FR2853072A1 - Dispositif de mesure de fluorescence d'une pluralite de zones a observer - Google Patents
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Abstract
Le dispositif comporte une source d'éclairage (8) en regard d'une face latérale d'un support (1), créant une onde évanescente sur la face avant du support, et un détecteur pour détecter la lumière émise par les zones à observer. Le support (1) comporte une pluralité de guides d'onde (10), disposés chacun sous une zone associée et comportant chacun une entrée de lumière agencée en regard de la source d'éclairage (8). La source d'éclairage (8) forme une pluralité de canaux de lumière (9) indépendants, programmables, éclairant chacun une seule entrée de lumière. Les canaux de lumière peuvent être constitués par des diodes électroluminescentes, des diodes laser, ou par multiplexage optique d'une source de lumière optique par l'intermédiaire de micro-miroirs, d'éléments à cristaux liquides ou d'un système de déflexion.
Description
Dispositif de mesure de fluorescence d'une pluralité de zones à observer
Domaine technique de l'invention L'invention concerne un dispositif de mesure de fluorescence d'une pluralité de zones à observer disposées sur une face avant d'un support, comportant une source d'éclairage, disposée en regard d'une face latérale du support et créant une onde évanescente sur la face avant du support, et des moyens de détection 10 de la lumière émise par les zones à observer.
État de la technique Les systèmes de lecture de bio-puces fluorescentes servent à déterminer la 15 présence de marqueurs biologiques sur chacune de différentes zones d'une puce par excitation optique et détection d'une lumière émise.
Un premier type de systèmes de lecture comporte des scrutateurs effectuant un déplacement de la source de lumière et/ou un déplacement du détecteur 20 nécessitant des composants mécaniques, acousto-optiques ou électro-optiques complexes et coûteux.
Un deuxième type de systèmes de lecture comporte une caméra de type CCD (<<CCD: charge coupled device ") et des moyens optiques de formation d'image 25 souvent fragiles, coûteux et encombrants. Ces systèmes nécessitent des caméras coûteuses pour des seuils de détection faibles.
Par ailleurs, ces types de systèmes se prêtent difficilement à la miniaturisation ainsi qu'à une production en grand nombre.
Un mode d'excitation de fluorescence particulier est l'excitation par une composante évanescente d'un champ électromagnétique à l'interface de deux milieux optiques ayant des indices de réfraction (n. et n2) différents. Un champ 5 évanescent est créé quand l'angle d'incidence d'une onde électromagnétique est supérieur à l'angle limite Oc de réflexion totale qui peut être exprimé à partir de la loi de Descartes par 0c=arcsin(n,/n2) , n2 étant l'indice du milieu dans lequel se propage le champ incident et n1 étant l'indice du milieu adjacent dans lequel les échantillons biologiques sont disposés. Au voisinage de cet angle limite, 10 l'amplitude du champ excitateur est plus forte qu'en épi-illumination, ce qui rend ce mode d'excitation particulièrement intéressant.
Une technique utilisant un simple mono-détecteur 4 (figure 1) consiste à éclairer complètement toutes les zones 3 d'un support 1 et à construire l'image de cette 15 surface point par point grâce à une matrice 7 à transparence programmable, par exemple une matrice de cristaux liquides (J.S. Lundgren et AI. <c A liquid crystal pixel array for signal discrimination in array biosensors ", Biosensors & Bioelectronics 15, 2000, 417-421). La source de lumière 2 est, par exemple, disposée en regard d'une face latérale du support 1, qui est ainsi éclairé par la 20 tranche (faisceaux incidents) de manière à ce qu'une onde évanescente soit créée à la surface avant du support. Cette technique présente pourtant un défaut pour les applications biologiques. En effet, les molécules fluorescentes sont photo-blanchies lorsqu'on les excite, c'est- à-dire qu'elles perdent leur capacité à convertir de la lumière d'une longueur d'onde en lumière d'une autre 25 longueur d'onde au bout d'un temps dépendant de la densité de puissance de lumière et des molécules. Les dernières zones sont lues après un temps d'éclairement supérieur à celui des premières zones et la différence d'intensité rend difficile une comparaison des différentes zones.
Afin d'éviter les différences de temps d'éclairement, une matrice à transparence programmable peut être disposée entre la source de lumière et les zones pour éclairer la surface point par point. Cependant, même en utilisant des optiques de collimation, la divergence du faisceau de lumière reste trop élevée pour 5 exclure l'excitation des zones voisines, conduisant d'une part à la photoextinction des zones sur-éclairées et d'autre part à la détection d'un signal fluorescent parasite.
Objet de l'invention L'invention a pour but de remédier à ces inconvénients et, plus particulièrement, de fournir un éclairage sélectif des différentes zones en évitant l'illumination parasite de zones voisines.
Selon l'invention, ce but est atteint par le fait que le support comporte une pluralité de guides d'onde, disposés chacun sous une zone à observer associée et comportant chacun une entrée de lumière agencée en regard de la source d'éclairage, la source d'éclairage formant une pluralité de canaux de lumière 20 indépendants, programmables, éclairant chacun une seule entrée de lumière.
Selon un développement de l'invention, les canaux de lumière sont constitués par un réseau de diodes électroluminescentes ou de diodes laser.
Selon un autre développement, les canaux de lumière sont constitués par multiplexage optique d'une source de lumière par l'intermédiaire de micromiroirs, chacun des micro-miroirs présentant une première position permettant de réfléchir un faisceau de lumière, issue de la source de lumière, vers une entrée de lumière et une deuxième position permettant d'écarter le faisceau de lumière de l'entrée de lumière.
Selon un autre développement, les canaux de lumière sont constitués par 5 multiplexage optique d'une source de lumière par l'intermédiaire d'éléments à cristaux liquides, présentant chacun un état transparent et un état opaque, chaque élément à cristaux liquides étant disposé entre une entrée de lumière correspondante et la source de lumière.
Selon un autre développement, les canaux de lumière sont constitués par multiplexage optique d'une source de lumière par l'intermédiaire d'un système de déflexion, présentant une pluralité d'états correspondant chacun à l'illumination d'une entrée de lumière.
Description sommaire des dessins
D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention 20 donnés à titre d'exemples non limitatifs et représentés aux dessins annexés, dans lesquels: La figure 1 représente un dispositif selon l'art antérieur.
Les figures 2 et 3 représentent un dispositif selon l'invention, respectivement de 25 profil et en coupe selon l'axe A-A.
Les figures 4 à 7 illustrent des modes de réalisation particuliers de la source d'éclairage du dispositif selon les figures 2 et 3.
La figure 8 illustre un dispositif selon l'invention comportant un système optique de collection de lumière et un système de mesure de lumière d'excitation.
La figure 9 représente un dispositif selon l'invention, dont le détecteur de lumière est disposé en regard de la face arrière du support.
Description de modes particuliers de réalisation.
A la figure 2, une source d'éclairage 8 est disposée en regard d'une face latérale du support 1, de manière à l'éclairer par la tranche. Le faisceau de lumière incident 9 crée une onde évanescente sur la face avant du support 10 permettant d'exciter un objet fluorescent, par exemple un échantillon biologique, disposé sur une zone 3 sur la face avant du support. La lumière 6 émise par les objets est détectée par un simple mono-détecteur 4, qui ne permet pas de distinguer spatialement les différentes zones.
Le support 1 représenté à la figure 3, comporte une pluralité de guides d'onde parallèles, disposés chacun sous une zone associée. Chaque guide d'onde comporte, sur la face latérale du support 1, une entrée de lumière agencée en regard de la source d'éclairage 8. La source d'éclairage comporte une pluralité de canaux de lumière indépendants programmables éclairant chacun une seule 20 entrée de lumière. Ainsi, le faisceau de lumière 9 d'un canal de lumière entre par l'entrée de lumière associée dans le guide d'onde correspondant et crée une onde évanescente sur la face avant du guide d'onde. Chaque guide d'onde 10 est disposé entre deux parois 11 ayant un indice de réfraction inférieur à l'indice de réfraction du guide d'onde 10. Ainsi, la lumière est soumise à des réflexions 25 totales à l'intérieur du guide d'onde 10 et ne peut pas être diffusée dans le plan du support 1 en dehors du guide d'onde. L'onde évanescente sur la face avant du support est alors délimitée latéralement par les parois 11. Cette onde guidée excite une seule zone sans risque d'excitation des zones voisines. Les différentes zones peuvent ainsi être illuminées une par une, et le signal 6 envoyé vers le détecteur correspond, à chaque instant, à la fluorescence d'une seule zone. Il est alors possible d'utiliser un mono-détecteur 4, l'origine de la fluorescence étant déterminée par le canal ou les canaux de lumière actifs.
Avantageusement les guides d'onde 10 sont parallèles entre eux, comme 5 représenté à la figure 3, mais ils peuvent également être disposés différemment, par exemple en éventail.
Comme représenté à la figure 4, les canaux de lumière de la source d'éclairage 8 peuvent être réalisés par un réseau de diodes 12, sous la forme d'un barreau 10 de diodes, par exemple des diodes laser ou des diodes électroluminescentes.
L'émission de chaque diode 12 est contrôlée par l'intermédiaire d'interrupteurs électroniques (non-représentés). Chaque diode activée 12 crée un faisceau de lumière 9 et, par conséquent, une onde évanescente sur le guide d'onde associé, tandis que les guides d'onde associés aux diodes 12' éteintes ne 1s reçoivent aucune lumière.
D'une autre manière, on peut utiliser une source de lumière unique et des moyens d'interruption du faisceau en direction des guides d'onde 10. Ainsi, selon un autre mode de réalisation particulier, représenté à la figure 5, la source 20 d'éclairage 8 comporte une source de lumière 14 unique et un réseau d'éléments à cristaux liquides 13 disposé entre les entrées de lumière du support 1 et la source de lumière 14. Chaque élément à cristaux liquides peut être dans un état transparent 13 ou dans un état opaque 13'. Ainsi, la source de lumière 14 illumine en permanence tous les éléments à cristaux liquides et seuls 25 les guides d'ondes correspondants aux éléments transparents 13 reçoivent un faisceau de lumière 9. Dans ce cas, les différents canaux de lumière sont formés par multiplexage optique de la source de lumière unique.
Selon une autre variante de réalisation particulière, représentée à la figure 6, la source d'éclairage 8 comporte une source de lumière 14 unique et une pluralité de micro-miroirs constituant un multiplexeur optique. Chacun des miroirs présente une première position 15 permettant de réfléchir un faisceau de 5 lumière, issu de la source de lumière 14, vers une entrée de lumière, et une deuxième position 15' permettant d'écarter le faisceau de lumière de l'entrée de lumière.
Selon une autre variante, représentée à la figure 7, la source de lumière 14, 10 comportant par exemple une diode laser, est munie d'un système de déflexion 22 du faisceau à travers une lentille 23, cette déflexion pouvant être assurée par un miroir galvanométrique ou par un déflecteur acousto- optique. A la figure 7, un faisceau de lumière 9, représenté en trait plein, correspond à un état particulier du système de déflexion 22 illuminant l'entrée de lumière d'un guide 15 d'onde 10 prédéterminé, tandis qu'un autre faisceau, représenté en pointillés, correspond à un autre état du système de déflexion 22 illuminant un autre guide d'onde.
La commande des canaux de lumière peut se faire par un système électronique 20 synchronisé ou non avec la mesure, par exemple par un ordinateur, un microcontrôleur ou une électronique dédiée.
Les guides d'onde 10 peuvent être réalisés soit par matriçage ou moulage de plastique, soit par gravure de verre ou de silicium, soit par dépôt et gravure de 25 couches minces. Le support 1 peut également comporter une couche mince additionnelle 21 déposée sur la totalité de la face avant du support (figure 8).
Ceci permet de mieux contrôler le champ excitateur et peut être avantageux lorsque le taux de réflexion est très faible, par exemple dans le cas o le support doit être submergé dans un liquide.
Avec ce type de système, on peut utiliser des détecteurs de faible coût dont la sensibilité intrinsèque est moindre que dans le cas des lecteurs optiques conventionnels car le rendement de collection optique peut être très grand. En 5 effet, le détecteur peut, par exemple, être quasiment plaqué contre l'objet. A contrario, en utilisant des détecteurs de sensibilité intrinsèque élevée, par exemple un photo-multiplicateur ou une photo-diode à avalanche, on obtient soit une plus grande vitesse de lecture, soit des seuils de détection de l'activité biologique spécifique plus bas que ceux offerts par les lecteurs actuels. On peut 10 encore utiliser des sources de faible puissance, donc de consommation électrique réduite.
Dans le mode particulier de réalisation de figure 8, le détecteur comporte un système 16 optique de collection de lumière permettant de concentrer la lumière 15 6 issue du support 1 sur l'ouverture d'un détecteur 18. Le détecteur de lumière peut être disposé en regard de la face avant du support ou en regard de sa face arrière, comme représenté à la figure 9.
Dans un mode de réalisation non-représenté, le détecteur comporte un ou 20 plusieurs filtres d'arrêt de la lumière qui n'est pas issue des échantillons à examiner, par exemple de la lumière diffusée provenant de la source d'éclairage ou d'autres sources.
Les guides d'onde 10 peuvent traverser complètement le support jusqu'à des 25 sorties de lumière situées sur la face latérale du support 1 opposée à la face comportant les entrées de lumière. Ceci permet de mesurer simultanément la fluorescence et la puissance d'excitation 19 transmise par le guide d'onde par l'intermédiaire d'un système 20 de mesure disposé en regard des sorties de lumière, afin de contrôler la dose d'éclairement ou de corriger toute fluctuation de la source d'éclairement. Or, la proportion de lumière absorbée par des molécules fluorescentes est très faible et la puissance de la lumière sortant du guide d'onde correspond, à environ 10-7-104 près, à la puissance d'excitation de la zone correspondante. Les incertitudes et les biais de mesure sont ainsi 5 beaucoup plus faibles et la normalisation des mesures inter-zones est plus fiable. Il est ainsi possible de quantifier l'activité biologique.
Le fait de déposer précisément une zone bio-spécifique sur une zone de lecture parfaitement déterminée augmente la spécificité de la mesure et, de fait, 10 améliore les performances d'analyse de bio-puces. Cette fonctionnalité est présente, dans ce cas, sans utiliser de système d'asservissement de position.
La lecture peut être faite avec un détecteur unique immobile par rapport à la biopuce. La simplicité, la robustesse et la fiabilité sont accrues et le coût du 15 composant est réduit. Le fait que tous les points de mesure soient effectués avec le même détecteur réduit les biais observables avec les systèmes à caméra.
L'invention est applicable dans toutes les applications diagnostiques des puces 20 ADN avec un faible nombre de zones à observer et dans la plupart des applications d'immuno-dosages en phase hétérogène, ne comportant en général que peu de paramètres différents (typiquement une centaine). Elle s'applique également aux tests d'antibiogrammes ou d'identification bactérienne, en diagnostic clinique, environnemental ou agro-alimentaire. Ceci 25 permet notamment de remplacer les boîtes de Petri, les cartes ou les galeries, par un dispositif nécessitant un plus petit volume d'échantillon et une instrumentation compacte et à bas coût.
Claims (15)
1. Dispositif de mesure de fluorescence d'une pluralité de zones (3) à observer 5 disposées sur une face avant d'un support (1), comportant une source d'éclairage (2), disposée en regard d'une face latérale du support (1) et créant une onde évanescente sur la face avant du support (1), et des moyens (4) de détection de la lumière (6) émise par les zones (3) à observer, dispositif caractérisé en ce que le support (1) comporte une 10 pluralité de guides d'onde (10), disposés chacun sous une zone (3) à observer associée et comportant chacun une entrée de lumière agencée en regard de la source d'éclairage, la source d'éclairage (8) formant une pluralité de canaux de lumière indépendants, programmables, éclairant chacun une seule entrée de lumière.
2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les canaux de lumière sont constitués par un réseau de diodes (12) électroluminescentes.
3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les canaux de 20 lumière sont constitués par un réseau de diodes (12) laser.
4. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les canaux de lumière sont constitués par multiplexage optique d'une source de lumière (14) par l'intermédiaire de micro-miroirs, chacun des micromiroirs 25 présentant une première position (15) permettant de réfléchir un faisceau de lumière, issue de la source de lumière (14), vers une entrée de lumière et une deuxième position (15') permettant d'écarter le faisceau de lumière de l'entrée de lumière.
5. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les canaux de lumière sont constitués par multiplexage optique d'une source de lumière (14) par l'intermédiaire d'éléments (13,13') à cristaux liquides, présentant chacun un état transparent (13) et un état opaque (13'), chaque élément à 5 cristaux liquides étant disposé entre une entrée de lumière correspondante et la source de lumière (14).
6. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les canaux de lumière sont constitués par multiplexage optique d'une source de lumière 10 (14) par l'intermédiaire d'un système de déflexion (22), présentant une pluralité d'états correspondant chacun à l'illumination d'une entrée de lumière.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce 15 que le matériau des guides d'onde (10) est choisi parmi le plastique moulé, le verre gravé et le silicium gravé.
8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le support (1) est constitué par dépôt et gravure de couches minces.
9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le support (1) comporte une couche mince additionnelle (21) recouvrant la face avant du support (1).
10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les moyens (4) de détection de lumière sont disposés en regard de la face avant du support (1).
11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les moyens (4) de détection de lumière sont disposés en regard de la face arrière du support (1).
12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les moyens de détection de lumière comportent un système optique (16) de collection de lumière.
13.Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en 10 ce que les moyens (4) de détection de lumière comportent au moins un filtre d'arrêt de la lumière qui n'est pas issue des zones (3) à observer.
14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que chaque guide d'onde (10) comporte une sortie de lumière situé sur la 15 face latérale du support (1) opposée à la face comportant les entrées de lumière.
15.Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'un système de mesure (20) de puissance d'excitation est disposé en regard des sorties de 20 lumière.
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