • a dye whose absorption properties, solid line, and fluorescence, dotted line, are shown in Figure 5, is for example used for the differential count of reticulocytes which is one of the major applications of the invention. . It is also possible to detect with the invention nucleated cells or other biological elements. As shown diagrammatically in FIG. 5, the excitation is carried out in a narrow band centered on 488 nm and the fluorescence measurement is carried out on a 30 nm band centered on 530 nm.
  • the filter F1 is centered at the excitation wavelength of 470 nm with a width of 15 nm
  • the filter F2 is centered at the fluorescence emission wavelength of 540 nm. with a width of 20 nm.
  • the filter F2 is mono channel.
  • a multi-channel filter is advantageously used.
  • the DC dichroic filter has a very fast rising edge from its minimum transmission to its maximum transmission at about 10 nm. It is a high-pass filter allowing the fluorescence emission wavelengths to pass and reflecting the excitation wavelengths.
  • filters are for example available from manufacturers OMEGA or SEMROCK.
  • magnification Gr of the optical assembly constituted by the optical combinations L1 and L2 is then a parameter determining this power.
  • the projected image in the counting chamber has a size of
  • the focusing of the excitation beam produces a power density equal to P Gr 2 / (axb), that is to say that the power density is Gr 2 times greater than at the level of the exit face of the light conductor EO.
  • magnification Gr it will therefore be advantageous for the magnification Gr to be as large as possible and it is therefore advantageous for the optical combinations L 2 to have large numerical apertures.
  • each microscopic object of the measurement volume perceives three excitation beams, thus enjoying a triple excitation fluorochromes.
  • the fluorescence lights being isotropic, fluorescence emission beams are collected by the three optical combinations L2a, L2b, L2c.
  • the emission beam is then transmitted through the dichroic plate DCi and then filtered using the filter F2i.
  • the emission beam is then focused using the optical combination L3i to the capture element CEi.
  • the capture elements CEa, CEb, CEc are advantageously light conductors, for example optical fibers, one end of which is placed at the focal center of the lenses L3a L3b, L3c and the other end is oriented towards a sensitive surface of a PD single photodetector, which can be a photomultiplier, a single photodiode or avalanche effect.
  • the photodetector PD simultaneously receives the emission beams from the three capture elements CEa, CEb and CEc and then realizes the sum of the light energies captured by the optical fibers CEa, CEb, CEc.
  • the quantity of light collected by this set is therefore greater than the sum of the luminous quantities collected by each system taken separately, and this as soon as two optical systems are used according to the principles of the invention.
  • the excitation beams in the device according to FIG. 2 are offset with respect to each other because the epifluorescence assemblies make a non-zero obtuse angle distinct from each other. 180 °. This configuration avoids a total overlap of the excitation and emission beams which minimizes background light, the main source of noise at the PD photodetector.
  • I b the more discriminating the measuring device will be.
  • I b is minimized in the devices according to the invention because the excitation beams do not overlap or overlap only partially.
  • the device of FIG. 2 further comprises spatial filters D, for example simple pinholes, placed in front of the capture elements CE.
  • This filtering has the effect of eliminating certain signals undesirable reflections, such as spurious reflections on the walls of the measuring vessel CM. It thus contributes to the decrease of the component I b and thus to the improvement of the signal-to-noise ratio.
  • FIG. 7 represents, in perspective, a first embodiment of a device according to the invention. in which a triangular CM measuring vessel is used. The measurement vessel CM is then such that its faces are perpendicular to the axes Xa, Xb, Xc of the optical systems Ca, Cb and Cc located at 120 ° from each other.
  • a DC dichroic plate is placed at 45 degrees at the intersection of the excitation and emission beams and has the spectral transmission characteristics shown in Figure 4.
  • the embodiment shown in FIG. 7 is suitable for the detection and counting of a single fluorescence wavelength and uses three optical systems Ca, Cb and Cc according to the principles of the invention.
  • This device can be used in particular for the detection and counting of reticulocytes in peripheral whole blood samples.
  • the passage of microscopic objects in the illumination plane of the optical systems is represented by a succession of aligned balls passing through the measurement vessel CM.
  • the three emission beams are captured by three capture elements CEa, CEb, CEc, which are conjugated light conductors on a single PD photodetector.
  • Each emission beam is spectrally filtered by means of a DC dichroic plate and interferential filters, not shown and preferably positioned between the DC dichroic plates and the L3 optical combinations.
  • the spectral filtering is provided by an interference filter positioned between the three arrivals of the capture elements CEa, CEb, CEc and the photosensitive detector PD.
  • each optical system Ca, Cb, Cc it is advantageous for each optical system Ca, Cb, Cc to comprise means for correcting the optical aberrations introduced by the thick diopter constituted by each face of the measurement vessel CM.
  • the optical combination L2 is advantageously corrected geometric aberrations related on the one hand to the large numerical aperture of the beam which may be greater than 0.6, and on the other hand to the crossing of thick diopters, in particular the diopter of the measuring vessel CM and the fluid thickness traversed to the measuring point M.
  • FIG. 8 shows an exemplary embodiment of a correction implementing a set of lenses of curvature and refractive indices chosen, the interval between two lenses being also a sizing parameter.
  • the correction is made for a measurement vessel CM of equilateral triangular section. It is an association of three flat dioptres for example composed of a 2.5 mm glass wall and 1.5 mm of silica.
  • the optical combination L1 is an achromatic doublet that minimizes the chromatic aberration at 488 nm
  • the optical combination L2 is composed of a four-lens train consisting of a paired doublet including the diopters of Figure 8.
  • the optical combination L3 is a convex plane lens.
  • aspheric optics can also be used to make corrections of similar aberrations or other kinds.
  • the described optics correct the geometric and chromatic aberrations introduced by the crossing of the thick dioptres constituted by the glass wall of the tank and the thickness of water between the wall of the measuring tank CM and the passage of the microscopic objects, by example the cells, in point M.
  • the excitation beam then passes through a first air / glass interface and then a second glass / water interface which reduces the amount of light by a factor equal to the Fresnel transmission at the interfaces considered.
  • optical assembly consisting of the optical combinations L1 and L2 can be optimized by correcting, in addition to geometric aberrations, chromatic aberration related to the width of the spectrum of the excitation.
  • optical assembly consisting of the optical combinations L2 and L3 can be optimized by correcting the chromatism linked, on the one hand, to the fact that the fluorescence lights are centered on wavelengths shifted towards the long wavelengths. and on the other hand that the detection of these lights is performed on a spectral band of finite width.
  • the fluorescence emission beams are collected by the three capture elements CEa, CEb and CEc, which are light conductors gathered in a single beam coupled to a photoelectric detector PD, which can be a photomultiplier or an avalanche photodiode.
  • This photodetector PD realizes the sum of the light energies collected from the three optical fibers.
  • a calculation of the fluorescence is then carried out according to the knowledge of those skilled in the art, especially after a prior calibration of the device. A measurement of the fluorescence generated in the measurement volume v is thus obtained.
  • FIG. 10 represents, in perspective, a second embodiment of a device according to the invention adapted to the measurements of several fluorescence wavelengths of a fluid in a measurement vessel CM.
  • the microscopic objects present in the measurement vessel CM are, here again, illuminated by the three excitation beams coming from the sources Si of three systems Ca, Cb, Cc, via a filtering by means of a possible spectral filter, not shown. and a DC dichroic splitter plate.
  • the dichroic plate DCi reflects light from Si to the measurement vessel CM where L2i concentrates it.
  • This dichroic plate DCi transmits the higher wavelengths from the illuminated microscopic objects to the capture elements CEa, CEb and CEc which are preferentially light conductors such as optical fibers.
  • the three capture elements CEa, CEb, CEc are then conjugated on a common spectrometric detection assembly consisting, for example, of a diffraction grating DG and of photodetectors PD1 to PDn.
  • the n photodetectors are positioned spatially with respect to the DG network to collect and measure each a wavelength band corresponding to one of the target fluorescences emitted by the biological elements passing through the tank CM.
  • These photodetectors PD1 to PDn may be detectors chosen from possibly avalanche-effect photodiodes, for example arranged in line or in strips, photo-multiplier tubes, multiple optical sensors of the CCD type, for example organized in matrix or in line. .
  • Distinct fluorescence intensities are then obtained for a plurality of distinct wavelength bands.
  • the presence of fluorescences at distinct wavelengths may be due to differences between the detected particles or to the plurality of wavelengths used in the emission, this plurality generating fluorescence at different wavelengths.
  • the three capture elements CEa, CEb, CEc are conjugated on a detection assembly consisting, for example, of separating plates, possibly dichroic, distributing the light beam towards photodetectors PD1 to PDn.
  • the emission beams Prior to the measurement, the emission beams can be filtered by means of interference filters adapted to the fluorophores used.
  • At least one of the optical systems includes an extinction capture element DT placed near the source, here Sa, of the system concerned.
  • This extinction capture element DT is intended to capture lights having the same properties in terms of wavelengths as the source Sa. These lights are thus reflected by the dichroic plate DC coming from the tank CM towards the Sa source.
  • the extinction capture element DT is coupled to a photodetector PDT.
  • FIG. 11 proposes a number of possible positions for an extinction capture element DTa near the source Sa, represented by the section of the optical element EOa ensuring the homogeneity of the beam produced by the source Sa.
  • Such an extinction capture element DT makes it possible to visualize the intersections of the excitation and emission beams, also called recovery beams. Geometrically, these intersections correspond to the intersection of six cones resting on the pupil of the optics L2i and pointing to the center of the measuring chamber CM; these volumes or FC cover beams are shown in Figure 12. They exist as soon as the numerical aperture of the lens L2 is sufficiently large.
  • Figure 12a shows a horizontal section of the measuring vessel CM on which are indicated the axes Xa, Xb and Xc of the three optical systems Ca, Cb and Cc.
  • the overlapping beams respectively corresponding to excitation by the excitation beam of the optical system Cb and Cc received by the system Ca are denoted FCb 3 and FCc 3 . This notation is used for the other overlay beams received by the Cb and Cc systems.
  • Figure 12b gives a three-dimensional representation of these same overlapping beams.
  • the existence of such overlapping beams is advantageously exploited to measure the absorption and diffraction by the microscopic objects present in the measurement vessel.
  • the extinction capture elements DT are intended to capture the light of these beams.
  • the section of the optical element EOa is rectangular and written in a square whose upper part is used to place a plurality of extinction capture elements DTa ', to receive signals indicative of an absorption , and DTa ", to receive signals indicative of a diffraction
  • the use of two rectangular extinction sensors DTa 'placed on either side of the source Sa captures the lights of the beams of recovery since the geometry of these beams is such that they are located on either side of the excitation beam, the use of the central extinction sensor DTa "makes it possible to capture the possible diffracted lights.
  • the sections of the other optical elements EOb, EOc can advantageously be, for their part, square.
  • FIG. 13 schematically illustrates the principle of an absorption and / or diffraction measurement in a photoluminescence measuring device according to FIG. 7.
  • the measurement vessel CM is illuminated by two beams of light. excitation from the optical systems Cb and Cc.
  • the opening of the excitation beams from sources Sb and Sc is such that overlap beams FCb 3 and FCc 3 exist with the transmission beam of the system Ca.
  • the emission beam of the fluorescence wavelength captured by the system Ca crosses the plate DCa without being deflected while the light received from the sources Sb and Sc constituting the covering beams is deflected by the dichroic blade DCa.
  • FIG. 13 only these overlapping light beams FCb 3 and FCc 3 of the same wavelength as the sources Sb and Sc are represented. They come from the measurement vessel CM and go towards the extinguishing capture element DTa via the dichroic plate DCa.
  • the extinguishing capture element DTa is advantageously an optical fiber of circular section.
  • FC 3 overlay beam Those that do not belong to any FC 3 overlay beam only include RD diffracted rays in the CM measuring vessel and are indicative of the diffraction in the CM measuring vessel.
  • RD rays will appear in the angular sector bordered by the overlapping beams FCb 3 and FCc 3 only when a microscopic object has diffracted the excitation light into the measurement vessel CM.
  • FCc 3 of the source Sc include diffracted rays from one of the sources Sb, Sc, or even Sa when the latter is active, and the beams of the beam from the source Sc and having passed through the measuring vessel CM without deviation or absorption.
  • the radii of a covering beam are partly a reflection of diffraction but also of absorption since extinction due to an absorbing microscopic object will be visible in the angular sectors defined by a covering beam.
  • One of the advantages of the invention is the ability to visualize and exploit the FC overlay beams and the RD diffracted beams in the angular sector bordered by the FC overlay beams.
  • an optical fiber preferably of circular section is used to produce the extinguishing capture element DTa, when it is unique.
  • the optical characteristics of such an optical fiber make it possible to exploit the differences in entry angles in the optical fiber of the rays belonging to and not belonging to a covering beam FCb 3 or FCc 3 . Indeed, as illustrated in FIG. 13, the radii of the covering beams FCb 3 and FCc 3 enter the fiber at an angle greater than the axis of the fiber than those RD, diffracted, located in the angular sector. bordered by overlapping bundles.
  • This angular property is conserved along the fiber because the rays of the overlapping beams twist along the fiber but remain close to the index jump line or index gradient while the other diffracted rays entered with a smaller angle to the axis of the fiber are found throughout the section of the fiber.
  • each element targeting a specific part of the section of the fiber DTa by imaging the output of the fiber DTa on a multi-element PDT photodetector, each element targeting a specific part of the section of the fiber DTa, it can be seen that the CNT contour of the fiber DTa is permanently illuminated and undergoes extinction at the moment of passage of a microscopic object, this extinction being due to absorption by this object. The light then observed on the CNT contour is indicative of the absorption and partially of the diffraction which has no reason to be zero in the angular sectors of the overlapping beams.
  • the CTR center of the fiber DTa only becomes illuminated when a microscopic object passes through, signifying the diffraction of the light by this object.
  • diffraction is isotropic, it is possible, by connecting the photodetector PDT to processing means, deduce its intensity to the light observed on the contour of the optical fiber to obtain a value of the absorption.
  • Such use of the overlay beams is particularly advantageous for differentiating biological cells according to their absorption and / or diffraction characteristics.
  • extinction measures can be used for the cytological study for which they are interpreted as morphological or chemical information.
  • each microscopic object for example a biological object passing through the measurement vessel CM
  • the three epifluorescence being conjugated in one and the same photodetector for each fluorescence wavelength considered.
  • the identification and differential counting of biological elements is commonly done in flow cytometry. To do this the blood sample is incubated with antibodies specific biological elements to identify. These antibodies are conjugated to markers, most often fluorochromes. These fluorochromes are usually chosen for identify each antibody specifically and the measurement of a fluorochrome therefore corresponds to the identification of the antibody on which it is conjugated. It is thus possible to identify several different antibodies by measuring as many different wavelengths. In the device described in FIG. 10, it is possible to measure several different wavelengths. It is thus possible to measure at least as many antibodies or specific markings as wavelengths.
  • FIG. 5 The spectrum of FIG. 5, already presented, is that of orange thiazole. It can also be applied to the dye Fluorescein Iso ThyoCyanate (FITC) very commonly used in conjugation to an antibody.
  • FITC Fluorescein Iso ThyoCyanate
  • Figure 15 depicts another dye, the tandem Phycoerythrin Cyanine 5, also commonly used in flow cytometry. These two dyes can be used to identify at least two different antibodies in the device described.
  • the tank CM is arranged to measure sequentially on all the elements passing through it, their volume by the method of impedance measurement as described in patent FR 2,653,885. ⁇
  • the measurements can be performed on a single wavelength or a plurality depending on the device used and the markers used.
  • the previously presented steps have been carried out for the differentiation and counting of reticulocytes with the device of FIG. 7.
  • Reticulocytes are young forms of erythrocytes or red blood cells. They are characterized by the intracytoplasmic presence of reticulum consisting of RNA. These traces are the remainder of the expulsion of the nucleus during its transition from the erythroblast stage to the reticulocyte stage within the bone marrow. About twenty-four hours after this expulsion, the reticulocytes pass from the bone marrow into the blood.
  • the ribosomes degrade to transform the reticulocyte into a mature erythrocyte. Since the average life span of a red blood cell is 120 days, the normal regeneration rate must be 0.83%. The generally accepted average normal percentage is between 0.5 and 1.5%, with these values being higher in infants under 3 weeks of age (2-6%).
  • the observation and counting of reticulocytes is therefore an indicator of the erythropoietic activity and thus a particularly useful parameter especially in the follow-up of the medullary recovery after chemotherapy, in the follow-up of treatment with recombinant erythropoietin (rHuEpo), in the balance sheet. investigation of anemia or in the search for hemolysis or compensated haemorrhage.
  • the dilution step of the whole blood sample is carried out using a reagent containing Thiazole Orange, in particular as described in patent FR 2,759,166.
  • the results of the fluorescence and volume measurements are reconstituted and advantageously arranged to allow the absolute and differential count of the biological elements observed. It is then possible to extract the number of erythrocytes and the number and percentage of reticulocytes based on the fluorescence of the intracellular RNA. It is also possible to calculate an index of reticulocyte immaturity (IRF) based on the distribution of elements according to their fluorescence. The most fluorescent elements being considered as the youngest ones.
  • IRF index of reticulocyte immaturity
  • FIG. 16 is a diagram bearing the results obtained by means of the invention: the reticulocyte population is placed on the diagram as a function of their VC cell volume in ⁇ m 3 measured by impedancemetry on the abscissa and on the ordinate, the intensity IF of the picoWatts fluorescence signal.
  • the invention can be implemented with various numbers of optical systems, starting from two and shifted in pairs by a non-zero angle and distinct from 180 °.
  • such a property is very useful for discriminating distinct microscopic objects.
  • the wavelengths of the sources Sa, Sb, Sc it is also possible to envisage varying the wavelengths of the sources Sa, Sb, Sc. It would thus be possible to illuminate the microscopic objects passing through the measurement vessel CM with an excitation beam comprising two or several wavelength ranges or with different wavelength excitation beams and to individually measure the resulting epifluorescence.

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Abstract

L'invention concerne un dispositif et un procédé de mesure de photoluminescence dans un fluide présent dans une cuve de mesure [CM]. Selon l'invention, le fluide dans la cuve de mesure [CM] reçoit simultanément au moins deux faisceaux d'excitation en provenance de deux systèmes optiques [Ci]. Ces systèmes optiques [Ci] sont positionnés pour que leurs axes [Xi] fassent entre eux un angle non nul et distinct de 180° autour de la cuve de mesure [CM]. Une mesure de photoluminescence est déduite selon l'invention d'un couplage de données obtenues à partir des faisceaux d'émission capturés simultanément par les éléments de capture [CEi]. Les systèmes optiques [Ci] sont en outre positionnés de telle manière qu'il existe au moins un faisceau de recouvrement partiel [FCba] entre le faisceau d'excitation de la source [Sb] d'un premier système optique [Cb] et le faisceau d'émission capté par l'élément de capture [CEa] d'un second système optique [Ca]. Le dispositif est en outre muni d'au moins un élément de capture [DTa] dit d'extinction au voisinage d'au moins une des sources [Sa] pour capter une lumière à la longueur d'onde de l'excitation dans le faisceau de recouvrement partiel [FCba], une mesure d'absorbance et/ou de diffraction étant déduite de données obtenues à partir de la lumière captée par l'élément de capture d'extinction [DTa].

Description

Titre de l'invention
Dispositif et procédé de mesure de photoluminescence, d'absorption et de diffraction d'objets microscopiques dans un fluide.
Arrière-plan de l'invention
La présente invention se rapporte au domaine général des dispositifs et procédés de mesure de photoluminescence dans un fluide présent dans une cuve de mesure. De tels dispositifs et procédés étant en particulier destinés au comptage d'objets microscopiques dans un fluide, par exemple biologique. Plus précisément, l'invention concerne les dispositifs basés sur l'utilisation de sources de lumière partiellement cohérentes, telle une diode électroluminescente, comme moyen d'excitation de molécules, par exemple fluorescentes, présentes dans un fluide.
La photoluminescence est un phénomène radiatif sensiblement isotrope induit lors du retour à l'état fondamental d'une molécule excitable et excitée par une énergie lumineuse à une longueur d'onde qui lui est propre. L'émission de lumière de fluorescence se fait toujours à une fréquence inférieure à celle d'excitation. La mesure s'effectue généralement en dehors de l'axe d'excitation par la lumière incidente et au travers d'un filtre chromatique ne transmettant au détecteur que la bande spectrale d'intérêt.
L'invention s'intéresse en particulier au développement de moyens optiques et optoélectroniques permettant la détection de très faibles signaux de photoluminescence tels ceux issus du marquage de biomolécules, protéines ou acides nucléiques par exemple. En biologie animale, la mesure des signaux de photoluminescence est particulièrement utile au praticien pour élaborer un diagnostic et plus spécifiquement un diagnostic cytologique pour lequel la détection et le comptage de lignées cellulaires rares comme les cellules souches hématopoïétiques ou autres éléments figurés du sang ou d'un autre liquide biologique sera particulièrement utile.
Les mesures de photoluminescence des éléments biologiques, que celle-ci soit naturelle ou induite par une sonde moléculaire, sont largement utilisées dans les domaines de la cytométrie de flux et des automates de cytologie notamment hématologique.
Les sondes moléculaires utilisées peuvent être des colorants vitaux ou supravitaux ayant une affinité intrinsèque pour un type particulier de molécules tels les colorants intercalant des acides nucléiques. Elles peuvent aussi être des sondes immunologiques tels des produits conjugués composés d'un anticorps sur lequel est greffée une molécule colorante, généralement un fluorochrome, seul ou en tandem, ou parfois un nano cristal. L'anticorps va pouvoir se lier de façon spécifique à des molécules ou portions de molécules appelées antigènes ou déterminants antigéniques qu'il sera alors possible de décompter par mesure de photoluminescence.
Le mode de marquage par la mise en œuvre de sondes immunologiques s'est largement répandu pour l'identification cytologique notamment à l'aide des techniques de cytométrie en flux. Pour obtenir la sensibilité nécessaire à de telles mesures, les sources de lumière d'excitation doivent pouvoir délivrer une énergie suffisante afin que chaque élément biologique marqué puisse être détecté avec suffisamment de sensibilité lors de son passage devant le faisceau d'excitation.
Pour obtenir cette puissance, la plupart des cytomètres ou automates intégrant ces techniques de fluorescence, utilisent des sources lumineuses de type laser, que ce soit gaz ou solide ou autres, ou des sources semi conducteur comme les diodes laser et autres laser dérivés, par exemple DPSS pour Diode- Pumped Solid-State.
Les sources de type laser permettent d'avoir une très bonne cohérence spatiale ainsi qu'une grande puissance mais la structure gaussienne du faisceau laser affecte l'homogénéité du champ de lumière au point de mesure. Il est nécessaire de mettre en œuvre une optique complexe, donc coûteuse, pour obtenir une homogénéité de ce champ supérieure à 0,5 % au point de mesure.
L'utilisation de sources laser présente donc l'inconvénient majeur du coût qui peut, dans le cas notamment des dispositifs à faisceau d'excitation ultra violet, à colorant ou multibandes, être prohibitif et réserver leur usage à des dispositifs très particuliers dans des domaines pointus de l'analyse biologique. Les diodes laser, moins coûteuses, présentent l'avantage d'avoir une grande densité de puissance liée à leur forte cohérence spatiale, mais le choix des longueurs d'onde est plus restreint par rapport aux choix procurés par les diodes électroluminescentes. A ce sujet, il est connu, par exemple du document WO 00/57161, d'utiliser de telles sources de faible cohérence spatiale, comme des diodes électroluminescentes, dans un cytomètre de flux.
La figure 1 représente un tel dispositif utilisant généralement des sources de faible cohérence spatiale, telles que des lampes à arc ou des diodes électroluminescentes. Un tel dispositif peut être utilisé pour une mesure de photoluminescence dans une cuve de mesure CM au centre de laquelle est injecté un fluide, par exemple biologique, à analyser. Le système optique proposé est généralement dit montage en mode d'épifluorescence. Le dispositif comprend une source de lumière S destinée à générer un faisceau d'excitation et un élément, par exemple un photodétecteur PD, destiné à capter la lumière d'un faisceau d'émission de photoluminescence.
On entend par les termes faisceau ou lumière ou rayonnement d'excitation, la lumière issue de la source de lumière servant à l'illumination du fluide à analyser. On entend par les termes faisceau ou lumière ou rayonnement d'émission, la lumière issue de l'interaction inélastique du faisceau d'excitation avec des objets microscopiques présents dans le fluide à analyser telles que les lumières de fluorescence ou photoluminescence.
Dans ce dispositif dit en épifluorescence, le faisceau d'excitation généré par la source de lumière S et le faisceau d'émission capté par le photodétecteur PD sont coaxiaux le long d'un axe appelé axe du système X, la même optique permettant l'émission et la réception des lumières.
Le dispositif comprend une lame dichroïque DC pour dissocier les faisceaux d'excitation et d'émission. Avantageusement, le dispositif comprend en outre deux filtres Fl et F2 respectivement destinés à filtrer la lumière de la source S émise en direction de la cuve de mesure CM et la ou les lumières de fluorescence résultant de l'interaction inélastique de la lumière d'excitation émise par la source S avec des objets microscopiques du fluide présent dans la cuve de mesure CM.
Des optiques Ll et L3 permettent que les faisceaux d'excitation et d'émission soient des faisceaux parallèles lors de leur traversée des filtres Fl et F2 et de la lame dichroïque DC. Une lentille ou une combinaison optique L2 de grande ouverture numérique permet de focaliser le faisceau d'excitation sur un petit volume centré en un point de mesure M de la cuve de mesure CM.
La lumière de fluorescence issue d'un objet microscopique présent dans le fluide et passant au point M illuminé par le faisceau d'excitation est focalisée en un faisceau parallèle grâce à la lentille L2, transmise au travers de la lame DC, filtrée par le filtre F2 et reçue par le photodétecteur PD après focalisation par la lentille L3.
De manière générale, la puissance du faisceau d'excitation obtenue à la longueur d'onde centrale choisie par rapport au fluorochrome utilisé est faible. Cela réduit d'autant les capacités de discrimination des dispositifs connus dont les champs d'application sont restreints. Ils sont en effet limités à la détection de signaux de fluorescence élevés par exemple correspondant à un grand nombre d'épitopes ou à des marqueurs de rendement de fluorescence élevés.
Objet et résumé de l'invention
La présente invention a donc pour but principal de pallier les inconvénients présentés par les dispositifs de l'art antérieur en proposant un dispositif de mesure de photoluminescence et de mesure d'absorbance et/ou de diffraction précis, sensible et peu coûteux comprenant au moins deux systèmes optiques incluant chacun une source de lumière de faible cohérence spatiale envoyant un faisceau d'excitation vers la cuve de mesure selon un axe dit du système et un élément de capture d'un faisceau d'émission de photoluminescence centré sur l'axe du système, lesdits systèmes optiques fonctionnant simultanément et étant positionnés pour que leurs axes fassent entre eux un angle obtus non nul et distinct de 180° autour de la cuve de mesure, ladite mesure de photoluminescence étant déduite d'un couplage de données obtenues à partir des faisceaux d'émission capturés simultanément par les éléments de capture. Selon l'invention, les systèmes optiques sont positionnés de telle manière qu'il existe au moins un faisceau de recouvrement partiel entre le faisceau d'excitation de la source d'un premier système optique et le faisceau d'émission capté par l'élément de capture d'un second système optique et en ce que le dispositif est muni d'au moins un élément de capture dit d'extinction au voisinage d'au moins une des sources pour capter une lumière à la longueur d'onde de l'excitation dans le faisceau de recouvrement partiel, une mesure d'absorbance et/ou de diffraction étant déduite de données obtenues à partir de la lumière captée par l'élément de capture d'extinction.
L'invention propose notamment de multiplier le nombre de systèmes optiques, utilisant une source de faible cohérence spatiale, tout en couplant les faisceaux d'émission reçus. Cela permet, pour n systèmes optiques, que la puissance d'excitation au point de mesure soit n fois plus important que pour un seul système et permet que la puissance d'émission de photoluminescence reçue soit donc n2 fois plus importante que pour un seul système puisqu'elle est reçue sur n systèmes optiques simultanément. C'est le caractère isotrope des rayonnements d'émission de photoluminescence qui assure que la sensibilité de détection du dispositif soit augmentée de manière substantielle, n2 en l'occurrence, en augmentant le nombre n de systèmes optiques en épifluorescence. L'utilisation de sources de lumière de faible cohérence, sans chute préjudiciable de sensibilité, devient alors possible.
En outre, en considérant une excitation du volume de mesure par deux faisceaux d'excitation en provenance des deux systèmes fonctionnant simultanément, les lumières de fluorescence étant isotropes, des faisceaux d'émission de fluorescence sont collectés simultanément par les deux éléments de capture des deux systèmes optiques. Comme les deux systèmes sont montés en épifluorescence, c'est-à-dire qu'émission et réception se font le long d'un même axe en utilisant les mêmes optiques, et que les deux systèmes sont disposés de manière à faire un angle strictement obtus, le faisceau d'émission de fluorescence reçu par chaque système optique est angulairement décalé par rapport au faisceau d'excitation de l'autre système optique.
Le faisceau d'émission de fluorescence reçu est alors peu parasité par l'éclairage en lumière directe et également deux fois plus intense puisque deux faisceaux d'excitation sont utilisés au lieu d'un seul faisceau d'excitation comme c'est le cas dans les dispositifs de l'art antérieur. Le dispositif selon l'invention est par conséquent plus précis et plus sensible.
En outre, les deux systèmes optiques faisant entre eux un angle obtus autour de la cuve de mesure, l'existence d'un faisceau de recouvrement, dans la mesure où son étendue est réduite, assure que le maximum de puissance arrive dans la cuve tout en générant un minimum de lumière parasite.
L'invention propose d'utiliser un élément de capture d'extinction apte à capter la lumière du faisceau de recouvrement qui révèle des modifications d'intensité signes qu'une absorption et/ou qu'une diffraction par un objet microscopique ayant traversé le faisceau de recouvrement a eu lieu. L'utilisation d'un élément de capture adapté permet de quantifier cette absorption.
Dans un mode de réalisation de l'invention, le dispositif comprend un nombre impair de systèmes optiques positionnés pour que, par paire, leurs axes fassent entre eux des angles obtus non nuls et distincts de 180° autour de la cuve de mesure.
Selon une caractéristique particulière, les systèmes optiques sont positionnés pour que leurs axes fassent entre eux des angles identiques autour de la cuve de mesure.
Avantageusement, le nombre de systèmes optiques est égal à trois. Le dispositif comprend alors trois systèmes optiques positionnés autour de la cuve de mesure de telle manière que leurs axes fassent entre eux des angles identiques autour de la cuve de mesure.
Cette caractéristique particulière permet de limiter l'encombrement stérique autour de la cuve de mesure tout en multipliant par trois l'intensité de chaque faisceau d'émission de fluorescence reçu par chaque élément de capture en provenance de la cuve de mesure CM par rapport à une excitation avec un seul système optique.
En outre, les positions à 120° autour de la cuve de mesure des systèmes optiques et la nécessité d'avoir un faisceau de recouvrement requiert l'utilisation de faisceaux d'excitation et d'émission ayant de grandes ouvertures numériques.
Cela présente l'avantage d'augmenter d'autant la puissance destinée à l'excitation des fluorochromes dans la cuve. De plus, en utilisant de telles sources à grandes ouvertures numériques, on obtient une grande uniformité du champ de lumière. L'utilisation de trois systèmes optiques permet donc une synergie d'effets positifs.
Aussi, la mise en œuvre de trois systèmes optiques représente une configuration préférentielle en termes d'angles entre les systèmes optiques, de puissance lumineuse disponible, de recouvrement, d'uniformité du champ de lumière, de coût et de sensibilité.
On note cependant que bon nombre d'avantages de la configuration à trois systèmes optiques sont indépendants de la présence ou non d'un faisceau de recouvrement et d'un élément de capture d'extinction. En outre, cette configuration peut tout à fait être mise en œuvre pour une mesure de fluorescence sans mesure d'extinction, utilisant des sources de faible cohérence spatiale, indépendamment de la présence ou non d'un faisceau de recouvrement.
Dans une mise en œuvre avantageuse, les éléments de capture du faisceau d'émission sont reliés à un même photodétecteur ou à un même ensemble de photodétecteurs.
Cette mise en œuvre permet de sommer les signaux de fluorescence reçus simultanément par les éléments de capture directement au sein du photodétecteur commun. Les données sont alors couplées de suite lors de leur acquisition par le même photodétecteur. Cette caractéristique permet de réaliser une addition optique des signaux lumineux. Les photodétecteurs sont généralement sensibles à une unique longueur d'ondes. L'utilisation d'un unique photodétecteur est donc plutôt adaptée lorsqu'une seule longueur d'ondes de photoluminescence est attendue, ce qui correspond généralement à une unique longueur d'ondes d'excitation.
L'utilisation d'un même ensemble de photodétecteurs pour les éléments de capture permet en revanche de détecter plusieurs longueurs d'ondes de photoluminescence. Cela sera donc mieux adapté lorsque plusieurs longueurs d'ondes de photoluminescence sont attendues, ce qui correspond plus généralement à une excitation sur plusieurs longueurs d'onde. Cela correspondra par exemple à une configuration où les trois systèmes optiques n'émettent pas nécessairement chacun une lumière de même longueur d'ondes. Dans tous les cas, les photodétecteurs réalisent une addition optique des signaux lumineux.
Avantageusement, le ou les photodétecteurs sont reliés à des moyens de traitement de données aptes à déduire la mesure de photoluminescence à partir des données reçues en provenance du ou des photodétecteurs.
Dans une mise en œuvre, l'élément de capture d'extinction est relié à un photodétecteur, lui-même relié à des moyens de traitement de données aptes à déduire une mesure d'absorbance et/ou de diffraction à partir des données reçues en provenance du photodétecteur. Selon une caractéristique particulière de l'invention, les éléments de capture des faisceaux d'émission et/ou d'extinction sont des fibres optiques de section circulaire ou rectangulaire.
Selon une autre caractéristique particulière de l'invention, les sources de lumière incluent une diode électroluminescente de faible cohérence spatiale couplée à un élément optique destiné à rendre homogène le faisceau d'excitation.
Avantageusement, l'élément optique est un conducteur de lumière, par exemple une fibre optique.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la cuve de mesure a une section polyédrique dans le plan où sont placés les systèmes optiques, le polyèdre étant tel que ses faces soient perpendiculaires aux axes des systèmes optiques.
Dans le cas où trois systèmes optiques placés à des angles réguliers autour de la cuve sont utilisées, la cuve présente donc une section triangulaire équilatérale.
Dans un autre mode de réalisation, la cuve de mesure est cylindrique. Avantageusement, chaque système optique inclut des moyens de correction d'aberration pour corriger les aberrations introduites par la géométrie de la cuve de mesure sur les différents faisceaux. Dans une application particulièrement avantageuse de l'invention, le fluide est un fluide biologique.
Dans cette application, un dispositif selon l'invention peut être utilisé pour la détection et le comptage d'éléments biologiques marqués en fluorescence. Les applications sont multiples dans le domaine de la cytométrie de flux notamment et plus particulièrement pour l'identification et la numération de cellules biologiques dans des échantillons de sang périphérique ou encore de moelle osseuse ou bien tout autre liquide biologique. L'invention concerne également un procédé de mesure de photoluminescence et de mesure d'absorbance et/ou de diffraction dans un fluide présent dans une cuve de mesure, caractérisé en ce que le fluide dans la cuve de mesure reçoit simultanément au moins deux faisceaux d'excitation en provenance de deux systèmes optiques comprenant chacun une source de lumière de faible cohérence spatiale envoyant ledit faisceau d'excitation vers la cuve de mesure selon un axe dit du système et un élément de capture destiné à recevoir un faisceau d'émission de fluorescence centré sur l'axe du système en provenance du fluide, lesdits systèmes optiques étant positionnés pour que leurs axes fassent entre eux un angle obtus non nul et distinct de 180° autour de la cuve de mesure, ladite mesure de photoluminescence étant déduite d'un couplage de données obtenues à partir des faisceaux d'émission capturés simultanément par les éléments de capture. Selon l'invention, les systèmes optiques étant positionnés de telle manière qu'il existe un faisceau de recouvrement partiel entre le faisceau d'excitation de la source d'un premier système optique et le faisceau d'émission capté par l'élément de capture d'au moins un second système optique, au moins une lumière à la longueur d'onde de l'excitation est captée dans le faisceau de recouvrement partiel par au moins un élément de capture dit d'extinction placé au voisinage d'au moins une des sources, une mesure d'absorbance et/ou de diffraction étant déduite de données obtenues à partir de la lumière captée par l'élément de capture d'extinction.
Brève description des dessins
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description faite ci-dessous, en référence aux dessins annexés qui en illustrent un exemple de réalisation dépourvu de tout caractère limitatif. Sur les figures :
- la figure 1 représente un dispositif de mesure de photoluminescence tel que connu de l'art antérieur ; - la figure 2 est un schéma de principe d'un dispositif de mesure d'une photoluminescence selon l'invention ;
- la figure 3 représente le profil de l'intensité du champ de lumière dans la direction horizontale dans la cuve de mesure d'un dispositif selon la figure 2 ; - la figure 4 donne des exemples de caractéristiques spectrales de filtres et de lame dichroïque tels qu'implémentés dans un dispositif selon la figure 2 ;
- la figure 5 représente les spectres d'absorption, trait plein, et d'émission, trait pointillé, en fluorescence du colorant thiazole ;
- la figure 6 illustre en trois dimensions le volume analysé par un dispositif de mesure de photoluminescence selon l'invention ;
- la figure 7 représente en perspective un premier mode de réalisation d'un dispositif de mesure d'une photoluminescence selon l'invention ;
- la figure 8 représente des moyens de correction des aberrations dues à la géométrie de la cuve de mesure ; - la figure 9 représente le coefficient de transmission du faisceau d'émission en fonction de l'angle d'incidence sur une interface verre/air ;
- la figure 10 représente en perspective un second mode de réalisation d'un dispositif de mesure de plusieurs photoluminescences selon l'invention ;
- les figures lia, 11b et lie présentent plusieurs positionnements pour un élément de capture d'extinction dans un dispositif selon l'invention ;
- les figures 12a et 12b représentent les faisceaux de recouvrement, respectivement dans une cuve triangulaire et en perspective ;
- la figure 13 explicite schématiquement le principe des mesures d'absorption et de diffraction selon l'invention ; - la figure 14 illustre le résultat observé en sortie d'une fibre optique utilisée comme élément de capture d'extinction ;
- la figure 15 représente les spectres d'absorption, en trait plein, et d'émission, en trait pointillé, en fluorescence du colorant Phycoérythrine Cyanine 5 ; - la figure 16 est un diagramme sur lequel sont portées les caractéristiques d'une population de réticulocytes mesurées grâce à un dispositif selon la figure 2. Description détaillée d'un mode de réalisation
La figure 2 représente schématiquement un dispositif de mesure de photoluminescence dans une cuve de mesure cylindrique CM selon l'invention. Ce dispositif comprend trois systèmes optiques Ca, Cb, Cc semblables et chacun centré sur un axe Xa, Xb, Xc. Ces axes Xa, Xb, Xc font des angles non nuls et distincts de 180° entre eux. Dans l'exemple de réalisation préférentiel présenté sur la figure 1, les systèmes optiques Ca, Cb, Cc étant répartis régulièrement autour de la cuve de mesure CM ces angles sont identiques et égaux à 120°. Ce sont des systèmes optiques dits montages en épifluorescence, dans lesquels la même optique est utilisée pour l'émission et la réception de la lumière. Dans ces montages, les axes de la lumière émise vers la cuve de mesure et de la lumière reçue en provenance de la cuve de mesure sont confondus.
Etant donné la similitude des systèmes optiques Ci, i=a, b ou c, mis en œuvre, par commodité, on ne reprendra les indices i=a, b ou c dans la description qu'aux endroits où leur utilisation est nécessaire à la compréhension.
Dans les figures, seul le schéma de principe de la figure 2 présente la totalité des références indexées.
Chaque système optique Ci, comprend une source Si, pour émettre un faisceau d'excitation, schématisé en trait plein, vers la cuve de mesure CM, et un élément de capture CEi, pour capter des faisceaux d'émission de fluorescence, partiellement schématisés en trait pointillé, coaxiaux au faisceau d'excitation le long de l'axe Xi.
Dans un mode de réalisation avantageux car notamment peu coûteux, les sources Si sont des diodes électroluminescentes de forte brillance et de faible cohérence spatiale.
On sait que les diodes électroluminescentes de forte brillance sont des circuits intégrés qui comportent, sur leurs surfaces, des zones inhomogènes dues à la présence de contacts électriques servant à l'alimentation en courant de la jonction à semiconducteur. Le faisceau obtenu n'est alors pas homogène et réaliser la projection de l'image de la diode dans un volume de mesure ne permet pas de faire une discrimination précise des objets microscopiques analysés. Ainsi, en particulier, dans le domaine des analyses biologiques, on ne peut pas obtenir d'analyseurs hématologiques donnant des résultats corrects avec un tel faisceau d'excitation d'homogénéité médiocre.
Comme illustré sur la figure 2, les diodes électroluminescentes Si sont donc avantageusement couplées avec un élément optique EOi dont la fonction est de rendre homogène le champ de lumière d'excitation. L'élément optique EOi est avantageusement un conducteur de lumière, par exemple une fibre optique, ou un élément optique spécifique comme un transformateur de faisceau optique non imageur. Par exemple, des fibres à gradient ou à saut d'indice, à section circulaire ou rectangulaire peuvent être utilisées.
Pour réaliser le couplage entre la source Si et l'élément optique EOi, la zone émissive du circuit intégré comportant la diode peut être placée sur la face d'entrée de l'élément optique conducteur de lumière EOi. Un tel couplage est économique et simple à réaliser. Comme la température du circuit intégré peut atteindre des valeurs supérieures à 10O0C, il est judicieux d'utiliser des matériaux supportant de telles températures, par exemple de la silice.
Autrement, il est possible d'utiliser des conducteurs de lumière EO en plastique en insérant une optique spécifique, telle qu'une lentille boule en verre, en silice ou en rubis synthétique, entre le conducteur de lumière EO et le circuit intégré. On note d'ailleurs que la lentille boule peut encore améliorer l'homogénéité du champ de lumière d'excitation en plaçant, par exemple, le circuit intégré dans le plan focal de la lentille boule. Dans de telles conditions, le conducteur de lumière EO est éclairé en faisceau parallèle, chaque point de la source émettant une onde couplée dans la fibre. La divergence du faisceau d'excitation en sortie d'un conducteur de lumière EO est donnée par son ouverture numérique qui, dans le cas d'une fibre optique, est une fonction de la différence d'indice entre la partie guidante et la gaine qui l'enveloppe.
Par exemple, le conducteur de lumière EO est une fibre optique en silice de diamètre 940 μm et d'ouverture numérique 0,22. La puissance couplée dans chaque fibre est de 1,5 mW soit un total de 4,5 mW dans la cuve de mesure CM. La fibre optique est placée en contact avec une diode électroluminescente de marque OSRAM (type Golden Dragon) alimentée par un courant de 2 000 mA. Dans cet exemple, l'alimentation en courant du circuit intégré pouvant être bien au delà des données constructeur, il est judicieux de prévoir des moyens pour refroidir la jonction en particulier lorsque le faisceau d'excitation est utilisé en mode d'éclairage continu. Un circuit de refroidissement composé d'un radiateur de faible résistance thermique accolé à un élément à effet Peltier est par exemple implémenté dans un dispositif selon l'invention.
A bilan photométrique équivalent, le refroidissement peut être évité quand la source de lumière est utilisée en régime d'impulsions déclenchées par un moyen auxiliaire tel un signal d'extinction optique ou un transducteur d'impédance électrique du type de celui dit à effet Coulter.
Des mesures d'extinction ou électrique, par exemple une mesure en résistif ou impédance, sont alors effectuées en amont du dispositif de mesure de photoluminescence selon l'invention dans le sens d'écoulement du flux de fluide dans la cuve de mesure CM. Sur la figure 2, ce sens d'écoulement est perpendiculaire au plan de la figure. De cette façon, quand un convertisseur analogique-numérique des faisceaux d'émission est déclenché par une mesure du type impédance, le déclenchement des faisceaux d'excitation est avantageusement retardé du temps de parcours de l'objet microscopique détecté pour aller du capteur d'impédance au point de mesure optique situé au point de mesure M.
Ce temps est connu puisqu'il est donné par le rapport de la distance entre les deux points de mesure divisé par la vitesse v du flux de fluide qui est elle- même connue car contrôlée. Le déplacement du flux est lui même assuré par un système hydraulique auxiliaire au montage comprenant un moteur pas à pas ou un vérin pneumatique non représenté sur les figures.
Dans chaque système optique Ci, le faisceau d'excitation issu du conducteur de lumière EOi est rendu parallèle par une optique de collimation LIi.
Ce faisceau d'excitation est avantageusement ensuite filtré par un élément de filtrage FIi qui est un filtre passe bande défini par le ou les spectres d'absorption du ou des composés fluorescents à détecter.
Le faisceau filtré est ensuite envoyé sur un filtre dichroïque DCi, qui est un filtre passe haut dont la fonction est de réfléchir le faisceau d'excitation en direction de la cuve de mesure CM et de transmettre les faisceaux d'émission de fluorescence venant de la cuve de mesure CM le long de l'axe du montage en épifluorescence vers un photodétecteur PD via un filtre F2i et un élément de capture CEi. Des optiques L2i permettent ensuite d'imager la face de sortie des fibres optiques EOi dans la cuve de mesure CM. La figure 3 représente un profil normalisé de l'intensité IL du champ de lumière centré au point M dans la direction horizontale tel qu'obtenu dans la cuve de mesure CM. On observe une bonne homogénéité spatiale sur la largeur du point M qui est, là, de 300 μm. Cela est notamment dû à l'utilisation de faisceaux d'excitation à grande ouverture numérique. La figure 4 décrit un exemple de caractéristiques spectrales, en l'occurrence des gains G en fonction de la longueur d'onde, pour les filtres Fl et F2 et pour la lame dichroïque DC dans une application destinée à la mesure d'objets microscopiques colorés au moyen du colorant thiazole orange ou tout autre colorant ayant les mêmes caractéristiques spectrométriques. Un tel colorant, dont les propriétés d'absorption, en trait plein, et de fluorescence, en trait pointillé, sont représentées sur la figure 5, est par exemple utilisé pour le comptage différentiel des réticulocytes qui est une des applications majeures de l'invention. Il est également possible de détecter avec l'invention des cellules nucléées ou d'autres éléments biologiques. Ainsi que schématisé sur la figure 5, l'excitation est réalisée dans une bande étroite centrée sur 488 nm et la mesure de fluorescence est réalisée sur une bande de 30 nm centrée sur 530 nm.
Ainsi, sur la figure 4, le filtre Fl est centré à la longueur d'onde d'excitation de 470 nm avec une largeur de 15 nm, le filtre F2 est centré à la longueur d'onde d'émission de fluorescence de 540 nm avec une largeur de 20 nm. Le filtre F2 est mono canal. Cependant lorsque l'on souhaite mesurer plusieurs fluorescences, un filtre multi canaux est avantageusement utilisé. Le filtre dichroïque DC a un front de montée très rapide passant de sa transmission minimale à sa transmission maximale sur 10 nm environ. C'est un filtre passe haut laissant passer les longueurs d'onde d'émission de fluorescence et réfléchissant les longueurs d'onde d'excitation. De tels filtres sont par exemple disponibles chez les fabricants OMEGA ou SEMROCK.
Par ailleurs, il est connu que plus la puissance lumineuse envoyée dans la cuve de mesure CM est importante, plus les phénomènes fluorescents vont être importants. Le grandissement Gr de l'ensemble optique constitué par les combinaisons optiques Ll et L2 est alors un paramètre déterminant de cette puissance.
En effet, avec un conducteur de lumière EO de section rectangulaire (a x b), l'image projetée dans la chambre de comptage présente une taille de
(a/Gr)x(b/Gr). En notant P la puissance optique lumineuse dans un conducteur de lumière unique, la densité de puissance au niveau de la face de sortie du conducteur de lumière EO est alors P/(a x b).
Au niveau de l'image, la focalisation du faisceau d'excitation produit une densité de puissance égale à P Gr2 / (a x b), c'est à dire que la densité de puissance est Gr2 fois plus importante qu'au niveau de la face de sortie du conducteur de lumière EO.
On aura donc intérêt à ce que le grandissement Gr soit le plus grand possible et il est donc avantageux que les combinaisons optiques L2 présentent de grandes ouvertures numériques.
Avec le dispositif de la figure 2, basé sur l'utilisation de trois systèmes optiques placées à 120 degrés l'un de l'autre, chaque objet microscopique du volume de mesure perçoit trois faisceaux d'excitation, bénéficiant ainsi d'une triple excitation des fluorochromes. En considérant une excitation du volume de mesure par un seul faisceau d'excitation, les lumières de fluorescence étant isotropes, des faisceaux d'émission de fluorescence sont collectés par les trois combinaisons optiques L2a, L2b, L2c. Dans chaque système optique Ci, le faisceau d'émission est alors transmis au travers de la lame dichroique DCi puis filtré à l'aide du filtre F2i. Le faisceau d'émission est alors focalisé à l'aide de la combinaison optique L3i vers l'élément de capture CEi.
Les éléments de capture CEa, CEb, CEc sont avantageusement des conducteurs de lumière, par exemple des fibres optiques, dont une extrémité est placée au centre focal des lentilles L3a L3b, L3c et l'autre extrémité est orientée vers une surface sensible d'un photodétecteur unique PD, qui peut être un photomultiplicateur, une photodiode simple ou à effet d'avalanche. Le photodétecteur PD reçoit simultanément les faisceaux d'émission en provenance des trois éléments de capture CEa, CEb et CEc et réalise alors la somme des énergies lumineuses captées par les fibres optiques CEa, CEb, CEc.
Puisque le dispositif selon l'invention permet de disposer de trois faisceaux d'excitation simultanés, ce raisonnement s'applique sur chaque faisceau d'excitation. Finalement, le gain en sensibilité par rapport à un montage de l'art antérieur comme celui représenté sur la figure 1 est donc de (32)=9.
La quantité de lumière collectée par cet ensemble est donc plus importante que la somme des quantités lumineuses collectée par chaque système prises séparément, et ce dès que deux systèmes optiques sont utilisés selon les principes de l'invention.
En outre, comme dans tous les dispositifs selon l'invention, les faisceaux d'excitation dans le dispositif selon la figure 2 sont désaxés l'un par rapport à l'autre car les montages en épifluorescence font un angle obtus non nul et distinct de 180°. Cette configuration évite un recouvrement total des faisceaux d'excitation et d'émission ce qui minimise la lumière de fond de scène, principale source de bruit au niveau du photodétecteur PD.
En considérant l'utilisation d'une cuve de section carrée avec quatre systèmes optiques se faisant face de part et d'autre de la cuve de mesure, on dispose de quatre faces opposées pour illuminer l'objet microscopique à analyser et, donc, stimuler la fluorescence. Cependant, cette configuration n'est pas favorable car il existe un recouvrement de 100 % entre les faisceaux d'excitation et d'émission, avec pour conséquence immédiate un taux de lumière parasite plus important que dans un dispositif selon l'invention. Une telle lumière parasite induit une composante continue Ib et un bruit photoélectrique aléatoire caractérisé par une variance σ2 = 2 q Ib B où q est la charge de l'électron et B est la bande passante du circuit de réception.
On note que plus Ib est petit, plus le dispositif de mesure sera discriminant. Or, Ib est minimisé dans les dispositifs selon l'invention car les faisceaux d'excitation ne se recouvrent pas ou ne se recouvre que partiellement.
Avantageusement, le dispositif de la figure 2 comporte en outre des filtres spatiaux D, par exemple de simples trous d'épingle, placés au devant des éléments de capture CE. Ce filtrage a pour effet d'éliminer certains signaux indésirables, comme par exemple des réflexions parasites sur les parois de la cuve de mesure CM. Il contribue ainsi à la diminution de la composante Ib et donc à l'amélioration du rapport signal sur bruit.
Un tel filtrage spatial a aussi pour fonction de réduire le volume de mesure v centré en M, lequel est défini par l'intersection des faisceaux d'excitation. La figure 6 présente un tel volume de mesure v dans le cas de conducteurs de lumière OE circulaires. Ce volume v correspond à l'ensemble des intersections des trois faisceaux d'excitation placés à 120° selon le principe présenté sur la figure 2. La figure 7 représente, en perspective, un premier mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention dans lequel est utilisée une cuve de mesure CM triangulaire. La cuve de mesure CM est alors telle que ses faces sont perpendiculaires aux axes Xa, Xb, Xc des systèmes optiques Ca, Cb et Cc situés à 120° les uns des autres. Dans chaque système Ci, une lame dichroïque DC est placée à 45 degrés à l'intersection des faisceaux d'excitation et d'émission et présente les caractéristiques de transmission spectrale présentée sur la figure 4.
Le mode de réalisation présenté sur la figure 7 est adapté à la détection et au comptage d'une unique longueur d'onde de fluorescence et utilise trois systèmes optiques Ca, Cb et Cc selon les principes de l'invention. Ce dispositif peut être utilisé notamment pour la détection et le comptage de réticulocytes dans des échantillons de sang total périphérique. Sur cette figure, le passage d'objets microscopiques dans le plan d'illumination des systèmes optiques est figuré par une succession de billes alignées traversant la cuve de mesure CM. Dans ce mode de réalisation, les trois faisceaux d'émission sont captés par trois éléments de capture CEa, CEb, CEc, qui sont des conducteurs de lumière conjugués sur un seul photodétecteur PD. Chaque faisceau d'émission est filtré spectralement au moyen d'une lame dichroïque DC et de filtres interférentiels, non représentés et préférentiellement positionnés entre les lames dichroïques DC et les combinaisons optiques L3.
Dans une variante, le filtrage spectral est assuré par un filtre interférentiel positionné entre les trois arrivées des éléments de capture CEa, CEb, CEc et le détecteur photosensible PD. Dans ce mode de réalisation où la cuve de mesure est triangulaire, il est avantageux que chaque système optique Ca, Cb, Cc comprenne des moyens de corrections des aberrations optiques introduites par le dioptre épais constitué par chaque face de la cuve de mesure CM. Ainsi, la combinaison optique L2 est avantageusement corrigée des aberrations géométriques liées d'une part à la grande ouverture numérique du faisceau qui peut être supérieure à 0,6, et d'autre part à la traversée de dioptres épais, notamment le dioptre de la cuve de mesure CM et l'épaisseur de fluide traversé jusqu'au point de mesure M.
On sait en effet que divers types d'aberrations, appelées aberrations géométriques, sont responsables d'une diminution de la densité de puissance au point de mesure M. L'aberration sphérique ou aberration de sphéricité est la principale aberration qui doit être ici corrigée. La géométrie de la cuve de mesure
CM étant fixée, plusieurs solutions peuvent être mises en œuvre pour la correction de l'aberration de sphéricité selon les connaissances de l'homme du métier.
La figure 8 montre un exemple de réalisation d'une correction mettant en œuvre un train de lentilles de cambrures et d'indices de réfraction choisis, l'intervalle entre deux lentilles étant aussi un paramètre dimensionnant.
Sur cette figure 8, la correction est réalisée pour une cuve de mesure CM de section triangulaire équilatérale. Elle est une association de trois dioptres plans par exemple composés d'une paroi en verre de 2,5 mm et de 1,5 mm de silice.
Ainsi, dans l'exemple proposé sur la figure 7, la combinaison optique Ll est un doublet achromatique qui minimise l'aberration de chromatisme à 488 nm, la combinaison optique L2 est composé d'un train de quatre lentilles composé d'un doublet accolé incluant les dioptres de la figure 8. Enfin, la combinaison optique L3 est une lentille plan convexe.
On note que des optiques asphériques peuvent également être utilisées pour réaliser des corrections d'aberrations semblables ou d'autres sortes. Les optiques décrites corrigent les aberrations géométriques et chromatiques introduites par la traversée des dioptres épais constitués par la paroi de verre de la cuve et l'épaisseur d'eau comprise entre la paroi de la cuve de mesure CM et le passage des objets microscopiques, par exemple les cellules, au point M.
Le faisceau d'excitation traverse alors une première interface air/verre puis une seconde interface verre/eau qui réduisent la quantité de lumière d'un facteur égal à la transmission de Fresnel aux interfaces considérées.
Un traitement multi diélectrique peut être utilisé pour minimiser la réflexion de la lumière aux interfaces considérées. La figure 9 présente le coefficient de transmission du faisceau d'émission en fonction de l'angle d'incidence sur l'interface matériau-air en fonction de l'angle d'incidence pour un indice de matériau de n= 1,46 à la longueur d'onde de 488 nm.
On constate que le phénomène de réflexion totale limite l'ouverture numérique du faisceau d'émission. Si n est l'indice de réfraction de la paroi transparente de la cuve de mesure, l'angle de réflexion limite l'angle géométrique à la valeur θ tel que sin θ = 1/n. On remarque donc ici que l'utilisation d'une cuve de mesure cylindrique ou sphérique, comme schématisée sur la figure 2, permet de limiter les aberrations introduites par la géométrie de la cuve de mesure CM.
On note en outre que l'ensemble optique constitué des combinaisons optiques Ll et L2 peut être optimisé en corrigeant, en plus des aberrations géométriques, l'aberration de chromatisme liée à la largeur du spectre de l'excitation. En outre l'ensemble optique constitué des combinaisons optiques L2 et L3 peut être optimisé en corrigeant le chromatisme lié, d'une part, au fait que les lumières de fluorescence sont centrées sur des longueurs d'onde décalées vers les hautes longueurs d'onde, et d'autre part au fait que la détection de ces lumières est réalisée sur une bande spectrale de largeur finie. II est ainsi utile d'optimiser les caractéristiques optiques des chemins des faisceaux d'excitation et d'émission en limitant, par exemple, les aberrations calculées sur l'axe et en bord de champ à moins de +/- 20 μm aux trois longueurs d'onde de base : 0,460 μm (bleu) 0,500 (vert) et 0,600 μm (rouge). Dans le dispositif de la figure 7, les faisceaux d'émission de fluorescence sont collectées par les trois éléments de capture CEa, CEb et CEc, qui sont des conducteurs de lumière rassemblés en un faisceau unique couplé à un détecteur photoélectrique PD, qui peut être un photomultiplicateur ou encore une photodiode à avalanche.
Ce photodétecteur PD réalise la somme des énergies lumineuses recueillies en provenance des trois fibres optiques. Un calcul de la fluorescence est alors effectué selon les connaissances de l'homme du métier, notamment après un étalonnage préalable du dispositif. Une mesure de la fluorescence générée dans le volume de mesure v est donc obtenue.
La figure 10 représente, en perspective, un second mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention adapté aux mesures de plusieurs longueurs d'onde de fluorescence d'un fluide dans une cuve de mesure CM.
Les objets microscopiques présents dans la cuve de mesure CM sont, ici encore, illuminés par les trois faisceaux d'excitation provenant des sources Si de trois systèmes Ca, Cb, Cc, via un filtrage au moyen d'un éventuel filtre spectral, non représenté et une lame séparatrice dichroïque DC. Dans chaque système optique Ci, la lame dichroïque DCi réfléchit la lumière issue de Si vers la cuve de mesure CM où L2i la concentre. Cette lame dichroïque DCi transmet en revanche les longueurs d'onde supérieures provenant des objets microscopiques illuminés, vers les éléments de capture CEa, CEb et CEc qui sont préférentiellement des conducteurs de lumière comme des fibres optiques.
Les trois éléments de capture CEa, CEb, CEc sont ensuite conjugués sur un ensemble de détection spectrométrique commun constitué, par exemple, d'un réseau de diffraction DG et de n photo détecteurs PDl à PDn. Les n photodétecteurs sont positionnés spatialement par rapport au réseau DG pour recueillir et mesurer chacun une bande de longueurs d'onde correspondante chacune à une des fluorescences cibles émises par les éléments biologiques passant dans la cuve CM. Ces photodétecteurs PDl à PDn peuvent être des détecteurs choisis parmi les photo diodes éventuellement à effet d'avalanche, par exemple agencées en ligne ou en barrette, les tubes photo multiplicateurs, les capteurs optiques multiples de type CCD par exemple organisés en matrice ou en ligne. Des intensités de fluorescence distinctes sont alors obtenues pour une pluralité de bandes de longueur d'onde distinctes. La présence de fluorescences à des longueurs d'ondes distinctes peut être due à des différences entre les particules détectées ou à la pluralité de longueur d'ondes utilisées lors de l'émission, cette pluralité engendrant des fluorescences à des longueurs d'ondes distinctes.
Un des avantages de cet ensemble de détection spectrométrique particulier est l'adaptabilité en longueurs d'onde de fluorescence, le dispositif pouvant être aisément utilisé pour détecter des particules de caractéristiques distinctes sans modification. En outre, le positionnement de chaque photodétecteur conditionne autant la longueur d'onde cible que la largeur de bande de la détection.
Dans une variante, les trois éléments de capture CEa, CEb, CEc sont conjugués sur un ensemble de détection constitué, par exemple, de lames séparatrices, éventuellement dichroïques répartissant le faisceau lumineux vers des photodétecteurs PDl à PDn.
Préalablement à la mesure, les faisceaux d'émission peuvent être filtrés au moyen de filtres interférentiels adaptés aux fluorophores utilisés.
Selon le mode de réalisation préférentiel de l'invention, au moins un des systèmes optiques, par exemple Ca sur la figure 2, inclut un élément de capture dit d'extinction DT placé à proximité de la source, ici Sa, du système concerné
Ca. Cet élément de capture d'extinction DT est destiné à capter des lumières ayant les mêmes propriétés en terme de longueurs d'onde que la source Sa. Ces lumières sont donc réfléchies par la lame dichroïque DC en provenance de la cuve CM vers la source Sa. L'élément de capture d'extinction DT est couplé à un photodétecteur PDT.
La figure 11 propose un certain nombre de positionnements possibles pour un élément de capture d'extinction DTa à proximité de la source Sa, figurée par la section de l'élément optique EOa assurant l'homogénéité du faisceau produit par la source Sa.
Un tel élément de capture d'extinction DT permet de visualiser les intersections des faisceaux d'excitation et d'émission, encore appelées faisceaux de recouvrement. Sur le plan géométrique, ces intersections correspondent à l'intersection de six cônes s'appuyant sur la pupille des optiques L2i et pointant au centre de la chambre de mesure CM ; ces volumes ou faisceaux de recouvrement FC sont représentés à la figure 12. Ils existent dès que l'ouverture numérique de la lentille L2 est suffisamment importante.
La figure 12a représente une coupe horizontale de la cuve de mesure CM sur laquelle sont indiqués les axes Xa, Xb et Xc des trois systèmes optiques Ca, Cb et Cc. Les faisceaux de recouvrement correspondant respectivement à l'excitation par le faisceau d'excitation du système optique Cb et Cc reçu par le système Ca sont notés FCb3 et FCc3. Cette notation est utilisée pour les autres faisceaux de recouvrement reçus par les systèmes Cb et Cc.
La figure 12b donne une représentation en trois dimensions de ces mêmes faisceaux de recouvrement.
L'existence de tels faisceaux de recouvrement est avantageusement exploitée pour faire une mesure de l'absorption et de la diffraction par les objets microscopiques présents dans la cuve de mesure. Les éléments de capture d'extinction DT sont destinés à capter la lumière de ces faisceaux.
Selon la figure lia, la section de l'élément optique EOa est rectangulaire et inscrite dans un carré dont la partie supérieure est exploitée pour placer une pluralité d'éléments de capture d'extinction DTa', pour recevoir des signaux révélateurs d'une absorption, et DTa", pour recevoir des signaux révélateurs d'une diffraction. En effet, l'utilisation de deux capteurs d'extinction rectangulaires DTa' placés de part et d'autre de la source Sa permet de capter les lumières des faisceaux de recouvrement puisque la géométrie de ces faisceaux est telle qu'ils sont localisés de part et d'autre du faisceau d'excitation. L'utilisation du capteur d'extinction central DTa" permet quant à lui de capter les lumières diffractés éventuelles. On note que, dans cet exemple, les sections des autres éléments optiques EOb, EOc pourront avantageusement être, quant à elles, carrées. Les figures 11b et lie décrivent deux autres positionnements d'un seul élément de capture DTa de section circulaire par rapport à la source Sa figurée par la section de l'élément optique EOa. La figure 13 explicite schématiquement le principe d'une mesure d'absorption et/ou de diffraction dans un dispositif de mesure de photoluminescence selon la figure 7. Pour l'explication, on considère que la cuve de mesure CM est éclairée par deux faisceaux d'excitation provenant des systèmes optiques Cb et Cc.
L'ouverture des faisceaux d'excitation en provenance des sources Sb et Sc est telle que des faisceaux de recouvrement FCb3 et FCc3 existent avec le faisceau d'émission du système Ca.
Le faisceau d'émission de la longueur d'onde de la fluorescence capté par le système Ca, non représenté, traverse la lame DCa sans être dévié alors que la lumière reçue en provenance des sources Sb et Sc constituant les faisceaux de recouvrement est déviée par la lame dichroïque DCa. Sur la figure 13, seuls ces faisceaux lumineux de recouvrement FCb3 et FCc3 de même longueur d'onde que les sources Sb et Sc sont représentés. Ils proviennent de la cuve de mesure CM et vont vers l'élément de capture d'extinction DTa via la lame dichroïque DCa.
L'élément de capture d'extinction DTa est avantageusement une fibre optique de section circulaire.
En réalité, il existe deux types de faisceaux lumineux de même longueur d'onde que les sources Sb et Sc arrivant sur le ou les éléments de capture d'extinction DTa : ceux qui appartiennent à un faisceau de recouvrement FCb3 ou FCc3 et ceux qui n'y appartiennent pas.
Ceux qui n'appartiennent à aucun faisceau de recouvrement FC3 n'incluent que des rayons diffractés RD dans la cuve de mesure CM et sont révélateurs de la diffraction dans la cuve de mesure CM. Des rayons RD n'apparaîtront donc dans le secteur angulaire bordé par les faisceaux de recouvrement FCb3 et FCc3 que lorsqu'un objet microscopique aura diffracté la lumière d'excitation dans la cuve de mesure CM.
Ceux qui appartiennent à un faisceau de recouvrement FC3, par exemple celui FCc3 de la source Sc, incluent des rayons diffractés en provenance d'une des sources Sb, Sc, voire même Sa quand cette dernière est active, et les rayons du faisceau de recouvrement en provenance de la source Sc et ayant traversé la cuve de mesure CM sans déviation ni absorption. En conséquence, les rayons d'un faisceau de recouvrement sont révélateurs partiellement de la diffraction mais aussi de l'absorption puisqu'une extinction due à un objet microscopique absorbant sera visible dans les secteurs angulaires définis par un faisceau de recouvrement. Un des avantages de l'invention est la possibilité de visualiser et d'exploiter les faisceaux de recouvrement FC et les rayons diffractés RD dans le secteur angulaire bordé par les faisceaux de recouvrement FC.
Selon une caractéristique particulièrement avantageuse de l'invention, une fibre optique préférentiellement de section circulaire est utilisée pour réaliser l'élément de capture d'extinction DTa, lorsque celui-ci est unique. Les caractéristiques optiques d'une telle fibre optique permettent en effet d'exploiter les différences d'angles d'entrée dans la fibre optique des rayons appartenant et n'appartenant pas à un faisceau de recouvrement FCb3 ou FCc3. En effet, comme illustré sur la figure 13, les rayons des faisceaux de recouvrement FCb3 et FCc3 entrent dans la fibre avec un angle plus grand par rapport à l'axe de la fibre que ceux RD, diffractés, situés dans le secteur angulaire bordé par les faisceaux de recouvrement. Cette propriété angulaire est conservée le long de la fibre car les rayons des faisceaux de recouvrement vrillent le long de la fibre mais restent à proximité de la ligne de saut d'indice ou de gradient d'indice alors que les autres rayons diffractés entrés avec un angle plus petit par rapport à l'axe de la fibre se retrouvent dans toute la section de la fibre.
Aussi, comme illustré sur la section de fibre optique de la figure 14, en imageant la sortie de la fibre DTa sur un photodétecteur PDT multiélément, chaque élément visant une partie spécifique de la section de la fibre DTa, on constate que le contour CNT de la fibre DTa est lumineuse en permanence et subit une extinction au moment du passage d'un objet microscopique, cette extinction étant due à l'absorption par cet objet. La lumière alors observée sur le contour CNT est révélatrice de l'absorption et partiellement de la diffraction qui n'a pas de raison d'être nulle dans les secteurs angulaires des faisceaux de recouvrement.
On constate aussi que le centre CTR de la fibre DTa ne s'éclaire qu'au passage d'un objet microscopique, signant la diffraction de la lumière par cet objet. En considérant que la diffraction est isotrope, il est possible, en connectant le photodétecteur PDT à des moyens de traitement, de déduire son intensité à la lumière observée sur le contour de la fibre optique afin d'obtenir une valeur de l'absorption.
Dans le cas où plusieurs éléments de capture d'extinction sont utilisés par exemple selon la configuration de la figure lia, c'est la présence et l'intensité d'une lumière en sortie des capteurs DTa' qui détermine les mesures d'absorption et la présence et l'intensité d'une lumière en sortie du capteur DTa" qui détermine les mesures de diffraction.
Une telle utilisation des faisceaux de recouvrement est particulièrement intéressante pour différencier des cellules biologiques en fonction de leurs caractéristiques d'absorption et/ou de diffraction. En particulier, de telles mesures d'extinction peuvent servir à l'étude cytologique pour laquelle elles s'interprètent comme des informations morphologiques ou chimiques.
Afin de mieux maîtriser l'isotropie de la diffraction il pourra être utile de rendre les cellules les plus sphériques possibles en utilisant des agents chimiques.
Les exemples de dispositifs selon l'invention décrits permettent donc la mesure de photoluminescences cellulaires sensibles dans la mesure où chaque objet microscopique, par exemple biologique traversant la cuve de mesure CM, reçoit la conjugaison de trois faisceaux lumineux de même longueur d'onde et la lumière réémise par fluorescence est mesurée par un procédé utilisant des montages en épifluorescence, les trois épifluorescences étant conjuguées dans un seul et même photodétecteur pour chaque longueur d'onde de fluorescence considérée. Dans la suite est donné une procédure de différenciation et de comptage d'éléments biologiques notamment marqués au moyen d'anticorps ou autres composés fluorescents à l'aide de mesure de photoluminescence selon l'invention.
Comme évoqué auparavant, l'identification et le comptage différentiel d'éléments biologiques se fait couramment en cytométrie de flux. Pour ce faire l'échantillon de sang est incubé avec des anticorps spécifiques des éléments biologiques à identifier. Ces anticorps sont conjugués à des marqueurs, le plus souvent des fluorochromes. Ces fluorochromes sont généralement choisis pour identifier chaque anticorps spécifiquement et la mesure d'un fluorochrome correspond donc à l'identification de l'anticorps sur lequel il est conjugué. Il est ainsi possible d'identifier plusieurs anticorps différents en mesurant autant de longueurs d'ondes différentes. Dans le dispositif décrit sur la figure 10, il est possible de mesurer plusieurs longueurs d'onde différentes. Il est ainsi possible de mesurer au moins autant d'anticorps ou de marquages spécifiques que de longueurs d'onde.
Il existe une très grande quantité d'applications de ces principes. Il est décrit ici un principe générique pouvant s'adapter à tout marquage de cytométrie de flux.
Le spectre de la figure 5, déjà présentée, est celui du thiazole orange. Il peut également s'appliquer au colorant Fluorescéine Iso ThyoCyanate (FITC) très couramment utilisé en conjugaison à un anticorps.
La figure 15 décrit un autre colorant, le tandem Phycoérythrine Cyanine 5, également couramment utilisé en cytométrie de flux. Ces deux colorants peuvent être utilisés pour identifier au moins deux anticorps différents dans le dispositif décrit.
Afin d'effectuer l'analyse des éléments biologiques avec un dispositif tel que décrit sur l'une des figures 7 et 10, les étapes suivantes doivent être effectuées :
- Mélange d'une aliquote de sang total, par exemple 50 mm3, avec les anticorps conjugués spécifiques des éléments biologiques ciblés.
- Incubation de la solution à l'abri de la lumière,,par exemple 20 min, le temps nécessaire au complet marquage des éléments biologiques et ainsi à la coloration des substances intra cellulaires.
- Injection de la solution d'éléments biologiques ainsi obtenue dans la cuve de mesure CM de telle manière que les éléments biologiques passent successivement et unitairement au centre M de la cuve CM afin d'interagir avec la lumière illuminant cette zone. Avantageusement la cuve CM est agencée de manière à mesurer séquentiellement sur tous les éléments la traversant, leur volume par la méthode d'impédancemétrie tel que décrit dans le brevet FR 2,653,885. ^
- Mesures successives et pour chaque élément biologique traversant la cuve CM de son volume par impédancemétrie et de sa fluorescence.
Les mesures peuvent être réalisées sur une seule longueur d'onde ou sur une pluralité en fonction du dispositif utilisé et des marqueurs utilisés. Les étapes précédemment présentées ont été effectuées pour la différenciation et le comptage de réticulocytes avec le dispositif de la figure 7. Les réticulocytes sont des formes jeunes des érythrocytes ou globules rouges. Ils sont caractérisés par la présence intracytoplasmique de réticulums constitués d'ARN. Ces traces sont le restant de l'expulsion du noyau lors de son passage du stade érythroblaste au stade réticulocyte au sein de la moelle osseuse. Environ vingt quatre heures après cette expulsion, les réticulocytes passent de la moelle osseuse dans le sang. Dans le sang périphérique où leur présence n'excède pas quarante huit heures, les ribosomes se dégradent pour transformer le réticulocyte en érythrocyte mature. La durée de vie moyenne d'un globule rouge étant de 120 jours, le taux de régénération normal doit donc être de 0,83 %. Le pourcentage moyen normal généralement accepté est entre 0,5 et 1,5 %, ces valeurs étant plus élevées chez le nourrisson de moins de 3 semaines (de 2 à 6%). L'observation et la numération des réticulocytes est donc un indicateur de l'activité érythropoïétique et ainsi un paramètre particulièrement utile notamment dans le suivi de la reprise médullaire après une chimiothérapie, dans le suivi de traitement par érythropoïétine recombinante (rHuEpo), dans le bilan exploratoire d'une anémie ou encore dans la recherche d'une hémolyse ou hémorragie compensée.
Pour la mesure de la fluorescence des réticulocytes, l'étape de dilution de l'échantillon de sang total est réalisée à l'aide d'un réactif contenant du Thiazole Orange, notamment tel que décrit dans le brevet FR 2,759,166.
Les résultats des mesures de fluorescence et de volume sont reconstitués et avantageusement agencés pour permettre le comptage absolu et différentiel des éléments biologiques observés. II est alors possible d'extraire le nombre d'érythrocytes et le nombre et pourcentage de réticulocytes sur la base de la fluorescence de l'ARN intracellulaire. II est aussi possible de calculer un index d'immaturité des réticulocytes (IRF) sur la base de la répartition des éléments en fonction de leur fluorescence. Les éléments les plus fluorescents étant considérés comme les plus jeunes.
La figure 16 est un diagramme sur lequel sont portées les résultats obtenus grâce à l'invention : la population de réticulocytes est placée sur le diagramme en fonction de leur volume cellulaire VC en μm3 mesuré par impédancemétrie en abscisses et en ordonnées, l'intensité IF du signal de fluorescence picoWatts.
Dans l'esprit de l'invention, plusieurs variantes et mises en œuvres apparaîtront évidentes à l'homme du métier.
Bien que décrite dans une configuration particulièrement avantageuse avec trois systèmes optiques, l'invention peut être mise en œuvre avec des nombres variés de systèmes optiques, à partir de deux et décalées par paires d'un angle non nul et distinct de 180°. En particulier, avec de telles caractéristiques selon l'invention, il est possible d'exploiter les faisceaux de recouvrement ainsi que décrit et revendiqué. Outre les propriétés de fluorescence également mesurées, une telle propriété est très utile pour discriminer des objets microscopiques distincts.
On constate que dans le cas où le nombre de systèmes excède trois, il est nécessaire qu'au moins deux systèmes optiques fassent un angle non obtus, l'invention nécessitant néanmoins qu'au moins une paire de systèmes optiques fassent entre eux un angle obtus, indépendamment des autres systèmes optiques. Une telle caractéristique est en particulier nécessaire pour observer un faisceau de recouvrement et donc mettre en œuvre une mesure d'absorption et/ou de diffraction selon l'invention.
Pour certaines applications particulières, il peut aussi être envisagé de varier les longueurs d'onde des sources Sa, Sb, Sc. Il serait ainsi possible d'illuminer les objets microscopiques traversant la cuve de mesure CM avec un faisceau d'excitation comportant deux ou plusieurs gammes de longueurs d'onde ou avec des faisceaux d'excitation de longueurs d'ondes distinctes et de mesurer individuellement les épifluore'scences en résultant.
Il peut aussi être envisagé de séparer les éléments de capture CEa, CEb, CEc afin de, soit les conjuguer par deux, soit les connecter individuellement ^
chacun sur un photodétecteur adapté. En outre, il est possible d'utiliser divers autres moyens de détection lumineuse dans un dispositif selon l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif pour une mesure de photoluminescence et une mesure d'absorbance et/ou de diffraction dans un fluide présent dans une cuve de mesure [CM] comprenant au moins deux systèmes optiques [Ci, i=a,b,c] incluant chacun une source [Si] de lumière de faible cohérence spatiale envoyant un faisceau d'excitation vers la cuve de mesure [CM] selon un axe [Xi] dit du système [Ci] et un élément de capture [CEi] d'un faisceau d'émission de photoluminescence centré sur l'axe du système [Xi], lesdits systèmes optiques [Ci] fonctionnant simultanément et étant positionnés pour que leurs axes [Xi] fassent entre eux un angle obtus non nul et distinct de 180° autour de la cuve de mesure [CM], ladite mesure de photoluminescence étant déduite d'un couplage de données obtenues à partir des faisceaux d'émission capturés simultanément par les éléments de capture [CEi], les systèmes optiques [Ci] étant en outre positionnés de telle manière qu'il existe au moins un faisceau de recouvrement partiel [FCb3] entre le faisceau d'excitation de la source [Sb] d'un premier système optique [Cb] et le faisceau d'émission capté par l'élément de capture [CEa] d'un second système optique [Ca], le dispositif est en outre muni d'au moins un élément de capture [DTa] dit d'extinction au voisinage d'au moins une des sources [Sa] pour capter une lumière à la longueur d'onde de l'excitation dans le faisceau de recouvrement partiel [FCb3], une mesure d'absorbance et/ou de diffraction étant déduite de données obtenues à partir de la lumière captée par l'élément de capture d'extinction [DTa].
2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un nombre impair de systèmes optiques [Ci] positionnés pour que, par paire, leurs axes [Xi] fassent entre eux des angles obtus non nuls et distincts de 180° autour de la cuve de mesure [CM].
3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que les systèmes optiques [Ci] sont positionnés pour que leurs axes [Xi] fassent entre eux des angles identiques autour de la cuve de mesure [CM].
4. Dispositif selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce qu'il comprend trois systèmes optiques [Ci] positionnés autour de la cuve de mesure [CM] de telle manière que leurs axes [Xi] fassent entre eux des angles identiques autour de la cuve de mesure [CM].
5. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les éléments de capture [CEi] du faisceau d'émission sont reliés à un même photodétecteur [PD] ou à un même ensemble de photodétecteurs [PDl, PDn].
6. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que le ou les photodétecteurs [PD] est(sont) relié(s) à des moyens de traitement de données aptes à déduire la mesure de photoluminescence à partir des données reçues en provenance du ou des photodétecteurs [PD].
7. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'élément de capture d'extinction [DTa] est relié à un photodétecteur [PDT], lui-même relié à des moyens de traitement de données aptes à déduire une mesure d'absorbance et/ou de diffraction à partir des données reçues en provenance du photodétecteur [PDT].
8. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les éléments de capture des faisceaux d'émission [CEi] et/ou d'extinction [DT] sont des fibres optiques de section circulaire ou rectangulaire.
9. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les sources de lumière [Si] incluent une diode électroluminescente de faible cohérence spatiale couplée à un élément optique [EOi] destiné à rendre homogène le faisceau d'excitation.
10. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'élément optique [EOi] est un conducteur de lumière.
11. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la cuve de mesure [CM] a une section polyédrique dans le plan où sont placés les systèmes optiques [Ci], le polyèdre étant tel que ses faces soient perpendiculaires aux axes des systèmes optiques [Ci].
12. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la cuve de mesure [CM] est cylindrique.
13. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque système optique [Ci] inclut des moyens de correction d'aberration pour corriger les aberrations introduites par la géométrie de la cuve de mesure [CM] sur les différents faisceaux.
14. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le fluide est un fluide biologique.
15. Procédé de mesure de photoluminescence et de mesure d'absorbance et/ou de diffraction dans un fluide présent dans une cuve de mesure selon lequel le fluide dans la cuve de mesure reçoit simultanément au moins deux faisceaux d'excitation en provenance de deux systèmes optiques comprenant chacun une source de lumière de faible cohérence spatiale envoyant ledit faisceau d'excitation vers la cuve de mesure selon un axe dit du système et un élément de capture destiné à recevoir un faisceau d'émission de photoluminescence centré sur l'axe du système en provenance du fluide, lesdits systèmes optiques étant positionnés pour que leurs axes fassent entre eux un angle non nul et distinct de 180° autour de la cuve de mesure, ladite mesure de photoluminescence étant déduite d'un couplage de données obtenues à partir des faisceaux d'émission capturés simultanément par les éléments de capture, le procédé étant tel que, les systèmes optiques étant positionnés de telle manière qu'il existe un faisceau de recouvrement partiel entre le faisceau d'excitation de la source d'un premier système optique et le faisceau d'émission capté par l'élément de capture d'au moins un second système optique, au moins une lumière à la longueur d'onde de l'excitation est captée dans le faisceau de recouvrement partiel par au moins un élément de capture dit d'extinction placé au voisinage d'au moins une des sources, une mesure d'absorbance et/ou de diffraction étant déduite de données obtenues à partir de la lumière captée par l'élément de capture d'extinction.
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