WO2003010523A1 - Dispositif et procede de mesure d'un echantillon par spectroscopie par correlation - Google Patents

Dispositif et procede de mesure d'un echantillon par spectroscopie par correlation Download PDF

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WO2003010523A1
WO2003010523A1 PCT/FR2002/002696 FR0202696W WO03010523A1 WO 2003010523 A1 WO2003010523 A1 WO 2003010523A1 FR 0202696 W FR0202696 W FR 0202696W WO 03010523 A1 WO03010523 A1 WO 03010523A1
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optical
photonic structure
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Hervé RIGNEAULT
Pierre-François LENNE
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J3/457—Correlation spectrometry, e.g. of the intensity

Definitions

  • the present invention relates to a device and a method for measuring a sample by correlation spectroscopy.
  • Fluorescence correlation spectroscopy consists in observing the fluorescence emitted by a very small volume of a sample comprising a liquid medium in which a set of particles to be analyzed is placed. This volume is defined by the interaction between an excitation light beam and the sample and is known as the "collection volume". On average, only a very small number of fluorescent particles are included in this collection volume. The number of particles also varies statistically around this average value either by thermal diffusion in the case of a static liquid or by collective displacement in the case of a moving liquid. The variable number of fluorescent particles in the collection volume results in variations in the fluorescence intensity over time.
  • a confocal microscope comprising an optical focusing system receives a light beam emitted by a laser and focuses it on a sample.
  • This microscope comprises a pinhole camera placed in an intermediate image plane so that the microscope combines the focusing plane of the excitation beam with the variable aperture of the pinhole camera.
  • the collection volume is therefore limited to a very small sample volume.
  • the collection of luminescence is limited by the numerical aperture of the optical focusing system of the microscope used. This collection defines the signal measured by molecule and fixes the integration time (duration of the measurement) to obtain an exploitable signal. The number of particles in the collection volume being very low, the data acquisition times are very long.
  • the objective of the present invention is therefore to propose an optical device and a measurement method, simple in their design and in their operating mode allowing the measurement of a sample by correlation spectroscopy in a short time by significant increase in the collected signal. by molecule on the one hand and allowing, on the other hand, to solve the problem of the definition of the volume of collection.
  • the invention relates to a device for measuring a sample by correlation spectroscopy comprising a confocal microscope comprising an optical focusing system whose field defines a collection volume, means capable of producing an excitation beam and directing it onto the sample through the microscope, means for detecting the intensity of the light flux produced by the interaction of the excitation beam on the sample and collected by the microscope, means for processing the signal produced by the detection means.
  • the device comprises a photonic structure increasing the collected luminous flux, placed at the focal point of the optical focusing system of the microscope or combined with this focal point by an optical element and forming interference fringes in the collection volume.
  • the present invention also relates to the characteristics which will emerge during the description which follows and which will have to be considered in isolation or according to all their technically possible combinations: - the photonic structure is a dielectric mirror resistant to water, the dielectric mirror comprises a stack of layers of Ta 2 0 5 and of Si ⁇ 2 ,
  • the photonic structure is a water-resistant metal mirror
  • the metal mirror is made of aluminum
  • the metallic mirror is in silver
  • the photonic structure has a reflection coefficient r of at least 99% for the excitation beam and the light flux produced by the interaction
  • the means for directing said excitation light beam comprise an optical device for reflecting the light beam coming from the light source towards the optical focusing system of the microscope, said optical device having a maximum transmission factor ⁇ for the light flux produced by the interaction of the excitation beam on the sample
  • the optical device for reflecting the light beam coming from the light source is a dichroic mirror placed at 45 ° from the incident beam, - the light source is a laser.
  • the invention also relates to a method for measuring a sample by correlation spectroscopy in which a collection volume is delimited by the field of a confocal microscope comprising an optical focusing system.
  • a photonic structure increasing the light flux collected is placed at the focal point of the optical focusing system of the microscope or combined with this focal point by an optical element to form interference fringes in the collection volume,
  • FIG. 1 is a schematic representation of a device for measuring a sample, according to the invention, in which a photonic structure is placed at the focus of the optical focusing system of the microscope (Fig. la) or conjugate of this focus by an optical element (Fig. lb);
  • FIG. 2 is a theoretical study demonstrating the existence of a diffusion time associated with the presence of fringes created by a photonic structure:
  • FIG. 2a) represents the theoretical diffusion curve expected from Cyanine 5 in the absence of interference fringes and
  • FIG. 2b) represents the correlation function g 2 as a function of time, in the presence of interference fringes;
  • FIG. 3 is an example of implementation of the invention for the diffusion in aqueous solution of microspheres
  • Crimson It represents the correlation function g 2 as a function of time obtained experimentally in two distinct cases: in the absence of a photonic structure (absence of interference fringes) (Fig. 3a) and in the presence of such a structure ( presence of interference fringes) (Fig. 3b);
  • the device for measuring a sample by correlation spectroscopy comprises a confocal microscope 1.
  • sample 2 means a liquid, gaseous medium or biological object containing particles 3 to be analyzed.
  • the confocal microscope 1 is an arrangement comprising a microscope comprising an optical system focusing 4 and a pinhole 5 having a variable aperture 6 placed in an intermediate image plane so that the microscope combines the focusing plane 7 of an excitation beam 8 with the variable aperture 6 of the pinhole 5.
  • the volume of collection 9 created by the interaction between the excitation beam 8 and the sample 2 is it restricted to a very small volume of the sample 2.
  • This collection volume 9 is placed in the focusing plane 7 of the optical system focusing 4.
  • the focusing optical system 4 is a lens.
  • the focusing optical system 4 is a lens.
  • the excitation beam 8 is emitted by a light source 10.
  • This source 10 is advantageously a laser.
  • the device also comprises means 1 1 able to direct the excitation beam 8 on the sample 2 through the microscope.
  • These means 11 for directing said excitation light beam 8 comprise lenses and an optical device 12 for reflecting the light beam 8 coming from the light source 10 towards the focusing optical system 4 of the microscope.
  • the interaction of the excitation beam 8 with the sample 2 creates a collection volume 9.
  • Each particle 3 of interest which diffuses into the collection volume 9 emits by fluorescence a luminous flux 13.
  • the focusing optical system 4 of the microscope also makes it possible to collect the luminous flux 13 resulting from the interaction of the excitation beam 8 with the sample 2.
  • This luminous flux 13 is sent to means of detection 14 through the microscope.
  • the optical device 12 has, in a preferred embodiment, a maximum transmission factor ⁇ for the light flux 13 produced by the interaction of the excitation beam 8 on the sample 2.
  • the optical device 12 is advantageously a dichroic mirror and band pass placed at 45 ° to the incident beam. In one embodiment, the bandwidth is centered on a wavelength ⁇ i so as to transmit the light flux 13 produced by the interaction of the excitation beam 8 on the sample 2 but to block the excitation light flux 8.
  • the means of detection 14 of the intensity of the light flux 13 produced by the interaction of the excitation beam 8 on the sample 2 and collected by the microscope include in one embodiment photodetectors. These photodetectors are advantageously photodiodes operating in an avalanche regime.
  • the signal from the detection means 14 is sent to signal processing means 15. These means 15 advantageously include a counter and a correlator 16 which makes it possible to process the data received.
  • the device also comprises means 17 for precise positioning of said sample 2. In one embodiment, these positioning means 17 comprise a set of translation plates (x, y, z) making it possible to move the sample 2 relative to the plane focal 7 of the focusing optical system 4 of the microscope.
  • the sample 2 is enclosed in a sealed box 18 whose side walls 19-22 are formed by self-adhesive shims of thickness d resistant to water.
  • the thickness d of these shims is between 50 and 100 ⁇ m.
  • the top of said box 18 advantageously comprises a microscope slide 23 of thickness d and of optical index n 0 .
  • the thickness d of the strip 23 is between 100 and 200 ⁇ m.
  • the device comprises a photonic structure 24 which is placed at the focal point 7 of the focusing optical system 4 of the microscope or combined with this focal point 7 by an optical element 29.
  • Said optical element 29 is for example a lens or an objective.
  • Interference fringes 25 are then created in the collection volume 9.
  • this photonic structure 24 has a reflection coefficient r of at least 99% for the excitation beam 8 and the light flux 13 produced by interaction.
  • the bottom of the box 18 enclosing the sample 2 is produced by a photonic structure 24.
  • This photonic structure is then placed in the focal plane 7 of the focusing optical system 4 of the microscope by displacement of the sealed box 18 thanks to the precision positioning means 17.
  • the sealed box 18 placed at said focal plane 7 advantageously comprises a transparent bottom which is for example a microscope slide 23.
  • the particles of interest 3 traveling in the interference fringes 25 will emit a light flux 13 whose duration depends on the interfringe.
  • the measurement device makes it possible to very precisely define this collection volume which is directly connected to the interfringe of the interference figure created and is equal to ( ⁇ / 2n) where ⁇ is the wavelength of the excitation light beam 8 and n middle index. This leads to the appearance of a diffusion time in the temporal correlation of the particles of interest 3 in the collection volume 9 depending only on the wavelength ⁇ of the excitation beam 8 used and on the diffusion coefficient. and / or of the speed v of the particles 3.
  • the photonic structure 24 makes it possible to enhance the light flux 13 produced by the interaction in the digital aperture of the focusing optical system 4. Thereby increases by a factor greater than two the light flux 13 collected per particle 3.
  • the enhancement of the light flux 13 corresponds to an increase in the collected flux coming from the source.
  • the photonic structure 24 is a water-resistant dielectric mirror.
  • the mirror 24 consists of a stack of 16 layers of type (HB) 15 B where H denotes a layer of Ta 2 0 5 of optical thickness ⁇ 0/4 and B a layer of Si0 2 of optical thickness .lambda.o / 4.
  • the mirror 24 is constituted in other embodiments and by way of examples, from a stack of layers taken from the following pairs: Ti0 2 / Si0 2 , Hf0 2 / Si0 2 .
  • ⁇ 0 is a control wavelength used during the manufacture of the dielectric mirror.
  • ⁇ 0 is adjusted so that the photonic structure 24 is reflective for the excitation beam 8 and for the light flux 13 produced by the interaction.
  • the photonic structure 24 is a water-resistant metal mirror.
  • the mirror is produced, by way of example, from a material chosen from aluminum (Al), silver (Ag) and tungsten (W).
  • Al aluminum
  • Ag silver
  • W tungsten
  • the invention cannot be limited to the above description and is subject to modification with the evolution of technology. Substitutions and / or modifications in the general structure and in the details of the present device can be carried out by a person skilled in the art without departing from the spirit of the present invention.
  • the particles 3 to be analyzed are not necessarily luminescent but in other embodiments have a reflecting power for the excitation light flux 8 (case of particle size).
  • the materials cited for producing the dielectric and metallic mirrors can vary without departing from the spirit of the present invention.
  • the invention also relates to a method for measuring a sample 2 by correlation spectroscopy in which a collection volume 9 is delimited by the field of a confocal microscope 1 comprising an optical focusing system 4.
  • the focusing optical system 4 is a lens.
  • the focusing optical system 4 is a lens.
  • a photonic structure 24 increasing the light flux 13 collected, is placed at the focal point 7 of the focusing optical system 4 of a microscope or is conjugated with this focal point 7 by an optical element 29, to form interference fringes 25 in the volume 9.
  • the said optical element 29 is either a lens or an objective.
  • Each particle of interest 3 which diffuses into the illuminated collection volume 9 emits a light flux 13 following its interaction with the excitation light flux 8.
  • the duration of this light flux 13 indicates the time spent by the particle 3 in the collection volume 9.
  • the intensity of the light flux 13 produced by the sample 2 is measured as a function of the microscope as a function time by means of photodetectors 14.
  • These photodetectors 14 are advantageously photodiodes operating in an avalanche regime.
  • a time autocorrelation of this intensity I (t) was therefore carried out to produce a correlation signal.
  • a first and second characteristic time of the correlation signal is then extracted and / or an analysis using frequency filtering
  • the frequency analysis is carried out by means of either a synchronous detection or a spectrum analyzer.
  • the correlation function makes it possible to determine the diffusion time ⁇ ⁇ i of the species of interest 3 and the number M of particles 3 in the collection volume 9. If we know the geometric characteristics of the collection volume 9, we can then determine the translational diffusion coefficient D and / or the speed v and the number of molecules M.
  • the diffusion coefficient and / or the speed v are of the parameters making it possible to distinguish the different species 3 emitting a light flux 13 in solution (free or linked ligands for example).
  • volume of collection 9 is Gaussian with spatial extension of the type
  • w t denotes the transverse waist (respectively longitudinal).
  • the measurement method according to the invention has been the subject of several implementations presented in the following examples and showing the quality of the results obtained.
  • FIG. 3 shows the correlation functions obtained in the absence (3a)) and in the presence of a photonic structure 24 (3b)). The curves have been adjusted (solid black lines 28) in order to deduce the time of diffusion X /. These adjustments were made using functions (1) and (2).
  • the abscissa axis 26 represents the time axis ( ⁇ s) and the ordinate axis 27 represents the correlation function g 2 .
  • the counting rate is increased by a factor of 3: for a power at the focal point of lMwatt / cm 2 , the counting rate per molecule goes from 2.3 kHz in the absence of the photonic structure to 6.8 kHz in Her presence. This signal increase allows faster construction of the correlation function (saving time in the analysis).
  • the implementation of the device has been demonstrated for the measurement of the diffusion coefficient but it also applies to the measurement of the speed v of species traveling in the network of fringes with a directed movement.
  • This device can be used to measure the speed of capillaries or microfluidic microstructures in which the molecules acquire a speed under the effect of an electric field or a pressure gradient.
  • the time correlation function or another quantity allowing the analysis of intensity fluctuations (with frequency filtering) could be used to detect the presence of species of different speed (giving rise to different characteristic travel times) with a power increased separator.

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Abstract

L'invention concerne un dispositif et un procédé de mesure d'un échantillon (2) par spectroscopie par corrélation. Le dispositif comprend un microscope confocal (1) comportant un système optique de focalisation (4) dont le champ (7) définit un volume de collection (9). Une source de lumière (10) produit un faisceau d'excitation (8) qui est envoyé vers des moyens (11) aptes à le diriger sur l'échantillon (2) au travers du microscope. Le dispositif de mesure comporte également des moyens de détection (14) de l'intensité du flux lumineux (13) produit par l'interaction du faisceau d'excitation (8) sur l'échantillon (2) et collecté par le microscope et des moyens de traitement (15) du signal produit par lesdits moyens de détection (14). Une structure photonique (24) augmentant le flux lumineux (13) collecté, est placée au foyer (7) du système optique de focalisation (4) du microscope ou conjuguée de ce foyer (7) par un élément optique (29), pour former des franges d'interférence (25) dans le volume de collection (9).

Description

Dispositif et procédé de mesure d'un échantillon par spectroscopie par corrélation
La présente invention concerne un dispositif et un procédé de mesure d'un échantillon par spectroscopie par corrélation.
La spectroscopie par corrélation de fluorescence ("Fluorescence corrélation spectroscopy"-FCS) consiste en l'observation de la fluorescence émise par un très petit volume d'un échantillon comprenant un milieu liquide dans lequel est placé un ensemble de particules à analyser. Ce volume est défini par l'interaction entre un faisceau lumineux d'excitation et l'échantillon et est connu sous le terme de "volume de collection" . En moyenne, seulement un nombre très faible de particules fluorescentes se trouvent comprises dans ce volume de collection. Le nombre de particules varie d'ailleurs statistiquement autour de cette valeur moyenne soit par diffusion thermique dans le cas d'un liquide statique soit par déplacement collectif dans le cas d'un liquide en mouvement. Le nombre variable de particules fluorescentes dans le volume de collection se traduit par des variations de l'intensité de fluorescence avec le temps.
Dans la spectroscopie FCS, un microscope confocal comprenant un système optique de focalisation reçoit un faisceau lumineux émis par un laser et le focalise sur un échantillon. Ce microscope comprend un sténopé placé dans un plan intermédiaire image de sorte que le microscope conjugue le plan de focalisation du faisceau d'excitation avec l'ouverture variable du sténopé. Ainsi le volume de collection est-il restreint à un très petit volume de l'échantillon. L'obtention de grandeurs physiques liées aux particules à analyser (coefficient de diffusion D ou vitesse v de l' espèce d'intérêt relié au temps de diffusion τd observé, concentration liée au nombre M de particules dans le volume de collection) nécessite un calibrage précis de ce volume de collection. Or, ce calibrage est réalisé par l'emploi de solutions de référence et fluctue dans le temps et d'une machine sur l'autre. D' autre part, la collection de la luminescence est limitée par l' ouverture numérique du système optique de focalisation du microscope utilisé. Cette collection définie le signal mesuré par molécule et fixe le temps d'intégration (durée de la mesure) pour obtenir un signal exploitable. Le nombre de particules dans le volume de collection étant très faible, les temps d'acquisition des données sont très longs.
L' objectif de la présente invention est donc de proposer un dispositif optique et un procédé de mesure, simples dans leur conception et dans leur mode opératoire permettant la mesure d'un échantillon par spectroscopie par corrélation en un temps court par augmentation significative du signal collecté par molécule d'une part et permettant, d'autre part, de résoudre le problème de la définition du volume de collection. A cet effet, l'invention concerne un dispositif de mesure d'un échantillon par spectroscopie par corrélation comprenant un microscope confocal comportant un système optique de focalisation dont le champ définit un volume de collection, des moyens aptes à produire un faisceau d'excitation et à le diriger sur l'échantillon au travers du microscope, des moyens de détection de l'intensité du flux lumineux produit par l'interaction du faisceau d'excitation sur l'échantillon et collecté par le microscope, des moyens de traitement du signal produit par les moyens de détection. Selon l'invention, le dispositif comporte une structure photonique augmentant le flux lumineux collecté, placée au foyer du système optique de focalisation du microscope ou conjuguée de ce foyer par un élément optique et formant des franges d'interférence dans le volume de collection. Dans différents modes de réalisation possibles, la présente invention concerne également les caractéristiques qui ressortiront au cours de la description qui va suivre et qui devront être considérées isolément ou selon toutes leurs combinaisons techniquement possibles : - la structure photonique est un miroir diélectrique résistant à l' eau, - le miroir diélectrique comprend un empilement de couches en Ta205 et en Siθ2,
- la structure photonique est un miroir métallique résistant à l'eau, - le miroir métallique est en aluminium,
- le miroir métallique est en argent,
- la structure photonique a un coefficient de réflexion r d'au moins 99% pour le faisceau d' excitation et le flux lumineux produit par l'interaction, - les moyens pour diriger ledit faisceau lumineux d' excitation comprennent un dispositif optique pour réfléchir le faisceau lumineux issu de la source de lumière vers le système optique de focalisation du microscope, ledit dispositif optique ayant un facteur de transmission τ maximal pour le flux lumineux produit par l'interaction du faisceau d'excitation sur l'échantillon,
- le dispositif optique pour réfléchir le faisceau lumineux issu de la source de lumière est un miroir dichroïque placé à 45° du faisceau incident, - la source de lumière est un laser.
L'invention concerne également un procédé de mesure d'un échantillon par spectroscopie par corrélation dans lequel un volume de collection est délimité par le champ d'un microscope confocale comportant un système optique de focalisation
Selon l' invention :
- une structure photonique augmentant le flux lumineux collecté, est placée au foyer du système optique de focalisation du microscope ou conjuguée de ce foyer par un élément optique pour former des franges d'interférence dans le volume de collection,
- on mesure l'intensité du flux lumineux produite par l'échantillon au travers du microscope en fonction du temps,
- on réalise une autocorrélation temporelle de cette intensité pour produire un signal de corrélation, - on extrait un premier et un deuxième temps caractéristique du signal de corrélation et/ou une analyse mettant en oeuvre du filtrage fréquentiel
• le premier temps dépendant du volume de mesure défini par le champ du microscope,
• le deuxième temps dépendant de l' interfrange des franges d' interférence,
- on produit la mesure à partir du deuxième temps caractéristique ou de l' analyse fréquentielle. L'invention sera décrite plus en détail en référence aux dessins annexés dans lesquels:
- la figure 1 est une représentation schématique d'un dispositif de mesure d'un échantillon, selon l' invention, dans lequel une structure photonique est placée au foyer du système optique de focalisation du microscope (Fig. l a) ou conjuguée de ce foyer par un élément optique (Fig. lb);
- la figure 2 est une étude théorique démontrant l'existence d'un temps de diffusion associé à la présence de franges créées par une structure photonique: Fig. 2a) représente la courbe de diffusion théorique attendue de la Cyanine 5 en l'absence de franges d'interférence et Fig. 2b) représente la fonction de corrélation g2 en fonction du temps, en présence de franges d'interférence;
- la figure 3 est un exemple de mise en œuvre de l'invention à la diffusion en solution aqueuse de microsphères
Crimson. Elle représente la fonction de corrélation g2 en fonction du temps obtenue expérimentalement dans deux cas distincts : en l'absence d'une structure photonique (absence de franges d'interférence) (Fig.3a) et en présence d'une telle structure (présence de franges d'interférence) (Fig. 3b);
Le dispositif de mesure d'un échantillon par spectroscopie par corrélation, selon l'invention, comprend un microscope confocal 1. On entend par - échantillon 2 - un milieu liquide, gazeux ou objet biologique contenant des particules 3 à analyser. Le microscope confocal 1 est un arrangement comprenant un microscope comportant un système optique de focalisation 4 et un sténopé 5 ayant une ouverture variable 6 placé dans un plan intermédiaire image de sorte que le microscope conjugue le plan de focalisation 7 d'un faisceau d'excitation 8 avec l' ouverture variable 6 du sténopé 5. Ainsi le volume de collection 9 crée par l'interaction entre le faisceau d'excitation 8 et l'échantillon 2 est-il restreint à un très petit volume de l'échantillon 2. Ce volume de collection 9 est placé dans le plan de focalisation 7 du système optique de focalisation 4. Dans un mode de réalisation, le système optique de focalisation 4 est un objectif. Dans un autre mode de réalisation, le système optique de focalisation 4 est une lentille.
Le faisceau d'excitation 8 est émis par une source de lumière 10. Cette source 10 est avantageusement un laser. Dans un mode de réalisation, cette source 10 est un laser He-Ne opérant à une longueur d'onde λ = 633nm. Le dispositif comprend également des moyens 1 1 aptes à diriger le faisceau d' excitation 8 sur l'échantillon 2 au travers du microscope. Ces moyens 11 pour diriger ledit faisceau lumineux d'excitation 8 comprennent des lentilles et un dispositif optique 12 pour réfléchir le faisceau lumineux 8 issu de la source de lumière 10 vers le système optique de focalisation 4 du microscope. Dans le plan focal 7 du système optique de focalisation 4 du microscope, l'interaction du faisceau d'excitation 8 avec l'échantillon 2 crée un volume de collection 9. Chaque particule 3 d'intérêt qui diffuse dans le volume de collection 9 émet par fluorescence un flux lumineux 13. Le système optique de focalisation 4 du microscope permet également de collecter le flux lumineux 13 résultant de l'interaction du faisceau d' excitation 8 avec l'échantillon 2. Ce flux lumineux 13 est envoyé vers des moyens de détection 14 au travers du microscope. Le dispositif optique 12 a, dans un mode de réalisation préféré, un facteur de transmission τ maximal pour le flux lumineux 13 produit par l'interaction du faisceau d' excitation 8 sur l'échantillon 2. Le dispositif optique 12 est avantageusement un miroir dichroïque et passe-bande placé à 45° du faisceau incident. Dans un mode de réalisation, la largeur de bande est centrée sur une longueur d' onde λi de façon à transmettre le flux lumineux 13 produit par l'interaction du faisceau d'excitation 8 sur l'échantillon 2 mais à bloquer le flux lumineux d'excitation 8. Les moyens de détection 14 de l'intensité du flux lumineux 13 produit par l'interaction du faisceau d'excitation 8 sur l'échantillon 2 et collecté par le microscope comprennent dans un mode de réalisation des photodétecteurs. Ces photodétecteurs sont avantageusement des photodiodes fonctionnant en régime d'avalanche. Le signal issu des moyens de détection 14 est envoyé vers des moyens de traitement 15 du signal. Ces moyens 15 comportent avantageusement un compteur et un corrélateur 16 qui permet de traiter les données reçues. Le dispositif comprend également des moyens de positionnement 17 précis dudit échantillon 2. Dans un mode de réalisation, ces moyens de positionnement 17 comportent un ensemble de platines de translation (x, y, z) permettant de déplacer l' échantillon 2 par rapport au plan focal 7 du système optique de focalisation 4 du microscope.
L'échantillon 2 est enfermé dans une boîte étanche 18 dont les parois latérales 19-22 sont formées par des cales autocollantes d'épaisseur d résistantes à l'eau. L' épaisseur d de ces cales est comprise entre 50 et 100 μm. Le sommet de ladite boite 18 comporte avantageusement une lamelle de microscope 23 d' épaisseur d et d'indice optique n0. L'épaisseur d de la lamelle 23 est comprise entre 100 et 200 μm.
Le dispositif comporte une structure photonique 24 qui est placée au foyer 7 du système optique de focalisation 4 du microscope ou conjuguée de ce foyer 7 par un élément optique 29. Ledit élément optique 29 est par exemple une lentille ou un objectif. Des franges d'interférence 25 sont alors créées dans le volume de collection 9. Dans un mode de réalisation préféré, cette structure photonique 24 a un coefficient de réflexion r d'au moins 99% pour le faisceau d'excitation 8 et le flux lumineux 13 produit par l'interaction. Dans un mode de réalisation, le fond de la boîte 18 enfermant l' échantillon 2 est réalisé par une structure photonique 24. Cette structure photonique est alors placée au plan focal 7 du système optique de focalisation 4 du microscope par déplacement de la boite étanche 18 grâce aux moyens de positionnement de précision 17. Lorsque la structure photonique 24 est conjuguée du plan focal 7 du système optique de focalisation 4 par un élément optique 29, la boite étanche 18 placée audit plan focal 7 comporte avantageusement un fond transparent qui est par exemple une lamelle de microscope 23.
Les particules d'intérêt 3 voyageant dans les franges d'interférences 25 vont émettre un flux lumineux 13 dont la durée dépend de l'interfrange. Le dispositif de mesure permet de définir très précisément ce volume de collection qui est directement relié à l'interfrange de la figure d'interférence créée et vaut (λ/2n) où λ est la longueur d'onde du faisceau lumineux d'excitation 8 et n indice du milieu. Ceci conduit à l' apparition d'un temps de diffusion dans la corrélation temporelle des particules d'intérêts 3 dans le volume de collection 9 ne dépendant que de la longueur d'onde λ du faisceau d'excitation 8 utilisé et du coefficient de diffusion et/ou de la vitesse v des particules 3. D' autre part, la structure photonique 24 permet d'exalter le flux lumineux 13 produit par l' interaction dans l'ouverture numérique du système optique de focalisation 4. On augmente ainsi d'un facteur supérieur à deux le flux lumineux 13 collecté par particule 3. L'exaltation du flux lumineux 13 correspond à une augmentation du flux collectée provenant de la source.
Dans un premier mode de réalisation, la structure photonique 24 est un miroir diélectrique résistant à l'eau. Avantageusement, le miroir 24 est constitué d'un empilement de 16 couches de type (HB)15B où H désigne une couche de Ta205 d'épaisseur optique λ0/4 et B une couche de Si02 d'épaisseur optique λo/4. Le miroir 24 est constitué dans d' autres modes de réalisation et à titre d'exemples, à partir d'un empilement de couches prises parmi les couples suivants : Ti02/Si02, Hf02/Si02. λ0 est une longueur d'onde de contrôle utilisée lors de la fabrication du miroir diélectrique. λ0 est ajustée pour que la structure photonique 24 soit réfléchissante pour le faisceau d'excitation 8 et pour le flux lumineux 13 produit par l'interaction.
Dans un deuxième mode de réalisation, la structure photonique 24 est un miroir métallique résistant à l' eau. Le miroir est réalisé, à titre d' exemples, dans un matériau pris parmi l' aluminium (Al), l'argent (Ag) et le tungstène (W). L'invention ne saurait être limitée à la description qui précède et est susceptible de modifications avec l'évolution des technologies. Des substitutions et/ou des modifications dans la structure générale et dans les détails du présent dispositif peuvent être réalisées par un homme du métier sans s'écarter de l' esprit de la présente invention. Ainsi les particules 3 à analyser ne sont pas forcement luminescentes mais présentent dans d'autres modes de réalisation un pouvoir réfléchissant pour le flux lumineux d'excitation 8 (cas de la granulométrie). D' autre part, les matériaux cités pour réaliser les miroirs diélectriques et métalliques peuvent varier sans s'écarter de l' esprit de la présente invention.
L'invention concerne également un procédé de mesure d'un échantillon 2 par spectroscopie par corrélation dans lequel un volume de collection 9 est délimité par le champ d'un microscope confocal 1 comportant un système optique de focalisation 4. Dans un mode de réalisation, le système optique de focalisation 4 est une lentille. Dans un autre mode de réalisation, le système optique de focalisation 4 est un objectif. Une structure photonique 24 augmentant le flux lumineux 13 collecté, est placée au foyer 7 du système optique de focalisation 4 d'un microscope ou est conjuguée de ce foyer 7 par un élément optique 29, pour former des franges d' interférence 25 dans le volume de collection 9. Ledit élément optique 29 est soit une lentille soit un objectif. Chaque particule d'intérêt 3 qui diffuse dans le volume de collection 9 éclairé émet un flux lumineux 13 suite à son interaction avec le flux lumineux d' excitation 8. La durée de ce flux lumineux 13 indique le temps passé par la particule 3 dans le volume de collection 9. On mesure l'intensité du flux lumineux 13 produite par l'échantillon 2 au travers du microscope en fonction du temps au moyen de photodétecteurs 14. Ces photodétecteurs 14 sont avantageusement des photodiodes fonctionnant en régime d'avalanches.
Comme la diffusion des particules 3 est un processus aléatoire, les événements de diffusion doivent être moyennes pour fournir une information statistiquement fiable. C'est le rôle du corrélateur 16 qui construit la fonction de corrélation à partir de l' intensité I(t). Cette dernière s'écrit :
( ) = < I(t)I(t + τ) > g2 τ) < /(t) >2
On a donc réalisé une autocorrélation temporelle de cette intensité I(t) pour produire un signal de corrélation. On extrait ensuite un premier et un deuxième temps caractéristique du signal de corrélation et/ou une analyse mettant en oeuvre du filtrage fréquentiel
• le premier temps dépendant du volume de mesure défini par le champ du microscope,
• le deuxième temps dépendant de l'interfrange des franges d'interférence, On produit enfin la mesure à partir du deuxième temps caractéristique ou de l'analyse fréquentielle. L' analyse fréquentielle est réalisée au moyen soit d'une détection synchrone soit d'un analyseur de spectre.
Dans le cas d'un volume de collection confocal 9 sans structure photonique 24, la fonction de corrélation permet de déterminer le temps de diffusion τ<i de l'espèce d'intérêt 3 et le nombre M de particules 3 dans le volume de collection 9. Si l' on connaît les caractéristiques géométriques du volume de collection 9, on peut alors déterminer le coefficient de diffusion translationnel D et/ou la vitesse v et le nombre de molécules M. Le coefficient de diffusion et/ou la vitesse v sont des paramètres permettant de distinguer les différentes espèces 3 émettant un flux lumineux 13 en solution (ligands libres ou liés par exemple). Dans le cas d'un volume de collection 9 gaussien allongé dans la direction parallèle à l'axe optique, et en l'absence de mouvement dirigé des molécules on peut montrer que T = wt 2/4D où wt désigne l' extension transverse (waist) du faisceau d'excitation 8 dans le plan focal 7 du système optique de focalisation 4.
Une approche théorique a été développée pour démontrer l'existence d'un temps de diffusion Tf associée à la diffusion dans les franges 25, lesdites franges 25 étant produites par un microscope confocal 1 comportant une structure photonique 24.
Considérons en premier lieu que le volume de collection 9 est gaussien d'extension spatiale du type
Figure imgf000012_0001
où wt (respectivement Wi) désigne le waist transverse (respectivement longitudinal).
Dans le cas d'une diffusion brownienne sans structure photonique, la fonction de corrélation s'écrit
Figure imgf000012_0002
où M désigne le nombre moyen de particules 3 dans le volume de collection 9 et τd le temps de diffusion transverse (τd - wt 2/4D). La figure 2a) montre la courbe théorique attendue pour la diffusion de la Cyanine 5 (avec wt= 0,6 μm, wi = 6 μm et M=l). L' axe des abscisses 26 représente l'axe des temps (s) et l' axe des ordonnées 27 représente la fonction de corrélation g . Plaçons à présent dans le plan focal 7 du système optique de focalisation 4 du microscope une structure photonique 24. Ladite structure 24 réfléchit le faisceau lumineux d'excitation 8 et produit des franges d'interférences 25 d'interfrange λ/(2n) (λ longueur d'onde du faisceau lumineux d' excitation 8 et n l'indice du milieu), qui modulent longitudinalement la répartition d'intensité du volume de collection 9 confocal
Figure imgf000013_0001
Nous avons déterminé numériquement la fonction de corrélation résultant d'une telle modulation. La courbe numérique obtenue peut être ajustée à l'aide de la fonction :
g2(t) = 1 + * ((1+ A exp(-τ/τ/)) (2)
Figure imgf000013_0002
Cette expression fait clairement apparaître un temps de diffusion τ associé à la diffusion dans les franges 25 (Figure 2b)). On montre que :
Figure imgf000013_0003
Le procédé de mesure selon l'invention a fait l'objet de plusieurs mises en oeuvre présentées dans les exemples suivants et faisant ressortir la qualité des résultats obtenus.
EXEMPLE 1
Le procédé a été mis en oeuvre afin d'étudier par FCS la diffusion en solution aqueuse de microsphères fluorescentes de 100 nm de rayon (Crimson Molecular Probes FluoSpheres). Une source laser 10 He-Ne a été utilisée pour obtenir la fluorescence des microsphères Crimson (longueurs d'onde d' excitation/émission = 625/645 μm). La figure 3 montre les fonctions de corrélation obtenues en l'absence (3a)) et en présence d'une structure photonique 24 (3b)). Les courbes ont été ajustées (traits noirs pleins 28) afin d' en déduire le temps de diffusion X/. Ces ajustements ont été réalisés à l'aide des fonctions ( 1 ) et (2). L'axe des abscisses 26 représente l'axe des temps (μs) et l'axe des ordonnées 27 représente la fonction de corrélation g2. En l'absence de la structure photonique 24 (ou en sa présence si le plan focal 7 du système optique de focalisation 4 est "loin" de ladite structure 24 - quelques dizaines de μm) le temps de diffusion τ vaut 2,6 ms (à 0.1 ms près). En présence d'une structure photonique 24 et si le plan focal 7 du système optique de focalisation 4 est confondu avec la surface de ladite structure photonique 24, un second temps de diffusion X/ apparaît : X/ vaut 57 μs (à 5 μs près). Nous pouvons déduire de X/ le coefficient de diffusion des microsphères dans l' eau (n=l .33) :
J-' 'Revxnp ± 2μm2 / s
Figure imgf000014_0001
Ce résultat est en excellent accord avec la valeur donnée par la formule de Stokes, qui relie le coefficient de diffusion d'une sphère de rayon R à la viscosité du milieu et à l'énergie thermique :
Dth = kT
24,4μm2 / s.
6πηR
En outre les temps de diffusion xd et X/ sont dans le rapport attendu :
Figure imgf000014_0002
EXEMPLE 2
Cette seconde expérience démontre qu'il est possible d'utiliser une structure photonique pour étudier finement la diffusion de protéines. Une série d'expériences a été conduite sur la streptavidine marquée par la cyanine 5. Les résultats marquants sont les suivants.
Détection exaltée
- Le taux de comptage est augmenté par un facteur 3 : pour une puissance au point focal de lMwatt/cm2, le taux de comptage par molécule passe de 2,3 kHz en l' absence de la structure photonique à 6,8 kHz en sa présence. Cette augmentation de signal permet une construction plus rapide de la fonction de corrélation (gain de temps dans l'analyse).
Analyse de la diffusion
- En l' absence de la structure photonique 24 la fonction de corrélation présente deux temps caractéristiques : un est associé à' la diffusion de la streptavidine dans le volume confocal (xd=5700 μs), le second est lié aux propriétés photophysiques intrinsèques de la Cyanine 5 (état triplet et isomérisation xd = 18 μs).
- En présence de la structure photonique 24, la fonction de corrélation montre un troisième temps X/(x/ = 135 μs) associé aux franges d'interférences 25, qui peut être déterminé avec précision dès lors que le temps triplet est caractérisé. A nouveau, ces résultats présentent un bon accord avec la théorie :
Figure imgf000015_0001
La mise en oeuvre du dispositif a été démontrée pour la mesure du coefficient de diffusion mais elle s'applique également à la mesure de la vitesse v d'espèces voyageant dans le réseau de franges avec un mouvement dirigé. Ce dispositif pourra être mis à profit pour la mesure de vitesse des capillaires ou des microstructures en microfluidique dans lesquels les molécules acquièrent une vitesse sous l'effet d'un champ électrique ou un gradient de pression. La fonction de corrélation temporelle ou une autre grandeur permettant l' analyse des fluctuations d'intensité (avec filtrage fréquentiel) pourra être utilisée pour détecter la présence d'espèces de vitesse différentes (donnant lieu à des temps caractéristiques de déplacement différents) avec un pouvoir séparateur accru.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de mesure d'un échantillon (2) par spectroscopie par corrélation comprenant :
- un microscope confocal (1) comportant un système optique de focalisation (4) dont le champ définit un volume de collection (9),
- des moyens ( 10) aptes à produire un faisceau d'excitation (8) et à le diriger sur l'échantillon (2) au travers du microscope,
- des moyens de détection (14) de l'intensité du flux lumineux (13) produit par l'interaction du faisceau d'excitation
(8) sur l' échantillon (2) et collecté par le microscope,
- des moyens de traitement (15) du signal produit par les moyens de détection (14), caractérisé en ce qu'il comporte une structure photonique (24) augmentant le flux lumineux (13) collecté, placée au foyer (7) du système optique de focalisation (4) du microscope ou conjuguée de ce foyer (7) par un élément optique (29) et formant des franges d'interférence (25) dans le volume de collection (9).
2. Dispositif de mesure selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la structure photonique (24) est un miroir diélectrique résistant à l' eau.
3. Dispositif de détection selon la revendication 2, caractérisé en ce que le miroir diélectrique comprend un empilement de couches en Ta205 et en Si02.
4. Dispositif de détection selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la structure photonique (24) est un miroir métallique résistant à l' eau,
5. Dispositif de détection selon la revendication 4, caractérisé en ce que le miroir métallique est en aluminium,
6. Dispositif de détection selon la revendication 4, caractérisé en ce que le miroir métallique est en argent,
7. Dispositif de mesure selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la structure photonique (24) a un coefficient de réflexion r d'au moins 99% pour le faisceau d' excitation (8) et le flux lumineux (13) produit par l'interaction.
8. Dispositif de mesure selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les moyens (1 1) pour diriger ledit faisceau lumineux d'excitation (8) comprennent un dispositif optique (12) pour réfléchir le faisceau lumineux (8) issu de la source de lumière ( 10) vers le système optique de focalisation (4) du microscope, ledit dispositif optique (12) ayant un facteur de transmission x maximal pour le flux lumineux ( 13) produit par l'interaction du faisceau d' excitation (8) sur l'échantillon
(2).
9. Dispositif de mesure selon la revendication 8, caractérisé en ce que le dispositif optique (12) pour réfléchir le faisceau lumineux (8) issu de la source de lumière ( 10) est un miroir dichroïque placé à 45° du faisceau incident (8).
10. Dispositif de détection selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la source de lumière (10) est un laser.
1 1. Procédé de mesure d'un échantillon par spectroscopie par corrélation dans lequel un volume de collection (9) est délimité par le champ d'un microscope confocal (1) comportant un système optique de focalisation (4), caractérisé en ce que
- une structure photonique (24) augmentant le flux lumineux (13) collecté, est placée au foyer (7) du système optique de focalisation (4) du microscope ou conjuguée de ce foyer (7) par un élément optique (29), pour former des franges d'interférence (25) dans le volume de collection (9),
- on mesure l'intensité du flux lumineux (13) produite par l'échantillon (2) au travers du microscope en fonction du temps,
- on réalise une autocorrélation temporelle de cette intensité pour produire un signal de corrélation,
- on extrait un premier et un deuxième temps caractéristique du signal de corrélation et/ou une analyse mettant en oeuvre du filtrage fréquentiel • le premier temps dépendant du volume de mesure (9) défini par le champ du microscope,
• le deuxième temps dépendant de l'interfrange des franges d' interférence (25),
- on produit la mesure à partir du deuxième temps caractéristique ou de l'analyse fréquentielle.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7388213B2 (en) 2005-09-23 2008-06-17 Applied Materials, Inc. Method of registering a blank substrate to a pattern generating particle beam apparatus and of correcting alignment during pattern generation
US7625679B2 (en) 2005-09-23 2009-12-01 Applied Materials, Inc. Method of aligning a particle-beam-generated pattern to a pattern on a pre-patterned substrate
CN109923396A (zh) * 2016-11-07 2019-06-21 梅特里克斯微粒有限公司 在散射光模式及荧光模式中测量液体纳米颗粒的浓度、尺寸及z电位装置及方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7285789B2 (en) * 2003-06-06 2007-10-23 Oc Oerlikon Balzers Ag Optical device for surface-generated fluorescence
FR2954499B1 (fr) 2009-12-22 2012-02-03 Centre Nat Rech Scient Procede et systeme d'analyse moleculaire a commutation de mesures d'imagerie et de spectroscopie

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4545646A (en) * 1983-09-02 1985-10-08 Hughes Aircraft Company Process for forming a graded index optical material and structures formed thereby
US4621911A (en) * 1985-03-12 1986-11-11 Carnegie-Mellon University Standing wave luminescence microscopy
US5394268A (en) * 1993-02-05 1995-02-28 Carnegie Mellon University Field synthesis and optical subsectioning for standing wave microscopy
US5949532A (en) * 1996-07-31 1999-09-07 Basf Aktiengesellschaft Method and apparatus for Raman correlation spectroscopy
US6137584A (en) * 1996-11-27 2000-10-24 Max-Planck-Gesellschaft Zur Method and device for determining predetermined properties of target particles of a sample medium

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999002974A1 (fr) * 1997-07-10 1999-01-21 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Microscope a champ d'ondes, procede de microscopie a champ d'ondes servant egalement au sequençage d'adn et procede d'etalonnage utilise en microscopie a champ d'ondes

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4545646A (en) * 1983-09-02 1985-10-08 Hughes Aircraft Company Process for forming a graded index optical material and structures formed thereby
US4621911A (en) * 1985-03-12 1986-11-11 Carnegie-Mellon University Standing wave luminescence microscopy
US5394268A (en) * 1993-02-05 1995-02-28 Carnegie Mellon University Field synthesis and optical subsectioning for standing wave microscopy
US5949532A (en) * 1996-07-31 1999-09-07 Basf Aktiengesellschaft Method and apparatus for Raman correlation spectroscopy
US6137584A (en) * 1996-11-27 2000-10-24 Max-Planck-Gesellschaft Zur Method and device for determining predetermined properties of target particles of a sample medium

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRENT BAILEY, VIJAY KRISHNAMURTHI, AND FREDERICK LANNI: "Optical subsectioning and multiple focal-plane imaging in the standing-wave fluorescence microscope", PROCEEDINGS ANNUAL MEETING MICROSCOPY SOCIETY OF AMERICA - ANNUAL MEETING MICROBEAM ANALYSIS SOCIETY, XX, XX, 31 July 1994 (1994-07-31), pages 158 - 159, XP002085004 *
DREWEL M AND PUSEY P N: "Number fluctuation spectroscopy in standing-wave fringes.", OPTICA ACTA, vol. 30, no. 10, October 1983 (1983-10-01), UK, pages 1483 - 1500, XP008001561 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7388213B2 (en) 2005-09-23 2008-06-17 Applied Materials, Inc. Method of registering a blank substrate to a pattern generating particle beam apparatus and of correcting alignment during pattern generation
US7625679B2 (en) 2005-09-23 2009-12-01 Applied Materials, Inc. Method of aligning a particle-beam-generated pattern to a pattern on a pre-patterned substrate
CN109923396A (zh) * 2016-11-07 2019-06-21 梅特里克斯微粒有限公司 在散射光模式及荧光模式中测量液体纳米颗粒的浓度、尺寸及z电位装置及方法
CN109923396B (zh) * 2016-11-07 2021-11-12 梅特里克斯微粒有限公司 在散射光模式及荧光模式中测量液体纳米颗粒的浓度、尺寸及z电位装置及方法

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