JP2010505132A - 流動式サイトメトリのパルスの区別と応用 - Google Patents

Abstract

【課題】流動式サイトメータにおいて、一つの粒子によって生成されたパルスか、複数の粒子から生成されたパルスかの区別がつかない。
【解決手段】流体中の粒子が電磁放射の励起用容積部に通され、前記電磁放射と相互作用してパルス形状の信号を生成するようになった流動式サイトメータからのパルスを分析する方法であって、前記電磁放射の前記励起用容積部を通る一以上の粒子の特性を示す時間依存パルスを生成するステップと、あらかじめ決められた値より上の開始点と終了点を有する前記パルスの一部を選択することによって測定ウインドウを決定するステップと、前記測定ウインドウにおいて時間に対する前記パルスの第一導関数を計算するステップとを含むことを特徴とする方法である。
【選択図】図９

Description

本発明は、概して、流動式サイトメトリに、特に流動式サイトメータによって作られたパルスの解析の方法とそのための装置に関する。

本出願は、合衆国法典３５巻１１９条（ｅ）に基づいて、２００６年７月２９日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６０／８４８、２００に基づく優先権を主張する。上述の関連出願は、引用により本明細書に組み入れる。

米国特許第４、０２１、１１７ 米国特許第３、９３８、０３８

流動式サイトメータシステムは、微生物の検出及び計数に用いられ、臨床診断、免疫学、たんぱく質及び核酸の検出、血液学、腫瘍学を含む生科学全体に渡る様々な用途において使用されている。商業的に入手できる計器は、広い範囲の測定が可能なように構成されている複雑な研究用のシステムから、限られた性能の安価な卓上用システムにまで渡る。現在のバイオテクノロジー市場において、流動式サイトメータの価格は、一般に、測定の精密さや実行可能な測定法の種類に応じて、高くなる。

流動式サイトメータは、典型的には、流体試料に含まれる特定の特性を持つ粒子を特定し、計数するために用いられる。ここでは、“粒子”という語は、例えば、ラテックス球、バクテリア、ウイルス、ＤＮＡ片、細胞、分子または、血全体の構成要素を意味する。適切な波長の光によって照射されると、粒子は、励起光を直接的に散乱させるか、又は、蛍光を発するようになる。多くの場合、プローブ分子を粒子全体又は粒子内部の微小な構造に付着させることで、蛍光放出特性が特定の測定方法にとって、最適になるようにする。

一般的な流動式サイトメータでは、粒子を含む試料流体は、励起用容積部を通って流れ、ここで、粒子は合焦された光源によって照射される。粒子が励起用容積部を通って流れるとき、該粒子は、ビームからの光を散乱させ、蛍光を発する。多くの場合、プローブ分子を粒子又は粒子内の構造に接合することにより、蛍光放出の進行が促進される。典型的には、粒子が励起用容積部を通るときに、放出され、散乱されるパルス光を収集し、分析することにより、粒子が特定され、計数される。

流動式サイトメータは、励起用容積部内又は励起用容積部周辺にある流体の組成に応じて、大きく二つのカテゴリーに分けられる。シース型流動式計器では、励起用容積部の領域内にある液体が二つの構成要素、すなわち、粒子を含む試料流体と、該試料流体の周りにあって、該試料流体を流路軸近傍の領域に閉じ込める、粒子を持たないシース流体とを有する。毛管型流動式サイトメータでは、粒子を含む試料流体が流路容積の全体を占め、シース流体がない。

流動式サイトメータによるパルスを解析する技術は知られており、例えば、本明細書に引用により組み入れられる米国特許第４、０２１、１１７号及び同第３、９３８、０３８号に開示されている。

本発明は、流動式サイトメータからのパルスを解析する方法を提供するものであり、この方法においては、流体内の粒子が電磁放射の励起用容積部を通過し、該電磁放射と相互作用してパルス形状の信号を生成する。この方法では、電磁放射の励起用容積部を通過する一またはそれ以上の粒子の特性を示す時間依存パルスが生成される。あらかじめ決められた値より上の開始点と終了点とを有するパルスの一部を選択することによって、測定ウインドウが決定される。測定ウインドウ上で時間に対するパルスの第一導関数を計算する。

一実施形態では、励起用容積部を通過する粒子の速度が、パルスの第一導関数を用いて計算される。パルスの測定された値は、粒子の計算された速度を用いて修正される。

別の実施形態では、本発明は、測定ウインドウ内で第一導関数がゼロ付近となった回数（ｎ）を求める。そして、この求められた第一導関数がゼロ付近となった回数を用いて、パルスを区別する。

さらに別の実施形態では、本発明は、流動式サイトメータから得られるパルスを解析する方法を提供するものであり、この方法においては、流体中の粒子が、二又はそれ以上の電磁放射ビームによって形成された部分からなる二又はそれ以上の励起用容積部を通過し、この二又はそれ以上の電磁放射と相互作用してパルス形状の信号を生成する。本方法は、
毛管内の第一励起用容積部を通過する第一粒子の第一時間依存パルスを生成するステップと、
測定ウインドウ上にある第一時間依存パルスの一番目の第一導関数を計算するステップと、
該一番目の第一時間依存パルスの第一導関数を用いて、第一粒子の第一速度を計算するステップと、
毛管内の第二励起用容積部を通過する第二粒子の第二時間依存パルスを生成するステップと、
測定ウインドウ上にある第二時間依存パルスの二番目の第一導関数を計算するステップと、
該二番目の第二時間依存パルスの第一導関数を用いて、第二粒子の第二速度を計算するステップと、
計算された第一速度と第二速度を比較することで、第一時間依存パルスと第二時間依存パルスを関連付けるステップと、を有する。

一つの側面として、本発明は、粒子を分析する装置を提供する。この装置は、毛管チューブと、光源と、該毛管チューブ内に励起用容積部を作るために光源から毛管チューブに電磁放射を導く光学システムと、流体内にある粒子を励起用容積部に通して電磁放射と粒子を相互作用させ、光を散乱させ及び／又は蛍光を放出させる手段と、測定ウインドウ上における時間に対する蛍光パルスの第一導関数を計算する手段と、を備える。

本発明における、これらの特徴や利点及び様々な別の特徴や利点は、以下に示す添付図面と添付の特許請求の範囲を参考にして、以下の詳細な説明を読むことにより、より深く理解される。

シース型流動式サイトメータ内にある流動式セルを示す概略図である。 毛管型流動式サイトメータ内にある流動式セルを示す概略図である。 流動式サイトメータ内にある安定層流条件を示す概略図である。 シース型流動式サイトメータシステムを示す概略図である。 第二粒子入射前に第一粒子が励起用容積部に到達したときに生成される一つのパルスを示す描画である。 第一粒子の一部と第二粒子の一部が同時に照射されるときに生成される二つのパルスを示す描画である。 第一の大部分と第二粒子の大部分が同時に照射されたときに作られる二つのパルスを示す描画である。 パルスの形状と粒子の大きさの関係を示す描画である。 パルスの形状と粒子の速度の関係を示す描画である。 本発明にかかる方法を実行するために用いることができる電子システムのブロック図である。 一つの粒子の玉が照射されたときの時間依存信号と時間依存信号の第一導関数を示す描画である。 二つの粒子の玉が同時に照らされたときの時間依存信号と時間依存信号の第一導関数を示す描画である。 二つの励起用容積部を持つ毛管流動式セルを通過する二つの粒子を示す概略図である。 ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色された哺乳類の細胞を平均１２５μl/secの流速で毛管型サイトメータに通過させることで得られた修正なしの区域データの描画である。 ヨウ化プロピジウムで染色した哺乳類の細胞を平均１２５μl/secの流速で毛管型サイトメータに通過させることで得られた修正なしの幅データの描画である。 本発明の一つの実施例によるリアルタイム速度修正により図１１Ａを修正したデータの描画である。 本発明の一つの実施例によるリアルタイム速度修正により図１１Ｂを修正したデータの描画である。

図を参照して、以下に本発明の様々な実施例を説明する。図は、概念的なものであり、本発明の実施例の説明を手助けするためだけに利用することを意図している点に注意すべきである。本発明の網羅的な記載として、また、本発明の権利範囲を限定するものとして利用することは意図されていない。加えて、本発明の特定の実施形態と関連して説明された一つの側面は、その実施形態に必ずしも制限されるものではなく、本発明の他の実施形態においても実施され得る。

図１Ａと図１Ｂは、本発明の方法を実行するために使用可能な二種類のサイトメータシステムに対するそれぞれの流動セルを概念的に説明している。図１Ａに示されるシース型流動セル１０において、シース液が、加圧された入口１２を通ってセル１０に入り、粒子を含む試料流体が、加圧ノズル１４(コアインジェクタ)を通って、セル１０内に注入される。セルの内側の壁とコアインジェクタ１４との間にシース液が流れる体積１６が形成される。ノズルチップ１８と励起用容積部１９の間の領域では、シース液の速度を増加させて、試料液の直径を小さくし、セル１０の直径を徐々に小さくしている。例えば、シース液の直径はセルの直径と等しいが、励起用容積部１９付近における試料液の直径は５μｍから５０μｍの間である。例えば、励起用容積部を含むセルの一部分では、流動式セルの直径は、５０μｍから７５μｍとなる。

図１Ｂに示される毛管型流動式セル２０においては、毛管チューブ２２は、実質的に変化しない内部横断面形状を備え、この部分が試料流体で満たされる。励起用容積部２４にある試料流体の横断面寸法は、シース型の流動システム１０における試料流体励起領域１９の横断面寸法より、大幅に大きく、流体の速度は比較的小さい。例えば、毛管型流動式サイトメータの正方形流動式セル２０の場合、内側縁部寸法は１００μｍである。作動に際しては、試料流体は、試料タンク２６から励起用容積部２４を通って、吸引される。

シース型流動セルは、毛管型流動セルと比べて、より複雑で高価である。シース型流動セルは、測定精度に関し、多くの利点を有する。一つの利点として、試料流体内の粒子は、ほぼ一定の速度で励起用容積部を通ることが挙げられる。両サイトメータシステムにおいて、流速は、励起用容積部を含むセルの領域内で滑らかな層流を作るように調整される。そして、速度の半径方向依存性は、ほぼ放物形状である。シース型流動セルにおいて、試料流体は、セルの軸付近の狭い領域に閉じ込められ、それ故、粒子の速度の変動は効果的に最小化される。一方で、図２に示されるように毛管型流動セルにおいては、壁付近の粒子の運動は、セルの中心付近での運動より、ずっと小さい。例えば、毛管型サイトメータにおける１００μｍの正方形流動セルの場合、軸から認識で切る距離だけ離れた場所における粒子の運動速度は、軸付近における粒子の速度のおよそ３３％である。

シース型流動セルは、小さく、かつ、中心に配置された励起用容積部を利用する。一定の出力電力を持つレーザー励起源において、シース型流動式セル内の光の強度は、励起用容積部がセル全体を満たす毛管型流動装置内の光の強度より大幅に強い。その上、シース型流動セルでは、セルの壁による散乱と屈折の寄与も小さく、かつ、一定である。毛管型の装置では、壁による影響が顕著であり、セル軸に対する発光粒子の位置により変動することがある。

流動式サイトメータは、H.M.ShapiroによるPractical Flow Cytometry,Wiley,Hoboken(2004)、Chuppによる米国特許第4,662,742号、Recktenwaldらによる米国特許第4,745,285号、及び米国特許出願公開番号第202/0028434 A1号に開示されている。上述の開示文献は、本明細書に引用により組み入れる。

図３は、本発明を実施するために用いられるシース型流動式サイトメータ３０の概略図を示す。このシステムでは、励起ビームは、例えば、レーザー、或いは、周波数二倍化器、周波数三倍化器、又は周波数四倍化器のようなレーザー駆動周波数非線形変換器、光学パラメトリック発振器、発光ダイオード(LED)、スーパールミネッセントダイオード、又はアークランプのような光源３２によって生成される。

励起光学システム３４は、励起ビーム３６を流動式セル１０内に合焦して、励起用容積部３８を定める。励起光学システム３４は、図３では単純なレンズとして示されているが、一又はそれ以上の回折光学素子、反射光学素子、屈折光学素子のような構成要素を含むことができる。任意的に、励起波長を高い透過率で透過させる光学バンドパスフィルタ４０を、励起光源３２と励起用容積部３８との間に配置して、光源によって放出された光のうち、励起波長と異なる波長の光を遮断することができる。

合焦された励起光は、蛍光励起、吸収、狭角散乱、及び広角散乱を含む様々な物理的過程を介して、励起用容積部３８を通って流れる粒子と相互作用する。粒子が励起ビームに照射されたときに生成されるパルス光の波長、振幅、持続時間、形を測定することで、粒子を特定し、計数することができる。

散乱した励起光は、一般的に、散乱する粒子の大きさと形によって決められる角度分布を持ち、励起ビームの伝播軸に対して大きい角度(４５度より大きい)と小さい角度(１０度より小さい)で集光される。蛍光は、一般的に、全ての立体角に放出され、励起ビームの伝播方向に対して、大きな角度において集光される。

暗い背景に対する蛍光及び散乱パルス光を調べることで、最大の信号対ノイズ比を得ることができる。広角散乱及び蛍光の測定においては、背景光レベルは、励起ビームの伝播方向に対して大きな角度の光を集め、粒子に由来しない光を遮断する絞りを用いることによって最小化できる。前方散乱の測定では、背景光のレベルは、一般的に、励起ビームを遮断することで最小化できる。

図３に戻ると、広角収集光学システム４２は、蛍光と、励起ビームの伝播軸と直角方向を軸とした円錐の角度範囲内に散乱する光を集める。散乱光は、二色性のビームスプリッタ４４Ａ、４４Ｂを通る。そして、レンズ又は代替として用いられる合焦システム４８が、散乱光を広角散乱検知器４６の能動素子に合焦する。第一波長の蛍光は、第一の二色性ビームスプリッタ４４Ａによって、第一蛍光検出器５０Ａへと反射され、異なる波長である第二波長の蛍光は、第二の二色性ビームスプリッタ４４Ｂによって、第二蛍光検出器５０Ｂへと反射される。第一波長と第二波長の蛍光を蛍光検出器５０Ａ、５０Ｂにそれぞれ合焦するために、レンズ又は他の合焦システム５３Ａ、５３Ｂが用いられる。検出器に到達する波長を限定するため、励起用容積部３８と検出器４６、５０Ａ、５０Ｂの間に一又はそれ以上の光学バンドパスフィルタ５２Ａ、５２Ｂ、５２Ｃを配置してもよい。

蛍光は、通常は、有機色素分子のようなプローブ分子によって放出される。このプローブ分子は、粒子を流れに導入する前に、ある定まった粒子又は該粒子内の特定の構造に付着させられる。プローブ分子は、典型的には、励起光に対する強い吸収剤であり、吸収した光エネルギーを蛍光放出に効率的に変換する。励起光の波長に対応した蛍光波長の赤方偏移(ストークス偏移)によって、通常の透過フィルタや回折格子を用いて、励起光から蛍光を分離することができる。蛍光の光子は、一般的に、励起ビームからの光子を吸収した後、数ナノ秒以内に放出される。この遅れは、一般的な流動式サイトメータにおける励起用容積部を粒子が通るために必要な時間と比較して短い。

ある応用例では、異なる放出及び／又は励起スペクトルを持つプローブ分子を、異なる種類の試料粒子又は一種類の試料粒子内の異なる構造と結びついてもよい。異なる波長の蛍光パルスの振幅を測定することで、一つの粒子の同時測定、及び／又は、異なる粒子若しくは構造によって作られる信号の区別を可能にする。

励起ビームの伝播軸に対して、狭角で散乱された光は、前方散乱イメージングシステム５４によって集めることができる。散乱しなかった励起ビームが前方散乱イメージングシステム５４に到達しないように、ビームブロック５６を励起用容積部３８と前方散乱イメージングシステム５４の間に置いてもよい。ビームブロック５６の縁部付近を通る散乱光は、前方の散乱検出器５８の能動素子に集められ、合焦される。励起波長の光を透過し、他の波長の光を遮断するために、バンドパスフィルタ６０を励起用容積部３８と前方散乱検出器５８の間に置いてもよい。

異なる粒子の型を区別するために、散乱した励起光を、用いてもよい。励起ビームの伝送軸に対して狭角散乱をする光の量は、おおむね粒子の大きさに応じて変化するが、広角散乱をする光の量は、粒子の粒度の関数となる。小さい角度と大きい角度の散乱の比を測定することで、粒子の種類を区別してもよい。

照射された粒子によって生成されたパルス光は、放出角度と波長に応じて、分離される。励起ビームの伝播に対して異なる角度の位置に、良好に定められた集光用絞りを有するレンズを配置することで、放出角度に応じた分離が達成される。一連の誘電性バンドパスフィルタ、及び／又は、エッジフィルタをパルスが通ることで波長に応じた分離をたっせいすることができる。

集光と色による分離の後、パルス光は、フォトマルチプライヤまたはフォトダイオードによってアナログ電気信号に変換される。データ取得システムが、デジタルシグナルプロセッサ又はコンピュータによってその後に行われる分析のために、アナログ信号をデジタルデータに変換する。

検出器に到達するパルス光の形と振幅は、粒子の光学的な特性、粒子の速度、集光システムの軸に対する粒子の相対的な位置によって決められる。粒子の光学的特性は、粒子に付着されるプローブの吸収特性と放出特性に加えて、粒子の大きさ、形、透過性によって決まる。蛍光放出の高い量子収率を持つ強い吸収プローブは、一般的に、最も大きな振幅のパルスを生み出す。

作動に際して、粒子が励起ビームにより照射されるとき、少なくとも一つの検出器が、パルス光を受け取る。粒子と励起ビーム間の相互作用は、一回ごとに“イベント”と呼ばれる。理想的な場合、イベント中に生成された検出パルスの特性から、粒子をはっきりと特定することができる。例えば、ある試料では、狭角散乱による信号と広角散乱による信号の相対的な大きさを測定することで、単核白血球、顆粒球、リンパ球を計数し、区別することが可能である。別の試料において、粒子が励起用容積部を通過したときに放出した蛍光パルスの形を測定することで、細胞核内のＤＮＡの量を求めることができる。

流動セルと関連する流体工学の例外として、毛管型流動式サイトメータは、シース型流動式機器と質的に類似することがある。試料流体は、励起用容積部内に合焦される光源により照射される。試料粒子によって放出させられ、散乱させられたパルス光は、波長に応じてパルス光を分離し、検出器へと導く小角及び広角の光学システムによって集光される。毛管型サイトメータの流動セルは、もともと単純であるため、シース型流動式機器よりも作ること、整列させることが簡単である。しかしながら、毛管型流動式機器にある励起用容積部は、比較的大きい横断面を持つため、測定の精度が制限される。

シース型の流動式サイトメータ、及び毛管型の流動式サイトメータの両方において、あらかじめ決められた基準と検出したパルスの｛かりゅうきゅう｝形を比較することによって、粒子を計数してもよい。例えば、パルスの高さが閾値を超えたときに、粒子を数えるようにしてもよい。他にも、パルスの高さと幅、若しくは面積の描画を用いて、異なる粒子の種類を特定し、計数してもよい。粒子を特定する過程においてエラーをもたらし得る要因には、滑らかな層流からの偏移、粒子速度の空間的変動、光学的な集光効率の空間的変動、複数の粒子に対する照射の同時性、試料の凝集体の構造が含まれる。これらのエラーの大きさは、一般的に、励起用容積部の大きさに応じて増加し、シース型流動式機器の場合に最小となる。

多くの測定において、毛管型システムは、適正な測定精度を備え、シース型流動式システムに対し、次の利点を持つ。
１．複雑さとコストを小さくする。シース型流動式セルは複雑で、高価で、適切に整列させることが難しい。毛管型流動セルは、より単純で、安く、不整列を生じがたい。
２．試料流体がポンプにより毛管を通って排出される。そのことによって、試料流体内の粒子密度を直接的に測定することが容易になる。シース型流動式サイトメータにおいて、試料流体とシース流体は、圧力をかけて流動式チューブに注入され、典型的には、粒子の密度は、システムに流入する既知の粒子密度を持つ試料流体から、間接的に測定される。
３．シース流体とそれに関連した流体構成が不要である。毛管型流動式機器に適用できる単純な流体構成を用いることにより、測定精度が減少してもよい、ある種の一般的な測定をする場合、十分な費用の節約ができる。

Shapiro(Practical Flow Cytometry、第四版、Wiley, Hoboken, 2003)によると、「サイトメータの測定精度は、ほぼ特定した粒子からの蛍光の強度又は散乱光の強度の測定値の分布を積算し、そして、測定値を中間値又は平均値によって割って得た標準偏差を、パーセンテージとして表現するために、１００をかけて得られる変動係数（ＣＶ）を計算することにより、通常の特性表示ができ、ＣＶが小さいほど、精度がよいと言える。」

典型的な測定では、検出器からのパルスの大きさが予め決められた閾値を超えたとき、計数値が増加される。同一の粒子により生成されたパルスの大きさの変動は計数誤差となり、測定におけるＣＶを望ましくないほど増加させる。従来技術である毛管型サイトメータのＣＶは、シース型流動式機器のＣＶより大きい。なぜなら、毛管型サイトメータでは、励起用容積部が大きく、毛管の軸から遠くにある粒子から光が放出されるからである。

サイトメトリーでは、一つの独立した試料粒子が照射されると、一般的に“シングレット”と呼ばれる一つのピークを持つ検出パルスが生成される。二つの別々の粒子が同時に照射されると、一般的に“ダブレット”と呼ばれる二つのピークを持つ検出パルスが生成される。粒子密度が高く、粒子の横断面より著しく大きい横断面寸法を持つ試料流体では、二つの粒子が同時に照射される確率が大きい。

図４Ａ、図４Ｂは、試料粒子の濃度が増加するにつれて、パルス形状が変化することを概念的に表している。低い濃度では、ほぼ全てのイベントが、一粒子に対する照射に対応する。毛管型流動式チューブの横断面における粒子密度が増加すると、ダブレットのパルス形状を観察する確率が増加する。図４Ａでは、二つ目の粒子が励起用容積部に入る前に、一つ目の粒子が励起用容積部から出ているので、それぞれの粒子によるシングレットのパルスが生成される。図４Ｂは、一つ目の粒子のわずかな一部がまだ照射されている間に、二つ目の粒子が励起用容積部に入った場合を示している。この場合、検出器の出力は、両パルスの間で０に戻らないが、パルスの最大値と最小値の間で有意な違いが存在する。図４Ｃは、一つ目の粒子と二つ目の粒子がほぼ同時に励起用容積部を通過し、パルスの最大値と最小値の大きさの違いが、小さいことを示している。

ある試料では、細胞、細胞の破片、その他の破片が凝集し、凝集体を作ることがある。これらの凝集体は、一般的に、測定対象の粒子の大きさと異なる大きさを持つ。シース型流動式サイトメータでは、ほぼ同じ速度で励起用容積部を粒子が通り、図５に示されるようにパルスの幅は、粒子の大きさと強く関連している。それ故、ダブレットと凝集体のパルスを、パルスと面積／幅技術を用いた分析によって特定し、除去してもよい。この方法は、WerstoらによるCytometry 46:296-306(2001)に開示されており、その記載は、一般的な情報に関し、引用により本明細書に組み込まれる。しかしながら、図６に示されるように、パルス幅が粒子速度とも強く関連しているので、この種の分析を従来の毛管型サイトメータによって実行することはできない。そのようなシステムでは、流体と粒子の半径方向の速度変動によって、パルス形状が変動してしまうので、一つの粒子と、凝集体やダブレットのパルス形状の違いがわからなくなる。

いくつかの実施形態では、試料の粒子密度を調整し、二以上の粒子を照射する確率を取るに足らない程度にし、ダブレットがほとんど検出されないようにしている。いくつかの例では、特定の生物試料において、凝集体形状を発生しないようにすることが難しいことが示されている。

いくつかの実施形態では、毛管の軸付近の小さい領域に粒子を集中することで、毛管型流動システムの精度を改善できる。この場合、毛管型流動式サイトメータの性能が、シース型流動式機器の性能に近くなることがある。例えば、Goixによる米国特許第6,710,871 B1号では、毛管の限定された断面積内を、磁気を帯びた荷電粒子が流れるように、磁場を用いている。Kaduchakらによる“Ultrasonic analyte concentration and applicaion in flow cytometry”という名称の米国特許出願公開第2006/0021437号では、毛管軸付近に粒子を集中させるために、超音波技術を用いている。米国特許第6,710,871 B1号と米国特許出願公開第2006/0021437号は、その全体が本明細書に組み入れられる。

例えば、試料粒子が流動式サイトメータの励起用容積部を流れるときに生成されるパルスの微分係数を、数学的手法により、リアルタイムに計算する。粒子の濃度と流量の比を典型的な範囲内にして、サイトメータを動作させるとき、粒子の速度を微分係数より計算して、個別のパルス形状を修正し、パルスの形状を流速が均一のとき発生するパルスの形状と近似するようにすることができる。複数の励起用容積部を持つ毛管型機器を流れる粒子によって作られるパルスを一意に特定するために、計算によって求められた速度を用いてもよい。例えば、計算によって求められたパルスの微分係数がゼロと交わった回数を用いて、ダブレットとシングレットのパルス間を区別することができる。

一つの特定の実施形態において、本発明は、流動式サイトメータからのパルスを分析する方法を提供するものであり、この方法では、パルス形状の信号を生成するために、流体内の粒子が電磁放射されている励起用容積部を通り、該電磁放射と相互作用する。電磁放射されている励起用容積部を通る一つ以上の粒子の特性を示す時間依存パルスが生成される。あらかじめ決められた値より上の開始点と終了点を有するパルスの部分を選択することで、測定ウインドウを決定する。測定ウインドウ上の時間に対するパルスの第一微分係数が計算される。

図７は、流動式サイトメータ内の検出器から得られる信号の微分係数を計算するために用いることができる電子システム７０のブロック図である。流動式サイトメータは、毛管型流動式サイトメータとすることができる。図に示されている機能ブロックは、電子的なデジタル信号処理技術としてよく知られた技術と構成要素を利用して実現できる。

図７を参照すると、光パルスが検出器７２によって受けられ、電子信号が生成される。その電子信号は、プログラマブルゲインアンプによって増幅され、アナログアウトプットバス７４によってアナログデジタルコンバータ（ＡＤＣ）７６に伝送される。アナログバス７４は、他の増幅検出器７８、圧力変換器、その他のセンサーからの信号を伝送するようにしてもよい。例えば、アナログバス７４は四つか五つの増幅された信号をＡＤＣ７６に伝送するようにしてもよい。

例えば、ＡＤＣ７６は、１６bitの分解能であって４０kHzのサンプリングレートで信号をデジタル化するものとすることができる。ＡＤＣ７６からのインターリーブされたデジタルデータは、マイクロコンピュータ７６のメモリ内に記憶されるようにすることができる。例えば、マイクロプロセッサは、５１２メガバイトのランダムアクセスメモリを持つEden 1 GHz Processorであってもよい。ＦＩＦＯバッファ８０とダイレクトメモリアクセスモジュール（ＤＭＡ）８２を用いて、マイクロコンピュータ７８によって同時に実行される他の処理といっしょにデータ伝送処理を効果的に多重伝送してもよい。

コンピュータメモリ(表示せず)から読み出したデジタルデータは、その他の機器の構成要素８４に対する実行パラメータ、検出電圧の設定情報、前方散乱検出器のプログラマブルアンプ及びその他プログラマブルアンプに関するゲインの設定情報を含むものであってもよい。そのデジタルデータは、コンピュータメモリから、ボードデコーダ８６及びデジタルインプット/アウトプット（ＤＩＯ）バッファ８８に、ＤＩＯバス９０を介して、ＤＩＯバスコントローラ９２の制御のもとで転送される。アンプの設定情報及びその他要素のデジタル制御用設定情報はＤＩＯバッファ８８から個別機器要素に送られる。アナログ制御信号は、ＤＩＯバス９０によってボードデコードモジュール８６に送られるデータから生成される。

インターリーブされたＡＤＣのデータは、マイクロコンピュータ７８によってメモリから読み取られ、測定されたパラメータのそれぞれに対して一つのバッファにデインターリーブする。例えば、検出器７２から得られたデータを、一つのデインターリーブされたバッファに記憶することができる。代わりに、追加された検出器からのデータを、追加されたバッファに記憶するようにしてもよい。

典型的には、アップサンプリングフィルタを、デインターリーブされたデータに適用する。適切なフィルタには、従来からある信号処理技術としてよく知られている８倍及び１６倍のアップサンプリングローパスフィルタが含まれる。そのようなフィルタは、試料間の補間の改善、ピーク値の予測の改善、及び、ある程度の高周波ノイズの除去を可能にする。

パルスの微分係数を計算するために、ピーク強度に対するパルスの強度の比があらかじめ決められた値と等しくなる点を求めることによって、測定ウインドウを決めてもよい。そして、このウインドウ内にあるそれぞれのデータ点に対応して、微分係数が計算される。

流動式サイトメータの検出器によって一般的に発生するノイズ信号が存在する場合にも、高速で、かつ、安定な従来からある数学的技術を用いて、マイクロプロセッサ７８によって、微分係数の計算を行うことができる。例えば、Abraham Savitzky and Marcel J.E. Golayによる“Smoothing and Differentiation of Data By Simplified Least Squares Procedures”という名称でAnalytical Chemistry 36pp. 1627-1639(1964)に開示されているSavitzky-Golay法を用いて、微分係数を計算することができ、この文献の開示は、引用により本明細書に組み入れられる。この方法は、微分係数バッファにおけるそれぞれのデータ点周りにある局所的な多項式回帰を順に実行し、処理前の信号の第一微分係数を推測するために多項式フィットを用いている。そして、（回帰を通した）滑らかなデータを微分推定フィルタと結合する。

例えば、９点Savitsky-Golayフィルタ（n=9）が二次の多項式（k=2）と組み合わせて用いられた。特定のデータ点において微分係数と比例する値は、次の係数｛８６、−１４２、−１９３、−１２６、０、１２６、１９３、１４２、−８６｝による順序付けされた９点を順に掛け合わすことで計算された。最初の計算は、データ点１から９を用いる。二番目の計算は、データ点２から１０を用いる。三番目の計算は、データ点３から１１を用いるなど、あらかじめ決められた計算範囲内の全てのデータ点に対して、スケール変化した微分係数値が計算されるまで行われる。入力データ点が、デインターリーブされた入力バッファから読み出されて、微分係数の計算結果が、微分係数の出力バッファに記憶される。

図８に、本発明の実施形態による、計算されたパルスの形状とパルスの微分係数の形状を示す。図８において、時間依存信号と時間依存信号の第一微分係数は、Guava Technologies,Inc.Hayward,Californiaから入手可能な毛管型流動式サイトメータの前方散乱チャネルによって生成された。Ｔ₁とＴ₂は開始点と終了点であり、あらかじめ決められた閾値と検出器の信号が交わっている点である。パルスの幅は、Ｔ₁とＴ₂の差によって決められる。Ｚ₁は、第一導関数とゼロ点とが交わる点であり、パルスの信号が最大となるときに生じる。

Savitsky-Golayフィルタは、デジタルデータの集合から第一導関数を計算する多くの適切な数学的方法のうちの一つに過ぎない。別の実施例として、適切な速さ、正確さ、安定性をもつ代わりの数学的技術を用いても、導関数が近似的に求められる。

いくつかの実施例において、例えば、パルスの1/4強度の点として定義される検出ウインドウ内の導関数のデータから、粒子の速度を計算してもよい。前記測定ウインドウ内における導関数の最大値と最小値が定義され、次の式から粒子の速度が見積もられる。

ここでＶは、粒子の速度を表す。αは、導関数の最大値

を表す。Absは絶対値関数である。ｋは励起レーザービームの形に依存するスケールファクターである。Ｐは、パルスの高さである。ガウス関数のレーザービーム

において、ＢＷは、ビーム幅の1/e²を表す。前記式は、ＢＷと比べて小さい粒子に適用される。時としてノイズやその他の効果が粒子の形状を調整し、導関数の最大最小の平均からαを計算することが利点となる。好ましくは、αは式

から計算される。しかしながら、αを計算するための方法は、他に数多く存在する。

パルスと面積/幅の計算のための導関数に基づく速度修正。

流動式サイトメータは、ＤＮＡの細胞周期分析に用いられることが多い。この測定においては、ＤＮＡに特異的な染色剤で細胞を染色し、流動式サイトメータの励起用容積部に通すことにより、細胞周期のＧ１、Ｓ、Ｇ２＋Ｍフェーズにおける試料細胞の相対的な割合を求める。既知の粒子の核にあるＤＮＡの大きさと量は、細胞周期のステージに依存し、それゆえ、ステージが異なっていると、粒子によって生成されたパルスは異なった形をしている。Werstoらによる“Doublet Discrimination in ＤＮＡ Cell-cycle Analysisu,”の名称で記載されているCytometry 46:296-306(2001)に開示されているような、よく知られた技術を使い、振幅、領域、幅に基づいてパルスを解析することができ、この文献の開示は、引用により本明細書に組み入れられる。パルスの形状解析に関する別の技術が米国特許第4,021,117号及び同第3,938,038号に記載されており、その開示は、引用により本明細書に組み入れられる。シース型流動式サイトメータにおいてパルス形状解析に用いられる従来の電子的、数学的信号処理技術は、まとめて「パルス及び面積／幅技術」として、記述されている。

ＤＮＡ物質があまりにも多く、凝集粒子の濃度がゼロでない試料では、細胞周期の測定の精度が悪化する。シース型流動式サイトメータにおいて、パルス及び面積/幅技術を用いることにより、凝集体によるパルスを特定することができる。一般的に、細胞周期のあらゆるステージにおける一つの細胞と異なる大きさとＤＮＡ量を凝集体が持つという事実にこれらの技術は依存している。

シース型流動式サイトメトリシステムでは、細胞が一定の速度でレーザービームを通るので、個々のパルスから直接的に面積と幅の測定をしてもよい。毛管型流動式サイトメータでは、粒子速度は、毛管の軸から半径方向への距離の関数となっている。例えば、一般的な毛管型システムでは、最も軸から離れた位置にある粒子の速度は、毛管の軸付近を通る粒子の速度の三分の一となることがあり、個々のパルスの面積と幅が、流動式チューブの軸から半径方向への粒子の距離に強く依存する。

本発明の速度測定方法を用いて、パルスの導関数から粒子の速度を計算してもよい。それに応じて、粒子の形状を、速度により修正してもよい。一度速度による修正が実行して、従来のパルスと面積/幅の技術を用いてパルスを解析してもよい。速度により修正されたパルスの解析に関連するエラーは、シース型流動式機器における修正をしていないパルスの解析で発生するエラーと同程度である。

速度修正は、単に計算された粒子の速度と任意のパルスの幅と面積の値を掛け合わせることにより得ることができる。例えば、修正されていないパルスの幅は、計算ウインドウ(入力パルスが最大値の1/4となる点の間の時間)の時間幅を測定することにより求められ、修正前の強度データを計算ウインドウ内で積分することにより面積が求められる。両者の値に基づく速度修正は、修正前のデータと計算した速度を掛けることにより遂行できる。

導関数に基づくダブレットの除去。

一般的な毛管型流動式サイトメータにおける流動チューブの横断面積は比較的大きいので、一度に一つ以上の試料粒子を同時に照射する可能性がゼロとならないことが多い。図８は、独立した一つの粒子によって生成された検出信号とその検出信号の第一導関数を表す図である。図９は、二つの粒子を同時に照射することで得られた検出信号とその検出信号の第一導関数である。

図８及び図９に示された代表例としての信号は、Guava Technologies,Inc.,Californiaから入手可能な毛管型流動式サイトメータの前方散乱の検出器によって得られたものである。Guava Check（登録商標）ビーズを含む試料を、励起した。Guava Check（登録商標）ビーズは、濃度が既知の凝縮した蛍光ビーズの懸濁物として提供される。使用に際しては、ビーズを希釈して既知の濃度のビーズ懸濁液とする。シングレットパルス及びダブレットパルスの時間幅は、信号があらかじめ決められた閾値と交わる時間Ｔ₁とＴ₂の差となる。信号の導関数は最大値最小値それぞれでゼロ点と交わる。つまり、シングレットパルスの場合には一回、ダブレットパルスの場合には三回ゼロ点と交わる。図８では、導関数のゼロ点との交差点をＺ₁とラベルし、図９では、Ｚ₁とＺ₂とＺ₃とラベルしている。二以上のパルスが同時に照射されるという珍しい事象において、ｎを同時に照射された粒子の数とすると、導関数信号は、（２ｎ−１）回ゼロ点と交わると予測される。

本発明の技術を用いて、入力信号の導関数を計算し、導関数がほぼゼロとなる回数を求めることでダブレットパルスとシングレットパルスは分離できる。シングレットパルスの場合には一回、ダブレットパルスの場合には三回、導関数がほぼゼロとなる。

代わりに、それぞれのパルスの最大の導関数値と幅を計算することによりダブレットパルスとシングレットパルスを分離することができる。粒子の大きさがわかっているとき、二つのパラメータの比が粒子の速度とほぼ独立であることから、シングレットパルスの立ち上がりエッジを示す導関数の最大値とパルスの幅が、速度に対応する。しかしながら、ダブレットパルスの場合、立ち上がりエッジを示す導関数はシングレットパルスと同様に速度に対応して変化するが、パルス幅は、二つの粒子の流れる方向の距離間隔に比例してシングレットの場合以上に増加する。よって、パルスの幅と導関数の最大値との比を計算することにより、ダブレットとシングレットのパルスを特定することができる。あらかじめ決められたダブレットの閾値より小さいパルス幅と導関数の比が、シングレットパルスに対応する。ダブレットとシングレットのパルスを区別するために用いられる立ち上がりエッジにおける導関数の最大値と、パルス幅と導関数の比を計算するために、本発明によるリアルタイムの導関数の計算を用いてもよい。

マルチソース流動式サイトメータにおける速度に基づいた粒子の追跡。

ある種の測定においては、二つ以上の励起波長を持つ試料粒子を照射することが望ましい。これは、典型的には、粒子の流れ方向に複数の異なる点において、異なるレーザーからの出力ビームを合焦させ、別々の励起用容積部が、それぞれのレーザーに対応して生成されるようにすることにより、遂行される。それぞれの励起用容積部からのパルス光は、異なる光学系によって、波長と角度に応じて集められ、分離させられる。

二以上の励起用容積部で一つの粒子を対象とした測定を行う場合、パルスを生成する一つの粒子がそれぞれの励起用容積部でパルスを放出するが、そのパルスを修正する必要がある。全ての粒子がほぼ同じ速度で動くシース型流動式機器では、異なる励起用容積部間の移動時間に対応する時間ゲートを定めることで修正できる。例えば、トリガー粒子によって生成されたパルスを特定し、記録するといった方法で、下流側の励起用容積部でのデータ収集の時間ゲートのために、上流側の励起用容積部で粒子によって生成されたパルスの立ち上がりエッジを用いてもよい。しかしながら、従来の毛管型流動式サイトメータでは、この方法を用いることができない。粒子の速度が毛管の軸からの距離との関数になっているためである。最良の場合でも、励起用容積部間を粒子が移動するために必要な時間が変動し、最悪の場合には、粒子が下流を通過するとき、二つの粒子の励起用容積部を通る順番が反転する。

図１０は、二つの励起用容積部を持つ毛管型流動式セルを通る二つの粒子の概略図である。粒子No.１は、第一の速さで毛管チューブの壁付近を通り、粒子No.２は、一番目の速さよりも大幅に速い第二の速さで軸付近を通る。図に示すように粒子No.１は粒子No.２より先に一番目の励起用容積部を通過するが、より速く動く粒子No.２は、励起用容積部間を流れる間に粒子No.１を追い越し、通り過ぎる。その結果、粒子No.２は二番目の励起用容積部(そしてその他全ての下流にある励起用容積部)を粒子No.１より先に通過する。一番目の励起用容積部を粒子が通ることにより生成されるパルスの立ち上がりエッジをトリガーとした単純な電子による時間ゲートでは、二番目の励起用容積部におけるパルスの一部の検出に失敗することがある。そして、二番目の励起用容積部でパルスが記録される場合、ゲートのトリガーを掛けた粒子と同じ粒子によってパルスが生成されたかを決定することは不可能である。

粒子が一番目の励起用容積部を通るときの粒子の速度と、粒子が一番目の励起用容積部から下流にある励起用容積部に移動するために必要な時間を計算するために、特許請求の範囲に記載した発明を使用することができる。粒子が下流の励起用容積部を通るときに粒子によって生成されるパルスを、一番目の励起用容積部のパルスによる速度データを用いて、修正することができる。トリガーパルスと時間ゲートの間隔が、トリガーを発生させた粒子の速度から正確に計算されるため、パルスを逃したり、トリガーとなったパルスを誤って下流の励起用容積部のパルスと関連させたりする可能性は非常に小さい。

励起用容積部を通過するときの粒子の速度はほぼ一定であるので、全ての領域において生成されたパルスについての速度計算を行うことにより、特定の粒子によって生成されたパルスを特定することもできる。一番目の励起用容積部におけるパルスの立ち上がりエッジが、一番目の励起用容積部と二番目の励起用容積部との間の可能性ある全ての移動時間を含むのに十分な幅である二番目の励起用容積部における測定ウインドウをトリガするものであるならば、ほぼ等しい導関数値(速度)を持つ測定ウインドウ内で生成されたパルスを、同一の粒子によって生成されたパルスとみなしてもよい。

実施例１
この実施例は、本発明による面積及び幅データの速度修正を示す。図１１Ａ、図１１Ｂは、Guava Technologiesから入手可能な毛管型サイトメータEasyCyteにより得られた未修正のデータである。このデータは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によって染色された核ＤＮＡを持つ哺乳類の細胞を、１２５μl/secの平均容量流動式レートで機器に流して得られた。

ヨウ化プロピジウムは、細胞周期の異なるステージにある細胞を分類するための細胞周期分析において、核ＤＮＡの染色剤として用いられた。静止細胞（Ｇ０/Ｇ１）は、それぞれの染色体に対して二つの複製を含む。細胞周期が進行し始めると、細胞は、染色体ＤＮＡを合成する（Ｓphase）。全ての染色体ＤＮＡが二倍化（Ｇ２/Ｍ）するまで、染色剤ＰＩを挿入されたＤＮＡからの蛍光強度が増加する。このステージでは、Ｇ２/Ｍ細胞が、Ｇ０/Ｇ１群の蛍光強度に対して二倍の蛍光を発する。Ｇ２/Ｍ細胞は、最終的に二つの細胞に分裂する。

細胞周期の異なったステージにおける特定可能な大きさである細胞に対して、図１１Ｂの幅データは鋭いピークを持つべきである。図１１Ａの面積データが、異なったステージにあるＤＮＡの内容を定性的に示す形を持つべきである。しかしながら、粒子が異なる速度で励起用容積部を通るので、図１１Ｂに示されるように、未修正の幅ヒストグラムは広がったピークを形作り、図１１Ａに示されるるように、未修正の面積ヒストグラムの形は異なったステージにあるＤＮＡの内容を定性的に示す形ではない。

図１２Ａ、図１２Ｂは、本発明に基づくリアルタイム速度修正を行った後の図１１Ａ、図１１Ｂの修正データを示す。図１２Ｂにある速度修正後の幅データのヒストグラムは、幅が狭く、ピークをしっかりと定義できる。図１２Ａにある速度修正後の面積データのヒストグラムは細胞周期のステージを定性的に示している。ダブレットと凝集体に基づくパルスを除去するためにWersto等の技術を用いて、図１２Ａ、図１２Ｂの速度修正データを最終的に解析してもよい。

流動式サイトメトリ技術の当業者にとって、本発明による導関数及び粒子速度のリアルタイム計算を、本開示において詳細に記載された応用例以外の応用例にも用いることは、自明であろう。さらに、本発明の核心から外れることなく、幅広い数学的技術を用いることで導関数を計算できることも明らかである。例えば、より高次の多項式フィットに対応するSavitsky-Golayフィルタ形態を用いる方法、及び／又は、Abraham Savitzky and Marcel J.E. Golayによる“Smoothing and Differentiation of Data by Simplified Least Aquares Procedures,”の名称でanalytical Chemistry, 36, pp. 1627-1639(1964). に記載された一回の計算に対して多くのデータ点を使用する方法を用いることでも本発明は、実施される。

デジタルデータ処理や流動式サイトメトリ技術における当業者は、図７に示された電子的構成要素と異なった電子的構成要素を用いて、本発明を実施できることを認識するであろう。特に、パルスの導関数の計算を、マイクロプロセッサや代替として用いる制御ユニットによって制御される専用のデジタルシグナル処理回路を用いて実施してもよい。デジタル電子工学や信号処理技術において知られる数学的要素の組み合わせを、アナログ信号をデジタル信号に変換するため、及び、デジタルデータの導関数を計算するために用いてもよい。様々な電子的構成要素を、流動式サイトメトリ機器内で保持してもよく、又は、適切なケーブルを用いて前記機器につないでもよい。例えば、図７に示されているＡＤＣ/ＣＩＯカードとマイクロプロセッサ機能を、物理的に互いに分離していて、毛管型サイトメータとも分離している二つの分離した電子的なケースによって保持してもよい。

１０ シース型流動式セル
１２ 入口
１４ ノズル（コアインジェクタ）
１６ シース醜態が流れる体積
１８ ノズルチップ
１９ 励起用容積部
２０ 毛管型流動式セル
２２毛管チューブ
２４ 励起用容積部
２６ 試料タンク
３０ シース型流動式サイトメータ
３２ 光源
３４ 励起光学システム
３６ 励起ビーム
３８ 励起用容積部
４０ 光学バンドパスフィルタ
４２ 広角収集光学システム
４４Ａ ビームスプリッタ
４４Ｂ ビームスプリッタ
４６ 広角散乱検出器
４８ レンズ（又は、合焦システム）
５０Ａ 蛍光検出器
５０Ｂ 蛍光検出器
５２Ａ 光学バンドパスフィルタ
５２Ｂ 光学バンドパスフィルタ
５２Ｃ 光学バンドパスフィルタ
５３Ａ レンズ（又は、合焦システム）
５３Ｂ レンズ（又は、合焦システム）
５４ 前方散乱イメージングシステム
５６ ビームブロック
５８ 前方散乱検出器
６０ バンドパスフィルタ
７０ 電子システム
７２ 検出器
７４ アナログバス
７６ アナログデジタルコンバータ（ＡＤＣ）
７８ マイクロコンピュータ
８０ ＦＩＦＯバッファ
８２ ダイレクトメモリアクセスモジュール（ＤＭＡ）
８４ その他の機器の構成要素
８６ ボードデコーダ
８８ デジタルインプット／アウトプット（ＤＩＯ）バッファ
９０ ＤＩＯバス
９２ ＤＩＯバスコントローラ

Claims (23)

1. 流体中の粒子が電磁放射の励起用容積部に通され、前記電磁放射と相互作用してパルス形状の信号を生成するようになった流動式サイトメータからのパルスを分析する方法であって、
   前記電磁放射の前記励起用容積部を通る一以上の粒子の特性を示す時間依存パルスを生成するステップと、
   あらかじめ決められた値より上の開始点と終了点を有する前記パルスの一部を選択することによって測定ウインドウを決定するステップと、
   前記測定ウインドウにおいて時間に対する前記パルスの第一導関数を計算するステップと、
   を含むことを特徴とする方法。
2. 前記粒子が前記励起用容積部通るとき、前記電磁放射と相互作用する一以上の前記粒子の光散乱により、前記時間依存パルスが生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記粒子が前記励起用容積部通るとき、前記電磁放射と相互作用する一以上の前記粒子の蛍光により、前記時間依存パルスが生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 毛管型流動式サイトメータにおいて、前記励起用容積部に粒子を通すことにより、前記時間依存パルスが生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記パルスのピーク振幅に対する前記パルス部分の開始点又は終了点の振幅の比を、あらかじめ決められた値より上に決定することで、前記測定ウインドウの決定が遂行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記パルスにおけるピークを示す前記第一導関数がゼロ近傍の値となる前記パルスにおける点を特定するステップ、
   をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記第一導関数の最大値を特定するステップと、
   前記パルス部分の幅に対する特定された前記最大値の比を計算するステップと、
   計算された前記比を用いてダブレットとシングレットを区別するステップと、
   をさらに有する請求項１に記載の方法。
8. 励起放射と同時に相互作用する粒子の数を示す前記第一導関数のゼロ付近の値を持つ測定ウインドウ内の点の数を特定するステップ、
   をさらに有する請求項１に記載の方法。
9. Ｖが前記粒子の速度を表し、αが、Ａｂｓが絶対値関数を示す
   

   

   に従い、前記導関数の最大値を表し、Ｐがパルスの高さを表し、ｋが倍率を表すものとして、
   

   

   の式から前記第一導関数を用いて、前記励起用容積部を通る前記粒子の速度を計算するステップ、
   をさらに含む請求項１に記載の方法。
10. ＢＷが前記電磁放射の幅の1/e2であるものとして、
    

    

    によってｋが計算されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. 流体中の粒子が電磁放射ビームの励起用容積部に通され、前記電磁放射と相互作用してパルス形状の信号を生成するようになった毛管型流動式サイトメータからのパルスを分析する方法において、
    前記毛管型流動式サイトメータの前記励起用容積部を通る粒子の特性を示す時間依存パルスを生成するステップと、
    あらかじめ決められた値より上の開始点と終了点を有する前記パルスの一部を選択することによって測定ウインドウを決定するステップと、
    前記パルスの部分の幅、高さ又は面積を含む前記パルスの部分の値を測定するステップと、
    前記測定ウインドウにおける時間に対する前記パルスの大きさの第一導関数を計算するステップと、
    計算した前記第一導関数を用いて前記励起用容積部を通る前記粒子の速度を計算するステップと、
    前記粒子の計算した前記速度を用いて前記パルスの部分の測定した前記値を修正するステップと、
    を含むことを特徴とする方法。
12. Ｖが前記粒子の速度を表し、αが、Ａｂｓが絶対値関数を示す
    

    

    に従い、前記導関数の最大値を表し、Ｐがパルスの高さを表し、ｋが倍率を表すものとして、
    

    

    の式から前記第一導関数を用いて、前記励起用容積部を通る前記粒子の速度を計算するステップ、
    をさらに含む請求項１１に記載の方法。
13. ＢＷが前記電磁放射の幅の1/e2であるものとして、
    

    

    によってｋが計算されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 前記粒子の修正された前記速度を測定された前記値に乗算することで、測定された前記値の前記修正が遂行されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
15. 流体中の粒子が毛管内の電磁放射ビームによって部分的に決められる励起用容積部に通され、前記電磁放射と相互作用してパルス形状の信号を生成するようになった毛管型流動式サイトメータからのパルスを分析する方法において、
    前記毛管内の前記励起用容積部を通る一つ以上の粒子の特性を示す時間依存パルスを生成するステップと、
    あらかじめ決められた値より上の開始点と終了点を伴う前記パルスの一部を選択することによって測定ウインドウを決定するステップと、
    前記測定ウインドウにある時間に対する前記パルスの第一導関数を計算するステップと、
    前記測定ウインドウ内で前記第一導関数がゼロ値近傍となる回数（ｎ）を決定するステップと、
    ｎが１のときパルスがシングレットと、ｎが３のときパルスがダブレットと、ｎが５のときトリプレットと、決定された前記回数を用いてパルスを分類するステップと、
    を含むことを特徴とする方法。
16. 前記一つ以上の粒子が前記励起用容積部通るとき、前記電磁放射と相互作用する前記一つ以上の粒子の光散乱により、前記時間依存パルスが生成されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
17. 前記一つ以上の粒子が前記励起用容積部通るとき、前記電磁放射と相互作用する前記一つ以上の粒子の蛍光により、前記時間依存パルスが生成されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
18. 流体中の粒子が毛管内の二以上の電磁放射ビームによって部分的に決められる二以上の励起用容積部に通され、前記二以上の電磁放射と相互作用してパルス形状の信号を生成するようになった毛管型流動式サイトメータからのパルスを分析する方法において、
    前記毛管内の第一励起用容積部を通る第一粒子の特性を示す第一時間依存パルスを生成するステップと、
    測定ウインドウ上の前記第一時間依存パルスの一番目の第一導関数を計算するステップと、
    前記第一時間依存パルスの前記一番目の第一導関数を用いて、前記第一粒子の第一速度を計算するステップと、
    前記毛管内の第二励起用容積部を通る第二粒子の特性を示す第二時間依存パルスを生成するステップと、
    測定ウインドウ上の前記第二時間依存パルスの二番目の第一導関数を計算するステップと、
    前記第二時間依存パルスの前記二番目の第一導関数を用いて、前記第二粒子の第二速度を計算するステップと、
    計算した前記第一速度と前記第二速度を比較することで前記第一時間依存パルスと前記第二時間依存パルスを修正するステップと、
    を含むことを特徴とする方法。
19. 前記第一時間依存パルスと前記第二時間依存パルスは、前記第一粒子と前記第二粒子が前記第一励起用容積部と前記第二励起用容積部を通っているときに、前記第一粒子と前記第二粒子が前記第一電磁放射と前記第二電磁放射と相互作用することによる散乱光から、生成されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. 前記第一時間依存パルスと前記第二時間依存パルスは、前記第一粒子と前記第二粒子が前記第一励起用容積部と前記第二励起用容積部を通っているときに、前記第一粒子と前記第二粒子が前記第一電磁放射と前記第二電磁放射と相互作用することによる蛍光から、生成されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
21. 粒子を解析する装置であって、
    毛管チューブと、
    光源と、
    前記光源から前記毛管チューブに電磁放射を導き、前記毛管チューブ内に励起用容積部を生じさせる光学システムと、
    流体中の粒子を前記励起用容積部に通して前記粒子を電磁放射と相互作用させて、光を散乱させ、及び／又は、蛍光を放出させる手段と、
    パルス形状の蛍光を検出する手段と、
    測定ウインドウ上で、時間に関する蛍光パルスの第一導関数を計算する手段と、
    を含むことを特徴とする装置。
22. パルス形状の散乱光を検出する手段と、
    測定ウインドウ上で、時間に関する散乱光パルスの第一導関数を計算する手段と、
    をさらに備える請求項２１に記載の装置。
23. 計算した前記第一導関数を用いて、前記粒子の速度を計算する手段をさらに備える請求項２１に記載の装置。

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