JP2013164363A - 生物粒子計数器及び生物粒子計数方法 - Google Patents

Abstract

【課題】水によるラマン散乱光の影響があっても、液体中の生物粒子を検出して生物粒子の個数を計数することができる技術を提供する。
【解決手段】検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光を照射する発光手段と、前記対象物又は前記液体と前記発光手段により照射された光との相互作用により放出される光について、前記発光手段により照射される前記光の偏光方向と同じ偏光方向を有する光を遮蔽する偏光光学選択手段と、前記偏光光学選択手段により透過された後の光の有無に基づいて、前記液体に生物粒子が含まれるか否かを判定する生物粒子判定手段とを備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、液体中の生物粒子をリアルタイムで検出する生物粒子計数器及び生物粒子計数方法に関する。

従来、生物粒子の検出においては、培養法（公定法）、マイクロコロニー法、ＡＴＰ（ルシフェラーゼ）法、蛍光染料法、自家蛍光法等が知られている。これらの検出方法の中で、リアルタイムで生物粒子の有無の結果が得られる検出方法は自家蛍光法である。この自家蛍光法とは、ある物質に所定の波長の光を照射して、その物質のもつエネルギー状態を励起こした（照射光の吸収）後に、基底状態に戻る際に余分なエネルギーを外部に蛍光として放出する現象を利用し、その蛍光の検出の有無で生物粒子の有無を知る方法である。また、その物質固有の波長を照射することで、その物質が光を吸収しやすくなり、自家蛍光を外部に放出しやすくなる。

この自家蛍光現象を利用して、水中内の生物粒子の有無を確かめる先行技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。この先行技術は、生物粒子を含む水媒質に紫外線を照射して、自家蛍光を検出するか否かで生物粒子の有無を確かめている。特にこの先行技術では、測定するべき自家蛍光の特定の部分（波長域）を選択するフィルターを使用している。

特表２００９−５０１９０７号公報

ここで、特許文献１の技術のように水中内の自家蛍光現象を利用した生物粒子の検出において、紫外線を水に照射すると、照射された紫外線は水により散乱（ラマン散乱）され、その紫外線よりも波長の長いラマン散乱光が発生することになり、自家蛍光の他に水によるラマン散乱光も検出してしまうこととなる。したがって、自家蛍光を指標にした生物粒子のみの有無を検出することは困難となる。また、自家蛍光の特定の部分を選択したとしても、照射する紫外線の波長によっては自家蛍光と同じ波長を有する液体によるラマン散乱光も同時に検出してしまう可能性があり、生物粒子の有無を検出することは困難である。

そこで本発明は、水によるラマン散乱光の影響を低減し、液体中の生物粒子を検出して生物粒子の個数を計数することができる技術を提供するものである。

上記の課題を解決するため、本発明は以下の解決手段を採用する。
解決手段１：本発明の生物粒子計数器は、検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光を照射する発光手段と、前記対象物又は前記液体と前記発光手段により照射された光との相互作用により放出される光について、前記発光手段により照射される前記光の偏光方向と同じ偏光方向を有する光を遮蔽する偏光光学選択手段と、前記偏光光学選択手段により透過された後の光の有無に基づいて、前記液体に生物粒子が含まれるか否かを判定する生物粒子判定手段とを備えることを特徴とする生物粒子計数器である。

本発明の生物粒子計数器による生物粒子の計数は、例えば、以下の特徴を有しており、所定の手順に沿って進行する。
（１）対象物を含む液体がフローセル内を流動していると想定し、そのフローセル内を流動している液体に対して、特定の波長の光を照射する。例えば、レーザーダイオードから単一波長のレーザー光を照射する。なお、このレーザーダイオードから照射されるレーザー光は直線偏光である。ここで、対象物とは、生物粒子や非生物粒子等を表している。また、液体とは、例えば、水を表している。

（２）上記（１）によりレーザー光を照射すると、レーザー光と対象物との相互作用、又は、レーザー光と液体との相互作用により光が放出されることとなる。具体的に放出される主な光は、生物粒子との反射等によって放出される散乱光、レーザー光が生物粒子に吸収されそのエネルギーを利用して放出される自家蛍光、非生物粒子との反射等によって放出される散乱光、液体（分子）に入射した光の波長が変換されて放出されるラマン散乱光である。なお、自家蛍光のスペクトルのピーク波長が散乱光及びラマン散乱光のピーク波長と異なる波長になるように、照射するレーザー光の波長を設定する。

（３）上記（２）により放出された光の波長はそれぞれ異なっており、例えば、生物粒子や非生物粒子からの散乱光はレーザー光の波長と同程度であるのに対し、ラマン散乱光や自家蛍光といった光の波長はそのレーザー光の波長よりも長くなる。また、ラマン散乱光と自家蛍光の波長については、それぞれの波長分布領域が重なることもあり、例えば、自家蛍光における波長分布のピーク値（ピーク波長）の方がラマン散乱光の波長分布のピーク値（ピーク波長）よりも長い波長となるがラマン散乱光の波長帯域に重なることもある。そこで、生物粒子や非生物粒子からの散乱光及び水分子のラマン散乱光のピークと、自家蛍光のピークとを波長により分光する。例えば、ラマン散乱光と自家蛍光のピークを分光する波長（カットオフ波長）を基準とする光学分離器（ダイクロイックミラー、ロングパスフィルター、ショートパスフィルター、バンドパスフィルター）を用いて分光する。

（４）上記（３）において、ラマン散乱光の波長帯域は自家蛍光の波長帯域に重なるので、光学分離器を用いて分光された自家蛍光にはラマン散乱光成分が含まれるため、直線偏光であるレーザー光の偏光方向と同じ方向の成分のみを遮光する偏光フィルターを用いてラマン散乱光成分を遮光する。これは、ラマン散乱光については、レーザー光と同様に偏光しており、その偏光についてもレーザー光の偏光方向と同一の方向に振動しているからである。なお、自家蛍光については無偏光である。したがって、このラマン散乱光が偏光していることに基づいて、上記（３）の後の分光されたラマン散乱光と自家蛍光とを含んだ光について、例えば、偏光フィルターを使用することで、ラマン散乱光だけを遮光することができる。

（５）上記（４）により透過された光、すなわち、生物粒子からの自家蛍光に基づいて、液体に含まれる対象物が生物粒子であるか否かが判定される。そして、その判定において生物粒子であると判定された場合、その個数をカウントすることで、生物粒子数が計数されることとなる。

このように、本解決手段によれば、ラマン散乱光がレーザー光と同様に偏光しておりその方向も同一であることから、レーザー光と偏光方向と同じ成分を遮光させる偏光フィルターを用いることで、ラマン散乱光を光学的に抑制し、一方生物粒子からの自家蛍光については透過させることができるため、液体によるラマン散乱光の影響を低減させて液体中の生物粒子の存在の有無を判定することができる。これにより、生物粒子に対する計数精度を向上させることができる。

解決手段２：本発明の生物粒子計数器は、解決手段１において、前記偏光光学選択手段を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じる大きさの第１信号を出力する自家蛍光受光手段と、前記対象物から放出される散乱光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じる大きさの第２信号を出力する散乱光受光手段と、前記散乱光受光手段により出力された前記第２信号の大きさが所定の閾値以上である場合、前記液体に含まれる対象物から放出された散乱光を検出したとして検出信号を出力する散乱光検出信号出力手段と、前記散乱光選択光学手段から前記自家蛍光受光手段までの光路に、前記光路以外から入射する光が入り込むことを防ぐ遮光壁とをさらに備え、前記生物粒子判定手段は、前記散乱光検出信号出力手段により前記検出信号が出力された場合であって、前記散乱光受光手段により前記対象物から放出された前記散乱光が受光された時点と同時期に前記自家蛍光受光手段により光が受光され、前記時点と同時期に前記自家蛍光受光手段により前記受光された光に対応する前記第１信号の大きさが所定の閾値以上である場合、前記散乱光検出信号出力手段により出力された前記検出信号に対応する前記液体に含まれる前記対象物を生物粒子であると判定することを特徴とする生物粒子計数器である。

本解決手段の生物粒子計数器による生物粒子の計数は、例えば、以下の特徴を有しており、所定の手順に沿って進行する。
（６）上記（４）で透過された光（自家蛍光）を受光し、受光した光量に応じた大きさの第１信号を出力する。例えば、フォトマルチチューブやフォトダイオード等の光検出装置により、受光した光量に応じた第１信号が出力される。

（７）上記（３）で分光された散乱光（対象物の散乱光）を受光し、受光した光量に応じた大きさの第２信号を出力する。例えば、フォトダイオード等の光検出装置により、受光した光量に応じた第２信号が出力される。

（８）上記（７）で出力された第２信号の大きさが所定の閾値以上であるか否かが判定され、判定の結果、閾値以上であると判定された場合を対象物からの散乱光が検出されたとする検出信号（例えば、検出フラグ）が出力される。

（９）上記（８）で検出信号が出力された場合であって、その検出信号に対応する時間、すなわち、上記（７）で受光した時点と同時期に、上記（４）で透過された光が受光されて第１信号が出力されていた場合、上記（５）における判定で、対象物が生物粒子であると判定する。なお、検出信号が出力されており、第１信号が出力されていない場合、対象物が非生物粒子であると判定してもよい。そして、その判定において生物粒子であると判定された場合、その個数をカウントすることで、生物粒子数が計数されることとなり、非生物粒子であると判定された場合、その個数もカウントしてもよい。また、第２信号の大きさに基づき、生物粒子（や非生物粒子）の大きさについても判定してもよい。

このように、本解決手段によれば、対象物との散乱光について所定の閾値を設けたことで、閾値より大きい信号を対象物の散乱光であると判定することができる。

解決手段３：本発明の生物粒子計数器は、検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光を照射する発光手段と、前記対象物又は前記液体と前記発光手段により照射された光との相互作用により放出される光のうち、前記対象物から放出される自家蛍光の波長帯域を透過させる自家蛍光選択光学手段と、前記自家蛍光選択光学手段を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する自家蛍光受光手段と、前記自家蛍光受光手段からの前記信号に基づいて、前記液体に生物粒子が含まれるか否かを判定する生物粒子判定手段とを備え、前記自家蛍光受光手段は、前記発光手段により照射される前記光の振動方向（偏光方向）から前記対象物により放出される光を受光することを特徴とする生物粒子計数器である。

本解決手段の生物粒子計数器による生物粒子の計数は、例えば、以下の特徴を有しており、所定の手順に沿って進行する。
（１０）対象物を含む液体がフローセル内を流動していると想定し、そのフローセル内を流動している液体に対して、特定の波長の光を照射する。例えば、レーザーダイオードから単一波長のレーザー光を照射する。なお、このレーザーダイオードから照射されるレーザー光は直線偏光である。ここで、対象物とは、生物粒子や非生物粒子等を表している。また、液体とは、例えば、水を表している。

（１１）上記（１０）によりレーザー光を照射すると、レーザー光と対象物との相互作用、又は、レーザー光と液体との相互作用により光が放出されることとなる。具体的に放出される主な光は、生物粒子との反射等によって放出される散乱光、レーザー光が生物粒子に吸収されそのエネルギーを利用して放出される自家蛍光、非生物粒子との反射等によって放出される散乱光、液体（分子）に入射した光の波長が変換されて放出されるラマン散乱光である。なお、自家蛍光のスペクトルのピーク波長が散乱光及びラマン散乱光のピーク波長と異なる波長になるように、照射するレーザー光の波長を設定する。

（１２）上記（１１）により放出された光の波長はそれぞれ異なっており、例えば、生物粒子や非生物粒子からの散乱光はレーザー光の波長と同程度であるのに対し、ラマン散乱光や自家蛍光といった光の波長はそのレーザー光の波長よりも長くなる。また、ラマン散乱光と自家蛍光の波長については、それぞれの波長分布領域が重なることもあり、例えば、自家蛍光における波長分布のピーク値（ピーク波長）の方がラマン散乱光の波長分布のピーク値（ピーク波長）よりも長い波長となるがラマン散乱光の波長帯域に重なることもある。そこで、生物粒子や非生物粒子からの散乱光及び水分子のラマン散乱光のピークと、自家蛍光のピークとを波長により分光する。例えば、ラマン散乱光と自家蛍光のピークを分光する波長（カットオフ波長）を基準とする光学分離器（ダイクロイックミラー、ロングパスフィルター、ショートパスフィルター、バンドパスフィルター）を用いて分光する。

（１３）上記（１２）で分光された光（自家蛍光）を受光し、受光した光量に応じた大きさの信号を出力する。例えば、フォトマルチチューブやフォトダイオード等の光検出装置により、受光した光量に応じた信号が出力される。そして、その信号に基づいて、液体に含まれる対象物が生物粒子であるか否かが判定される。そして、その判定において生物粒子であると判定された場合、その個数をカウントすることで、生物粒子数が計数されることとなる。

（１４）上記（１３）における光検出装置では、レーザー光の振動方向（偏光方向）に向かって放出される光のうち、自家蛍光の波長帯域成分が受光されることとなる。これは、ラマン散乱の対象物である水分子がレーザー光の波長と比較すると非常に小さいことで、そのラマン散乱光がレーザー光が進行する方向である前方方向（θ＝０°）や後方方向（θ＝１８０°）と比較して側方方向付近には放出されにくいからである。なお、自家蛍光の対象物である生物粒子については、大きさがレーザー光の波長と同等かそれ以上であるため、上記側方方向付近にも自家蛍光が放出される。

このように、本解決手段によれば、ラマン散乱光が偏光方向付近には放出されにくいことから、その方向付近に放出される光を光検出装置で受光することで、液体によるラマン散乱光の影響を低減させて液体中の生物粒子の存在の有無を判定することができる。これにより、生物粒子に対する計数精度をさらに向上させることができる。

解決手段４：本発明の生物粒子計数器は、検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光を照射する発光手段と、前記対象物又は前記液体と前記発光手段により照射された光との相互作用により放出される光のうち、前記発光手段により照射される前記光の偏光方向と進行方向に直交する方向に前記対象物から放出される自家蛍光の波長帯域を透過させる第１自家蛍光選択光学手段と、前記対象物又は前記液体と前記発光手段により照射された光との相互作用により放出される光のうち、前記発光手段により照射される前記光の進行方向に前記対象物から放出される自家蛍光の波長帯域を透過させる第２自家蛍光選択光学手段と、前記第１自家蛍光選択光学手段を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する第１自家蛍光受光手段と、前記第２自家蛍光選択光学手段を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する第２自家蛍光受光手段と、前記第１自家蛍光受光手段により出力された信号と前記第２自家蛍光受光手段により出力された信号を差分した差分信号を出力する差分手段と、前記差分手段からの前記差分信号に基づいて、前記液体に生物粒子が含まれるか否かを判定する生物粒子判定手段とを備えることを特徴とする生物粒子計数器である。

本解決手段の生物粒子計数器による生物粒子の計数は、例えば、以下の特徴を有しており、所定の手順に沿って進行する。
（１５）対象物を含む液体がフローセル内を流動していると想定し、そのフローセル内を流動している液体に対して、特定の波長の光を照射する。例えば、レーザーダイオードから単一波長のレーザー光を照射する。なお、このレーザーダイオードから照射されるレーザー光は直線偏光である。ここで、対象物とは、生物粒子や非生物粒子等を表している。また、液体とは、例えば、水を表している。

（１６）上記（１５）によりレーザー光を照射すると、レーザー光と対象物との相互作用、又は、レーザー光と液体との相互作用により光が放出されることとなる。具体的に放出される主な光は、生物粒子との反射等によって放出される散乱光、レーザー光が生物粒子に吸収されそのエネルギーを利用して放出される自家蛍光、非生物粒子との反射等によって放出される散乱光、液体（分子）に入射した光の波長が変換されて放出されるラマン散乱光である。なお、自家蛍光のスペクトルのピーク波長が散乱光及びラマン散乱光のピーク波長と異なる波長になるように、照射するレーザー光の波長を設定する。

（１７）上記（１６）により放出された光の波長はそれぞれ異なっており、例えば、生物粒子や非生物粒子からの散乱光はレーザー光の波長と同程度であるのに対し、ラマン散乱光や自家蛍光といった光の波長はそのレーザー光の波長よりも長くなる。また、ラマン散乱光と自家蛍光の波長については、それぞれの波長分布領域が重なることもあり、例えば、自家蛍光における波長分布のピーク値（ピーク波長）の方がラマン散乱光の波長分布のピーク値（ピーク波長）よりも長い波長となるがラマン散乱光の波長帯域に重なることもある。そこで、生物粒子や非生物粒子からの散乱光及び水分子のラマン散乱光のピークと、自家蛍光のピークとを波長により分光する。例えば、ラマン散乱光と自家蛍光のピークを分光する波長（カットオフ波長）を基準とする光学分離器（ダイクロイックミラー、ロングパスフィルター、ショートパスフィルター、バンドパスフィルター）を用いて分光する。

（１８）上記（１７）で分光された光（自家蛍光）を受光し、受光した光量に応じた大きさの信号を出力する。例えば、フォトマルチチューブやフォトダイオード等の光検出装置により、受光した光量に応じた信号が出力される。そして、その信号に基づいて、液体に含まれる対象物が生物粒子であるか否かが判定される。そして、その判定において生物粒子であると判定された場合、その個数をカウントすることで、生物粒子数が計数されることとなる。

（１９）上記（１８）における光検出装置は、２つの光検出装置（例えば、第１自家蛍光受光装置と第２自家蛍光受光装置）と、それらから出力される検出信号を差分する差分装置（例えば、差分回路）から構成されている。

（２０）上記（１８）における第２自家蛍光受光装置では、レーザー光の前方方向付近に向かって放出される自家蛍光の波長帯域のラマン散乱光と自家蛍光が受光されることとなる。そして、その受光した光量に応じた信号（進行方向信号）が出力される。

（２１）上記（１８）における第１自家蛍光受光装置では、レーザー光の振動方向（偏光方向）と進行方向に直交する方向付近に向かって放出される自家蛍光の波長帯域のラマン散乱光と自家蛍光が受光されることとなる。そして、その受光した光量に応じた信号（直交方向信号）が出力される。ここで、第１自家蛍光受光装置により受光される自家蛍光については、第２自家蛍光受光装置により受光される自家蛍光の光量よりも少ないものとなる。これは、偏光面と直交する面に放出される自家蛍光について、レーザー光が進行する方向である前方方向（θ＝０°）から後方方向（θ＝１８０°）に放出角度（散乱角度）が変化するごとに放出される光量が顕著に減少するからである。一方、偏光面と直交する面に放出されるラマン散乱光については、放出角度（散乱角度）が変化してもほぼ一様な光量が放出される。したがって、第１自家蛍光受光装置により受光される自家蛍光（側方方向近辺（θ〜９０°））については、第２自家蛍光受光装置により受光される自家蛍光（前方方向近辺（θ〜０°））の光量よりも少ないものとなる。

（２１）上記（１８）における差分回路は、上記（１８）により出力される進行方向信号と、上記（１９）により出力される側方方向信号との差分を計算し（進行方向信号−側方方向信号）、計算した結果を出力する。なお、この出力信号については自家蛍光に基づく信号となる。これは、上記（２０）に説明したように、偏光面と直交する面に放出されるラマン散乱光については、放出角度（散乱角度）が変化してもほぼ一様なため、差分することでお互い相殺されるのに対し、偏光面と直交する面に放出される自家蛍光については、前方方向近辺に放出される自家蛍光の方が側方方向近辺に放出される自家蛍光よりも光量が多いからである。

このように、本解決手段によれば、偏光面と直交する面においてラマン散乱光は一様に放出されるのに対し、自家蛍光は前方方向近辺と側方方向近辺とでは放出される光量が異なる（前方方向の方が多い）ことに基づいて、それら２方向付近に放出される光を２つ光検出装置で受光する。そして、自家蛍光（側方方向近辺（θ〜９０°））については、自家蛍光（前方方向近辺（θ〜０°））の光量よりも少なく、ラマン散乱光については一様な光量であることから、それぞれの信号（光量）の差分を求めることで、ラマン散乱光に対応する信号を相殺し、液体によるラマン散乱光の影響を低減させて液体中の生物粒子の存在の有無を判定することができる。これにより、生物粒子に対する計数精度を向上させることができる。

解決手段５：本発明の生物粒子計数器は、検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光のパルスを照射する発光手段と、前記対象物又は前記液体と前記発光手段により照射された光との相互作用により放出される光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する受光手段と、前記受光手段により出力された信号ついて、散乱光による信号が出力された後から、数ナノ秒以内に自家蛍光による信号が出力されたか否かに基づいて、前記液体に含まれる前記対象物が生物粒子であるか否かを判定する生物粒子判定手段とを備えることを特徴とする生物粒子計数器である。

本解決手段の生物粒子計数器による生物粒子の計数は、例えば、以下の特徴を有しており、所定の手順に沿って進行する。
（２２）対象物を含む液体がフローセル内を流動していると想定し、そのフローセル内を流動している液体に対して、特定の波長の光を照射する。例えば、レーザーダイオードから単一波長のレーザー光を照射する。なお、このレーザーダイオードから照射されるレーザー光は直線偏光である。ここで、対象物とは、生物粒子や非生物粒子等を表している。また、液体とは、例えば、水を表している。

（２３）上記（２２）によりレーザー光を照射すると、レーザー光と対象物との相互作用、又は、レーザー光と液体との相互作用により光が放出されることとなる。具体的に放出される主な光は、生物粒子との反射等によって放出される散乱光、レーザー光が生物粒子に吸収されそのエネルギーを利用して放出される自家蛍光、非生物粒子との反射等によって放出される散乱光、液体（分子）に入射した光の波長が変換されて放出されるラマン散乱光である。なお、自家蛍光のスペクトルのピーク波長が散乱光及びラマン散乱光のピーク波長と異なる波長になるように、照射するレーザー光の波長を設定する。

（２４）上記（２３）により放出された光の波長はそれぞれ異なっており、例えば、生物粒子や非生物粒子からの散乱光はレーザー光の波長と同程度であるのに対し、ラマン散乱光や自家蛍光といった光の波長はそのレーザー光の波長よりも長くなる。また、ラマン散乱光と自家蛍光の波長については、それぞれの波長分布領域が重なることもあり、例えば、自家蛍光における波長分布のピーク値（ピーク波長）の方がラマン散乱光の波長分布のピーク値（ピーク波長）よりも長い波長となるがラマン散乱光の波長帯域に重なることもある。そこで、生物粒子や非生物粒子からの散乱光及び水分子のラマン散乱光のピークと、自家蛍光のピークとを波長により分光する。例えば、ラマン散乱光と自家蛍光のピークを分光する波長（カットオフ波長）を基準とする光学分離器（ダイクロイックミラー、ロングパスフィルター、ショートパスフィルター、バンドパスフィルター）を用いて分光する。

（２５）上記（２４）で分光された光（自家蛍光）を受光し、受光した光量に応じた大きさの信号を出力する。例えば、フォトマルチチューブやフォトダイオード等の光検出装置により、受光した光量に応じた信号が出力される。そして、その信号に基づいて、液体に含まれる対象物が生物粒子であるか否かが判定される。そして、その判定において生物粒子であると判定された場合、その個数をカウントすることで、生物粒子数が計数されることとなる。

（２６）上記（２２）において照射するレーザー光について、照射する時間を水によるラマン散乱光が放出されるのに要する時間だけ照射することとする。具体的には、フェムト秒〜ピコ秒の間隔だけ照射する。

（２７）上記（２６）において光検出装置で受光された光のうち、パルスレーザー光が照射された後から数ナノ秒間に受光された光について、ラマン散乱光は照射後数フェムト秒〜数ピコ秒で出現し、自家蛍光は数ピコ秒〜数ナノ秒で出現する。したがって、ラマン散乱光が放出され、その後しばらく時間が経過した後に自家蛍光が放出することとなる。

このように、本解決手段によれば、ラマン散乱光が放出され、その後しばらく時間が経過した後に自家蛍光が放出することから、高速の時系列処理により、自家蛍光に基づく信号だけを選択して出力することができる。したがって、ラマン散乱光を抑制し、液体によるラマン散乱光の影響を低減させて液体中の生物粒子の存在の有無を判定することができる。これにより、生物粒子に対する計数精度をさらに向上させることができる。

解決手段６：本発明の生物粒子計数器は、検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光を照射する発光手段と、前記対象物又は前記液体と前記発光手段により照射された光との相互作用により側方に放出される光のうち、透過する前記液体から放出されるラマン散乱光を低減し、且つ前記対象物から放出される自家蛍光を透過させる自家蛍光選択光学手段と、前記自家蛍光選択光学手段を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する受光素子を複数配列した（アレイ構造とした）多分割受光素子からなる自家蛍光受光手段と、前記自家蛍光受光手段の前記各受光素子からの前記信号について、一部の（少なくとも１つの）前記受光素子からの前記信号が他の前記受光素子からの前記信号よりも大きい場合に、前記液体に生物粒子が含まれると判定する生物粒子判定手段とを備えることを特徴とする生物粒子計数器である。

本解決手段の生物粒子計数器による生物粒子の計数は、例えば、以下の特徴を有しており、所定の手順に沿って進行する。
（２８）対象物を含む液体がフローセル内を流動していると想定し、そのフローセル内を流動している液体に対して、特定の波長の光を照射する。例えば、レーザーダイオードから単一波長のレーザー光を照射する。なお、このレーザーダイオードから照射されるレーザー光は直線偏光である。ここで、対象物とは、生物粒子や非生物粒子等を表している。また、液体とは、例えば、水を表している。

（２９）上記（２８）によりレーザー光を照射すると、レーザー光と対象物との相互作用、又は、レーザー光と液体との相互作用により光が放出されることとなる。具体的に放出される主な光は、生物粒子との反射等によって放出される散乱光、レーザー光が生物粒子に吸収されそのエネルギーを利用して放出される自家蛍光、非生物粒子との反射等によって放出される散乱光、液体（分子）に入射した光の波長が変換されて放出されるラマン散乱光である。なお、自家蛍光のスペクトルのピーク波長が散乱光及びラマン散乱光のピーク波長と異なる波長になるように、照射するレーザー光の波長を設定する。

（３０）上記（２９）により放出された光の波長はそれぞれ異なっており、例えば、生物粒子や非生物粒子からの散乱光はレーザー光の波長と同程度であるのに対し、ラマン散乱光や自家蛍光といった光の波長はそのレーザー光の波長よりも長くなる。また、ラマン散乱光と自家蛍光の波長については、それぞれの波長分布領域が重なることもあり、例えば、自家蛍光における波長分布のピーク値（ピーク波長）の方がラマン散乱光の波長分布のピーク値（ピーク波長）よりも長い波長となるがラマン散乱光の波長帯域に重なることもある。そこで、生物粒子や非生物粒子からの散乱光及び水分子のラマン散乱光のピークと、自家蛍光のピークとを波長により分光する。例えば、ラマン散乱光と自家蛍光のピークを分光する波長（カットオフ波長）を基準とする光学分離器（ダイクロイックミラー、ロングパスフィルター、ショートパスフィルター、バンドパスフィルター）を用いて分光する。

（３１）上記（３０）で分光された光（自家蛍光）を受光し、受光した光量に応じた大きさの信号を出力する。例えば、フォトマルチチューブやフォトダイオード等の光検出装置により、受光した光量に応じた信号が出力される。そして、その信号に基づいて、液体に含まれる対象物が生物粒子であるか否かが判定される。そして、その判定において生物粒子であると判定された場合、その個数をカウントすることで、生物粒子数が計数されることとなる。

（３２）上記（２８）において平面状の検出領域を２次元（面）で測定するために、その平面を上記（３１）の光検出装置の入射面（受光面）に結像する。

（３３）上記（３２）の光検出装置がフォトダイオードアレイなどの２次元での検出が可能な検出装置（多分割受光素子）であると想定する。例えば、多分割受光素子はｎ×ｍ個の受光素子を配列したものであり、それぞれ検出領域を分割して検出することが可能ということを示している。したがって、上記（３５）において、多分割受光素子の入射面に結像された光は、それぞれの分割領域ごとに検出信号が出力されることとなる。すなわち、２次元での検出が可能な光検出装置では、入射面内での位置情報（例えば、（ｘ、ｙ）座標）とその位置情報と対応した検出信号が出力されることとなる。これまで、検出領域全体のラマン散乱光は約１／（ｎ×ｍ）の大きさの検出信号として出力されるのに対し、生物粒子は検出領域のある１点から放出されているためその検出信号の大きさは変化せず出力される。照射光を適度に傾けて流路を横切らせても良い。

このように、本解決手段によれば、位置情報と対応した検出信号を出力することができる光検出装置を用いることで、対象物（移動する点光源）から放出される光を抽出することができるので、液体中の生物粒子の存在の有無を判定することができる。これにより、生物粒子に対する計数精度をさらに向上させることができる。

本発明の生物粒子計数器及び生物粒子計数方法によれば、流動する液体中の生物粒子を、水のラマン散乱光が発生する状態においても、ラマン散乱光を抑制して生物粒子から放出される自家蛍光を効率よく検出し、計数精度の高い計数を行うことができる。

生物粒子計数器システムの一実施形態を示す概略構成図である。 レーザー光の偏光方向を説明する図である。 自家蛍光物質の一例であるリボフラビンとＮＡＤ（Ｐ）Ｈの励起吸収スペクトルとその物質からの自家蛍光スペクトルを示す図である。 波長が４０５ｎｍの光を照射した際の水によるラマン散乱光スペクトルの概略図である。 自家蛍光計数処理の手順例を示すフローチャートである。 データ収集処理の手順例を示すフローチャートである。 データ解析処理の手順例を示すフローチャートである。 解析処理の手順例を示すフローチャートである。 蛍光用受光装置及び散乱用受光装置からの出力信号の一例を示す図である。 解析結果出力処理の手順例を示すフローチャートである。 報知処理の手順例を示すフローチャートである。 生物粒子の計数結果の報知の一例を示す図である。 散乱光強度の角度分布を示す図である。 粒径パラメータα＝１における散乱光の強度の角度分布を示す図である。 第２実施形態における光検出システムのセットアップの一例を示す図である。 第３実施形態における光検出システムのセットアップの一例を示す図である。 第３実施形態におけるデータ解析処理の手順例を示すフローチャートである。 第４実施形態におけるレーザー光と蛍光用受光装置に入射する光に関するタイミングチャートの一例を示す図である。 第５実施形態におけるフローセルの検出領域と蛍光用受光装置の検出位置を説明する図である。

以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。

〔第１実施形態〕
第１実施形態では、生物粒子３５・非生物粒子３７による散乱光や水によるラマン散乱光３３ｓがレーザー光の直線偏光と同じ偏光方向の光であるのに対して、生物粒子３５による自家蛍光３５ｅは無偏光であることを利用し、偏光フィルターでレーザー光の直線偏光と同じ偏光方向の光を遮蔽し、透過した自家蛍光３５eの光により生物粒子を検出及び計数する。

図１は、生物粒子計数器システムの一実施形態を示す概略構成図である。
図１に示すように、生物粒子計数器システムは、対象物に光を照射し、対象物からの散乱光や自家蛍光を検出する光検出システム１と、光検出システム１から出力された信号に基づいて自家蛍光数をカウントする自家蛍光計数システム２とから構成されている。なお、本実施形態における検出（計数）可能な生物粒子は、例えば、０．１μｍ〜数１００μｍの大きさの生物粒子であり、具体的には、細菌、酵母、カビ等である。また、生物粒子に照射する光は紫外線領域のレーザー光であり、生物粒子の体内（細胞内）に存在する代謝に必要となる物質（リボフラビン、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸））等）から発せられる自家蛍光を指標として検出する。

〔光検出システム〕
光検出システム１は、例えば、発光装置１０、照射光学レンズ系２０、対象流動装置３０、第１集光光学レンズ系４０、遮光装置５０、散乱光選択光学装置６０、遮光壁６５、自家蛍光選択光学装置７０、第２集光光学レンズ系８０、蛍光用受光装置９０、第３集光光学レンズ系１００、散乱用受光装置１１０から構成されている。これらの構成要素により、対象物に光を照射し、対象物からの散乱光や自家蛍光を検出することができる。以下、各構成要素について具体的に説明する。

〔発光装置（発光手段、発光工程）〕
発光装置１０は、例えば、半導体レーザーダイオード（半導体ＬＥＤ素子を含む。以下、レーザーダイオードとする）から構成されている。レーザーダイオード１０によりレーザー光が照射され、生物粒子を含む液体に照射される。

〔偏光面〕
図２は、レーザー光の偏光方向を説明する図である。
図２に示すように、レーザーダイオード１０から照射されるレーザー光は、直線偏光しており、ここでは、その偏光方向（ｘ方向）と進行方向（ｙ方向）からなる偏光面（電界面）を垂直面Ａ（ｘｚ面）とし、偏光面と直交する面を水平面Ｂ（ｙｚ面）として説明する。

レーザーダイオード１０が照射するレーザー光の波長は、生物粒子の細胞内に存在する自家蛍光を発することができる物質（以下、自家蛍光物質とする）に対応して決定される。ここで、自家蛍光物質の励起波長はその物質によって異なっており、さらに、励起状態から基底状態に戻る際に放出する自家蛍光の波長も自家蛍光物質によって異なっている。自家蛍光物質の励起波長及び自家蛍光波長について具体例を挙げて説明する。

〔励起波長及び自家蛍光波長〕
図３は、自家蛍光物質の励起吸収スペクトルとその物質からの自家蛍光スペクトルの一例を示す図である。
図３に示すように、各分布は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの励起波長スペクトル、リボフラビンの励起波長スペクトル、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈからの自家蛍光スペクトル、リボフラビンからの自家蛍光スペクトルを示している。例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの励起波長スペクトルは、約３４０ｎｍの波長をピークにした分布をしている。また、リボフラビンの励起波長スペクトルは、約３７５ｎｍの波長をピークにした分布をしており、リボフラビンを励起こさせやすくするために３７５ｎｍ〜４２０ｎｍの波長のレーザー光を照射することが適していることを表している。

したがって、多くの自家蛍光を生物粒子から放出させるために、レーザーダイオード１０から照射されるレーザー光の波長は、生物粒子の細胞内に存在するＮＡＤ（Ｐ）Ｈやリボフラビンの励起波長に対応して決定される。本実施形態では４０５ｎｍの波長を有するレーザー光がレーザーダイオード１０から照射されることと想定する。この４０５ｎｍの波長を有するレーザー光を照射することにより、リボフラビンによる自家蛍光が生物粒子から放出されることになる。

〔照射光学レンズ系（照射光学手段、照射光学工程）〕
照射光学レンズ系２０は、例えば、複数種類の光学レンズから構成されている。例えば、コリメーターレンズ、両凸レンズ、シリンドリカルレンズから構成されており、レーザーダイオード１０から照射されたレーザー光を平行光線に調整し、対象物に照射している。

〔対象流動装置〕
対象流動装置３０は、例えば、合成石英やサファイア等で作成された中空の四角柱の筒部３２から構成されており、対象物（生物粒子３５又は非生物粒子３７）を含んだ液体３３が上から下に流動する構造をしている。レーザー光３１は、筒部３２の液体が流動する中空領域に照射されて検出領域が形成される。

この検出領域において、レーザー光３１がフローセル３０内を流動する液体３３の水（水分子）や対象物（生物粒子３５又は非生物粒子３７）と相互作用を起こすこととなる。

生物粒子３５に入射するレーザー光３１の波長が４０５ｎｍであるので、生物粒子３５からの散乱光も４０５ｎｍの波長で放出されることとなる。また、図３に示すように、レーザー光３１が生物粒子３５の細胞内のリボフラビンに吸収された場合、約５２０ｎｍをピークとした分布の波長となる。ここで、生物粒子３５から放出される散乱光又は自家蛍光は、周囲に放出されることとなる。

また、非生物粒子３７に入射したレーザー光３１による散乱光は、生物粒子３５から放出される散乱光と同様である。

上記のように、生物粒子３５や非生物粒子３７とレーザー光３１とが相互作用することにより、生物粒子３５や非生物粒子３７からの散乱光、又は生物粒子３５からの自家蛍光が放出される。そして、それらの光は複数の集光レンズ系や波長選択光学装置を経て受光装置により検出されることになる。なお、散乱光の強度、すなわち、散乱光の光量は生物粒子３５や非生物粒子３７の大きさに依存し、大きいほど光量も多くなる。ここで、生物粒子３５からの自家蛍光は生物粒子３５の細胞内のリボフラビンの量に依存する。また、レーザー光３１の光量（強度）にも依存し、レーザー出力を高めて、フローセル３０に多くのレーザー光３１を照射すれば、生物粒子３５や非生物粒子３７からの散乱光、生物粒子３５からの自家蛍光も増加することとなる。しかし、生物粒子３５や非生物粒子３７からの散乱光、生物粒子３５からの自家蛍光以外の光も増加し、具体的には、レーザー光３１と水３３との相互作用（ラマン散乱）による光（ラマン散乱光）も増加することとなる。次に水によるラマン散乱光について、具体的に説明する。

〔水によるラマン散乱〕
図４は、波長が４０５ｎｍの光を照射した際の水によるラマン散乱光スペクトルの一例を示す図である。
図４に示すように、水に波長４０５ｎｍのレーザー光３１を照射すると、水とレーザー光３１との相互作用により、約４６５ｎｍの波長をピークとした波長分布を有するラマン散乱光が放出される。

〔遮光装置〕
遮光装置５０は、例えば、レーザートラップから構成されている。このレーザートラップ５０は、レーザーダイオード１０から照射され、フローセル３０内で相互作用を起こさずに通過したレーザー光３１を遮光する。遮光することで、その通過したレーザー光３１が様々な場所で反射などを起こして、生物粒子３５による散乱光や自家蛍光の検出のノイズとなることを抑制する。

〔第１集光光学レンズ系（結像光学手段、結像光学工程）〕
第１集光光学レンズ系４０は、例えば、複数の光学レンズから構成されている。この第１集光光学レンズ系４０により、フローセル３０内における生物粒子３５や非生物粒子３７からの散乱光及び生物粒子３５からの自家蛍光が集光される。なお、これら生物粒子３５からの側方方向散乱光及び自家蛍光をなるべく多く集光するために、レンズ口径は大きい方が好ましく、生物粒子３５からの散乱光や自家蛍光を検出する検出装置が備えられる位置（距離）に対応して決定される。

〔散乱光選択光学装置（散乱光選択光学手段、散乱光選択光学工程）〕
散乱光選択光学装置６０は、例えば、ダイクロイックミラーから構成されている。本実施形態のダイクロイックミラー６０は、４１０ｎｍよりも長い波長の光を透過させ、４１０ｎｍよりも短い波長の光を反射させる。このように光の波長で分離する基準となる特定の波長をカットオフ波長と称する。しがたって、フローセル３０内で４０５ｎｍのレーザー光３１により散乱された生物粒子３５や非生物粒子３７からの散乱光の波長は主に４０５ｎｍであるため、ダイクロイックミラー６０により生物粒子３５や非生物粒子３７からの散乱光を反射することができる。そして、反射された生物粒子３５や非生物粒子３７からの散乱光は、次に第３集光光学レンズ系１００に集光され、散乱用受光装置１１０に結像されることとなる。

一方、フローセル３０内を流動する生物粒子３５から放出される自家蛍光については、図３に示すように、約５２０ｎｍをピークにした波長分布をしているため、ダイクロイックミラー６０に反射されることなくほぼ全てが透過することとなる。また同様に、水によるラマン散乱光も、図４に示すように、約４６５ｎｍをピークにした波長分布をしており、カットオフ波長４１０ｎｍよりも長い波長が大部分を占めているため、一部を除いた大部分がダイクロイックミラー６０を透過することとなる。そして、透過する自家蛍光及び水によるラマン散乱光は、次に自家蛍光選択光学装置へ進むこととなる。

なお、ダイクロイックミラー６０の基準となるカットオフ波長は４１０ｎｍに限定されることなく、レーザー光３１により散乱された生物粒子３５又は非生物粒子３７からの散乱光が反射され、生物粒子３５から自家蛍光が透過される波長であればよい。

ここで、図示していないが、散乱光選択光学装置６０について、生物粒子３５又は非生物粒子３７による散乱光の光路と、生物粒子３５による自家蛍光の光路とが別系統になるように散乱光選択光学装置６０を並列して設置してもよい。その場合、１つ目の散乱光選択光学装置６０としてカットオフ波長４１０ｎｍよりも短い波長の光だけを透過するといったショートパスフィルターを使用して、生物粒子３５又は非生物粒子３７による散乱光だけを透過させる系統と、２つ目の散乱光選択光学装置６０としてカットオフ波長４１０ｎｍよりも長い波長の光だけを透過するといったロングパスフィルターを使用して、生物粒子３５又は非生物粒子３７による散乱光を透過させずに他の光（水によるラマン散乱光や生物粒子３５による自家蛍光）を透過させる系統とを備えてもよい。

なお、２つ目の散乱光選択光学装置６０としてカットオフ波長４９０ｎｍよりも長い波長の光だけを透過するといったロングパスフィルターを使用して、低減された水によるラマン散乱光や生物粒子３５による自家蛍光を透過させる系統を備えてもよい。また、４９０ｎｍよりも長い波長を透過するといったロングパスフィルターに限定されることなく、４９０ｎｍ〜６００ｎｍの波長域の光を透過するといったバンドパスフィルターを備えてもよい。また、生物粒子３５の細胞内のリボフラビンからの自家蛍光３５ｅを指標とするために、上記のカットオフ波長（例えば、４９０ｎｍ）を基準としたロングパスフィルターを備えたが、生物粒子３５の細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを指標とする場合、４１０ｎｍ〜４７０ｎｍのいずれかの波長（例えば、４５０ｎｍ）をカットオフ波長としそれよりも長い波長の光を透過するといったロングパスフィルターや、カットオフ波長として４５０ｎｍ〜６００ｎｍの波長域の光を透過するといったバンドパスフィルターを備えてもよい。これは、約３５０ｎｍのレーザー光３１を照射した場合、水によるラマン散乱光３３ｓが４００ｎｍをピークとした分布をし、４５０ｎｍを基準としたロングパスフィルターにより、リボフラビンからの自家蛍光３５ｅの検出を指標とした場合と同様に大部分の水のラマン散乱光３３ｓを遮光できるからである。なお、このようなカットオフ波長（４９０ｎｍ、４５０ｎｍ）のロングパスフィルターや、カットオフ波長（４９０ｎｍ〜６００ｎｍ、４５０ｎｍ〜６００ｎｍ）のバンドパスフィルターを上記ダイクロイックミラー６０を透過した光に対して使用してもよい。

〔自家蛍光選択光学装置〕
自家蛍光選択光学装置７０は、例えば、偏光フィルター（偏光光学選択手段）から構成されている。この偏光フィルター７０を特定の偏光方向で用いることで、ある特定方向に振動している光を遮光することが可能となる。本実施形態においては、レーザーダイオード１０から直線偏光しているレーザー光と同じ偏光方向に偏光フィルター７０を備えることで、遮光している。なお、偏光フィルター７０の配設位置は限定するものではない。また、ダイクロイックミラー６０の基準となるカットオフ波長を４１０ｎｍとした場合には、ラマン散乱光を低減するために偏光フィルター７０と共にロングパスフィルター（カットオフ波長４９０ｎｍ）などの光学フィルターを併用してもよい。

〔第２集光光学レンズ系（結像光学手段、結像光学工程）：図１参照〕
第２集光光学レンズ系８０は、例えば、複数の光学レンズから構成されている。この第２集光光学レンズ系８０は、偏光フィルター７０を透過してきた光の進行方向（光軸）上に設置される。この第２集光光学レンズ系８０により、偏光フィルター７０を透過してきた生物粒子３５による自家蛍光３５ｅが集光され、蛍光用受光装置９０の入射面に結像されることとなる。

〔蛍光用受光装置（自家蛍光受光手段、自家蛍光受光工程）〕
蛍光用受光装置９０は、例えば、半導体受光素子（フォトダイオードＰｈｏｔｏ Ｄｉｏｄｅ：ＰＤ）又はフォトダイオードよりも感度のよい光電子増倍管（フォトマルチプライヤーチューブＰｈｏｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ：ＰＭＴ）から構成されている。これらフォトダイオードやフォトマルチプライヤーチューブ（以下、フォトマルとする）は受光した光を電流にし、受光した光量に応じた電流を出力する。なお、受光した光の光量によって出力する電流の大きさが変化し、受光した光の光量が多ければ多いほど、電流の大きさが大きくなる。なお、フォトマル９０から出力される電気信号は、次に自家蛍光計数システム２に入力される。

〔遮光壁（遮光工程）〕
遮光壁６５は、ダイクロイックミラー６０の透過側からフォトマル９０までの光路を囲う筒状の構造物から構成されている。この遮光壁６５により、ダイクロイックミラー６０を透過してきた光（自家蛍光３５ｅ）以外の光がフォトマル９０に入射することを防ぐことができる。例えば、ラマン散乱光３３ｓや対象物からの散乱光３５ｓ、３７ｓが光検出システム１内で反射して、この光路に回り込まないように遮蔽することができる。図示していないが、ダイクロイックミラー６０の反射側から散乱用受光装置１１０までの光路などにも同様に遮光壁を設けてもよい。

〔第３集光光学レンズ系〕
第３集光光学レンズ系１００は、例えば、複数の光学レンズから構成されている。この第３集光光学レンズ系１００は、ダイクロイックミラー６０によって反射された光の進行方向（光軸）上に設置される。

〔散乱用受光装置〕
散乱用受光装置１１０は、例えば、フォトダイオード又はフォトマルから構成される。ここで、散乱用受光装置１１０に入射する光は、ダイクロイックミラー６０により反射された４１０ｎｍより短い波長の光であって、具体的には、フローセル３０内を流動する生物粒子３５や非生物粒子３７により散乱された散乱光である。これら生物粒子３５や非生物粒子３７による散乱光は、生物粒子３５から放出される自家蛍光３５ｅよりも光量が多いため、フォトマルではなく安価なフォトダイオードでも十分に検出することができる。本実施形態においては、このフォトダイオード１１０が備えられ、ダイクロイックミラー６０により反射された生物粒子３５や非生物粒子３７による散乱光を受光する。フォトダイオード１１０が受光した光は、その光量に応じた電気信号に変換され、その電気信号がフォトダイオード１１０から出力されることとなる。フォトダイオード１１０からの出力信号は、次に自家蛍光計数システム２に入力される。

〔自家蛍光計数システム：図１参照〕
自家蛍光計数システム２は、例えば、検出信号処理部２００、データ処理部３００、報知部４００から構成されている。また、図５は、自家蛍光計数処理の手順例を示すフローチャートである。

検出信号処理部２００は、例えば、光検出システム１からの出力信号、すなわち、蛍光用受光装置（フォトマル）９０からの出力信号と散乱用受光装置フォトダイオード）１１０からの出力信号をそれぞれ受信し、受信した信号を増幅し、アナログ信号からデジタル信号にＡＤ変換する処理等を行う（図５中のデータ収集処理ステップＳ２００）。

データ処理部３００は、例えば、検出信号処理部２００でＡＤ変換処理された自家蛍光信号（信号Ａ）及び散乱光信号（信号Ｂ）を受信し保存し（図５中のデータ解析処理ステップＳ３００）、保存した信号Ａ及び信号Ｂから液体中に生物粒子３５に由来する信号、すなわち、自家蛍光３５ｅによる信号が含まれているか否かを判定し、その判定結果を出力する（図５中のステップ解析結果出力処理Ｓ４００）等を行う。

報知部４００は、例えば、データ処理部３００により判定された結果を外部に報知したり、外部に報知信号を出力したりする（図５中の報知処理ステップＳ５００）。
以下、各構成要素及びその処理について具体的に説明する。

〔検出信号処理部〕
検出信号処理部２００は、例えば、蛍光用出力信号処理装置２１０と、散乱用出力信号処理装置２２０から構成されている。さらに、蛍光用出力信号処理装置２１０は、例えば、第１増幅器２１２、第１アナログ／デジタル変換器２１４から構成され、散乱用出力信号処理装置２２０は、例えば、第２増幅器２２２、第２アナログ／デジタル変換器２２４から構成されている。

〔データ収集処理〕
図６は、データ収集処理の手順例を示すフローチャートである。
まず、蛍光用出力信号処理装置２１０は、蛍光用受光装置（フォトマル）９０からの出力信号を受信すると（出力信号受信処理ステップＳ２１０）、第１増幅器２１２がフォトマル９０から出力された出力信号を増幅する（出力信号増幅処理ステップＳ２２０）。そして、第１アナログ／デジタル変換器２１４が第１増幅器２１２により増幅されたアナログ信号をデジタル信号（信号Ａ）に変換する（出力信号Ａ／Ｄ変換処理ステップＳ２３０）。

同様に、散乱用出力信号処理装置２２０は、散乱用受光装置（フォトダイオード）１１０からの出力信号を受信すると（出力信号受信処理ステップＳ２１０）、第２増幅器２２２がフォトダイオード１１０から出力された出力信号を増幅する（出力信号増幅処理ステップＳ２２０）。そして、第２アナログ／デジタル変換器２２４が第２増幅器２２２により増幅されたアナログ信号をデジタル信号（信号Ｂ）に変換する（出力信号Ａ／Ｄ変換処理ステップＳ２３０）。

その後、デジタル信号に変換された信号Ａ及び信号Ｂは蛍光用出力信号処理装置２１０及び散乱用出力信号処理装置２２０から出力される（変換信号出力処理ステップＳ２４０）。出力された信号Ａ及び信号Ｂは、次にデータ処理部３００に入力される。

〔データ処理部〕
データ処理部３００は、例えば、データ収集装置３１０、データ解析装置３２０、解析結果出力装置３３０から構成されている。また、データ収集装置３１０は、例えば、データを記憶するメモリ（ＲＡＭ）３１０から構成されている。

〔データ解析処理〕
図７は、データ解析処理の手順例を示すフローチャートである。
まず、データ処理部３００は、蛍光用出力信号処理装置２１０及び散乱用出力信号処理装置２２０から出力される信号Ａ及び信号Ｂを受信する（変換信号受信処理ステップＳ３１０）。受信された信号Ａ及び信号Ｂは、そのままメモリ３１０の記憶領域に記憶される。

メモリ３１０への信号Ａ及び信号Ｂの記憶が終了すると、つぎに、これらの信号Ａ及び信号Ｂを用いて解析処理（解析処理ステップＳ３４０）が行われる。

〔データ解析装置〕
データ解析装置３２０は、例えば、メモリ３１０に記憶されたデータ（信号Ａ及び信号Ｂ）を解析する計算回路（例えば、ＣＰＵ３２２）及び計算処理内容（プログラム、閾値データ）等を予め記憶（保存）したメモリ３２４（ＲＯＭ）から構成されている。

〔解析処理〕
図８は、解析処理の手順例を示すフローチャートである。
まず、メモリ３１０に記憶された信号Ｂに関して、ＣＰＵ３２２により予めメモリ３２４に記憶された閾値データ（電圧値）と比較される。具体的には、記憶された信号Ｂの電圧値が閾値Ｂ（ＶｔｈＢ）以上か否かが判定される（ステップＳ３４２）。この判定の結果、信号Ｂの電圧値が閾値Ｂ以上であると判定された場合（ステップＳ３４２：Ｙｅｓ）、散乱用受光装置フォトダイオード１１０に生物粒子３５又は非生物粒子３７からの散乱光が入射し検出されたことを表している。ここで、生物粒子３５又は非生物粒子３７からの散乱光が検出されたことを示す散乱光検出フラグをＯＮにする処理が行われてもよい。

次に、メモリ３１０に記憶された信号Ａに関して、ＣＰＵ３２２により予めメモリ３２４に記憶された閾値データ（電圧値）と比較される。具体的には、記憶された信号Ａの電圧値が閾値Ａ（ＶｔｈＡ）以上か否かが判定される（ステップＳ３４４）。この判定の結果、信号Ａの電圧値が閾値Ａ以上であると判定された場合（ステップＳ３４４：Ｙｅｓ）、蛍光用受光装置フォトマル９０に生物粒子３５から放出された自家蛍光３５ｅが入射し検出されたことを表している。そして、その自家蛍光３５ｅが検出されたことを示す検出フラグをＯＮにする処理が行われる（ステップＳ３４６）。なお、この検出フラグ（ＯＮ）は、次に解析結果出力処理装置３３０にフラグ信号として送信される。

一方、これらの判定の結果、信号Ｂの電圧値が閾値Ｂ以上ではないと判定された場合（ステップＳ３４２：Ｎｏ）、又は、信号Ａの電圧値が閾値Ａ以上ではないと判定された場合（ステップＳ３４４：Ｎｏ）、検出フラグをＯＦＦにする処理が行われ（ステップＳ３４８）、自家蛍光３５ｅが検出されなかったことを表している。ここで、上記散乱光検出フラグがＯＮであり、かつ、検出フラグがＯＦＦであった場合、生物粒子３５ではない非生物粒子３７が検出されたことを示す非生物検出フラグをＯＮにする処理が行われてもよい。なお、この検出フラグ（ＯＦＦ）は、次に解析結果出力処理装置３３０にフラグ信号として送信される。また、非生物検出フラグも送信してもよい。

上記解析処理について、各受光装置から出力された出力信号に対応する信号Ａ及び信号Ｂの図を用いて具体的に説明する。

〔蛍光用受光装置及び散乱用受光装置からの出力信号の一例〕
図９は、蛍光用受光装置及び散乱用受光装置からの出力信号の一例を示す図である。
図９中の上段の信号は蛍光用受光装置のフォトマル９０から出力された検出信号に対応する信号Ａの時間変化分布、図９中の下段の信号は散乱用受光装置のフォトダイオード１１０から出力された検出信号に対応する信号Ｂの時間変化分布を示している。ここで、図９中の上下段に示されている信号Ａ及び信号Ｂの分布はタイミング調整された分布であると想定する。また、横軸の時間については、時刻ｔ１、ｔ２、ｔ３、…といった順に時間が経過していることを示している。

例えば、時刻ｔ１では、閾値Ｂ（ＶｔｈＢ（図ではＶｔｈＢ１））よりも大きな信号Ｂの電圧値がデータ処理部３００に入力されたとすると、ＣＰＵ３２２は、信号Ｂの電圧値が閾値Ｂ以上であると判定する（ステップＳ３４２：Ｙｅｓ）。すなわち、時刻ｔ１に、散乱用受光装置フォトダイオード１１０に生物粒子３５又は非生物粒子３７からの散乱光が入射し検出されたことを表している。

そして、ＣＰＵ３２２により予めメモリ３２４に記憶された閾値Ａ（ＶｔｈＡ）と、信号Ａの電圧値とが比較される（ステップＳ３４４）。時刻ｔ１における信号Ａについては、閾値Ａよりも大きな信号ではないため（ステップＳ３４４：Ｎｏ）、時刻ｔ１における信号Ｂは非生物粒子３７からの散乱光となり、検出フラグはＯＦＦにセットされる（ステップＳ３４８）。

次に、時刻ｔ２では、ＣＰＵ３２２は信号Ｂの電圧値が閾値Ｂ以上であると判定する（ステップＳ３４２：Ｙｅｓ）。

そして、ＣＰＵ３２２により閾値Ａ（ＶｔｈＡ）と信号Ａの電圧値とが比較され（ステップＳ３４４）、その結果、ＣＰＵ３２２は信号Ａの電圧値が閾値Ａ以上であると判定する（ステップＳ３４４：Ｙｅｓ）。したがって、時刻ｔ２における信号Ａ及び信号Ｂは生物粒子３５からの自家蛍光３５ｅ及び散乱光であることを表し、検出フラグがＯＮにセットされる（ステップＳ３４６）。

上記のようにして、リアルタイムで生物粒子３５の存在の有無の結果が得られることとなる。ここで、信号Ａや信号Ｂの大きさについては、蛍光用受光装置フォトマル９０や散乱用受光装置フォトダイオード１１０に入射する光量に応じ、さらに、散乱光の大きさは生物粒子３５又は非生物粒子３７の大きさに応じたものとなる。したがって、生物粒子３５の存在の有無だけではなく、信号Ａや信号Ｂの大きさに基づいて、生物粒子３５又は非生物粒子３７の大きさについても測定することができる。

ここで、予めメモリ３２４に生物粒子３５の大きさ（０．１μｍ〜０．３μｍ、０．３μｍ〜０．５μｍ、０．５μｍ〜１．０μｍ、…）に対応する閾値Ｂが複数個（ＶｔｈＢ１、ＶｔｈＢ２、ＶｔｈＢ３、ＶｔｈＢ４、…）記憶してあると想定する。例えば、時刻ｔ２の信号Ｂについては、ＶｔｈＢ１よりも大きくＶｔｈＢ２よりも小さいことから、生物粒子３５の大きさは０．１μｍ〜０．３μｍであると測定することができる。なお、生物粒子３５の大きさ（０．１μｍ以上、０．２μｍ以上、…）に対応する閾値Ｂとしてもよく、閾値Ｂは所望により決めればよい。

本実施例では信号記憶処理ステップＳ３１０で保存したデータに対して解析処理Ｓ３４０を行っているが、保存せずに閾値Ｂ，Ａと逐次比較することにより生物粒子３５又は非生物粒子３７を検出し、リアルタイムに信号Ｂのピークを検出し、粒径区分を求めてもよい。また、自家蛍光３５ｅの光量に応じた信号Ａの大きさは、生物粒子の種類や活性状態にも対応していることから、信号Ａのピークを検出することでそれらの情報についても求めてもよい。

上記のように、信号Ａ及び信号Ｂにより、リアルタイムで生物粒子３５の存在の有無を検出することができ、さらに、生物粒子３５の大きさも測定することができる。生物粒子３５の存在の有無の検出により検出フラグがＯＮにセットされると、次に解析結果出力処理ステップＳ４００により生物粒子３５の計数処理が行われる。

〔解析結果出力装置〕
解析結果出力装置３３０は、データ解析装置３２０により解析された生物粒子３５の個数を計数し、その計数値を報知部４００に送信する装置である。

〔解析結果出力処理〕
図１０は、解析結果出力処理の手順例を示すフローチャートである。
まず、解析結果出力装置３３０は、データ解析装置３２０よりフラグ信号（検出フラグ）を受信する。そして、検出フラグがＯＮにセットされているか否かを判定する（ステップＳ４１０）。その結果、検出フラグがＯＮであった場合（ステップＳ４１０：Ｙｅｓ）、生物粒子３５を検出したとして、カウント数を１増加し計数値を算出する（ステップＳ４２０）。そして、計数値（カウント数）を報知部４００に送信する（ステップＳ４３０）。ここで、図示していないが、リセットボタン（図示せず）が押下された場合や、スタートボタン（図示せず）が押下された場合、カウント数をリセットする処理をステップＳ４１０の前に実行してもよい。また、受信したフラグ信号（大きさフラグ）に基づいて、生物粒子３５の大きさ別に生物粒子３５の個数を計数してもよい。

〔報知部〕
報知部４００は、例えば、表示装置４１０、スピーカー４２０から構成されている。

〔報知処理〕
図１１は、報知処理の手順例を示すフローチャートである。
まず、報知部４００は、データ処理部３００の解析結果出力装置３３０が送信してきた計数値を受信する（ステップＳ５１０）。次に、表示装置４１０に受信した計数値に更新し検出した生物粒子３５の個数を表示する（ステップＳ５２０）。また、スピーカーから報知音を出力する（ステップＳ５３０）。ここで、表示装置４１０に生物粒子３５の大きさ別に検出した生物粒子３５の個数を表示してもよい。また、リアルタイムでカウントを１づつ増加するといった表示形態でもよく、所定の時間（例えば、５秒間隔）後にその更新した計数値を表示する形態でもよい。

報知音については計数値の増加頻度に対応して出力態様（報知音の出力回数、報知音の高低）を変化させてもよい。また、生物粒子３５の大きさに応じて報知音の出力態様も変化させてもよい。例えば、単位時間における０．２μｍ以上の生物粒子３５の計数値が１〜９個である場合は「ピ！」といった単音を１回出力し、その計数値が１０〜９９個である場合は「ピ！ピ！」といった単音を２回出力し、その計数値が１００個以上である場合は「ピ！ピ！ピ！」といった単音を３回出力するといった出力態様でもよい。

図１２は、生物粒子３５の計数結果を報知する表示装置及びスピーカーの一例を示す図である。表示装置として生物粒子３５の大きさ別に計数結果を報知する表示パネル４１０と、生物粒子３５が検出されたことを音で報知するスピーカー４２０が備えられている。例えば、表示パネル４１０は、生物粒子３５の大きさの基準を示す「Ｓｉｚｅ（μｍ）」の表示部と、各大きさに対応する検出した生物粒子３５の個数（計数値）を示す「Ｃｏｕｎｔ」の表示部からなる。生物粒子３５の大きさの基準を示す「Ｓｉｚｅ（μｍ）」の表示部には、例えば、３つの値「０．２」「１．０」「５．０」予め表示されている。それぞれの値に関して、「０．２」については、０．２μｍ以上の生物粒子３５の大きさ、「１．０」については１．０μｍ以上の生物粒子３５の大きさ「５．０」については５．０μｍ以上の生物粒子３５の大きさにそれぞれ対応する。又は、「０．２」については０．２μｍ〜１．０μｍの生物粒子３５の大きさ、「１．０」については１．０μｍ〜５．０μｍの生物粒子３５の大きさ、「５．０」については５．０μｍ〜の生物粒子３５の大きさにそれぞれ対応するように表示してもよく、表示は所望により決めればよい。

ここでは、０.２μｍ以上の大きさの生物粒子３５が３２１個、１．０μｍ以上の大きさの生物粒子３５が７個、５．０μｍ以上の大きさの生物粒子３５が０個とそれぞれ計数されたことを表している。

上記のように、報知部４００は、表示装置４１０からリアルタイムで生物粒子３５の計数値を報知し、スピーカー４２０から生物粒子３５を検出した際に報知音を出力することができる。なお、他にも、報知部４００は外部出力端子を備えてもよく、端子を通して別の装置にデータを出力してもよい。

このように、本実施形態によれば、検出（計測）対象とする生物粒子３５の細胞内のリボフラビンやＮＡＤ（Ｐ）Ｈといった生体内で行っている生命活動の代謝に必要となる物質からの自家蛍光３５ｅの検出を指標とし、物質に対応した波長のレーザー光３１を照射し、対象物による散乱光を反射するためのダイクロイックミラー６０と、水などによるラマン散乱光３３ｓを遮光し、生物粒子３５からの自家蛍光３５ｅを透過する偏光フィルター７０とを備えることで、生物粒子３５に対する計数精度を向上させることができる。

〔第２実施形態〕
この第２実施形態では、レーザー光と相互作用して放出される散乱光が進行する散乱面と、その散乱される散乱角度との関係に基づき、光検出システム１をセットアップすることで、ラマン散乱光３３ｓに対して自家蛍光３５ｅの比を高めるものであり、図面を用いてその関係及びセットアップについて具体的に説明する。なお、第１実施形態と同様な構成については説明を省略し、異なる構成について説明する。

〔散乱光強度の角度分布〕
図１３は、散乱光強度の角度分布を示す図である。
図１３に示すように、縦軸を散乱強度Ｉの相対値、横軸を散乱角度〔°〕（レーザー光の進行する方向である前方方向に散乱される散乱角度θを０°、後方方向に散乱される散乱角度θを１８０°）として、異なる粒径パラメータα（＝πＤ／λ）（Ｄ：生物粒子３５や非生物粒子３７についての大きさ（粒径）、λ：入射光の波長）毎に散乱強度Ｉが異なることが表されている。また、図１３内の実線に対応する強度分布ｉ１は、直線偏光しているレーザー光の水平面Ｂ（ｙｚ面）に散乱される光の強度を示している。そして、図１３内の破線に対応する強度分布ｉ２は、レーザー光の垂直面Ａ（ｘｚ面）に散乱される光の強度を示している。

例えば、粒径Ｄが１．１６μｍの対象物に波長λが４０５ｎｍの光が入射した場合、粒径パラメータαは９．０であることから、図１３のα＝９．０に対応した光が散乱され、具体的には、垂直面Ａ（ｘｚ面）には散乱強度ｉ２で散乱され、水平面Ｂ（ｙｚ面）には散乱強度ｉ１で散乱されることが表されている。他にも、対象物に波長λが４０５ｎｍの光が入射した場合、粒径Ｄの値（０．５２μｍ、０．２６μｍ、０．１３μｍ、０．０６μｍ）に基づいた粒径パラメータα（４．０、２．０、１．０、０．５）に対応した散乱強度分布ｉ１とｉ２が表されている。

図１４は、粒径パラメータα＝１における散乱光の強度の角度分布を示す図である。なお、この図１４は、図１３の粒径パラメータα＝１．０の強度分布ｉ１とｉ２を半円状のグラフを用いたものであり、同一の強度分布を示すものである。また、一点鎖線は強度分布ｉ１とｉ２とを合計した強度を示している。

図１４に示すように、粒径パラメータαの値が１である場合、すなわち、粒径Ｄが０．１３μｍの対象物に波長λが４０５ｎｍの光が入射した場合の垂直面Ａ（ｘｚ面）又は水平面Ｂ（ｙｚ面）に散乱される光の強度分布ｉ１、ｉ２が表されている。また、前方散乱（散乱角度θ＝０°）や後方散乱（散乱角度θ＝１８０°）の場合では、散乱強度分布ｉ１とｉ２の散乱強度の値が１０^−２〜１０^−１であることが示されている。一方、側方方向散乱の場合（散乱角度が９０°である場合）では、散乱強度分布ｉ１の散乱強度の値が１０^−２〜１０^−１であり、散乱強度分布ｉ２の散乱強度の値はほぼ０であることが示されている。したがって、レーザー光が粒径０．１３μｍの対象物に入射した際、水平面Ｂ（ｙｚ面）についてはある程度強弱はあるものの一様に光が散乱されるのに対し、垂直面Ａ（ｘｚ面）については前方方向や後方方向（散乱角度θ＝０°、１８０°）に比して側方方向（散乱角度θ＝９０°）には光が散乱されにくいことを表している。

なお、図１３に示すように、粒径パラメータαの値が０．５についても、散乱強度分布ｉ１及びｉ２が粒径パラメータα＝１．０のときと同様な分布をしていることから、垂直面Ａ（ｘｚ面）と水平面Ｂ（ｙｚ面）において散乱される光が同様な振る舞いをすることがわかる。したがって、粒径パラメータαの値が１．０よりも小さい対象物、すなわち、粒径Ｄが０．１３μｍよりも小さい対象物から光が散乱される場合、水平面Ｂ（ｙｚ面）についてはある程度強弱はあるものの一様に光が散乱されるのに対し、垂直面Ａ（ｘｚ面）については前方方向や後方方向（散乱角度θ＝０°、１８０°）に比して側方方向（散乱角度θ＝９０°）には光が散乱されにくいことを表している。

〔水のラマン散乱光の散乱角度に依存する強度関係〕
ここで、生物粒子３５の粒径が０．３μｍ以上のものを検出対象とすると、粒径パラメータαは２．０以上であり、図１３によると散乱強度分布ｉ１、ｉ２共にある程度強弱はあるものの一様に光が散乱され、散乱強度分布ｉ２の散乱強度の値がほぼ０になることはない。一方、ラマン散乱光３３ｓを放出する水については、水分子の粒径Ｄは約０．３ｎｍであると考えると、粒径パラメータαは非常に小さい（約０．００２）値となる。したがって、上記で説明したように、水によるラマン散乱光３３ｓは垂直面Ａ（ｘｚ面）については、前方方向（散乱角度θ＝０°）や後方方向（散乱角度θ＝１８０°）に放出されるのに対し、側方方向（散乱角度θ＝９０°）には放出されにくい。

そこで、水によるラマン散乱光３３ｓは垂直面Ａ（ｘｚ面）の側方方向（散乱角度θ＝９０°）には放出されにくいことに基づいて、垂直面Ａ（ｘｚ面）の側方方向（散乱角度θ＝９０°）の自家蛍光３３ｅを測定する。

〔光検出システムのセットアップ〕
図１５は、第２実施形態における光検出システムのセットアップの一例を示す図である。
図１５に示すように、第１実施形態と同様に、光検出システム１は、発光装置１０、照射光学レンズ系２０、対象流動装置３０、遮光装置５０、自家蛍光選択光学装置７１、第２集光光学レンズ系８０、蛍光用受光装置９０（フォトマル９０）から構成されている。ここで、自家蛍光選択光学装置７１の前方方向に設置される集光レンズ系や、自家蛍光選択光学装置７１から蛍光用受光装置９０の間に設置される遮光壁については図示していない。なお、第１実施形態で説明した偏光フィルター７０を自家蛍光選択光学装置７１の前方や自家蛍光選択光学装置７１から蛍光用受光装置９０の間などに設置してもよい。

また、第１実施形態では散乱光選択光学装置６０として、図１において散乱光選択光学装置としてダイクロイックミラー６０（カットオフ波長４１０ｎｍ）を設置したものを説明していたが、第２実施形態では、ロングパスフィルター７１（カットオフ波長４９０ｎｍ）を設置したものを説明する。このロングパスフィルター７１（カットオフ波長４９０ｎｍ）により、散乱光を透過させずそれ以外の光を蛍光用受光装置９０に向けて透過させる。

発光装置１０のレーザーダイオード１０の垂直面Ａ（ｘｚ面）が図１５に示すようになっている。レーザーダイオード１０から直線偏光しているレーザー光を照射する方向をｚ方向とする。このレーザー光は照射光学レンズ系２０、対象流動装置３０（フローセル３０）を通り、レーザー光の進行方向となる前方方向（θ＝０°）に設置される遮光装置５０（レーザートラップ５０）で終端されることとなる。

また、図１５に示すように、ロングパスフィルター７１、第２集光光学レンズ系８０、及び、フォトマル９０は、垂直面Ａ（ｘｚ面）の側方方向（散乱角度θ１＝９０°）に設置される。上記で説明したように、水によるラマン散乱光３３ｓは垂直面Ａ（ｘｚ面）の側方方向（散乱角度θ＝９０°）にはほとんど放出されないことから、ロングパスフィルター７１に入射する光は、生物粒子３５又は非生物粒子３７による散乱光と生物粒子３５による自家蛍光３５ｅとなる。そして、カットオフ波長が４９０ｎｍのロングパスフィルター７１により、生物粒子３５又は非生物粒子３７による散乱光は遮光されることとなり、それ以外の光である生物粒子３５による自家蛍光３５ｅが透過することとなる。したがって、フォトマル９０に入射する光のほとんどは自家蛍光３５ｅとなる。なお、図示していないが、ロングパスフィルター７１の前後などに偏光フィルター７０を設置すれば、さらにラマン散乱光３３ｓを低減し、自家蛍光３５ｅのＳＮ比を向上できる。また、対象物の散乱光を検出するのであれば、適宜設置すればよい。

このように、本実施形態によれば、水によるラマン散乱光がレーザー光の垂直面（ｘｚ面）の側方方向に散乱されにくいことに基づいて、ロングパスフィルター７１やフォトマル９０を設置することで、生物粒子３５に対する計数精度を向上させることができる。

〔第３実施形態〕
この第３実施形態では、水平面Ｂ（ｙｚ面）において散乱される自家蛍光３５ｅが散乱角度により異なる関係にあることに基づき、ラマン散乱光３３ｓに対して、自家蛍光３５ｅの比を高めるものであり、図面を用いて具体的に説明する。なお、第１、第２実施形態と同様な構成については説明を省略し、異なる構成について説明する。

〔偏光面と直交する面における光の散乱角度に依存する強度関係〕
図１３に示すように、レーザー光の水平面Ｂ（ｙｚ面）について、散乱される光は粒径パラメータα毎にそれぞれ異なる散乱強度分布ｉ１をしている。例えば、粒径Ｄが０．３μｍ以上の検出対象である生物粒子３５については、粒径パラメータαは２．０以上の散乱強度分布ｉ１に基づき、後方方向（散乱角度θ＝１８０°）から前方方向（散乱角度θ＝０°）になる程散乱強度が大きいことを表している。一方、粒径Ｄが約０．３ｎｍである水分子については、全周方向に同程度の強度で散乱することを表している。

そこで、水によるラマン散乱光３３ｓは水平面Ｂ（ｙｚ面）の全方位に同程度放出されること、及び、生物粒子３５による自家蛍光３５ｅは前方方向（散乱角度θ＝０°）の方が側方方向（散乱角度θ＝９０°）よりも多く放出されることに基づいて、水平面Ｂ（ｙｚ面）の前方方向（散乱角度θ＝０°）と側方方向（散乱角度θ＝９０°）からのラマン散乱光３３ｓ及び自家蛍光３５ｅを測定し、差分をとる。なお、前方方向（散乱角度θ＝０°）で測定することは、ダイクロイックミラーを使用することで可能であるが、散乱角度θ＝０°に限らず、前方方向の近傍から測定してもほぼ同様である。

〔光検出システムのセットアップ〕
図１６は、第３実施形態における光検出システムのセットアップの一例を示す図である。
図１６に示すように、光検出システム１は、発光装置１０、照射光学レンズ系２０、対象流動装置３０、遮光装置５０、自家蛍光選択光学装置７１ｓ、７１ｋ（第１自家蛍光選択光学手段、第２自家蛍光選択光学手段、第１自家蛍光選択光学工程、第２自家蛍光選択光学工程）、第２集光光学レンズ系８０ｓ、８０ｋ、蛍光用受光装置９０ｓ、９０ｋ（フォトマル９０ｓ、９０ｋ）（第１自家蛍光受光手段、第２自家蛍光受光手段、第１自家蛍光受光工程、第２自家蛍光受光工程）から構成されている。ここで、自家蛍光選択光学装置７１ｓ、７１ｋの前方に設置される集光レンズ系や、自家蛍光選択光学装置７１ｓ、７１ｋから蛍光用受光装置９０ｓ、９０ｋの間に設置される遮光壁については図示していない。なお、第１実施形態で説明した偏光フィルター７０を自家蛍光選択光学装置７１ｓ、７１ｋの前方や自家蛍光選択光学装置７１ｓ、７１ｋから蛍光用受光装置９０ｓ、９０ｋの間に設置してもよい。

図１６に示すように、発光装置１０（レーザーダイオード１０）から照射される直線偏光しているレーザ光の水平面Ｂ（ｙｚ面）にそれぞれの装置を設置しており、レーザー光が照射される方向をｚ方向とする。このレーザー光は照射光学レンズ系２０、対象流動装置３０のフローセル３０内を通りレーザー光の進行方向である前方方向（散乱角度θ＝０°）に設置される遮光装置５０（レーザートラップ５０）で終端されることとなる。

また、ロングパスフィルター７１ｓ、第２集光光学レンズ系８０ｓ、及び、フォトマル９０ｓは、水平面Ｂ（ｙｚ面）の側方方向（散乱角度θ１ｓ＝９０°）に設置され、ロングパスフィルター７１ｋ、第２集光光学レンズ系８０ｋ、及び、フォトマル９０ｋは、水平面Ｂ（ｙｚ面）の前方方向（散乱角度θ１ｋ＝０°）に設置される。なお、図示していないが、ラマン散乱光３３ｓをさらに低減するために、ロングパスフィルター７１ｓ、７１ｋの前後に偏光フィルター７０を設置してもよい。また、対象物の散乱光を検出するのであれば、第１実施形態のように適宜設置すればよい。

このように、２箇所にフォトマル９０ｓ、９０ｋを設置した場合、上記で説明したように、生物粒子３５による自家蛍光３５ｅは前方方向（散乱角度θ１ｋ＝０°）の方が側方方向（散乱角度θ１ｓ＝９０°）よりも多く放出されることとなる。具体的には、粒径と光の波長から粒径パラメータαを算出し、図１３のグラフから求めることができる。一方、水によるラマン散乱光３３ｓについては、全方位に同程度放出されることとなる。同様に、ロングパスフィルター７１ｓ、７１ｋで遮蔽しきれず、透過するラマン散乱光３３ｓ（ラマン散乱光の透過波長帯域成分）も同程度となる。

〔データ解析処理〕
図１７は、第３実施形態におけるデータ解析処理の手順例を示すフローチャートである。
図１７に示すように、第１実施形態と異なり、第３実施形態におけるデータ解析処理では、変換信号受信処理（ステップＳ３１０）の後に、差分処理（ステップＳ３２０）が行われる。なお、変換信号受信処理（ステップＳ３１０）では、蛍光用出力信号処理装置２１０により、フォトマル９０ｓから出力された検出信号に基づいて処理された信号Ａｓとフォトマル９０ｋから出力された検出信号に基づいて処理された信号Ａｋとが受信されたと想定する。

〔差分処理（差分手段、差分工程）〕
上記で受信された信号Ａｋと信号Ａｓは、差分装置（例えば、図示しない差分回路）に送られる。差分回路では信号Ａｋと信号Ａｓとの差分（Ａｋ−Ａｓ）が計算され、計算結果が信号Ａとして出力されることなる。

例えば、フォトマル９０ｓの信号（Ａｓ）は、ラマン散乱光３３ｓの信号（Ａｓｓ）と自家蛍光３５ｅの信号（Ａｅｓ）とからなり、フォトマル９０ｋの信号（Ａｋ）は、ラマン散乱光３３ｓの信号（Ａｓｋ）と自家蛍光３５ｅの信号（Ａｅｋ）とからなるので、水平面Ｂに放出される自家蛍光３５ｅについては、フォトマル９０ｋの検出信号に対応する信号Ａｋの大きさに対し、フォトマル９０ｓの検出信号に対応する信号Ａｓは非常に小さいおおきさであることから、その差分はほぼ信号Ａｅｋ（Ａｅｋ≫Ａｅｓ）に基づくものとなる。一方、水平面Ｂにおいては、ラマン散乱光３３ｓが全周方向に一様に放出され、フォトマル９０ｋと９０ｓから同程度の大きさの検出信号（Ａｓｓ＝Ａｓｋ）が出力されることから、ラマン散乱光３３ｓに対応する信号は差分計算によりほぼ消去され、自家蛍光３５ｅに対応する信号（Ａｅｋ）が残ることとなる。その後、それらを用いて解析処理（ステップＳ３４０）が行われる。

このように、本実施形態によれば、水平面Ｂ（ｙｚ面）において、自家蛍光が前方方向（θ〜０°）になるほど多く散乱されることに基づき、２つのフォトマル９０ｓ、９０ｋをそれぞれ水平面の前方方向（θ＝０°）側方方向（θ＝９０°）とに設置し、それぞれの出力信号Ａｓ、Ａｋの差分を算出することで、生物粒子３５に対する計数精度を向上させることができる。

〔第４実施形態〕
第４実施形態においては、ラマン散乱光３３ｓと自家蛍光３５ｅとが放出される時間に基づき、自家蛍光３５ｅの比を高めるものであり、図面を用いて具体的に説明する。なお、他の実施形態と同様な構成については説明を省略し、異なる構成について説明する。

第４実施形態における生物粒子計数器システムは、第１〜第３実施形態と同様に、対象物に光を照射し、対象物からの散乱光や自家蛍光を検出する光検出システム１と、光検出システム１から出力された信号に基づいて自家蛍光数をカウントする自家蛍光計数システム２とから構成されている。ここで、第４実施形態では、他の実施形態と異なり、光検出システム１の発光装置１０として、高周波パルスレーザー１０を使用し、自家蛍光計測システム２として超高速信号処理装置２を使用する。

図１８は、第４実施形態におけるレーザー光と蛍光用受光装置に入射する光に関するタイミングチャートの一例を示す図である。
図１８に示すように、高周波パルスレーザー１０から時刻ｔ１〜ｔ２のパルスレーザー光を所定の間隔(例、１μｓ）で照射すると想定する。なお、このパルス幅ｔ１〜ｔ２は、ラマン散乱光３３ｓが出現するまでに要する所定の時間（例、数ｐｓ）だけ設定される。

パルスレーザー光は、その後、フローセル３０内の水３３、生物粒子３５、非生物粒子３７と相互作用することとなる。ここで、水によるラマン散乱光３３ｓや生物粒子３５や非生物粒子３７による散乱光については、時刻ｔ３〜時刻ｔ４の間に出現し、そのラマン散乱光３３ｓはほぼ同時刻ｔ３〜ｔ４の間にフォトマル９０に散乱光が入射することとなる。なお、この時刻ｔ２〜ｔ３、及び、ｔ３〜ｔ４の間の時間は、数ｆｓ〜数ｐｓで出現する。

一方、生物粒子３５による自家蛍光３５ｅは、パルスレーザー光が照射された後の数ｐｓ〜数ｎｓの間に出現することとなる。したがって、図１８に示すように、時刻ｔ１〜ｔ４の間の時間（数ｐｓ）に比して非常に長い時間（数ｎｓ）が経過した時刻ｔ５にフォトマル９０に自家蛍光３５ｅが入射することとなる。

例えば、フォトマル９０にゲート信号を入力し、上記時刻ｔ４から数ｎｓ間に受光した光だけの検出信号を出力させることで、フォトマル９０からはラマン散乱光３３ｓに対応する検出信号は出力せずに自家蛍光３５ｅに対応する検出信号だけを出力することができる。

他にも、データ解析処理において、上記時刻ｔ４から数ｐｓ〜数ｎｓ間に受光した光に対応するものだけ信号Ａに変換し出力（記録）し解析を進めてもよい。

上記のように、ラマン散乱光３３ｓと自家蛍光３５ｅとが異なる時間にフォトマル９０に到達することに基づいて、超高速信号処理装置２により、高周波パルスレーザー１０からパルスレーザー光を照射した時刻の数ｐｓ〜数ｎｓ後に信号Ａが存在するか否かを判定すること、すなわち、自家蛍光３５ｅを検出したことに基づいて生物粒子３５が存在するか否かが判定することができ、生物粒子３５に対する計数精度を向上させることができる。

〔第５実施形態〕
上記第１〜第３実施形態では、レーザーダイオード１０から照射されたレーザー光は、フローセル３０内の検出領域において、液体を流す流路方向については照射幅（検出幅）を狭く設定し、流路方向に対して垂直方向はフローセル３０内をカバーするために照射幅（検出幅）を広く設定している。したがって、フローセル３０に照射されたレーザー光と相互作用を起こすこととなる検出領域はほぼ平面をなしている。例えば、図１６で示すならば、フローセル３０内の水平面Ｂ（ｙｚ面）が平面状の検出領域となる。また、このフローセル３０の検出領域、すなわち、レーザー光が照射されている平面状の検出領域に対して、蛍光用受光装置９０（フォトマル９０）をその平面がある面上に設置して散乱光や自家蛍光３５ｅを検出している。

ここで、フローセル３０の平面状の検出領域を真横（フォトマル９０側）から見るとほぼ線状（上記照射幅の長さの線）となり、この線状の検出領域全体からの光を１つの受光素子で集光している。水によるラマン散乱光３３ｓについては、検出領域全体を占めている水から放出されるのに対し、自家蛍光３５ｅについては、検出領域の生物粒子３５が位置する場所から放出される。したがって、自家蛍光３５ｅと比較すると、ラマン散乱光３３ｓは検出領域全体から放出されていることから非常に多く放出されることとなっている。

そこで、第５実施形態においては、検出領域全体から放射される光をまとめて１つの受光素子で検出するのではなく２次元に配置された複数の受光素子（多分割受光素子）で検出することで、ラマン散乱光３３ｓを各受光素子に分散して自家蛍光３５ｅの比を高めるものであり、図面を用いて具体的に説明する。

〔フローセル〜集光光学レンズ系〜蛍光用受光装置〕
図１９は、第５実施形態におけるフローセルの検出領域と蛍光用受光装置の検出位置を説明する図である。
図１９に示すように、例えば、レーザー光が照射される検出領域３０ｔ近辺のフローセル３０の形状をＬ字形状とし、液体が流動している進行方向に対して直交する方向に照射することで、検出領域３０ｔを形成している。そして、液体が流動している進行方向の中心軸上に第２集光光学レンズ系８０の中心軸を合わせて設置し、同様にその軸上の第２集光光学レンズ系８０の後方に蛍光用受光装置９０の中心軸を合わせて設置する。このように第２集光光学レンズ系８０と蛍光用受光装置９０を設置することで検出領域３０ｔを２次元の平面として捉えることができる。ここでは、フローセル３０をＬ字形状としたが、限定するものではなく、中空の四角柱の筒形状であっても、照射光を適度に傾ければ、検出領域の平面側を観測できる。また、検出領域の線状側を観測したとしても、線として捉えることができるので、二次元の平面ほどではないがラマン散乱光を分散させる効果がある。

ここで、図示していないが、散乱光選択光学手段、遮光壁、偏光フィルター等は必要に応じて、上記第１実施形態などと同様に設置する。

また、図１９に示すように、第５実施形態における蛍光用受光装置９０として多分割受光素子９０を備えることとする。この多分割受光素子は、縦横にｎ×ｍ（複数）個の受光素子を配列したものであり、例えば、１６個ずつ配列したとすると計２５６個（１６×１６個）の検出信号を出力することができる。したがって、この多分割受光素子９０を備えることで、検出領域３０ｔ全体をｎ×ｍ個に分割して、分割された各分割領域からの光をそれぞれ検出することができる。

そして、生物粒子３５が検出領域３０ｔの特定の位置に存在していた場合、生物粒子３５から放出された自家蛍光３５ｅは、第２集光光学レンズ系８０により多分割受光素子９０の入射面９７の位置９７ｅに集光されることとなる。多分割受光素子９０の入射面９７の位置９７ｅに入射した自家蛍光３５ｅは、その位置９７ｅに対応した受光素子により検出されることとなる。

一方、検出領域３０ｔにおいて放出される水によるラマン散乱光３３ｓも同様に第２集光光学レンズ系８０により多分割受光素子９０に結像されることとなる。ここで、検出領域３０ｔ全体をｎ×ｍ個に分割しているので、各分割領域からのラマン散乱光３３ｓはそれぞれに対応した多分割受光素子９０の受光素子において検出するので、１つの分割領域から放出されるラマン散乱光の強さは全体の強さの１／（ｎ×ｍ）にすることができる。

例えば、上記１６×１６個の多分割受光素子９０の場合、１つあたりの受光素子から出力される検出信号について、生物粒子３５による自家蛍光３５ｅでは、上記第１実施形態〜第４実施形態と同様の大きさの検出信号を出力するのに対し、水によるラマン散乱光３３ｓでは、上記第１実施形態〜第４実施形態の約１／２５６の大きさの検出信号を出力することとなる。したがって、ラマン散乱光３３ｓの検出信号は低減され、自家蛍光３５ｅがより検出しやすくなる。

このように、本実施形態によれば、検出領域を平面で検出するとともに、マルチチャンネルの蛍光用受光装置を備えることで、生物粒子３５に対する計数精度をより向上させることができる。

１ 光検出システム
２ 自家蛍光計数システム
１０ 発光装置
２０ 照射光学レンズ系
３０ 対象流動装置
４０ 第１集光光学レンズ系
５０ 遮光装置
６０ 散乱光選択光学装置
６５ 遮光壁
７０ 自家蛍光選択光学装置
８０ 第２集光光学レンズ系
９０ 蛍光用受光装置
１００ 第３集光光学レンズ系
１１０ 散乱用受光装置
２００ 検出信号処理部
３００ データ処理部
４００ 報知部

Claims (12)

1. 検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光を照射する発光手段と、
   前記対象物又は前記液体と前記発光手段により照射された光との相互作用により放出される光について、前記発光手段により照射される前記光の偏光方向と同じ偏光方向を有する光を遮蔽する偏光光学選択手段と、
   前記偏光光学選択手段により透過された後の光の有無に基づいて、前記液体に生物粒子が含まれるか否かを判定する生物粒子判定手段と
   を備えることを特徴とする生物粒子計数器。
2. 請求項１に記載の生物粒子計数器において、
   前記偏光光学選択手段を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じる大きさの第１信号を出力する自家蛍光受光手段と、
   前記対象物から放出される散乱光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じる大きさの第２信号を出力する散乱光受光手段と、
   前記散乱光受光手段により出力された前記第２信号の大きさが所定の閾値以上である場合、前記液体に含まれる対象物から放出された散乱光を検出したとして検出信号を出力する散乱光検出信号出力手段と、
   前記散乱光選択光学手段から前記自家蛍光受光手段までの光路に、前記光路以外から入射する光が入り込むことを防ぐ遮光壁と
   をさらに備え、
   前記生物粒子判定手段は、
   前記散乱光検出信号出力手段により前記検出信号が出力された場合であって、前記散乱光受光手段により前記対象物から放出された前記散乱光が受光された時点と同時期に前記自家蛍光受光手段により光が受光され、前記時点と同時期に前記自家蛍光受光手段により前記受光された光に対応する前記第１信号の大きさが所定の閾値以上である場合、前記散乱光検出信号出力手段により出力された前記検出信号に対応する前記液体に含まれる前記対象物を生物粒子であると判定することを特徴とする生物粒子計数器。
3. 検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光を照射する発光手段と、
   前記対象物又は前記液体と前記発光手段により照射された光との相互作用により放出される光のうち、前記対象物から放出される自家蛍光の波長帯域を透過させる自家蛍光選択光学手段と、
   前記自家蛍光選択光学手段を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する自家蛍光受光手段と、
   前記自家蛍光受光手段からの前記信号に基づいて、前記液体に生物粒子が含まれるか否かを判定する生物粒子判定手段と
   を備え、
   前記自家蛍光受光手段は、
   前記発光手段により照射される前記光の偏光方向から前記対象物により放出される光を受光することを特徴とする生物粒子計数器。
4. 検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光を照射する発光手段と、
   前記対象物又は前記液体と前記発光手段により照射された光との相互作用により放出される光のうち、前記発光手段により照射される前記光の偏光方向と進行方向に直交する方向に前記対象物から放出される自家蛍光の波長帯域を透過させる第１自家蛍光選択光学手段と、
   前記対象物又は前記液体と前記発光手段により照射された光との相互作用により放出される光のうち、前記発光手段により照射される前記光の進行方向に前記対象物から放出される自家蛍光の波長帯域を透過させる第２自家蛍光選択光学手段と、
   前記第１自家蛍光選択光学手段を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する第１自家蛍光受光手段と、
   前記第２自家蛍光選択光学手段を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する第２自家蛍光受光手段と、
   前記第１自家蛍光受光手段により出力された信号と前記第２自家蛍光受光手段により出力された信号を差分した差分信号を出力する差分手段と、
   前記差分手段からの前記差分信号に基づいて、前記液体に生物粒子が含まれるか否かを判定する生物粒子判定手段と
   を備えることを特徴とする生物粒子計数器。
5. 検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光のパルスを照射する発光手段と、
   前記対象物又は前記液体と前記発光手段により照射された光との相互作用により放出される光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する受光手段と、
   前記受光手段により出力された信号ついて、散乱光による信号が出力された後から、数ナノ秒以内に自家蛍光による信号が出力されたか否かに基づいて、前記液体に含まれる前記対象物が生物粒子であるか否かを判定する生物粒子判定手段と
   を備えることを特徴とする生物粒子計数器。
6. 検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光を照射する発光手段と、
   前記対象物又は前記液体と前記発光手段により照射された光との相互作用により側方に放出される光のうち、透過する前記液体から放出されるラマン散乱光を低減し、且つ前記対象物から放出される自家蛍光を透過させる自家蛍光選択光学手段と、
   前記自家蛍光選択光学手段を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する受光素子を複数配列した多分割受光素子からなる自家蛍光受光手段と、
   前記自家蛍光受光手段の前記各受光素子からの前記信号について、一部の前記受光素子からの前記信号が他の前記受光素子からの前記信号よりも大きい場合に、前記液体に生物粒子が含まれると判定する生物粒子判定手段と
   を備えることを特徴とする生物粒子計数器。
7. 検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光を照射する発光工程と、
   前記対象物又は前記液体と前記発光工程により照射された光との相互作用により放出される光について、前記発光工程により照射される前記光の偏光方向と同じ偏光方向を有する光を遮蔽する偏光光学選択工程と、
   前記偏光光学選択工程により透過された後の光の有無に基づいて、前記液体に生物粒子が含まれるか否かを判定する生物粒子判定工程と
   を含むことを特徴とする生物粒子計数方法。
8. 請求項７に記載の生物粒子計数方法において、
   前記偏光光学選択工程を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じる大きさの第１信号を出力する自家蛍光受光工程と、
   前記対象物から放出される散乱光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じる大きさの第２信号を出力する散乱光受光工程と、
   前記散乱光受光工程により出力された前記第２信号の大きさが所定の閾値以上である場合、前記液体に含まれる対象物から放出された散乱光を検出したとして検出信号を出力する散乱光検出信号出力工程と、
   前記散乱光選択光学工程から前記自家蛍光受光工程までの光路に、前記光路以外から入射する光が入り込むことを防ぐ遮光工程と
   をさらに含み、
   前記生物粒子判定工程は、
   前記散乱光検出信号出力工程により前記検出信号が出力された場合であって、前記散乱光受光工程により前記対象物から放出された前記散乱光が受光された時点と同時期に前記自家蛍光受光工程により光が受光され、前記時点と同時期に前記自家蛍光受光工程により前記受光された光に対応する前記第１信号の大きさが所定の閾値以上である場合、前記散乱光検出信号出力工程により出力された前記検出信号に対応する前記液体に含まれる前記対象物を生物粒子であると判定することを特徴とする生物粒子計数方法。
9. 検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光を照射する発光工程と、
   前記対象物又は前記液体と前記発光工程により照射された光との相互作用により放出される光のうち、前記対象物から放出される自家蛍光の波長帯域を透過させる自家蛍光選択光学工程と、
   前記自家蛍光選択光学工程を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する自家蛍光受光工程と、
   前記自家蛍光受光工程からの前記信号に基づいて、前記液体に生物粒子が含まれるか否かを判定する生物粒子判定工程と
   を含み、
   前記自家蛍光受光工程は、
   前記発光工程により照射される前記光の偏光方向から前記対象物により放出される光を受光することを特徴とする生物粒子計数方法。
10. 検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光を照射する発光工程と、
    前記対象物又は前記液体と前記発光工程により照射された光との相互作用により放出される光のうち、前記発光工程により照射される前記光の偏光方向と進行方向に直交する方向に前記対象物から放出される自家蛍光の波長帯域を透過させる第１自家蛍光選択光学工程と、
    前記対象物又は前記液体と前記発光工程により照射された光との相互作用により放出される光のうち、前記発光工程により照射される前記光の進行方向に前記対象物から放出される自家蛍光の波長帯域を透過させる第２自家蛍光選択光学工程と、
    前記第１自家蛍光選択光学工程を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する第１自家蛍光受光工程と、
    前記第２自家蛍光選択光学工程を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する第２自家蛍光受光工程と、
    前記第１自家蛍光受光工程により出力された信号と前記第２自家蛍光受光工程により出力された信号を差分した差分信号を出力する差分工程と、
    前記差分工程からの前記差分信号に基づいて、前記液体に生物粒子が含まれるか否かを判定する生物粒子判定工程と
    を含むことを特徴とする生物粒子計数方法。
11. 検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光のパルスを照射する発光工程と、
    前記対象物又は前記液体と前記発光工程により照射された光との相互作用により放出される光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する受光工程と、
    前記受光工程により出力された信号ついて、散乱光による信号が出力された後から、数ナノ秒以内に自家蛍光による信号が出力されたか否かに基づいて、前記液体に含まれる前記対象物が生物粒子であるか否かを判定する生物粒子判定工程と
    を含むことを特徴とする生物粒子計数方法。
12. 検出する対象物を含む液体に向けて直線偏光の所定の波長の光を照射する発光工程と、
    前記対象物又は前記液体と前記発光工程により照射された光との相互作用により側方に放出される光のうち、透過する前記液体から放出されるラマン散乱光を低減し、且つ前記対象物から放出される自家蛍光を透過させる自家蛍光選択光学工程と、
    前記自家蛍光選択光学工程を経た後の光を受光し、前記受光した際の光の光量に応じた大きさの信号を出力する受光素子を複数配列した多分割受光素子からなる自家蛍光受光工程と、
    前記自家蛍光受光工程の前記各受光素子からの前記信号について、一部の前記受光素子からの前記信号が他の前記受光素子からの前記信号よりも大きい場合に、前記液体に生物粒子が含まれると判定する生物粒子判定工程と
    を含むことを特徴とする生物粒子計数方法。