JP6150259B2 - 毛細管ベースのフローサイトメトリーにおける集光効率を高めるための装置及び方法 - Google Patents

毛細管ベースのフローサイトメトリーにおける集光効率を高めるための装置及び方法 Download PDF

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Description

本発明は、一般的に流体試料中の粒子の検出及び分析に関し、特に、毛細管ベースのフローサイトメトリーの集光効率を高めるための装置及び方法に関する。
フローサイトメトリーには、臨床診断及び免疫学、たんぱく質及び核酸の検出、血液学、及び腫瘍学を含む生命科学にわたって様々な用途が見られる。例えば、流体試料中で特定の特性を有する粒子、細胞、又は微生物を同定するのにフローサイトメトリーを使用することができる。一般的なフローサイトメトリーでは、分析される粒子が分析領域に搬送され、この領域で光源の集束出力ビームによって照明される。照明された試料粒子によって放出された散乱光及び／又は蛍光が集光され、光学系を用いて放出角度及び波長に従って分離され、光検出器によって検出される。振幅及び時間プロフィールを有するパルスの形態の検出された散乱光及び／又は蛍光は、粒子のサイズ、形状、及び構造などの特徴を示すことができる。その後の処理及び分析に向けてアナログ光信号をデジタルデータストリームに変換するのに、コンピュータシステムが一般的に使用される。
フローサイトメーター内の光学系の集光効率（ＣＥ）は、機器の感度及びスループットを決定する。開口数は、光学系の集光力の尺度である。集光効率は、ＣＥ〜ＮＡ2のように集光光学系の開口数（ＮＡ）と共に増大する。より強力な、すなわち、高いＮＡの光学系を使用することにより、集光効率の直接的な増大を可能にすることができる。しかし、毛細管の内側の分析領域内の粒子位置に対する感度も、集光光学系の開口数に対する同じ２次依存性を伴って増大し（被写界深度〜１／ＮＡ2）、機器の高い変動係数（ＣＶ）値又は分解能の低減をもたらすので、毛細管ベースのフローサイトメトリーに高いＮＡの光学系を使用することには有意な欠点が存在する。従って、毛細管ボアのサイズが、検査工程において試料位置面積を定める現在の毛細管利用サイトメトリーでは、多くの場合に、毛細管及び集光光学系の構成において、毛細管の使用性及び利用可能性、及び機器の望ましい分解能、感度、及び製造可能性のようなファクタを考慮して妥協が経験的に見られる。例えば、従来の毛細管利用サイトメーターでは、約０．４〜０．５の開口数を有する集光光学系が使用され、これらの光学系は、約３パーセントの蛍光集光効率しか与えない。低い集光効率は、達成可能な機器の感度及び／又はスループットを実質的に制限する。改善された空隙式光学系では、集光効率は増大することができるが、物理法則によってＮＡ＝０．６９に制限され、集光効率は、約１０パーセントの集光効率に制限される。
従って、フローサイトメトリーにおいて、機器の分解能を有意に損なうことなく集光効率を改善する必要性が存在する。機器の製造可能性又は構造コストを有意に損なうことなくフローサイトメトリーの感度及び／又はスループットを改善する必要性も存在する。
粒子分析装置の集光効率を改善するように構成された光学系を提供する。同じく提供するのは、１つ又はそれよりも多くのマイクロレンズに統合された微小毛細管を含むフローセルである。提供する光学系及び／又はフローセルを含む粒子分析装置も提供する。他の実施形態を本明細書において更に説明する。
これら及び様々な他の特徴及び利点は、以下に続く詳細説明を添付図面及び以下に提供する特許請求の範囲に関連付けて読解することで、より明快に理解されることになるであろう。
本発明の一部の実施形態による粒子分析装置の概略図である。 光が毛細管の両方のかつ対向する側から集光され、かつこの両方の側で検出されることを示す一部の実施形態による粒子分析装置における集光及び光検出構成の概略図である。 光が毛細管の両方のかつ対向する側から集光されるが、再帰反射構成にあるミラーを用いて一方の側で検出されることを示す一部の他の実施形態による粒子分析装置における集光及び光検出構成の概略図である。 図２に示す構成に対する毛細管の内側の分析領域内の粒子位置への集光効率の依存性を示す図である。 図３に示す構成に対する毛細管の内側の分析領域内の粒子位置への集光効率の非依存性を示す図である。 一部の実施形態による粒子分析装置における集光及び光検出構成の概略図である。 一部の実施形態による２つのマイクロレンズに統合された毛細管を含むフローセルの概略図である。 一部の実施形態による集光レンズ及び反射ミラーに統合された毛細管を含むフローセルの概略図である。 一部の実施形態による粒子分析装置における集光及び光検出構成の概略図である。 一部の他の実施形態による粒子分析装置における集光及び光検出構成の概略図である。
光学系、フローセル、並びにこれらの光学系及び／又はフローセルを含む粒子分析装置の様々な実施形態を説明する。本発明は、当然ながら変化する場合がある説明する特定の実施形態に限定されないことは理解されるものとする。様々な実施形態を毛細管ベースのフローサイトメトリーに関して説明するが、これらの実施形態は、被覆管フローサイトメトリーのような他の粒子分析デバイスにおいて実施することができることは認められるであろう。本明細書に使用する用語法は、特定の実施形態を説明する目的のためだけのものであり、本発明の範囲は、特許請求の範囲と共にそのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲によって定められることになるので、この用語法が、限定的であるように意図したものではないことも理解されるであろう。更に、様々な実施形態は、図を参照して説明する。これらの図は、特定の実施形態の説明を容易にするように意図したものであり、本発明の網羅的な説明又は本発明の範囲の限定を意図したものではないことに注意されたい。
本明細書に使用する「粒子」という用語は、合成粒子、ビーズ、分子、生体分子、微生物、細胞、例えば、細菌、ウイルス、ＤＮＡ断片、血液細胞、全血組成などを含む本明細書に説明する粒子分析装置によって検出及び分析することができるあらゆる粒子を指す。粒子は、適切な波長の光によって照明されると、励起光を直接散乱させるか、又は蛍光を発することができる。一部の場合には、特定の測定に向けて、プローブ分子を粒子全体又は粒子内の微小構造に付着させることにより、蛍光放出特性が最適化される。
図１は、本発明の一部の実施形態による粒子分析装置１００の概略図である。一般的に、装置１００は、毛細管１０２と、光源１０４と、光ビーム１０８を毛細管１０２に誘導、成形、及び集束させて分析領域１１０を定めるための第１の光学系１０６と、光を集光及び色分割して光検出器１１４に案内するための第２の光学系１１２と、光検出器１１４によって検出された光信号を処理及び分析するための電子システム１１６とを含む。
毛細管１０２は、分析される粒子を含む流体を通過させるように構成される。一部の実施形態において、毛細管１０２を通過して試料流体を搬送するために、毛細管１０２に流体工学システム（図示せず）を結合することができる。流体工学システムは、毛細管の浮遊端部から試料流体を吸引するように構成されたポンプを含むことができる。代替的に、ポンプを毛細管の端部に結合し、毛細管を通過して試料流体をポンピングするように構成することができる。一例として、毛細管を通過して試料流体をほぼ一定の速度で吸引又はポンピングするのに、シリンジポンプのような較正されたポンプを使用することができる。
毛細管１０２は、良好な光学的透明度を与えるガラス、又は石英、溶融シリカ、プラスチックのような他の材料で製造することができる。毛細管１０２は、縦方向に拡がって流体中に含まれる粒子を通過させるためのボア１０３を定める壁を有する。一部の実施形態において、毛細管ボア１０３のサイズは、流体中の粒子が分析領域１１０を通過するときに、これらの粒子が単離されるように選択される。一部の実施形態において、毛細管ボア１０３のサイズは、毛細管ボア１０３が、集積した粒子又は様々なサイズの粒子によって容易に塞がれないように選択される。一般的に、毛細管ボア１０３のサイズは、５０マイクロメートルから１５０マイクロメートルまでの範囲にわたるとすることができる。
毛細管１０２は、毛細管の縦方向を横断する断面１２２を定める適切な構成の外部壁面１１８と内部壁面１２０とを有することができる。一例として、毛細管１０２の断面１２２は、矩形又は正方形の外側形状と、矩形、正方形、又は円形の内側形状とを有することができる。代替的に、毛細管１０２の断面１２２は、円形の外部形状と、矩形、正方形、又は円形の内部形状とを有することができる。三角形、台形、半球形、及び偏菱形の外側形状又は内側形状を含む毛細管断面１２２の規則的又は不規則な外側形状及び内側形状の様々な他の組合せが可能である。一部の好ましい実施形態において、毛細管１０２の断面１２２は、以下により詳細に説明するように、光学要素を毛細管に付着させるための実質的に平坦な面を与えるために矩形の外側形状を有することができる。一部の実施形態において、毛細管１０２の外部壁面１１８は、不透明コーティングを含むことができる。光ビームが射出することを可能にし、毛細管内に分析領域を定めるために、不透明コーティングのある区域を除去することができる。
光源１０４は、粒子又は粒子にラベル付けされた物質を励起して蛍光を放出させるのに適切な選択された波長の光ビームを供給することができるあらゆる適切な光源とすることができる。適切な光源は、レーザ、アーク放電ランプ、発光ダイオードなどを含む。レーザは、単一波長のコヒーレント光を生成することができる。アーク放電ランプは、それ程高価ではなく、かつ狭波長帯域の光を生成するのに光学フィルタと併用することができる。励起に有効入射光波長は、３００ｎｍから１０００ｎｍの範囲にわたるとすることができる。例示的な有効入射光波長は、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、又は９００ｎｍの波長を含むが、これらに限定されない。例示的な有効入射光領域は、３５０ｎｍから４５０ｎｍまで、４５０ｎｍから５００ｎｍまで、５００ｎｍから５５０ｎｍまで、５５０ｎｍから６００ｎｍまで、６００ｎｍから７００ｎｍまで、及び７００ｎｍから１０００ｎｍまでを含む。一例として、特定の入射光波長は、３７５ｎｍ、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、６４０ｎｍとすることができる。単一の粒子分析装置内に、出力波長と出力輝度との適切な組合せを有する１つ又はそれよりも多くの光源を含めることができる。
一部の実施形態において、第１の光学系１０６は、集束励起ビーム１０８を供給して毛細管１０２上に誘導して分析領域１１０を定めるために使用することができる。第１の光学系１０６は、回折光学系、反射光学系、及び屈折光学系のような１つ又はそれよりも多くの光学構成要素（図示せず）を含むことができる。光源１０６と分析領域１１０の間には、光源によって放出されて励起波長とは異なる波長を有する光を遮蔽するために、励起波長において高い透過率を有する任意的な帯域通過フィルタ（図示せず）を配置することができる。一部の実施形態において、第１の光学系１０６は、シート状のビームを毛細管１０２上に投影するように構成することができる。一部の実施形態において、毛細管１０２上に入射するビーム１０８は、毛細管の縦方向にほぼ矩形又は楕円形の断面を有するように成形及び／又はサイズ決定することができる。一部の実施形態において、毛細管上に入射するビームのほぼ矩形又は楕円形の断面は、毛細管のボアサイズに等しいか又はそれよりも大きい長手寸法を有することができる。一部の実施形態において、入射ビームのほぼ矩形又は楕円形の断面は、毛細管のボアサイズに等しいか又はそれよりも小さい短手寸法を有することができる。一部の実施形態において、毛細管上に入射するビームのほぼ矩形又は楕円形の断面は、毛細管のボアサイズに等しいか又はそれよりも大きい長手寸法と、毛細管のボアサイズに等しいか又はそれよりも小さい短手寸法とを有することができる。一例として、毛細管１０２上に投影されるビーム１０８は、１００マイクロメートルから１０００マイクロメートルまでの長手寸法と、５マイクロメートルから５０マイクロメートルまでの短手寸法とを有するほぼ矩形又は楕円形の断面を有することができる。
分析領域１１０は、毛細管１０２の内部壁面１２０と毛細管１０２を通る入射ビーム１０８とによって定めることができる。分析領域１１０内で、粒子は入射励起ビーム１０８と相互作用して、蛍光励起、小角散乱、及び大角散乱のような過程が発生する。粒子又は粒子にラベル付けされた物質によって放出された散乱光及び／又は蛍光は、第２の光学系１１２によって集光及び案内され、１つ又はそれよりも多くの光検出器１１４によってそれぞれ検出される。
第２の光学系１１２は、散乱光及び蛍光を集光するために、入射光ビームの伝播軸に関して大きい角度で配置された光学系を含むことができる。第２の光学系１１２は、散乱光を散乱検出器に通過させて蛍光を反射するか又は散乱光を反射して蛍光を通過させる１つ又はそれよりも多くのビームスプリッタを含むことができる。例えば、第１の波長の蛍光は、散乱光を反射する第１のダイクロイックビームスプリッタを通過し、第２のダイクロイックビームスプリッタによって第１の蛍光検出器に向けて反射させることができ、第２の異なる波長の蛍光は、第３のダイクロイックビームスプリッタによって第２の蛍光検出器に向けて反射させることができ、以降同じように続く。分析領域１１０と検出器１１４の間には、各検出器に到達する波長帯域を制限する１つ又はそれよりも多くの光学帯域通過フィルタ（図示せず）を配置することができる。
第２の光学系１１２は、入射励起ビームの伝播軸に対して小さい角度の前方散乱光を集光する光学系を含むことができる。非散乱励起ビームが前方散乱光検出器に到達するのを防止するために、一般的にビーム遮蔽を使用することができる。分析領域と前方散乱光検出器の間には、励起波長の光を透過し、他の波長の光を遮蔽するために、帯域通過フィルタを配置することができる。
光検出器１１４は、光増倍管（ＰＭＴ）、光ダイオード、及び別の固体検出器のようなあらゆる適切な光子検出デバイスとすることができる。一般的に光増倍器は、散乱光及び蛍光の検出には比較的感度が高い。光ダイオードは、かなり廉価であり、かつコストを低減する機器構成に対して使用することができる。光検出器１１４は、粒子のサイズ、形状、及び／又は構造のような特徴を示す振幅及び時間プロフィールを有するパルスを生成する。コンピュータ又はデータ取得及び分析システム１１６は、一般的に、更に別の処理及び分析に向けてアナログ光信号を電気信号に変換するアナログ／デジタルコンバータ（ＡＤＣ）を含む。
図２は、一部の実施形態による粒子分析装置２００における集光及び光検出構成の概略図である。実施形態の例示及び説明における明瞭化のために図２には示していない光源及び励起ビームを集束及び案内するための第１の光学系に加えて、粒子分析装置２００は、分析領域２０４を定める内部壁面を有する毛細管２０２と、互いに対向して配置された第１の検出器２０６及び第２の検出器２０８とを含むことができる。分析領域２０４と第１及び第２の検出器２０６、２０８との間には、色選択フィルタを有する集光光学系２１０、２１２を配置することができる。第１及び第２の検出器２０６、２０８によって検出された光信号を処理して分析するために、第１及び第２の検出器２０６、２０８には電子システム（図２には示していない）を結合することができる。図示のように、分析領域２０４にある粒子２１４は、毛細管の縦軸（紙面に対して垂直な）に対してどの場所にも位置付けることができる。参照番号２１４ａ及び２１４ｂは、分析領域２０４内での粒子２１４の２つの例示的な位置を表している。照明された粒子２１４からの蛍光及び／又は散乱光は、分析領域２０４の両方のかつ対向する側から集光され、第１の検出器２０６と第２の検出器２０８とによって同時に検出される。第１の検出器２０６によって検出された光信号と第２の検出器２０８によって検出された光信号とを加え合わせて、電子システムによって更に処理及び分析することができる。
図２に示す集光及び光検出配列は、粒子分析装置２００の集光効率と検出分解能の両方を有利に高めることができる。上述したように、従来の毛細管ベースのフローサイトメトリーにおける集光は、毛細管の内側の分析領域内の粒子の位置に対して高い感度を有する。図４のグラフは、個々の光検出器２０６、２０８の集光効率（垂直軸）が、毛細管２０２の内側の分析領域２０４内の粒子２１４の位置（水平軸）の関数として変化することを示している。しかし、蛍光及び／又は散乱光が、図示のように、分析領域の両方のかつ対向する側から集光され、加え合わせられる場合には、集光効率は、毛細管の内側の分析領域内の粒子位置に依存せず、これを光検出器２０６と２０８での加え合わせ信号の集光効率（垂直軸）が、毛細管２０２の内側の分析領域２０４内の粒子２１４の位置（水平軸）に依存しないことを示す図５のグラフによって示している。
図３は、一部の他の実施形態による粒子分析装置３００における別の集光及び光検出構成の概略図である。実施形態の例示及び説明における明瞭化のために図３には示していない光源及び励起ビームを集束及び案内するための第１の光学系に加えて、粒子分析装置３００は、分析領域３０４を定める内部壁面を有する毛細管３０２と、ある波長の蛍光を検出するように構成された光検出器３０６と、第１の光検出器３０６に対向して配置され、第１の光検出器３０６によって検出されるものと少なくとも同じ波長の蛍光を反射するように構成された反射要素３０８とを含むことができる。分析領域３０４と第１の光検出器３０６の間、及び分析領域３０４と反射要素３０８の間には、集光光学系３１０、３１２を配置することができる。第１の光検出器３０６には、第１の検出器によって検出された光信号を処理及び分析するための電子システム（図３には示していない）を結合することができる。参照番号３１４ａ及び３１４ｂは、分析領域３０４内の粒子３１４の２つの例示的な位置を表している。図示のように、第１の光検出器３０６は、反射要素３０８を通じて第１の集光レンズ３１０及び第２の集光レンズ３１２の両方によって集光される蛍光を検出する。図２に図示の実施形態と同様に、図３に示す集光及び光検出配列は、粒子分析装置３００の集光効率と検出分解能の両方を有利に高めることができる。これを第１の光検出器３０６の集光効率（垂直軸）が、毛細管３０２の内側の分析領域３０４内の粒子３１４の位置（水平軸）に依存しないことを示す図５のグラフによって示している。
図６は、一部の他の実施形態による粒子分析装置６００における集光及び光検出構成の概略図である。粒子分析装置６００は、光源と、励起ビームを集束及び案内するための第１の光学系（図６には示していない）と、分析される粒子を含む流体を通過させるように構成された毛細管６０２とを含む。更に、粒子分析装置６００は、粒子又は粒子にラベル付けされた物質によって放出された蛍光を集光するように構成された第２の光学系６０３と、第１の検出器６０４ａと、第２の検出器６０４ｂとを含む。
一部の実施形態において、第２の光学系６０３は、毛細管６０２の第１の側にある第１の集光レンズ６０８ａと、第１の平行化レンズ６１２ａと、第１の集光レンズ６０８ａと同じ側にある第１の反射要素６１０ａとを含む第１の集光アーム６０３ａを含むことができる。第１の集光レンズ６０８ａ及び第１の平行化レンズ６１２ａは、粒子によって第１の側から放出された光を集光するように構成される。第１の反射要素６１０ａは、集光された１つ又はそれよりも多くの波長の蛍光を反射し、蛍光のうちの非反射部分を透過するように構成される。第１の検出器６０４ａは、第１の集光レンズ６０８ａ及び第１の平行化レンズ６１２ａによって集光され、第１の反射要素６１０ａを通じて透過された波長の蛍光を検出するように構成される。
一部の実施形態において、第２の光学系６０３は、毛細管６０２の第２の側にある第２の集光レンズ６０８ｂと、第２の平行化レンズ６１２ｂと、第２の集光レンズ６０８ｂと同じ側にある第２の反射要素６１０ｂとを含む第２の集光アーム６０３ｂを更に含むことができる。第２の集光レンズ６０８ｂ及び第２の平行化レンズ６１２ｂは、粒子によって第２の側から放出された光を集光するように構成される。第２の反射要素６１０ｂは、集光された１つ又はそれよりも多くの波長の蛍光を反射し、蛍光のうちの非反射部分を透過するように構成される。第２の検出器６０４ｂは、第２の集光レンズ６０８ｂ及び第２の平行化レンズ６１２ｂによって集光され、第２の反射要素６１０ｂを通じて透過された波長の蛍光を検出するように構成される。
第１の反射要素６１０ａによって反射して戻された蛍光は、第１の平行化レンズ６１２ａ、第１の集光レンズ６０８ａ、毛細管６０２、第２の集光レンズ６０８ｂ、第２の平行化レンズ６１２ｂ、及び第２の反射要素６１０ｂを通過することができ、第２の検出器６０４ｂによって検出することができる。同様に、第２の反射要素６１０ｂによって反射して戻された蛍光は、第２の平行化レンズ６１２ｂ、第２の集光レンズ６０８ｂ、毛細管６０２、第１の集光レンズ６０８ａ、第１の平行化レンズ６１２ａ、及び第１の反射要素６１０ａを通過することができ、第１の検出器６０４ａによって検出することができる。図６に示す配列は、機器の分解能を保持し、同時に毛細管ボア内に分散された放出粒子からの集光効率を高めることをもたらすことができる。
一部の実施形態において、第１及び第２の集光レンズ６０８ａ、６０８ｂのうちの少なくとも一方を毛細管６０２に結合することができる。第１及び／又は第２の集光レンズ６０８ａ、６０８ｂは、毛細管６０２に光学接触によって結合するか又は物質、例えば、光学接着剤、フィルム、及び液浸油のような液体などを用いて結合することができる。光学接触は、透明体の２つの面が、分子力の作用範囲程度の距離に寄せ合わせられた場合に起こすことができる。面をこの距離まで寄せ合わせることをこれらの面を光学接触状態に設定すると呼ぶ場合がある。良好に研磨された清浄な面は、一般的に、いずれの粘着剤も用いない極めて耐久性の高い接着に向けて容易に光学接触状態にすることができる。第１及び／又は第２の集光レンズ６０８ａ、６０８ｂを毛細管６０２に結合するのに使用することができる物質は、好ましくは、毛細管６０２の屈折率と実質的に適合する屈折率を有する。毛細管６０２は、あらゆる適切な構成を有することができる。例えば、毛細管６０２の断面は、矩形、正方形、円形、楕円形、又は他の規則的又は不規則な外側形状と、矩形、正方形、円形、楕円形、又は他の規則的又は不規則な内側形状とを有することができる。
一部の実施形態において、第１及び第２の集光レンズ６０８ａ、６０８ｂのうちの少なくとも一方を毛細管６０２と統合することができる。例えば、集光レンズ６０８ａ、６０８ｂの一方又は両方を毛細管６０２に光学接着剤によって接着することができる。一部の実施形態において、毛細管６０２は、実質的に平坦な外部壁面を与える矩形の構成を有することができ、第１及び／又は第２の集光レンズ６０８ａ、６０８ｂも、それぞれ平面を有することができる。従って、第１及び／又は第２の集光レンズ６０８ａ、６０８ｂは、これらの平面を通じて、例えば、光学接着剤を用いて毛細管と統合することができる。
一部の実施形態において、第１の反射要素６１０ａは、１つ又はそれよりも多くの波長の蛍光を反射し、反射する１つ又はそれよりも多くのこれらの波長とは異なる波長の蛍光を透過するように構成された帯域通過フィルタ、ダイクロイックミラーなどとすることができる。一部の実施形態において、第２の反射要素６１０ｂも帯域通過フィルタ、ダイクロイックミラーなどとすることができ、第１の帯域通過フィルタ又はダイクロイックミラー６１０ａによって透過されるものと同じ１つ又はそれよりも多くの波長の蛍光を反射し、第１の帯域通過フィルタ又はダイクロイックミラー６１０ａによって反射されるものと同じ波長の蛍光を透過するように構成される。
一部の実施形態において、第１の集光レンズ６０８ａと第１の検出器６０４ａの間に、集光された光を平行化して第１の検出器６０４ａに集束させるための平行化レンズ６１２ａ及び視野レンズ６１４ａを配置することができる。同様に、第２の集光レンズ６０８ｂと第２の検出器６０４ｂの間に、集光された光を平行化して検出器６０４ｂに集束させるための平行化レンズ６１２ｂ及び視野レンズ６１４ｂｇを配置することができる。
作動時には、光源からの励起ビームが毛細管６０２に集束及び案内され、毛細管内に分析領域が定められる。例えば、毛細管６０２を通じて投影される励起ビームは、毛細管の縦方向に、毛細管のボアサイズに等しいか又はそれよりも大きい長手寸法と、毛細管のボアサイズに等しいか又はそれよりも小さい短手寸法とを有するほぼ矩形の断面を有することができる。分析される粒子を含む試料流体が、分析領域を通過して搬送され、粒子が入射励起ビームと相互作用するときに、蛍光励起、吸光、小角散乱、及び大角散乱等が発生する。粒子又は粒子にラベル付けされた物質によって放出される蛍光は、図示のように、全ての方向に放出される。第１の集光レンズ６０８ａは、毛細管６０２の第１の側における蛍光を集光し、第２の集光レンズ６０８ｂは、毛細管６０２の第２の側における蛍光を集光する。第１の集光レンズ６０８ａによって集光された蛍光は平行化され、第１の波長、例えば、赤色の蛍光を検出するように構成された第１の検出器６０４ａに案内される。第２の集光レンズ６０８ｂによって集光された蛍光は平行化され、第２の波長、例えば、黄色の蛍光を検出するように構成された第２の検出器６０４ｂに案内される。第１の集光レンズ６０８ａと同じ側に配置された第１の反射要素６１０ａは、第１の波長、例えば、赤色の蛍光を透過し、第２の波長、例えば、黄色の蛍光を反射して第２の検出器６０４ｂに更に案内するように構成することができる。第２の集光レンズ６０８ｂの側にある第２の反射要素６１０ｂは、第２の波長、例えば、黄色の蛍光を透過し、第１の波長、例えば、赤色の蛍光を反射して第１の検出器６０４ａに更に案内するように構成することができる。図６に示す構成では、第１の検出器６０４ａは、第１の集光レンズ６０８ａと第２の集光レンズ６０８ｂの両方によって集光された第１の波長、例えば、赤色の蛍光を検出することができる。第２の検出器６０４ｂは、第２の集光レンズ６０８ｂと第１の集光レンズ６０８ａの両方によって集光された第２の波長、例えば、黄色の蛍光を検出することができる。
有利な態様においては、上述の実施形態による粒子分析装置は、機器の集光効率を少なくとも３０％高めることができ、これは、従来の毛細管ベースのフローサイトメトリーのもの少なくとも１０倍である。高い集光効率は、機器の分解能を犠牲にすることなく得られる。高い集光効率は、感度を有意に改善し、機器のダイナミックレンジ及びスループットを高める。改善された集光効率の結果として、それ程高価ではなく、かつ比較的低い感度のみを有する光検出器を粒子分析装置内に使用して、機器の構成コストを低減し、かつ従来技術のものと等しい機器性能を得ることができる。
図７は、一部の実施形態によるフローセル７００の概略図である。フローセル７００は、ボア７０４を定める縦方向に拡がる壁を有する毛細管７０２と、毛細管７０２の壁に取り付けられた第１の集光レンズ７０６とを含む。第１の集光レンズ７０６は、粒子又は粒子にラベル付けされた物質からの蛍光及び／又は散乱光を集光するように構成することができる。一部の実施形態において、フローセル７００は、毛細管７０２の壁に取り付けられた第２の集光レンズ７０８を更に含むことができる。第１の集光レンズ７０６と第２の集光レンズ７０８は、互いに対向して配置することができる。一部の実施形態において、第１及び第２の集光レンズ７０６、７０８は、毛細管７０２に統合されたマイクロレンズとすることができる。マイクロレンズと毛細管との統合は、あらゆる適切な手段を用いてもたらすことができる。一例として、マイクロレンズは、毛細管に接着剤、フィルム、液体などを用いて接着することができる。市販のＵＶ光硬化性光学接着剤のような光学接着剤を使用することができる。好ましくは、光学接着剤は、レンズと毛細管の間に高強度接合を与え、良好な光透過特性を与えるように選択される。好ましくは、選択された接着剤の屈折率は、毛細管を製造する材料の屈折率に適合し、低い自家蛍光を有する。マイクロレンズ７０６、７０８と毛細管７０２とを統合するのには、別の手段を使用することができる。
一部の実施形態において、毛細管７０２は、第１及び／又は第２の集光レンズ７０６、７０８との統合を容易にするための平坦な外部壁面を与える矩形又は正方形の構成を有することができる。従って、第１及び／又は第２の集光レンズ７０６、７０８も、毛細管７０２の平坦な外部壁面に取り付けられる平面を有することができる。縦方向を横断する毛細管７０２の断面は、矩形又は正方形の外側形状と、矩形、正方形、又は円形の内側形状とを有することができる。例えば、一部の好ましい実施形態において、毛細管７０２は、矩形の外側形状と、円形又は正方形の内側形状とを有する断面を有することができる。毛細管の断面は、三角形、台形、半球形、及び偏菱形の外側形状又は内側形状を有することができる。毛細管７０２、並びに第１及び／又は第２の集光レンズ７０６、７０８の様々な別の構成が可能であり、本発明によって考えられている。一例として、毛細管７０２は、０．８ｍｍ×１．５ｍｍの寸法を有する矩形外側形状と、約１００マイクロメートルの直径を有する円形内側形状とを有することができる。
図８は、フローセルの別の実施形態８００を示している。フローセル８００は、ボアを形成する縦方向に拡がる壁を有する毛細管８０２と、毛細管８０２の壁に取り付けられ、蛍光及び／又は散乱光を集光するように構成された第１の集光レンズ８０４と、第１の集光レンズ８０４に対向して毛細管８０２に取り付けられた反射要素８０６とを含む。反射要素８０６は、１つ又はそれよりも多くの波長の蛍光を反射するように構成された曲面上にコーティングを含むことができる。第１の集光レンズ８０４及び反射要素８０６は、上述したように光学接着剤を用いて、又は当業技術で公知のあらゆる他の代替手段を用いて毛細管８０２と統合することができる。一例として、一部の実施形態の特徴を具現化する毛細管−レンズ統合体は、モノリシックレンズ成形のウェーハスケール技術を用いて量産することができる。そのような技術は、例えば、オランダ、アイントホーフェン５６００ＡＡ、私書箱３３のＡｎｔｅｒｙｏｎ ＢＶによって商業的に実施されている。
上述して図７又は図８に示すフローセルは、粒子分析装置内に交換可能に装着することができる支持アセンブリによって支持することができる。図７又は図８に示すフローセルを含むフローセルアセンブリは、損傷を受けたか又はそうでなければ破壊した毛細管を有するフローセルと、損傷を受けていない毛細管を有するフローセル又は異なるサイズ又は形状の毛細管を有するフローセルとの交換を容易にすることができる。
図９は、一部の他の実施形態による粒子分析装置９００における集光及び光検出構成の概略図である。比較すると、粒子分析装置９００の集光及び光検出構成は、図６に例示した粒子分析装置６００の集光及び光検出構成と多くの態様において同様である。例えば、集光システム９０３は、毛細管９０２の第１の側にある第１の集光アーム９０３ａと、第１の集光アーム９０３ａの反対側にあるとすることができ、かつ毛細管９０２の第２の側にある第２の集光アーム９０３ｂとを含むことができる。
第１の集光アーム９０３ａは、第１の集光レンズ９０８ａと、第１の平行化レンズ９１２ａと、第１の反射要素９１０ａと、第１の視野レンズ９１４ａとを含むことができる。第１の集光レンズ９０８ａは、粒子によって毛細管９０２の第１の側から放出された光を集光するように構成することができる。第１の反射要素９１０ａは、集光された１つ又はそれよりも多くの波長の蛍光を反射し、蛍光のうちの非反射部分、例えば、赤色光及び／又は近赤外線（ＮＩＲ）光を透過するように構成することができる。第１の検出器９０４ａは、第１の反射要素９１０ａを通じて透過された波長の蛍光、例えば、赤色光を検出するように構成することができる。
第２の集光アーム９０３ｂは、第２の集光レンズ９０８ｂと、第２の平行化レンズ９１２ｂと、第２の反射要素９１０ｂと、第２の視野レンズ９１４ｂとを含むことができる。第２の集光レンズ９０８ｂは、粒子によって毛細管９０２の第２の側から放出された光を集光するように構成することができる。第２の反射要素９１０ｂは、集光された１つ又はそれよりも多くの波長の蛍光を反射し、蛍光のうちの非反射部分、例えば、黄色光を透過するように構成することができる。第２の検出器９０４ｂは、第２の反射要素９１０ｂを通じて透過された波長の蛍光、例えば、黄色光を検出するように構成することができる。
第１の反射要素９１０ａによって再帰反射された蛍光は、第１の平行化レンズ９１２ａ、第１の集光レンズ９０８ａ、毛細管９０２、第２の集光レンズ９０８ｂ、第２の平行化レンズ９１２ｂ、及び第２の反射要素９１０ｂを通過することができ、第２の検出器９０４ｂによって検出することができる。同様に、第２の反射要素９１０ｂによって再帰反射された蛍光は、第２の平行化レンズ９１２ｂ、第２の集光レンズ９０８ｂ、毛細管９０２、第１の集光レンズ９０８ａ、第１の平行化レンズ９１２ａ、及び第１の反射要素９１０ａを通過することができる。
図６に図示の実施形態と比較すると、図９に示す集光及び光検出構成は、多数の蛍光色を検出する多チャンネル機器において有利とすることができる１つ又はそれよりも多くの付加的な反射要素と１つ又はそれよりも多くの付加的な検出器とを更に含むことができる。図９に示すように、第１の反射要素９１０ａと第１の検出器９０４ａの間に、ダイクロイックミラー９１６のような付加的な反射要素を配置することができる。ダイクロイックミラー９１６は、平行化方向に対して、例えば、４５度のような角度で位置決めすることができる。ダイクロイックミラー９１６は、ある波長、例えば、近赤外線の蛍光を反射し、ある波長、例えば、赤色の蛍光を透過するように構成することができる。ダイクロイックミラー９１６を通じて透過された赤色光は、検出器９０４ａによって検出することができる。ダイクロイックミラー９１６によって反射された近赤外線光は、付加的な検出器９０４ｃによって検出することができる。検出器９０４ｃの前には、光を検出器内に集束させる視野レンズ９１４ｃを配置することができる。
図１０は、一部の他の実施形態による粒子分析装置１０００における集光及び光検出構成の概略図である。図６に図示の実施形態と比較すると、該当波長範囲を有する蛍光を反射するのに、反射要素１０１０ａを使用することができる。毛細管１００２に関して同じ側に、２つ又はそれよりも多くの検出器１００４、１００５を配置することができ、この配置は、例えば、機器構成要素をパッケージ化するのに有利とすることができる。
粒子分析装置１０００は、光源と、励起ビーム（図１０には示していない）を集束及び案内するための第１の光学系と、分析される粒子を含む流体を通過させるように構成された毛細管１００２とを含むことができる。粒子分析装置１０００は、粒子又は粒子にラベル付けされた物質によって放出された蛍光を集光するように構成された第２の光学系１００３と、毛細管１００２に関して同じ側に配置することができる第１の検出器１００４及び第２の検出器１００５とを含むことができる。第２の光学系１００３は、毛細管１００２の第１の側にある第１の集光アーム１００３ａと、第１の集光アーム１００３ａの反対側とすることができる毛細管１００２の第２の側にある第２の集光アーム１００３ｂとを含むことができる。
第１の集光アーム１００３ａは、第１の集光レンズ１００８ａと、第１第の平行化レンズ１０１２ａと、第１の反射要素１０１０ａとを含むことができる。第１の集光レンズ１０００ａは、粒子によって毛細管１００２の第１の側から放出された光を集光するように構成することができる。第１の反射要素１０１０ａは、集光された蛍光を再帰反射するように構成することができる。例えば、第１の反射要素１０１０ａは、３００ｎｍから１０００ｎｍまで、３５０ｎｍから９５０ｎｍまで、又は４００ｎｍから９００ｎｍまでの範囲にわたる波長、又はあらゆる該当波長範囲の波長を有する蛍光を反射するように構成することができる。
第２の集光アーム１００３ｂは、第１の側とは反対の毛細管１００２の第２の側にある第２の集光レンズ１００８ｂと、第２の平行化レンズ１０１２ｂと、第２の反射要素１０１０ｂとを含むことができる。第２の集光レンズ１００８ｂは、粒子によって第２の側から放出された光を集光するように構成することができる。第２の反射要素１０１０ｂは、平行化方向に対して、例えば、４５度のような角度で位置決めすることができるダイクロイックフィルタとすることができる。ダイクロイックフィルタ１０１０ｂは、ある波長の蛍光、例えば、黄色光を反射し、ある波長の蛍光、例えば、赤色光を透過するように構成することができる。ダイクロイックフィルタ１０１０ｂを通じて透過された赤色光は、第１の検出器１００４によって検出することができる。ダイクロイックミラー１０１０ｂによって反射された黄色光は、第２の検出器１００５によって検出することができる。検出器１００４、１００５の前には、光を検出器内に集束させる視野レンズ１０１４、１０１５を配置することができる。当業者には、多チャンネル機器において検出することができる色数を高めるために、２つ又はそれよりも多くのダイクロイックフィルタを追加することができることは認められるであろう。
当業者は、様々な他の修正を本発明の精神及び範囲で加えることができることを認めるであろう。これら又は他の全ての変形及び修正は、本発明者によって考えられており、本発明の範囲にある。
なお、好ましい構成態様として、本発明を次のように構成することもできる。
１． 光の照明時に蛍光を発するか又は蛍光を発する物質でラベル付けされた分析される粒子を含む流体を通過させるように構成された毛細管と、
光源と、
前記毛細管を通じて光ビームを誘導して毛細管内に分析領域を定めるように構成された第１の光学系と、
前記分析領域内の粒子又は該粒子にラベル付けされた物質から放出された蛍光を集光するように構成され、該分析領域に隣接する前記毛細管の第１の側に取り付けられた第１の集光レンズと、該第１の集光レンズに隣接して配置され、１つ又はそれよりも多くの波長の蛍光を反射し、かつ第１の反射要素から反射される該１つ又はそれよりも多くの波長とは異なる波長の蛍光を透過するように構成された第１の反射要素とを含む第２の光学系と、
前記第１の反射要素を通じて透過された蛍光を検出するように構成された第１の検出器と、
を含むことを特徴とする粒子分析装置。
２． 前記第２の光学系は、前記第１の側と反対の前記毛細管の第２の側に取り付けられた第２の集光レンズと、該第２の集光レンズに隣接して配置され、１つ又はそれよりも多くの波長の蛍光を反射し、かつ第２の反射要素によって反射される該１つ又はそれよりも多くの波長とは異なる波長の蛍光を透過するように構成された第２の反射要素とを更に含み、 粒子分析装置が、前記第２の反射要素を通じて透過された蛍光を検出するように構成された第２の検出器を更に含む、
ことを特徴とする上記１に記載の粒子分析装置。
３． 前記第１の反射要素は、前記第２の反射要素によって透過可能な１つ又はそれよりも多くの波長の蛍光を反射し、かつ該第２の反射要素によって反射可能な波長の蛍光を透過するように構成され、
前記第２の反射要素は、前記第１の反射要素によって透過可能な１つ又はそれよりも多くの波長の蛍光を反射し、かつ該第１の反射要素によって反射可能な波長の蛍光を透過するように構成される、
ことを特徴とする上記２に記載の粒子分析装置。
４． 前記第２の光学系は、前記第１の集光レンズと前記第１の反射要素の間に配置された第１の平行化レンズと、前記第２の集光レンズと前記第２の反射要素の間に配置された第２の平行化レンズとを更に含むことを特徴とする上記３に記載の粒子分析装置。
５． 前記第２の光学系は、前記第１の反射要素から透過された波長の蛍光を反射し、かつ該第１の反射要素から透過された波長の蛍光を透過するように構成されて該第１の反射要素に隣接して配置された第３の反射要素を更に含み、
粒子分析装置が、前記第３の反射要素によって反射された蛍光を検出するように構成された第３の検出器を更に含む、
ことを特徴とする上記３に記載の粒子分析装置。
６． 前記第３の反射要素は、ダイクロイックフィルタであり、かつ光学軸に対して傾斜した角度で配置されることを特徴とする上記５に記載の粒子分析装置。
７． 前記第２の光学系は、前記第１の側と反対の前記毛細管の第２の側に取り付けられた第２の集光レンズと、該第２の集光レンズに隣接して配置され、該第２の集光レンズによって集光された範囲の波長の蛍光を再帰反射するように構成されたミラーである第２の反射要素とを更に含み、
前記第１の反射要素は、光学軸に対して傾斜した角度に置かれ、
粒子分析装置が、前記第１の反射要素によって反射された前記蛍光を検出するように構成された第２の検出器を更に含む、
ことを特徴とする上記１に記載の粒子分析装置。
８． 前記第１の反射要素は、ダイクロイックフィルタであることを特徴とする上記７に記載の粒子分析装置。
９． 分析される粒子を含む前記流体を前記毛細管内の前記分析領域を通じて搬送するように構成された流体システムを更に含むことを特徴とする上記１に記載の粒子分析装置。
１０． 前記第１の検出器によって検出された光の信号を分析するように構成されたデータ取得及び分析システムを更に含むことを特徴とする上記１に記載の粒子分析装置。
１１． 光の照明時に蛍光を発するか又は蛍光を発する物質でラベル付けされた粒子を分析するための分析領域を含む粒子分析装置に使用するための集光システムであって、
前記分析領域の第１の側の第１の集光レンズと、
前記第１の側とは反対の前記分析領域の第２の側の第２の集光レンズと、
前記第１の集光レンズに隣接して配置され、該第１の集光レンズによって集光された１つ又はそれよりも多くの波長の蛍光を再帰反射するように構成された第１の反射要素と、 を含むことを特徴とする集光システム。
１２． 前記第１の反射要素は、該第１の反射要素によって反射される前記波長とは異なる波長の蛍光を透過するように更に構成されることを特徴とする上記１１に記載の集光システム。
１３． 前記第２の集光レンズに隣接して配置され、前記第１の反射要素によって透過可能な１つ又はそれよりも多くの波長の蛍光を再帰反射し、かつ該第１の反射要素によって反射可能な波長の蛍光を透過するように構成された第２の反射要素を更に含むことを特徴とする上記１２に記載の集光システム。
１４． 前記分析領域は、毛細管内に形成され、前記第１及び第２の集光レンズのうちの少なくとも一方が、光学接触によって該毛細管に結合されることを特徴とする上記１３に記載の集光システム。
１５． 前記分析領域は、毛細管内に形成され、前記第１及び第２の集光レンズのうちの少なくとも一方が、該毛細管の屈折率と実質的に適合する屈折率を有する物質を用いて該毛細管に結合されることを特徴とする上記１３に記載の集光システム。
１６． 前記第１の集光レンズと前記第１の反射要素の間に配置された第１の平行化レンズと、前記第２の集光レンズと前記第２の反射要素の間に配置された第２の平行化レンズとを更に含むことを特徴とする上記１３に記載の集光システム。
１７． 前記第２の反射要素に隣接して配置されて光学軸に対して傾斜した角度で置かれ、該第２の反射要素から透過された波長の蛍光を反射し、かつ該第２の反射要素から透過された波長の蛍光を透過するように構成されたダイクロイックフィルタである第３の反射要素を更に含むことを特徴とする上記１３に記載の集光システム。
１８． 前記第１の集光レンズに隣接する第１の平行化レンズと、前記第２の集光レンズに隣接する第２の平行化レンズとを更に含むことを特徴とする上記１１に記載の集光システム。
１９． １つ又はそれよりも多くの波長の蛍光を反射し、かつ第２の反射要素から反射されるものとは異なる波長の蛍光を透過するように構成されたダイクロイックフィルタであり、前記第２の集光レンズに隣接して配置され、かつ光学軸に対して傾斜した角度で置かれた第２の反射要素を更に含むことを特徴とする上記１１に記載の集光システム。
２０． 前記分析領域は、毛細管内に形成され、前記第１及び第２の集光レンズのうちの少なくとも一方が、光学接触によるか又は該毛細管の屈折率と実質的に適合する屈折率を有する物質を用いて該毛細管に結合されることを特徴とする上記１９に記載の集光システム。
２１． 粒子分析装置内に使用するためのフローセルであって、
光の照明時に蛍光を発するか又は蛍光を発する物質でラベル付けされた分析される粒子を含む流体を通過させるように構成されたボアを形成する縦方向に拡がる壁を有する毛細管と、
前記毛細管の前記壁に取り付けられ、粒子又は該粒子にラベル付けされた物質から放出された蛍光を集光するように構成された第１の集光レンズと、
を含むことを特徴とするフローセル。
２２． 前記毛細管の前記壁は、第１の実質的に平坦な面を有し、前記第１の集光レンズは、該壁の該第１の平坦な面に取り付けられた平面を有することを特徴とする上記２１に記載のフローセル。
２３． 前記第１のレンズに対向して前記毛細管の前記壁に取り付けられ、粒子又は該粒子にラベル付けされた物質から放出された蛍光を集光するように構成された第２のレンズを更に含むことを特徴とする上記２１に記載のフローセル。
２４． 前記第１及び第２の集光レンズのうちの少なくとも一方が、光学接触によって前記毛細管に結合されることを特徴とする上記２３に記載のフローセル。
２５． 前記第１及び第２の集光レンズのうちの少なくとも一方が、前記毛細管の屈折率と実質的に適合する屈折率を有する物質を用いて該毛細管に結合されることを特徴とする上記２３に記載のフローセル。
２６． 前記毛細管は、正方形又は矩形の外側形状を有して前記縦方向に対して横断する断面を有することを特徴とする上記２１に記載のフローセル。
２７． 前記断面は、円又は正方形の内側形状を有することを特徴とする上記２６に記載のフローセル。
２８． 前記断面は、矩形の外側形状と円の内側形状を有することを特徴とする上記２７に記載のフローセル。
２９． 前記毛細管の前記壁は、４つの実質的に平坦な外面と円形内面とを含み、前記第１の集光レンズは、第１の平坦面に取り付けられ、
フローセルが、前記第１の平坦面に対向する第２の平坦面に取り付けられて粒子又は該粒子にラベル付けされた物質から放出された蛍光を集光するように構成された第２のレンズを更に含む、
ことを特徴とする上記２１に記載のフローセル。
６００ 粒子分析装置
６０２ 毛細管
６０３ａ、６０３ｂ 集光アーム
６０４ａ、６０４ｂ 検出器
６０８ａ、６０８ｂ 集光レンズ

Claims (8)

  1. 粒子分析装置内に使用するためのフローセルであって、
    光の照明時に蛍光を発するか又は蛍光を発する物質でラベル付けされた分析される粒子を含む流体を通過させるように構成されたボアを形成する縦方向に拡がる壁を有する毛細管と、
    前記毛細管の前記壁に取り付けられ、粒子又は該粒子にラベル付けされた物質から放出された蛍光を集光するように構成された第１の集光レンズと、
    前記第１の集光レンズに対向して前記毛細管の前記壁に取り付けられ、粒子又は該粒子にラベル付けされた物質から放出された蛍光を集光するように構成された第２の集光レンズと、
    を含むことを特徴とするフローセル。
  2. 前記毛細管の前記壁は、第１の実質的に平坦な面を有し、前記第１の集光レンズは、該壁の該第１の平坦な面に取り付けられた平面を有することを特徴とする請求項１に記載のフローセル。
  3. 前記第１及び第２の集光レンズのうちの少なくとも一方が、光学接触によって前記毛細管に結合されることを特徴とする請求項１に記載のフローセル。
  4. 前記第１及び第２の集光レンズのうちの少なくとも一方が、前記毛細管の屈折率と実質的に適合する屈折率を有する物質を用いて該毛細管に結合されることを特徴とする請求項１に記載のフローセル。
  5. 前記毛細管は、正方形又は矩形の外側形状を有して前記縦方向に対して横断する断面を有することを特徴とする請求項１に記載のフローセル。
  6. 前記断面は、円又は正方形の内側形状を有することを特徴とする請求項５に記載のフローセル。
  7. 前記断面は、矩形の外側形状と円の内側形状を有することを特徴とする請求項６に記載のフローセル。
  8. 前記毛細管の前記壁は、４つの実質的に平坦な外面と円形内面とを含み、前記第１の集光レンズは、第１の平坦面に取り付けられ、
    前記第２のレンズは、前記第１の平坦面に対向する第２の平坦面に取り付けられて粒子又は該粒子にラベル付けされた物質から放出された蛍光を集光するように構成されている、
    ことを特徴とする請求項１に記載のフローセル。
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