CN110226082B - 具有多个强度峰值设计的流式细胞仪 - Google Patents

Abstract

感测系统包括用于将至少一种分析物提供到至少一个感兴趣区域中的至少一个微流体通道；用于提供激发辐射的至少一个辐射传输系统，该激发辐射激发穿过感兴趣区域的分析物使之发射辐射；以及用于收集从至少一个感兴趣区域发射的任何辐射信号的辐射收集系统。该至少一个辐射传输系统提供包括其间距离为已知的多个激发辐射强度峰值的激发辐射，使得至少一种分析物，当穿过至少一个感兴趣区域时，在穿越多个激发辐射强度峰值中的每一者之际发射其强度的最大值的辐射信号。该感测系统还包括用于基于所收集的从至少一个感兴趣区域发射的辐射对微流体通道内的至少一种分析物的速度测量的装置，其包括用于获得由至少一种分析物发射的辐射信号中的最大值之间的时间的定时装置。

Description

具有多个强度峰值设计的流式细胞仪

发明领域

本发明涉及分析物传感领域。更具体地，它涉及检测、计数和分析流中的分析物，例如流式细胞计数。

发明背景

流式细胞计数是用于分析物的检测、计数以及甚至分析的技术。这种分析可以是光学的，通过荧光细胞计数法，散射等，其根据用户的特定需要和分析物的类型来选择。流式细胞计数适用于生物分析物，诸如细胞，但它可以被扩展到其他分析物，诸如病毒、抗体、DNA、酶、蛋白质等。

紧凑型细胞仪是令人满意的，特别是在护理点和/或便携式设备的领域中。微流体，其意味着在基板上制造微观通道(微流体通道)，可以很容易地应用于该领域。这样允许用于彻底分析所需的样品量的减少。

然而，微流体通道带来额外的问题。一般来说，由于层流，流体中的分析物不以相同速度移动。在一般通道(不仅是微流体通道)的中心附近行进的相同分析物将比通道壁附近的分析物移动得更快。在非微流体通道中，与其余的分析物相比，在通道壁附近移动的分析物的数量非常少，并且可以忽略层流的影响。因此，在宽流体通道的情况下，分析物的速度可以近似于流速。在这些情况下，如果在分析后需要对分析物采取行动，诸如识别、标记、分类或第二次分析，则流动和流速应该被准确地测量。流动传感器可被用于测量该速度。

然而，宽通道难以包括在集成和紧凑型细胞仪中。通常，这些期望的集成细胞仪包括微流体通道，但是在这种微流体通道中层流的影响更明显，因为壁附近的分析物的数量与微流体通道的中心附近的分析物的数量相当。例如，在包括两个分析区域(也称为感兴趣区域或ROI)的紧凑型流式细胞仪中，可以在第一区域中检测到第一慢分析物，并且可以在第一分析物到达第二ROI之前在第一和第二ROI中检测到第二快分析物。因此，第二分析物可能被误认为是第一分析物，反之亦然。因此，在第二ROI中测量的分析物可能被错误地识别，导致错误的结果。

US2005105077公开了从相对于流动轴线以一定角度定向的VCSEL获得的聚焦斑点阵列，以便改善流动中的测量。该设置需要许多检测器和VCSEL，这会消耗大量能量。

US4906094公开了一种相对宽的通道，其包括小的散射区域，分开很长的距离以便获得良好的速度测量。该设置容易发生错误识别和层流的其他错误。

US2013037726公开了一种具有两个光源的通道，这两个光源照射通道的相同部分。每个光源通常需要特殊和复杂的设置，例如每个光源可以以不同的调制频率和/或波长发射，以便改善粒子辨别。

US2008268469公开了一种用于分析微粒的系统，其包括用于控制一个方向和相反方向上的流动的装置，诸如泵和阀，用于改善塞子中微粒的分析。

US2009071225公开了用于校准流式细胞仪的存储介质和脉冲相关系统。它公开了通过在不同的询问点之间提供很大的间隔来避免同时的粒子询问，其中每个询问点提供不同的测量通道，并且在具有不同粒子的通道中分配不同系列的脉冲。在该系统中使用用于飞行时间分析的校准粒子。

WO2004040319公开了一种具有用于微流体系统的连续分支的分束器装置，其可用于提供多个用于沿微流体通道分析的位置。

US2002093641公开了一种用于测量对象的速度并通过在入射在速度检测器上的光的路径中引入光栅来用于提高距离标度的精度，从而改善检测器的视场的轮廓的方法和装置。

US2004057050公开了一种荧光检测器，其具有少量源并且改善了激光器的使用寿命。它公开了根据响应于散射光(或立即或在延迟之后)从输出端接收的信号激活第二激光，以产生飞行时间测量。

总之，将分析物的速度近似于流速可在微流体通道中引入大量误差。

在流速中执行校正是可能的，但是由于速度流量、涡流等的变化，它容易出错，导致识别错误。测量微流体通道不同部分中的流速会扰乱流动(例如，使用基于悬臂的光流控传感器)或增加设置和测量系统的复杂性(在使用多普勒技术，诸如激光多普勒测速仪的情形中)。在稀释溶液的情况下使用沿微流体通道的若干分析物检测器并测量它们的平均速度可能是有帮助的，其中在一个分析物和下面的分析物之间有足够的距离。然而，高稀释度会带来错误、污染，并且会降低产量，这增加了分析时间，这在医疗应用中是严重的缺点。

发明内容

本发明的各实施例的目的是提供一种感测系统，其包括用于检测流中的分析物的光学检测器，该光学检测器具有分析物速度检测和识别能力，允许高产量和低或无错误识别。另一个目的是提供这种感测系统在微流体系统中的集成。

在第一方面，本发明提供了一种感测系统，包括：

至少一个微流体通道，用于将至少一种分析物提供到至少一个感兴趣区域中。

至少一个辐射传输系统，用于提供可见的、IR或UV激发辐射，该激发辐射用于激发穿过至少一个感兴趣区域的分析物，使得该分析物在接收到这样的激发辐射时发射辐射信号。

辐射收集系统，用于收集从至少一个感兴趣区域发射的辐射信号。

该至少一个辐射传输系统被适配成提供包括多个激发辐射强度峰值的激发辐射，由此激发辐射强度峰值之间的距离是已知的，使得所述至少一种分析物在穿过所述至少一个感兴趣区域时，在穿越多个激发辐射强度峰值中的每一个之际，发射或散射包括其强度的最大值的辐射信号。发射与荧光有很大关系。然而，根据本发明的实施例，对象不需要是荧光的，并且如果它不是，它仍然可以修改光束以便速度可被检测到。

感测系统还包括用于基于所收集的从至少一个感兴趣区域发射的辐射信号对流体通道内的至少一种分析物的速度测量的装置，该用于速度测量的装置包括用于获得由至少一种分析物发射的辐射信号的最大值之间的时间的定时装置。

本发明的实施例的一个优点是在检测之际感兴趣的分析物的瞬时速度可以被直接测量。另一个优点是分析物速度和光谱信息可被同时获得。在根据本发明的特定实施例的感测系统中，流体通道可以是微流体通道。本发明的各实施例的优点在于，可以针对预定分析物来优化速度的测量。另一个优点是，通过测量与激发辐射中的穿越峰值和峰值之间的预定距离相关的周期，可以以简单的方式容易地计算速度。

在根据本发明的实施例的感测系统中，激发辐射强度峰值之间的距离可以在分析物的平均直径的一半与分析物的平均直径的两倍之间。本发明的这些实施例的优点是同时检测多个分析物的概率很小，同时获得良好的分辨率和所发射信号最大值的区分。

在根据本发明的实施例的感测系统中，至少一个辐射传输系统可以包括波导、多个分离波导分支、以及在波导与分离波导分支之间的用于分离由波导提供的激发辐射并将其引导到多个分支中的分束器。在这样的实施例中，每个峰的强度以及波长可以是相同的，因此简化了检测和测量，并使该系统易于与光谱、荧光和/或散射测量结合。

在根据本发明的实施例的感测系统中，至少一个辐射传输系统可以包括与通道的宽度相比长的光栅，从而确保当定向光束基本上覆盖通道的宽度时，各细胞不能在不被检测到的情况下通过。

根据本发明的实施例的感测系统可包括多个感兴趣区域和用于向每个感兴趣区域提供不同波长的辐射的多个辐射传输系统。这样，可以对不同的分析物进行多种测量。例如，可以使用不同的荧光标签，并且在本发明的实施例中，每个标签可以被预定波长最佳地激发。

在根据本发明的实施例的这种感测系统中，多个辐射传输系统中的每一个可被适配成提供用于流体通道内的至少一种分析物的速度测量的装置。可以针对每个分析物跟踪速度，改进其识别并允许校正(例如由于流体通道内的横向位移引起的)速度的变化。

在根据本发明的实施例的感测系统中，多个感兴趣区域和多个辐射传输系统可以沿多个流体通道布置。这允许并行测量，进一步提高了产量。

在根据本发明的实施例的感测系统中，辐射收集系统可以包括集成光电系统。在这样的实施例中，由分析物发出的信号很少或没有丢失。

在根据本发明的实施例的感测系统中，流体通道、辐射收集系统和至少一个辐射传输系统可被集成在单个感测单元中。这样，可以获得紧凑、高度便携和精确的设备。

根据本发明的实施例的感测系统可进一步包括光谱分析装置，用于分析从至少一个感兴趣区域收集的辐射。

根据本发明实施例的感测系统还可以包括用于发射激发辐射的辐射源，激发辐射被适配成在穿过至少一个感兴趣区域的分析物中产生荧光发射，该辐射收集系统被适配成用于收集来自该分析物的荧光发射。这些实施例允许具有速度校正允许低错误识别的紧凑型荧光细胞仪的构建。

根据本发明实施例的感测系统还可以包括处理模块，用于在考虑测得速度的情况下识别分析物。

在第二方面，本发明提供了一种细胞分类装置，其包括根据第一方面的实施例的感测系统，并且还包括用于根据分析物的识别对分析物进行分类的分类装置。这样，可以获得适用于芯片实验室的集成细胞分类装置。这种分类装置可以是包含细胞分类器(芯片)的完整仪器。

在第三方面，本发明提供了一种细胞计数装置，其包括根据第一方面的任一实施例的感测系统，并且还包括控制装置，用于在估计至少一种分析物通过感测系统中的特定位置时，基于测得的至少一种分析物的速度来产生控制信号，该控制信号用于触发对分析物的动作或用于触发脉冲分析。感测系统中的特定位置可以是任何有用的位置，诸如举例而言，何时分析物穿过来自光源的光束，或者在光学检测器(或成像器)的前面，或者通常在频道/系统(例如，成像器或图像传感器和/或分类器)的特定位置。在本发明的实施例中，控制信号可被使用，但不需要被使用，以便仅触发光学光源或检测器和/或图像传感器而不进行分类。因此，它可以用于还触发装置的一些控制信号(激活、停用电源、信号生成、检测等)。

在所附独立和从属权利要求中阐述了本发明的特定和优选方面。来自从属权利要求的特征可以与独立权利要求的特征以及其他从属权利要求的特征适当地结合，而不仅仅是如在权利要求中明确阐述的。

本发明的这些以及其他方面从下文所描述的(多个)实施例中将变得显而易见并且将参考这些实施例来进行阐明。

附图的简要说明

图1解说了根据本发明的实施例的感测系统和激发辐射的辐射轮廓。

图2解说了根据本发明实施例的两个感测系统，其分别包括双强度峰值和单峰值，以及两个双强度峰值。

图3解说了根据本发明的实施例的读出系统。

图4解说了具有异步数字块的并行感测系统。

图5解说了用于双强度峰值激发辐射的生成的波导的两个示例。

图6示意性地解说了作为时间的函数的检测信号的强度，其示出了根据本发明的实施例的穿越ROI的两个分析物的两个检测事件。

图7解说了根据本发明的实施例的细胞分类装置。

权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。

在不同的附图中，相同的附图标记指示相同或相似的要素。

具体实施方式

将就具体实施例并且参考特定附图来描述本发明，但是本发明不限于此而仅由权利要求书来限定。所描述的附图仅是示意性且非限制性的。在附图中，出于说明性目的，可将要素中的一些要素的尺寸放大且不按比例绘制。尺寸和相对尺寸不对应于对本发明的实施的实际缩减。

说明书和权利要求书中的术语第一、第二等被用于区分相似要素，而不一定用于描述时间上、空间上、等级上或其他方式上的顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的并且本文中所描述的本发明实施例与本文中所描述或图示的相比能够以其他顺序操作。

另外，说明书和权利要求书中的术语顶部、下方等等被用于描述性目的而不一定用于描述相对位置。应该理解，如此使用的这些术语在合适情况下可以互换，并且本文描述的本发明的实施例能够以除了本文描述或说明取向的之外的其他取向来操作。

应注意，权利要求中使用的术语“包括”不应被解释为限定于其后列出的装置；它并不排除其他要素或步骤。因此，该术语应被解释为指定如所提到的所陈述的特征、整数、步骤或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤或组件、或其群组的存在或添加。因此，表述“一种包括装置A和B的设备”的范围不应当被限定于仅由组件A和B构成的设备。这意味着对于本发明，该设备的仅有的相关组件是A和B。

贯穿本说明书对“一个实施例”或“实施例”的引用意指结合该实施例描述的特定的特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施例中。因此，短语在“一个实施例中”或“在实施例中”贯穿本说明书在各个地方的出现并不一定全部指代同一实施例，而是可以指代同一实施例。此外，在一个或多个实施例中，如从本公开中对本领域普通技术人员将是显而易见的，特定的特征、结构或特性可以用任何合适的方式进行组合。

类似地，应当领会，在本发明的示例性实施例的描述中，出于精简本公开和辅助理解各发明性方面中的一个或多个发明性方面的目的，本发明的各个特征有时被一起编组在单个实施例、附图或其描述中。然而，这种公开的方法不应被解释为反映所要求保护的本发明需要比每项权利要求中所明确记载的更多特征的意图。相反，如所附权利要求反映的，各发明方面可以存在比单个前述公开的实施例的全部特征更少的特征。因此，具体实施方式之后所附的权利要求由此被明确纳入本具体实施方式中，其中每一项权利要求本身代表本发明的单独实施例。

此外，尽管本文中所描述的一些实施例包括其他实施例中所包括的一些特征但不包括其他实施例中所包括的其他特征，但是不同实施例的特征的组合旨在落在本发明的范围内，并且形成如将由本领域技术人员所理解的不同实施例。例如，在所附的权利要求书中，所要求保护的实施例中的任何实施例均可以任何组合来使用。

在本文中所提供的描述中，阐述了众多具体细节。然而应理解，在没有这些具体细节的情况下也可实践本发明的实施例。在其他实例中，公知的方法、结构和技术未被详细示出以免混淆对本描述的理解。

在本发明的实施例中，对“感兴趣区域”或简称“ROI”作出参考，对分析物(例如在研究中，细胞、颗粒、染色细胞、循环肿瘤细胞、蛋白质等)可能会穿越的区域作出参考。通常，ROI是由辐射源发出的激发辐射照射的区域。ROI可以具有与分析物相当或者小于分析物的体积。在这种情况下，据说该系统提供点信息，并且激发辐射聚焦于该小体积。ROI也可以是平面区域，例如，分析物穿越的二维区域。

在本发明的实施例中，对“直径”作出参考，例如分析物的直径，对球形分析物的球形直径的传统意义作出参考，但它也具有与分析物(例如，非球形分析物)的边界相切的两条相对平行线之间的最长距离的更普遍的含义。

在本发明的实施例中，对“激发辐射”作出参考，对适配成用于激发分析物的辐射作出参考，然后该辐照可发射携带关于分析物的形态、组成等的信息的辐射信号。当由分析物发射的辐射信号被检测器收集时，据说发生了“检测事件”。

在第一方面，本发明涉及一种用于感测流中的分析物的感测系统。该感测系统包括用于光学分析，并且被适配成结合检测和定时装置获得分析物的速度的辐射源。该感测传感系统可以很容易地被适配成用于流式细胞仪，允许计数、光学分析和测速，以及甚至分类的组合。

在本发明的实施例中，至少一个辐射源可提供用于激发穿过感兴趣区域分析物的激发辐射。该激发辐射可以通过从激光谐振腔、波导、光纤或任何其它合适的辐射承载装置的外耦合而被引导到感兴趣区域中。例如，在波导或光纤的情况下，可以通过外耦合光栅执行信号外耦合；尽管本发明不限于此。

可以选择激发辐射，和/或可以适配分析物，使得在接收激发辐射之际由分析物生成和发射特定类型的辐射信号(例如，辐射散射或荧光信号)。在本发明的一些实施例中，分析物被适配成在它们进入由特定激发辐射(例如，激光)照射的ROI时发射荧光辐射。为了获得这一点，分析物可以例如是荧光的，或者它们可被附连到一个或多个荧光团上。

在本发明的实施例中，分析物被提供在流体介质中，使该流体介质流经流体通道进入ROI。在一些实施例中，流体通道是微流体通道，但是本发明不限于此，并且它可以应用于高度比其宽度更小，甚至小的多的宽通道。

本发明的一些实施例包括一种包括一个或多个检测器的检测系统。这些检测器也可被选择或适配成用于特定类型的辐射，例如，由存在于ROI中并具有已知的预定波长范围的分析物发射的辐射信号。该系统包括成像器、CMOS单元、CCD等，并且它包括进一步包括镜头、滤波器、单色器等。

在本发明的实施例中，包括定时装置，用于结合检测系统和激发辐射测量来分析物的速度。

在本发明的实施例中，激发辐射和定时装置可被适配成提取关于穿过ROI的分析物的速度的信息。

在现有的光学系统中，激发辐射包括一个强度最大值，其足够高以在分析物中产生某种类型的可测量响应或信号，诸如可检测的前向、侧向和后向散射、荧光发射、拉曼散射等。在本发明的实施例中，激发辐射设置有多于一个的强度峰值，例如两个强度峰值或更多个强度峰值，从而在分析物穿越ROI时产生分析物的多个响应。激发强度峰值之间的距离与分析物的相关尺寸参数(直径、宽度、长度等)相当。从这种激发辐射获得的信息包括光谱信息(来自由分析物发射的辐射信号的辐射波长和强度)和速度信息(从发射与强度峰值间隔之间经过的时间)。例如，激发辐射中的两个最大峰值之间的距离可以是球形细胞的直径的一半，或者与直径相同，或者是大致直径的两倍。

使用具有单一强度峰值的激发辐射来获得分析物的速度将是可能的，但是激发辐射需要广泛分布(例如，其半峰全宽FWFM需要比预期分析物更大，例如大的多)以便使由分析物发出的信号定时并使用获得的信号持续时间来计算分析物速度成为可能。然而，信号将非常小，并且在发射的开始和结束时信号的对比度小得多(阻碍对信号持续时间的估计)。此外，若干细胞同时穿越宽激发光束的概率增加。使用一个以上的强度峰值有利地有助于增加分析物发射的信号的强度。另外，它提供了比激发辐射中分析物的进口和出口更容易检测的多个参考点(在穿越每个强度峰值之际发射的信号)。此外，使用多个强度峰值使得不需要使用宽激发辐射，因此减少了同时检测多种分析物的机会。

在本发明的实施例中，分析物可以大于激发辐射的单个强度峰值。例如，每个峰值的半峰全宽(FWHM)可以小于分析物的平均直径或横截面的最长轴。比预期分析物大得多或小得多的杂质可以在进入ROI时与分析物区分开，并且可以被忽视或识别为诸如举例而言，杂质。

在本发明的一些实施例中，选择激发辐射使得它基本上不具有与由检测器易于检测的范围相同的波长范围。在某些类型的荧光检测器的情况下，激发辐射的波长范围优选地不与分析物的荧光发射的波长范围重叠。滤波器可以位于ROI与探测器之间，用于减少或消除来自由流动中的分析物弹性散射(并且携带与激发辐射相似的波长)的应变辐射的噪声。

在其他实施例中，检测器被允许并适配成接收具有与激发辐射(例如，背散射、侧散射或前向散射辐射)相似或相同波长的辐射。

在一些实施例中，分析物可以是附着有荧光标记物(例如，生物标记物，诸如荧光蛋白、荧光团等)的细胞。在本发明的特定实施例中，一种类型的分析物可以用标记物的混合物标记，或者可替换地，不同类型的分析物可以用不同类型的标记物各自标记。同样，可发生组合。

本发明实施例中的分析物不限于细胞，还可包括细菌和颗粒，诸如举例而言，流式荧光检测(luminex)。

在本发明的一些实施例中，激发辐射通常是可见辐射，例如，可见激光辐射，虽然本发明不限于此，并且可以使用其他类型的辐射源，诸如举例而言，UV激光。

在本发明的一些实施例中，感测系统可以在距离远的ROI中向分析物提供多个激发辐射。不止一个ROI，例如每个ROI，可被适配成获得分析物的速度。通常可存在于流式细胞仪中的其他组件，诸如举例而言，分析物提供器、流动室、流速检测器和其他传感器(例如温度)、样品入口、光学系统等是本领域技术人员已知的。

本发明的实施例可以包括分类系统或可以被包括在分类系统中。例如，一旦针对穿越ROI的每个分析物测量并识别了速度，就可以预测给定分析物将穿越另一个区域，例如分类区域的时刻，并且致动(流动压力的变化、电致动、细胞计数系统等)可被用于例如通过给定的分类(微流体)通道发送分析物。

图1顶部的绘图示出了根据本发明一些方面的包括激发辐射103的布置。激发辐射103包括两个强度峰值101、102。两个强度峰值具有基本相同的强度和波长，并且分开距离“d”，例如从FWHM的中心计算的距离，或最大值之间的距离等。微流体通道104穿越两个强度峰值，并且分析物105在流中以速度“v”在其中流动。两个强度峰值101、102之间的距离“d”可被设计为一方面减少同时测量多于一种分析物的机会，并且另一方面，允许足够的分辨率以能够区分多个信号最大值。例如，距离“d”可以与预期分析物105的尺寸具有相同的顺序，从而允许速度测量的优化。例如，在使用具有荧光团作为标记物的抗体的典型细胞计量学中，可以用于距离d的一系列值可以在分析物直径的一半和分析物直径的两倍之间。

距离“d”可取决于预期分析物上的设置。例如，如果分析物是平均10μ0的血细胞，则该距离可以是5-20μm。如果分析物是平均2μm的细菌，那么该距离可以在约1和约4μm之间。

图1的底部的图形110示出了作为时间“t”的函数的由分析物发射的辐射(例如荧光)信号的强度“I”。“t0”处的信号最大值111表示分析物105穿越激发辐射103的第一强度峰值101的时刻，而“t1”处的信号最大值112表示分析物105穿越第二强度峰值102的时刻。这些时刻可被定义为由分析物发出的辐射信号为最大的时刻。因为强度峰值101、102之间的距离“d”是已知的，所以第一峰值111与第二峰值112之间的时间差(t1-t0＝δt)的测量导致对分析物105在由激发辐射103照射的ROI处的速度“v”的精确测量。可以非常精确地估计瞬时速度，并且这可以与适合于例如细胞术、荧光分析、细胞计数等的光学分析同时进行。

在一些实施例中，激发辐射可包括两个以上强度峰值，例如，三个或更多个峰值，允许速度测量和细胞尺寸的估计的改进。它们可能具有相同的强度，尽管这不是必需的要求。这些峰值可以具有不同的强度。激发辐射的每个峰值可以优选地具有相同的波长，尽管如果已知对于形成激发辐射的多个峰值的每个波长将容易检测到发射就可以使用不同的波长。

由穿越激发辐射的分析物发出的辐射信号可由感测系统来采集。该感测系统可包括用于测量各强度峰值(诸如，峰值111、112)之间的时间的计时器，从而获得沿着激励辐射103的分析物105的速度。多亏分析物105的速度v的测量，流中的每个分析物105可被清楚地识别。该信息可被用于分类；例如：分析物可在特定的速度下以特定的发射(例如荧光)检测，而在下游，电泳或压力手段可将分析物移动到给定的分类(微流体)通道。如果两个分析物以不同的速度穿越激发辐射，归因于对每个分析物将要到达分类区域的时刻的识别和预测，分类系统可以分类出每个分析物。根据本发明系统的一些实施例，这种预测可由处理器单元执行。

分析物105相对于流动的速度v可以给出其类型的一般指示。例如，在现有技术的检测器中，刚好可以通过从ROI获得发射来检测存在。如果没有提供全息、前向或侧向散射测量，则从测量中获取的唯一信息是分析物是否通过，以及发射的强度和波长。这不是诸如举例而言，分析物的大小或粗糙度之类因素的良好指示符。本发明通过例如将分析物的瞬时速度与独立测量的流速进行比较，来提供流中的瞬时速度，从而给出关于例如分析物的尺寸、动量、粗糙度等的更多信息。该信息可以与来自所发射的辐射信号的信息相组合。

样品可包含多种，例如具有不同特征(例如，不同的尺寸或粗糙度)的两种不同的分析物，两者都易于附着在同一荧光团上。由于附着的荧光团是相同的，所以一个或另一个的信号实际上是难以区分的。当用激发辐射照射时，两种分析物都会给出相同的荧光信号。然而，本发明的实施例在检测每种分析物之际允许根据其瞬时速度对其进行区分和分类，而不需要昂贵和复杂的设置或高分辨率成像系统。此外，例如细菌的速度可用于表征它们产生的菌落。细菌通常形成菌落，并因此而表现或移动不同。

也可以使用该设置执行其他测量。例如，另外，计时器可以测量ROI开始和停止发射辐射的时刻之间经过的时间。该测量与流速的测量结合可以给出对分析物的尺寸的近似。

根据本发明实施例的感测系统可以包括多个ROI，每个ROI用激发辐射照射，并且其中的至少一个用包括多个强度峰值的激发辐射来照射。图2中示出了这类系统的示例。例如，在荧光检测器中，可以针对多个标记优化每个激发辐射的波长和/或强度。可以使用由激发辐射的源单独照射的多个ROI来精确地研究其中标记在特定波长范围(取决于入射激发)处发射荧光的那些情况。可以根据由检测系统中的每个检测器接收的辐射来跟踪和识别行进通过多个ROI的每个特定分析物，其可以有利地针对每个分析物进行优化。在大量分析物的情况下，本发明允许通过测量每种分析物的速度来适当地识别每种分析物。

图2的上图示出了通道104，例如，微流体通道(具有中心轴201)，多个分析物105、202流过该微流体通道。这些分析物105、202可以分别以不同的速度v和v'行进。速度的差异可能源于它们的相对尺寸、粗糙度以及甚至距微流体通道104的中心轴201的距离的差异。在图2的特定情况下，第一分析物105以速度v靠近轴201行进，而第二分析物202由于例如不同的层流而以不同的速度v'进一步远离轴201而靠近微流体通道104的壁行进。该系统包括两个激发辐射103、203，其照射两个ROI。第一激发辐射103(相对于流方向)包括两个强度峰值101、102，如图1中所示，而另一激发辐射203包括单个强度峰值。例如，第一激发辐射103可被用于简单地测量速度，从而识别分析物，而第二激发辐射203可被用于荧光分析。激发辐射203可以在使用时始终照射相应的ROI，或者它可以仅在基于分析物在穿越第一ROI时的速度测量预测到分析物要穿过第二ROI时的时刻而开启。在其他实施例中，激发辐射s103、203两者都可被用于分析，例如，两者均可被用于荧光分析。另外的激发辐射203可以由与第一激发辐射103的波长不同的波长表征，从而产生针对给定分析物或荧光标记物优化的额外测量阶段。替换地，两个ROI中的激发辐射103、203可以呈现相同的波长。可以轻松实现更多ROI，从而提供多个测量阶段。可以执行使用不同波长的多重分析。在本发明的实施例中，通过在穿越第一激发辐射103的同时测量第一ROI中的分析物的速度，可以预测相同分析物将穿越另外的激发辐射203的时刻，因为在第一和第二激发辐射103、203(在第一和第二ROI之间)的距离D可以是已知的，并且分析物在该距离上的速度可以被认为是恒定的。这减少或避免了分析物错误识别的风险。此外，预测分析物将穿越由另外的激发辐射203照射的另一ROI的时刻可以实时地进行，例如通过诸如处理器、微处理器等的计算装置，其可以接收速度信息并识别分析物。

图2的下图示出了另一种配置，其中多个激发辐射，例如，所有激发辐射-在所示实施例中，两个探测光束103、213-呈现多个强度峰值。第一双强度峰值101、102形成激发辐射103，并且第二双强度峰值211、212形成包括另外的激发辐射213的另一ROI。如前所述，每个激发辐射可以由相同或不同的波长表征，这使多种类型的分析物的优化分析成为可能。在本发明的实施例中，由第一激发辐射103照射的第一ROI处和由第二激发辐射213照射的第二ROI处的分析物的速度可被测量。这消除了预测给定细胞可能穿越另一ROI的时间的需要。对于在类似条件下速度及其变化的精确测量而言，由激发辐射103、213照射的第一和第二ROI的强度峰值101、102，对应的为211、212之间的距离的d、d'可以是相同的。然而，在替代实施例中，强度峰值101、102，对应的为211、212之间的距离d、d'可以是不同的，并且可以针对不同类型和尺寸的分析物进行优化，例如，峰值之间的距离可与预期细胞的大小相同或可为其一半。

可以将每个分析物的速度与在每个ROI中获得的光谱信息一起记录，并且可以离线执行数据分析，从而实时地放宽计算的要求。这允许仅在记录模式下操作，并且可以增加产量，从而允许在稍后阶段执行耗时的计算和识别。此外，如果两个不同速度的分析物同时穿越一个ROI，则双信号可以使用来自由多强度峰值激发辐射照射的进一步的ROI的信息来被轻松检测和校正。此外，可以容易地检测分析物的速度变化并将其考虑在内以便正确识别。这些变化可能源于例如影响层流的不规则通量、涡流或分析物朝向微流体通道壁的横向位移。

图3示出了根据本发明的一些实施例的适合于收集以速度v移动通过微流体通道104的分析物105的光谱和速度信息的感测系统210。由ROI中的分析物发射的辐射信号可被收集到辐射收集系统301中，辐射收集系统301可以是检测系统或将辐射发送到检测器的光学系统。尽管光学系统给出了更多的设计灵活性(例如，检测器可以在系统外部，并且可以使用不同的检测器)，如果辐射收集系统301是检测系统，则可以以较低损失或没有损失来有利地收集来自ROI的大部分或全部辐射，而没有光学系统典型的吸收、泄漏或反射。而且，光信号可以容易地被转换成电信号，这是更通用的并且接受放大。例如，荧光检测器可以位于微流体通道104的下方或顶部，用于收集由分析物或其附着的荧光标签发射的辐射信号(例如荧光)。还可以包括光学系统(例如，包括透镜、和/或耦合光栅，和/或波导等，用于收集辐射并将辐射发送到检测器)。可以在信号分析模块302中分析由辐射收集系统301收集的信号。例如，分析模块302可以将由检测系统(作为辐射收集系统301)收集的光信号转换成电子信号，该电子信号可以使用定时装置303被进一步处理并识别。分析模块302和/或辐射收集系统301可以包括光电元件、CMOS单元、模数转换器、FPGA、实时DSP等。该定时装置303可以是电子定时器、可编程逻辑控制器或类似物，并且它被包括在本发明的感测系统中，以便记录分析物通过第一和/或第二ROI中的激发辐射103、213的多个强度峰值所花费的时间。例如，定时装置303可以获得由检测器收集的第一和第二发射之间经过的时间。速度v可以容易地从激发辐射103、213的强度峰值101、102，对应的为211、212之间的预定距离d、d'获得。这些信息可以与光谱仪信息一起在处理模块304中被处理和/或记录，用于通过数据实时或在稍后的时间点识别分析物105。可以包括输出305，用于输出识别数据，例如，用于显示它。

可以包括另外的激发辐射源，每个激发辐射源例如包括用于多光谱分析的不同波长范围。如果实时处理信息，则可以预测给定分析物将在哪个时刻穿越由激发辐射照射的第二或进一步的ROI。可任选地，照射第二或进一步的ROI的激发辐射可以仅在预测分析物通过的时段中有效，减少微流体通道的功率使用、功率耗散和加热。另一组检测器、分析器等可以获得并分析穿越第二或进一步照射的ROI的分析物的光谱。预测分析物将穿越第二或另外的ROI的时刻的能力，以及可任选地测量那里的分析物的速度的能力，改善了分析物的识别和测量。通过增加由激发辐射照射的更多ROI，总体上降低了错误识别的风险。

使用这种设计，可以在不同阶段快速地分析大量细胞，增加了荧光分析的灵活性和调整能力，因为大量的荧光标记和其组合可被用于单个流程，增加了分析物的区分。

给出了感测系统210的各部分的一些示例性尺寸和参数，但是本发明不限于这些参数。例如，微流体通道104的横截面可以具有50微米侧面和30微米高度的矩形或正方形形状。辐射收集系统301可以是例如成像器，其具有250微米的宽度，并且可以是例如正方形并且包括多个像素，例如7×7像素的矩阵，或10×10、100×100等，例如形成像素阵列。它们也可以是光电二极管、用于收集辐射并将其发送到分析模块(诸如，光谱仪等)的系统。空间分辨率(例如，需要被分辨的荧光的最小距离)可以是1微米。如果强度峰值101、102之间的距离d例如是10微米，则对于以10cm/s的速度移动的直径约10微米的分析物而言，将需要100k帧/秒的速率来分辨在所选空间分辨率的分析物。在实践中，检测器可以具有3.33微秒的曝光时间，并且可以达到每秒300k帧的帧速率。信号区分可以在过程或分析模块中被实现，用于仅在预定阈值上获取和/或处理数据，例如基于检测器的噪声水平。可以使用针对每个ROI的多个检测器单元。该系统可以包括其他元件，诸如光学透镜、滤波器、放大器等。大量微流体通道利用更好的系统区域，这在设备集成在芯片中的情况下是经济上有利的。

在本发明的实施例中，多个微流体通道401可被用于平行分析。感测系统可以包括多个并联配置的微流体通道401，如图4中所示。这增加了测量速度，因为可以并行分析更多数量的分析物105。这进而提高了准确性，因为放松了处理并且可以减少每个微流体通道中的分析物浓度。辐射收集系统301可以包括多个检测器，每个检测器可以包括多个像素311。每个检测系统可以包括行地址单元402和用于列读出的读出模块403、ADC、逻辑电路系统以及例如分析。由此获得的数据可以被发送到异步数字块404，例如现场可编程门阵列(FPGA)或数字信号处理器(DSP)。可以为分析、定时器和处理功能中的任何一个或全部提供集成或外部处理单元，用于进一步分析、定时和速度计算、数据存储、输出等。

另外，其他元件可以被包括在微流体系统中，诸如分析物馈送管线405、系统的下层或上层中的流体动力学聚焦馈送管线406、以及收集总线407。

本发明的实施例可以包括其他特征，诸如(发射相干光、IR、UV、激光辐射等的)一个或多个辐射源、传输来自辐射源的辐射以便照射ROI的一个或多个波导、用于将来自辐射源的辐射引入波导的耦合器、用于将来自波导的辐射引入ROI的外耦合器等。外耦合器可被适配成产生多个强度峰值，这可以通过多种技术获得。例如，可以使用众所周知且高度适应性的经典光学结构(棱镜或半反射镜分束器等)和/或提供多强度峰值的衍射光栅。

在其他实施例中，可使用专用外耦合器。

图5示出了根据本发明的一些实施例的外耦合器的示例性实施例500、510。第一实施例500包括辐射传输系统(波导)501和分束器502，其被适配成将激发辐射分成行进穿过波导的分离分支的两束(例如，具有相同强度)。一些实施例可以包括单模或多模波导、硅基波导(例如，硅衬底上的氧化硅包层中的氮化硅芯)。可以在不同类型的趁此上使用其他材料，诸如其他类型的半导体、或玻璃，石英等。辐射传输系统(波导)501可以被集成在包含微流体通道104的相同衬底内。两个外耦合光栅503、504可以从辐射传输系统(波导)501中行进的激发光束输出包括两个相同波长的强度峰值的激发辐射。例如，通过选择外耦合光栅503、504之间适当的距离505，可以调整激发辐射的两个强度峰值之间的距离d。与经典光学结构或提供多个强度峰值的特殊适配的衍射光栅(需要耗时、复杂的对准，可能体积庞大并且不易制造和集成)不同，这些类型的外耦合器对于未对准基本上不敏感，并且制造和安装是易于实现和集成的。激发辐射103的强度轮廓的形状可被适配成用于特定目的。例如，激发辐射可以包括照射分析物穿过(例如在宽通道的中心)的小体积的一对强度峰值。其他配置也是可能的，例如，图1到3示出了特定实施例，其中激发辐射103、213包括两个强度峰值101、102，其形式为延伸通过微流体通道104的宽度的光片，对应于211、212。例如，在图5中，粗箭头506表示相对于由每个光栅503、504外耦合的光片的流的方向。可以包括其他特征，例如内耦合光栅507，用于将来自光源的辐射引入辐射传输系统(波导)501。每个光片的宽度可被适配成预期分析物的大小，例如，该宽度可以比预期要检测的分析物更薄，并且它可以近似为二维光片。可以针对特定类型的细胞优化或调整本发明的实施例，例如通过根据细胞尺寸调整外耦合光栅503、504之间的距离505。

第二示例性实施例510包括具有掩模层512的长光栅511，用于分开两个峰值中的辐射强度。

可以使用其他外耦合光栅，例如聚焦光栅，其可以产生两个强度峰值，这两个强度峰值被分开一个定制的预定距离，该预定距离的定制取决于例如给定分析物的大小。还可以使用衍射光栅，其产生两个强干涉峰值。

图6示出了所检测信号的强度601与时间的示意性示例图。它示出了如图1中穿越ROI、被包括两个强度峰值的激发辐射照射的两个分析物的两个检测事件。第一事件602包括由时间段T1分开的两个信号最大值603、604。第二事件605包括由时间段T2分开的两个信号最大值606、607。数据分析可以直接提取不同分析物的周期，其与强度峰值之间的预定距离d组合，允许提取分析物的速度。在这种情况下，T1>T2，因此第一分析物的速度低于第二分析物的速度(v1<v2)。附加地或替代地，数据包分析器608可以分析积分强度，其可以被用于获得时间段T1和T2，考虑强度峰值距离d，并因此获得速度。作为示例，仅将与预定噪声水平609相比呈现高水平的信号认为是分析物的信号。例如，仅应使用信噪比(SNR)大于5的信号，例如大于10，诸如14或更大的信号。

本发明的实施例允许检测分析物的速度，能够预测分析物沿微流体通道的位置，例如用于实现脉冲分析，或用于触发对分析物的动作，例如朝向分类的微流体通道的推力或拉力。

在本发明的第二方面中，提供了一种细胞分类装置，其包括根据前一方面的实施例的感测系统，还包括分类装置。图7中示出了示意性细胞分类装置700，其包括由包括两个强度峰值的激发辐射103照射的ROI，如图1中所示。此外，微流体通道104的一部分701包括分类装置。例如，分类装置可以包括分类区域702，其包括分成两个或更多个微流体通道703、704、705的微流体通道104的分区。分类区域可以包括用于将分析物强制进入一个或另一个通道的另外的装置711、712，例如电泳装置，或用于产生压力梯度的装置，例如，例如通过气泡产生、通过膜等局部地改变微流体通道的一侧或另一侧的压力。因此，当感测系统在ROI中检测到给定的分析物时，其速度的测量允许确定在它将到达分类区域的时刻，并且可以通过知道ROI与分类区域之间的距离来执行正确的分类。因此，获得了包含细胞分析和分类的紧凑且集成的芯片上实验室设备，其具有低错误识别或无错误识别。

Claims (13)

1.一种感测系统，包括：

-至少一个微流体通道(104)，所述至少一个微流体通道(104)用于将至少一种分析物提供到至少一个感兴趣区域中，

-至少一个辐射传输系统(501)，所述至少一个辐射传输系统(501)用于提供可见的、IR或UV激发辐射(103)，所述激发辐射(103)用于激发穿过所示至少一个感兴趣区域的分析物，使得所示分析物在接收到这样的激发辐射时发射或散射辐射信号，

-辐射收集系统(301)，所述辐射收集系统(301)用于收集从散射至少一个感兴趣区域发射的辐射信号，

其中所述至少一个辐射传输系统(501)被适配成提供包括多个激发辐射强度峰值(101、102、211、212)的激发辐射(103)，

其中所述感测系统还包括用于基于所收集的从所述至少一个感兴趣区域发射的辐射对所述微流体通道(104)内的至少一种分析物(105)的速度测量的装置，所述用于速度测量的装置包括定时装置(303)，所述定时装置(303)用于获得由所述至少一种分析物(105)发射的辐射信号中的最大值之间的时间，

所述感测系统的特征在于，所述至少一个辐射传输系统(501)被适配成提供激发辐射(103)，所述激发辐射包括延伸通过所述微流体通道(104)的宽度的形成光片的多个激发辐射强度峰值(101、102、211、212)，所述激发辐射强度峰值之间的距离是已知的并且在所述分析物的平均直径的一半和所述分析物的平均直径的两倍之间，使得所述至少一种分析物(105)，在穿过所述至少一个感兴趣区域时，在穿越所述多个激发辐射强度峰值中的每一个之际发射包括其强度(601)中的最大值(111、112；603、604、606、607)的辐射信号。

2.-如权利要求1所述的感测系统，其特征在于，至少一个辐射传输系统(501)包括波导、多个分离波导分支、以及在所述波导与所述分离波导分支之间的用于分离由所述波导提供的激发辐射并将其引导至所述多个分离波导分支中的分束器(502)。

3.-如权利要求1所述的感测系统，其特征在于，至少一个辐射传输系统包括与所述微流体通道(104)的宽度相比长且具有掩模层(512)的光栅(511)，用于分开两个峰值中的辐射强度。

4.-如前述权利要求中任一项所述的感测系统，其特征在于，包括多个感兴趣区域和用于向每个感兴趣区域提供不同波长的辐射的多个辐射传输系统。

5.-如权利要求4所述的感测系统，其特征在于，所述多个辐射传输系统中的每一个辐射传输系统被适配成提供用于所述微流体通道内的所述至少一种分析物的速度测量的装置。

6.-如权利要求4所述的感测系统，其特征在于，所述多个感兴趣区域和所述多个辐射传输系统沿多个微流体通道(104)布置。

7.-如前述权利要求1-3中任一项所述的感测系统，其特征在于，所述辐射收集系统(301)包括集成光电系统。

8.-如前述权利要求1-3中任一项所述的感测系统，其特征在于，所述微流体通道(104)、所述辐射收集系统(301)和所述至少一个辐射传输系统(501)被集成在单个感测单元中。

9.-如前述权利要求1-3中任一项所述的感测系统，其特征在于，进一步包括光谱分析装置，用于分析从所述至少一个感兴趣区域收集的辐射。

10.-如前述权利要求1-3中任一项所述的感测系统，其特征在于，还包括用于发射激发辐射的辐射源，所述激发辐射被适配成在穿过所述至少一个感兴趣区域的分析物(105)中产生荧光发射，所述辐射收集系统(301)被适配成用于收集来自所述分析物的荧光发射。

11.-如前述权利要求1-3中任一项所述的感测系统，其特征在于，还包括处理模块(304)，用于在考虑测得速度的情况下识别分析物。

12.-一种包括根据权利要求11的感测系统的细胞分类装置(700)，进一步包括用于取决于分析物识别来分类分析物的分类装置。

13.-一种包括权利要求1到11中任一者的感测系统的细胞计数装置，还包括控制装置，所述控制装置用于在估计所述至少一种分析物通过所述感测系统中的特定位置时，基于测得的所述至少一种分析物的速度来产生控制信号，所述控制信号用于触发对所述分析物的动作或用于触发脉冲分析。

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