JP2017526914A - フローサイトメーターを用いた多重ピークイベントの評価 - Google Patents

Abstract

粒子の適正な特徴付けのため、多重ピークイベントが、単一の粒子と関連するイベントと複数の粒子と関連するイベントとを区別するために、フローサイトメーターによって評価される。フローサイトメーターを使用して粒子を特徴付ける方法は、流体流中の１つ以上の粒子を、フローサイトメーターの光線に通すことと、流体流中の１つ以上の粒子が光線を通ったときに放射される光を検出し、検出した放射光に基づいて波形を生成することと、波形が多重ピーク波形であることを判定することと、多重ピーク波形を評価して単一の粒子と複数の粒子とを区別することによって、１つ以上の粒子を特徴付けることと、を含む。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１５年７月２０日にＰＣＴ国際特許出願として出願されており、２０１４年８月６日に出願された米国特許出願第６２／０３４，００２号の優先権を主張するものであり、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

（背景技術）
フローサイトメーターは、試料の内容を評価するように動作する。典型的には、試料は、試料内の粒子を大まかに単一の縦列に整列させる、流体ノズルを通る。粒子は、次いで、流体流に注入される。レーザ光線で粒子を照射し、それによって前方散乱光、側方散乱光、後方散乱光、及び蛍光を含む、放射光が生じる。次いで、放射光が検出され、分析されて、粒子の１つ以上の特徴が判定され得る。

大まかに言えば、本開示は、フローサイトメーターを対象とする。１つの可能な構成において、また非限定的な例として、フローサイトメーターは、粒子のより正確な特徴を得るなどのため、多重ピークイベントを識別し、評価するように機能する。以下の態様を含むが、これらに限定されない様々な態様が本開示に記載される。

１つの態様は、フローサイトメーターを使用して粒子の特徴付けを行う方法であり、この方法は、流体流中の１つ以上の粒子をフローサイトメーターの光線に通すこと、流体流中の１つ以上の粒子が光線を通ったときに放射される光を検出し、検出した放射光に基づいて波形を生成すること、波形が多重ピーク波形であることを判定すること、及びこの多重ピーク波形を評価して単一の粒子と複数の粒子とを区別することによって、１つ以上の粒子の特徴付けを行うことを含む。

別の態様は、流体流を生成するように構成された流体ノズルであって、流体流がその中に粒子を含む、流体ノズルと、流体流及び粒子を照射するための光線を生成するように構成された光源と、流体流からの放射光を検出し、粒子と関連付けられた波形を生成するように構成された検出器と、多重ピーク波形を識別し、多重ピーク波形を評価して、多重ピーク波形のうちの少なくともいくつかを単一の粒子と関連しているとして識別し、多重ピーク波形のうちの少なくともその他のものが複数の粒子と関連しているとして識別し、この評価に基づいて、これらの粒子を単一の粒子又は複数の粒子として特徴付けるように構成された少なくとも１つの処理デバイスと、を備える、フローサイトメーターである。

更なる態様は、光線を生成し、流体流を照射するように配置される、光源と、光源による照射後に流体流から放射される光を検出し、出力信号を生成する、検出器と、出力信号を評価し、多重ピークイベントを特定し、多重ピークイベントを単一のイベントとして特徴付けるように多重ピーク評価エンジンを実行する、少なくとも１つの処理デバイスと、を備える、フローサイトメーターである。

フローサイトメーターの例を示す概略ブロック図である。 図１に示されるフローサイトメーターの１つ以上の検出器によって生成された多重ピークイベントの例を示す例示的な波形を示す図である。 図１に示されるフローサイトメーターの１つ以上の検出器によって生成された多重ピークイベントの例を示す例示的な波形を示す図である。 図１に示されるフローサイトメーターの１つ以上の検出器によって生成された多重ピークイベントの例を示す例示的な波形を示す図である。 図１に示されるフローサイトメーターの１つ以上の検出器によって生成された多重ピークイベントの例を示す例示的な波形を示す図である。 フローサイトメーターを操作する例示的な方法を示すフローチャートである。 図３に示される方法の設定操作の例を示すフローチャートである。 図１に示される例示的なフローサイトメーターの一部分を示す。 光線が図１に示されるフローサイトメーターの光線を通ったときに検出された例示的な波形のプロットである。 図３に示される方法の取得操作の例を示すフローチャートである。 図１に示されるフローサイトメーターを使用して１つ以上の粒子を検出する操作の例を示すフローチャートである。 多重ピークイベントの評価操作の例を示すフローチャートである。 谷分析を使用して多重ピークを評価する方法を示すフローチャートである。 多重ピーク波形の隣接するピーク間の緩やかに湾曲した谷の例を示す図である。 多重ピーク波形の隣接するピーク間の尖った谷の例を示す図である。 多重チャネル分析を使用して多重ピークイベントを評価する方法を示すフローチャートである。 図１に示されるフローサイトメーターなど、フローサイトメーターの検出器の複数のチャネルによって生成される波形を示す。

様々な実施形態が図面を参照して詳細に説明され、同様の参照番号は、いくつかの図を通して同様の部品及びアセンブリを表す。様々な実施形態への言及は、本明細書に添付された特許請求の範囲を限定しない。加えて、本明細書に述べられたいかなる例も、限定することを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲の多数の可能な実施形態のうちのいくつかについて述べたものであるに過ぎない。

図１は、フローサイトメーター１００の例を示す概略ブロック図である。この例では、フローサイトメーターは、試料源１０２と、流体源１０４と、流体ノズル１０６と、光源１０８と、検出器１１０（検出器１１０Ａ、１１０Ｂ、及び１１０Ｃなどを含む）と、多重ピーク評価エンジン１１４を含む粒子分析器１１２と、分類コントローラ１１８並びに分類プレート１２０及び１２２を含む分類システム１１６と、容器１２４（例えば、容器１２４Ａ、１２４Ｂ、及び１２４Ｃなどを含む）とを含む。流体ノズル１０６は、粒子１２８を中に含む流体流１２６を生成し、光源１０８は光線１３０を生成する。放射光１３２は、光線１３０が流体流１２６及び中に含まれる粒子１２８と交差すると生じる。フローサイトメーター１００の他の実施形態には、図１に示された例よりも多い、少ない、又は異なる構成要素が含まれる。

試料源１０２は、分析のためにフローサイトメーターに提供される試料の供給源である。試料には、光線１３０が照射され、粒子分析器によって分析される、個々の粒子１２８が含まれる。広範な異なる種類の試料を、フローサイトメーターにより分析することができる。試料の種類のいくつかの例としては、血液、精液、唾液、間質液、脳脊髄液、細胞培養物、海水、及び飲料水が挙げられる。試料は、一般的に試薬を添加し、当該技術分野で広く知られているプロトコルを行うことによって得られる、溶解血、懸濁液中の標識化粒子、免疫グロブリン標識化細胞、又はＤＮＡ染色細胞といった調製された試料の形態であり得る。粒子の種類の例としては、ビーズ、血液細胞、精細胞、上皮細胞、癌細胞、ウイルス、細菌、酵母、プランクトン、微小粒子（例えば、細胞の原形質膜由来）、及びミトコンドリアが挙げられる。試料源１０２には、分析される試料を保持する、試験管などの１つ以上の容器が含まれ得る。一部の実施形態では、試料を容器から吸引し、試料を流体ノズル１０６に送達するためのものなど、流体移送システムが提供される。

試料は、典型的に、フローサイトメーター内のシース流体に注入され、このシース流体は、シース流体源１０４によって提供される。シース流体の一例は、生理食塩水である。流体源１０４の例は、中に生理食塩水が保管された容器であり、流体移送システムは、流体源１０４から流体ノズル１０６にシース流体を送達するように動作可能である。

一部の実施形態において、流体ノズル１０６は、流体流１２６を生成し、試料の粒子１２８を流体流に注入するために提供される。流体ノズル１０６の例は、フローセルである。流体ノズル１０６は、典型的に、試料中の目的の粒子のサイズよりは少なくとも大きいが、粒子を狭い流れに配置するのに十分に小さくなるように選択されるサイズを有する。単一の粒子又は少数の粒子（例えば、１〜３個）が一度に光線１３０を通り得るように、粒子が単一の列又はほぼ単一の列の配置で配置されることが理想である。一部の実施形態では、粒子は、流体力、音響力、又は磁力を用いて集束される。

光源１０８（本明細書で考察されるように、１つ以上の光源が含まれ得る）は、流体流１２６に向けられた少なくとも１つの光線を生成する。光源１０８の例としては、レーザ及びアーク灯が挙げられる。一部の実施形態では、光線１３０は、光線を流体流１２６に集束させるなどのために、光学アセンブリを通る。一部の実施形態では、光線は、レーザ光線である。

光源１０８からの光線１３０は、流体流１２６と交差する。光線１３０内に含まれた粒子１２８は、光線１３０を遮り、放射光１３２を生成する。放射光１３２の種類及びパターンは、粒子１２８の種類及びサイズに依存するが、放射光１３２には、前方散乱光、側方散乱光、後方散乱光、並びに蛍光（光線が粒子に吸収され、再放出された場合に起こるものであり、光線の波長（即ち、色）の対応する変化によって検出することができる）が含まれ得る。

放射光１３２を検出するために１つ以上の検出器１１０が提供される。この例では、検出器１１０は、前方散乱及び蛍光を検出するように配置された検出器１１０Ａ、側方散乱及び蛍光を検出するように配置された検出器１１０Ｂ、及び後方散乱及び蛍光を検出するように配置された検出器１１０Ｃを含む。検出器１１０の一例は、光電子倍増管である。

粒子分析器１１２は、１つ以上の検出器１１０からの信号を受信して、粒子１２８を特徴付けるための様々な動作を行うように機能する。一部の実施形態では、粒子分析器１１２には、１つ以上の処理デバイスと、処理デバイスによって実行されると、処理デバイスに本明細書に考察されるものなどの１つ以上の動作を行わせる、データ命令を記憶するコンピュータ可読ストレージデバイスとが含まれる。一部の実施形態では、粒子分析器１１２は、アナログからデジタルへの変換器及びファームウェアを含む。

一部の実施形態では、粒子分析器１１２は、多重ピークイベントを検出及び評価するように機能する、多重ピーク評価エンジン１１４を含む。多重ピークイベントの例は、例えば図２を参照して、本明細書に考察されている。多重ピーク評価エンジン１１４によって行われる動作の例は、図３〜１４を参照して例示され、説明されている。

一部の実施形態では、フローサイトメーター１００は、分類フローサイトメーターであり、これは、粒子分析器１１２によって生成された粒子の特徴付けを使用して、粒子１２８を複数の容器１２４に分類するように機能する。分類フローサイトメーターは、例えば分類コントローラ１１８並びに分類プレート１２０及び１２２を含む、分類システム１１６を含む。一例として、分類コントローラ１１８は、粒子の特徴付けに基づいて流体流から形成された液滴に、正、負、又は中性の電荷を適用する。一部の実施形態では、流体ノズルは、分類コントローラ１１８によって制御される、電荷生成電気回路に電気的に接続されている。液滴が、荷電した分類プレートを通ると、液滴は、それらのそれぞれの電荷に基づいて、容器１２４Ａ、１２４Ｂ、及び１２４Ｃのうちの１つに向かって偏向される。分類フローサイトメーターは、典型的には少なくとも２つの容器を有してもよく、３つを上回る容器を有してもよい。典型的に、１つの容器は、不要な粒子、又は１つ以上の粒子が混入していると見られる流体液滴のための廃液容器である。

図２は、１つ以上の粒子１２８が光線１３０を通ったときに１つ以上の検出器１１０によって生成され、粒子分析器１１２によって受信された、例示的な波形１５０、１５２、１５４、及び１５６を示す図である。波形１５２、１５４、及び１５６はまた、多重ピークイベントの例でもある。

第１のプロット（Ａ）は、単一の粒子によって生成された典型的なほぼガウス形の波形１５０を示す。第２のプロット（Ｂ）は、別の粒子によって生成された例示的な多重ピーク波形１５２を示す。第３のプロット（Ｃ）は、２つの粒子によって生成された別の例示的な多重ピーク波形１５４を示す。第４のプロット（Ｄ）は、単一の大きな粒子によって生成された別の例示的な多重ピーク波形１５６を示す。

検出器１１０のうちの１つによって光が検出されると、光によって電流が流れ、電圧が発生する。結果として得られる出力信号は、図２に示された４つの例のような波形を形成する。これらの波形は、図形で例示するために提供されているが、典型的には、フローサイトメーターにおいて、又はそれによって、実際に図で表示されることはない。一部の実施形態では、フローサイトメーターは、最大の高さ、半分の高さにおける幅、及び面積などを含む、生成された波形に関するデータを収集し、記録している。一部の実施形態では、複数の光源によって生成された信号についてのデータが、各光源のための複数のチャネルで収集される。異なるチャネルで検出される信号の例としては、前方散乱、側方散乱、及び蛍光信号が挙げられる。これらのプロットは、電圧を示すｙ軸と時間を示すｘ軸で波形を示している。

第１のプロット（Ａ）は、粒子１２８が光線１３０を通ったときに予測される典型的な波形を示す。粒子１２８の前縁部が、まず光線と交差し、少量の光が、粒子によって偏向される。粒子が完全に光線１３０内に入るまで、粒子１２８のより多くの部分が光線１３０と交差するにつれ、偏向される光の量は時間と共に増加する。粒子１２８が完全に光線１３０内に入ったこの時点で波形１５０のピークが生じる。次いで、粒子１２８の前縁部が光線１３０から出ると、偏光は減少し始め、粒子１２８の後縁部が光線１３０から出るまで継続する。

本発明者らは、３つの更なる波形１５２、１５４、及び１５６を特定した。これらもまた、フローサイトメーターによって検出されることがある。これらの波形は、第２（Ｂ）、第３（Ｃ）、及び第４（Ｄ）のプロットに示されている。

第２のプロット（Ｂ）は、粒子１２８によって生成される場合がある多重ピーク波形１５２を示す。この例では、波形１５２は、谷１６４によって分離された２つのピーク１６０及び１６２を呈している。これらのピークは、上昇及びそれに続く下降を呈する信号の一部分である。第１のプロット（Ａ）のように、波形１５２は、粒子１２８の前縁部が光線１３０に入ると開始され、粒子のより多くの部分が光線１３０に入るにつれて、ピーク１６０を迎えるまで急速に上昇する。しかしながら、この例では、粒子が完全に光線に入ると、検出器において検出される放射光が減少することで電圧の低下が引き起こされ、谷１６４が形成される。粒子１２８の前縁部が光線１３０の縁部に到達すると電圧は再び上昇し、後縁部が完全に覆われると、第２のピーク１６２が形成される。電圧は、次いで、粒子１２８が光線１３０を出るにつれ、次第に弱まる。本明細書により詳細に考察されるように、谷１６４は、滑らかな曲線形状を呈する。実験による観察及び数学的モデリングにより、単一の粒子によって生成された多重ピーク波形１５２は、典型的に、光線１３０の光線幅未満又はそれにほぼ等しい粒子幅を有する粒子によって生成されることがわかっている。具体的には、光線幅とほぼ等しい幅を有する粒子は、最も深い谷１６４を有する波形を呈し、そのため、２つの粒子として誤って特徴付けられる可能性が極めて高い。

第３のプロット（Ｃ）は、別の多重ピーク波形１５４を示す。この例では、多重ピーク波形１５４は、互いに近接して光線１３０を通る２つの粒子から形成されている。波形１５４は、谷１７４によって分離された第１のピーク１７０及び第２のピーク１７２を有する。この例では、それぞれの粒子がほぼガウス形状を有する波形を生成しているが、粒子が近接しているため、これらの波形の一部分が重なり、単一の波形をもたらしている。

多重ピークプロット（Ｂ及びＣ）は、ピークが２つだけの波形１５２及び１５４を示しているが、更なるピークを有する波形、例えば、３つ又は４つのピークを有する波形もまた観察されている。

第４のプロット（Ｄ）は、別の多重ピーク波形１５６を示す。この例では、波形１５６は、谷１９２によって分離された２つのピーク１８８及び１９０を呈している。波形１５６は、前方散乱波形の例である。一部の実施形態において、粒子が光線１３０を通るとき、粒子の前縁部が、まず、光線１３０と交差する。前縁部からの偏光が、第１のピーク１８８の形成を引き起こす。粒子が光線１３０内に進むにつれて、粒子は、光の前方散乱を遮断し始め、偏光の減少を引き起こし、波形１５６に谷１９２の形成をもたらす。次いで、粒子の後縁部が光線内に入り、光が、この後縁部から検出器に向かって再び偏向され始め、波形１５６に第２のピーク１９０の形成をもたらす。実験による観察及び数学的モデリングにより、単一の粒子によって生成された多重ピーク波形１５６は、典型的に、光線１３０の光線幅よりも大きい粒子幅を有する粒子によって生成されることがわかっている。

多重ピーク波形（本明細書では、多重ピークイベントと称されることもある）の存在は、粒子を適正に特定し、それらを特徴付ける際に、いくつかの問題をもたらす可能性がある。

問題の１つは、第２（Ｂ）及び第４（Ｄ）のプロットに示されている多重ピーク波形１５２及び１５６が、２つ以上の別個の粒子として誤って特徴付けられ得ることである。

これがどのように起こるかについて説明する前に、フローサイトメーター１００が、典型的に、可変電圧閾値（トリガ閾値又は単純に閾値と称されることもある）を有することを理解することが有益である。この可変電圧閾値は、粒子の波形を検出するように設定され使用され得る。電圧閾値は、非粒子関連のノイズを粒子波形と混同することを回避するために、ノイズフロアよりも高い電圧に設定することが好ましい。ノイズは、ショットノイズ、ダークノイズ、及びその他の源を含む、様々な源に起因してシステム内に存在し得る。一部の実施形態では、この閾値は、ファームウェアの設定であり、波形の電圧が閾値を超えた場合にファームウェアの動作をトリガするように機能する。

フローサイトメーターが本明細書に記載される多重ピーク評価エンジン１１４の利点を有さずに動作する場合、粒子を適正に特徴付けることに問題が生じる可能性がある。例えば、電圧閾値が、第２のプロット（Ｂ）に示されているレベル１８０など非常に低く設定されている場合、粒子分析器は、閾値レベル１８０を通る信号の立ち上がりエッジ１つと立ち下がりエッジ１つしか認識しないため、波形１５２が単一の粒子によって生成されていると適正に特定するであろう。しかしながら、電圧閾値が、レベル１８２など高く設定されている場合、粒子分析器は、第１のピーク１６０と関連する立ち上がりエッジ及び立ち下がりエッジ、並びに第２のピーク１６２と関連する第２の立ち上がりエッジ及び第２の立ち下がりエッジを認識することになるため、波形１５２を２つの粒子として誤って特定してしまうことになる。閾値の設定にかかわらず、同じ問題が第４のプロット（Ｄ）で生じる。

多重ピーク波形を適正に特定する別の問題は、複数の粒子が単一の粒子として誤って特徴付けられ得ることである。第３のプロット（Ｃ）に示される例では、電圧閾値が、レベル１８４など比較的高く設定されている場合、粒子分析器１１２は、２つのピーク１７０及び１７２の立ち上がりエッジ及び立ち下がりエッジにより、波形１５４が２つの粒子によって生成されていると適正に特定する。しかしながら、電圧閾値が、レベル１８６など低く設定されている場合、粒子分析器１１２は、電圧閾値レベル１８６では単一の立ち上がりエッジと単一の立ち下がりエッジのみを認識するため、波形１５４を単一の粒子として誤って特定してしまう。

したがって、第２のプロット（Ｂ）に示される多重ピーク波形１５２を不正確に誤って特徴付ける可能性を低減するには電圧閾値を下げることが有益ではあるが、そうすることにより、検出されるノイズ及び重要でない細胞片（ｄｅｂｒｉｓ）が増加し、更には第３のプロット（Ｃ）に示される波形１５４を単一の粒子として不正確に誤って特徴付ける可能性が増加する。更に、電圧閾値を下げることは、多重ピーク波形１５６を単一の粒子として正確に特徴付けることに役立つわけではない。

結果として、図１に示されるように、フローサイトメーター１００の一部の実施形態は、したがって、多重ピークイベントを生成する１つ以上の粒子を適正に特徴付けるために、多重ピークイベントを特定するように機能する多重ピーク評価エンジン１１４を含む。

図３は、フローサイトメーターを操作する例示的な方法１９４を示すフローチャートである。この例では、方法１９４は、設定操作１９６及び取得操作１９８を含む。

設定操作１９６は、フローサイトメーター１００の現在の構成を試験し、初回計算を行うために行われる。例えば、設定操作１９６は、２つ以上の光線１３０間の間隔を判定し、流体流１２６（図１）の流速を判定するために用いられ得る。設定操作１９６の例は、図４〜６を参照して本明細書により詳細に例示され、説明される。

設定操作１９６が完了した後、設定操作１９６中に収集された情報を使用して試料を処理するための取得操作１９８が行われる。取得操作１９８の例は、図７〜１２を参照して本明細書により詳細に例示され、説明される。

図４は、図３に示される設定操作１９６の例を示すフローチャートである。この例では、設定操作１９６は、操作２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、及び２１２を含む。

ビーズを流体流１２６に注入するための操作２０２が行われる。一部の実施形態では、ビーズは、品質管理用ビーズなど既知の寸法を有する既知の粒子である。品質管理用ビーズの例は、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ，ＩＬ）から入手可能な直径３．０〜３．４ｕｍのＵｌｔｒａ Ｒａｉｎｂｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓパーツ番号ＵＲＦＰ−３０−２である。

このビーズを使用して流体の流速を判定するための操作２０４が行われる。操作２０４の例は、図５を参照して本明細書により詳細に例示され、説明される。

また、ビーズが光線１３０（図１）を通るときに生成される波形のパルス幅を測定するための操作２０６が行われる。操作２０６の例は、図６を参照してより詳細に例示され、説明される。

操作２０６の後に、光線１３０の幅を計算するための操作２０８が行われる。操作２０８の例は、図６を参照してより詳細に説明される。

次いで、操作２０８で計算された光線幅及び操作２０４で計算された流体の流速に基づいて、最小許容可能閾値パルス幅を判定するための操作２１０が行われる。操作２１０の例は、図６を参照してより詳細に説明される。

最大許容可能閾値パルス幅を判定するための操作２１２が行われる。一部の実施形態では、最大許容可能パルス幅は、最大許容可能粒径に少なくとも部分的に基づいて計算される。一部の実施形態では、最大許容可能粒径は、例えば、流体ノズル１０６（図１）のサイズのファクターである。一般に言って、ある粒子に対して発生し得る最大のパルス幅は、流体ノズル１０６を通り得る最も大きな粒子のパルス幅であり、この最も大きな粒子は、光線幅とその粒子の直径との合計であるパルス幅を生成するであろう。したがって、一部の実施形態では、最大許容可能閾値パルス幅は、
最大許容可能パルス幅＝Ａ×（最大粒径＋光線幅）であり、
最大粒径は、
最大粒径＝Ｂ×ノズルサイズであり、
式中、Ａ及びＢは、定数である。Ａは、例えば、ベースラインから閾値へと変換するために使用され得る。例として、定数Ａは、約０．５〜１の範囲、例えば０．８〜０．９の範囲にある。しかしながら、Ａはまた、複数粒子のイベントが見逃されないことを確実にするために、一部の実施形態では１よりも大きくてもよい。定数Ｂは、ノズルサイズに非常に近い粒子が、依然としてノズルを詰まらせ得るという事実に起因して含まれる。したがって、最大粒径は、典型的に、ノズルサイズよりも小さく、例えば、一例として約４０％〜約６０％の範囲にある。一部の実施形態では、定数Ｂは、５０％未満である。

フローサイトメーター１００は、約５０ミクロン〜約２００ミクロンの範囲のサイズの流体ノズルを有することが多い。したがって、約２０〜約１２０ミクロンの範囲の最大粒径が、多くの実施形態では適切であろう。

図４に示される操作２０４及び操作２０６は、示されている例とは異なる順序で行われてもよい。

一部の実施形態では、品質管理用ビーズを用いて、光線スポット幅判定が行われる。次いで、各取得の前に、所定の光線スポット幅及び現在のトリガ閾値（１回の取得実施と次の取得とでは変化し得る）を用いて、最小許容可能パルス幅が再計算される。

図５は、流体ノズル１０６からの流体流１２６、光源１０８Ａからの光線１３０Ａ、光源１０８Ｂからの光線１３０Ｂ、及び検出器１１０を含む、例示的なフローサイトメーター１００の一部分を示す。図５はまた、図４に示される操作２０２及び２０４の例も示す。

操作２０２（図４）において、ビーズ２２０が、流体流１２６に注入され、流体流と共に、２つ以上の光線１３０Ａ及び１３０Ｂを通って流れる。ビーズ２２０が、光線１３０Ａを横切ると、検出器１１０は、放射光を検出し、図２の第１のプロット（Ａ）に示される波形１５０など、単一ピークのパルスを含んだ、結果として得られる波形を生成する。パルスは、例えば、波形１５０の立ち上がりエッジが電圧閾値と交差し、それを超えると開始され、波形１５０の立ち下がりエッジが電圧閾値と交差し、それを下回ると終了する。一例として、パルスは、時間ｔ_０で開始する。

ビーズ２２０は、次いで、流体流１２６と共に前進を続け、光線１３０Ｂと交差し、このときに、検出器１１０（検出器１１０Ａ〜Ｃのいずれかなど、同じ検出器であっても異なる検出器であってもよい）が、放射光を検出し、別の波形（例えば、図２のプロット（Ａ）に示される波形１５０）を生成する。この例では、パルスは、時間ｔ_１で開始する。

次いで、これらの測定値に基づいて、また光源１０８Ａと１０８Ｂとの間の既知の間隔（距離Ｄ１）に基づいて、流体速度を計算するための操作２０４が行われる。より具体的には、流体の流速（Ｖ_ＦＬＯＷ）は、
Ｖ_ＦＬＯＷ＝Ｄ１／（ｔ_１−ｔ_０）として計算することができる。

図６は、図５に示されている、ビーズ２２０が光線１３０Ａを通ったときに検出される例示的な波形２３０のプロットである。図６はまた、図４に示される操作２０６の例も示す。

ビーズ２２０のサイズ及び組成に起因して、検出器１１０（図５）によって検出される波形２３０は、ほぼガウス形状を有する。

波形２３０におけるパルスのパルス幅を測定するために、操作２０６は、まず、波形２３０が現在選択されている電圧閾値（Ｖ_ｔｈ）を上回った時間ｔ_０を判定する。操作２０６は、次いで、波形２３０が電圧閾値よりも低く戻った時間ｔ_１を判定する。閾値における全パルス幅（ｔ_{ｔｏｔａｌ}）は、
ｔ_{ｔｏｔａｌ}＝ｔ_１−ｔ_０として計算される。

この全パルス幅は、以下のように、（１）光線１３０Ａの光線幅、及び（２）ビーズ２２０の直径という２つの因子の組み合わせを表し、
ｔ_{ｔｏｔａｌ}＝ｔ_ｂｗ＋ｔ_ｐｗ
式中、ｔ_ｂｗは、閾値の光線幅であり、ｔ_ｐｗは、閾値の粒子幅である。

ビーズの直径が既知であり、また流体流１２６の流速が既知であるため（例えば、操作２０４）、閾値において単独で光線幅に寄与し得るパルス幅（非常に小さいビーズ／粒子などによる）は、
ｔ_ｂｗ＝ｔ_{ｔｏｔａｌ}−（閾値の有効ビーズ直径／Ｖ_ＦＬＯＷ）として計算することができる。

閾値の光線幅（ｔ_ｂｗ）は、流体流１２６中の非常に小さな粒子が光線を通るのに必要な時間として表される。閾値の光線幅そのもの（距離の単位で）も、既知の流体速度に基づいて、
閾値の有効光線幅＝Ｖ_ＦＬＯＷ×ｔ_ｂｗとして計算することができる。

一部の実施形態において、閾値測定値を予測ベースライン測定値に変換することが望ましい。閾値からベースラインに値を変換する１つの方法は、波形を、ガウス関数に近似すると見なすことである。実験による測定を通じて、イベントプロファイルは、最大高さが最大高さの１％まで低下し、平均誤差が−１．９％であり、標準偏差が３．６％であることから、ガウス関数に近似することがわかっている。最大ガウス高さ１％未満では、ガウス関数は、実際の信号よりもかなりゆっくりと下がることがわかっている。したがって、以下の計算では、最大パルス幅は、最大ガウス高さの１％で生じると見られる。

ガウス関数は、次の通りであり、
ｆ（ｘ）＝ｈｅｉｇｈｔ＿ｍａｘ×ｅｘｐ（−ｘ＾２／（２×Ｃ＾２））
式中、Ｃは、標準偏差を表す。

実験により、イベント波形がほぼガウス形であると判定されると、既知の高さの１つのパルス幅測定値を用いてＣを求めることができる。つまり、半分の高さにおけるｆ（ｘ）は、
ｈｅｉｇｈｔ＿ｍａｘ／２＝ｈｅｉｇｈｔ＿ｍａｘ×ｅｘｐ（−ｘ＾２／（２×Ｃ＾２））となり、
Ｃを求めると、
２×ｌｎ（ｈｅｉｇｈｔ＿ｍａｘ／（２×ｈｅｉｇｈｔ＿ｍａｘ））＝−（ｘ＾２／Ｃ＾２）
Ｃ＝ｘ／ｓｑｒｔ（ｌｎ（２）×２）となる。

ｘ＝パルス幅の半値となるため、半分の高さのパルス幅でＣを求めると、
Ｃ＝ＰＷ＿ｈｈ／（２×ｓｑｒｔ（ｌｎ（２）×２））
Ｃ＝ＰＷ＿ｈｈ／２．３５４８２となる。

同様に、１％の高さのパルス幅でＣを求めると、
Ｃ＝ＰＷ＿ｈｈ／６．０６９７１となる

したがって、全パルス幅は、半分の高さのトリガ閾値の測定パルス幅から
ＰＷ＿ｆｕｌｌ＝（ＰＷ＿ｈｈ／２．３５４８２）×６．０６９７１となる。

この考察から、半分の高さのトリガ閾値での有効なビーズ直径は、
有効なビーズ直径＝ビーズ直径×２．３５４８２／６．０６９７１となる。

閾値の光線幅（ｔ_ｂｗ）の計算が終わると、一部の実施形態では、本明細書でより詳細に考察されるように、多重ピーク考察エンジン１１４によって使用される最小許容可能パルス幅を判定するために、操作２１０が行われる。一部の実施形態では、最小許容可能パルス幅は、図２の第２のプロット（Ｂ）に示される多重ピーク波形１５２が、粒径が光線幅とほぼ等しい場合に最も顕著となるが、粒径が光線幅よりも幾分小さい場合にも存在し得るという理解に基づく。一部の実施形態では、最小許容可能パルス幅は、
最小許容可能パルス幅＝Ｄ×（２×ｔ_ｂｗ）として計算され、
式中、Ｄは、０．５〜１の範囲にあり、一部の実施形態では０．８〜０．９の範囲にある。

換言すると、多重ピークイベントについては、単一の粒子から予測されるべき複数のピークを組み合わせた最大のパルス幅は、粒子が光線幅と等しい直径を有する場合に生じ、その場合、閾値のパルス幅は、「２×ｔ_ｂｗ」となる）。したがって、最小許容可能パルス幅よりも小さい単一のパルス幅はいずれも、２つ以上の小さな粒子が近接していることに起因する可能性が高い（図２のプロット（Ｃ））。最小許容可能パルス幅よりも大きいが、最大許容可能パルス幅よりも小さい単一のパルス幅はいずれも、複数の粒子が近接している（図２のプロット（Ｃ））又は単一の粒子が多重ピーク波形を有する（図２のプロット（Ｂ））のいずれかに起因する可能性が高く、この場合、本明細書に記載されるように更なる評価が行われ得る。

図３を再度簡単に参照すると、設定操作１９６が完了すると、フローサイトメーター１００は、取得操作１９８の開始準備が整う。取得操作１９８の例は、図７〜１４を参照して示され、説明される。

図７は、図３に示される取得操作１９８の例を示すフローチャートである。この例では、取得操作１９８は、操作２４０、２４２、及び２４４を含む。

１つ以上のイベントを検出するための操作２４０が行われる。操作２４０の例は、図８を参照してより詳細に例示され、説明される。

多重ピークイベントを評価するための操作２４２が行われる。操作２４２の例は、図９を参照してより詳細に例示され、説明される。

１つ以上の粒子を特徴付けるための操作２４４が行われる。操作２４４の例は、図９〜１２を参照してより詳細に例示され、説明される。

図８は、図７に示される１つ以上のイベントを検出する操作２４０の例を示すフローチャートである。この例では、操作２４０は、操作２５２、２５４、２５６、及び２５８を含む。

検出された波形のパルスを検出するための操作２５２が行われる。例えば、操作２５２は、波形が最小電圧閾値（Ｖ_ｔｈ）を上回るかどうかを判定するために行われる。本明細書に考察されるように、最小電圧閾値は、例えば、存在し得るノイズを無視するために用いられ得る。波形が最小電圧閾値を上回っている場合、操作２４０は、操作２５４へと進行する。そうでない場合、即ち波形が最小電圧閾値を上回っていない場合、粒子は検出されず（２５６）、操作２４０は、次のパルスの監視を継続する（操作２５２）。操作２５６は、操作２５２とは別個の操作として示されているが、一部の実施形態では、操作２５６は、パルスが検出されていない期間の操作２５２の状態である。

検出されたパルスのパルス幅が最小パルス幅閾値を上回るかどうかを判定するために、操作２５４が行われる。最小パルス幅閾値は、同様に、非常に短いパルス幅（例えば、例として光線幅（ｔ_ｂｗ）よりも大幅に狭いパルス幅）を有する電圧スパイクなど、非粒子ノイズを無視するように機能する。パルス幅が最小パルス幅閾値を上回っている場合、操作２５８が行われ、少なくとも１つの粒子が検出されたと判定される。そうでない場合は、操作２５６が行われ、粒子が検出されていないと判定される。

図９は、多重ピークイベントの波形を評価する例示的な方法２６０を示すフローチャートである。図９はまた、図７に示される操作２４２の例でもある。この例では、方法２６０は、操作２７０、２７２、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、及び２８０を含む。

最大許容可能パルス幅内に複数のピークが波形に存在するかどうかを判定するための操作２７０が行われる。ピークは、電圧の上昇に続く電圧の低下など、波形の上昇及び下降として検出され得る。一部の実施形態では、上昇と下降は、例えば、ノイズと区別するために、所定の大きさよりも大きくなければならない。一部の実施形態では、ピークは、極大を含む波形の一部分として特定される。一部の実施形態では、波形のピーク及び谷は、導関数がゼロになる波形上の点として特定され得る。

一部の実施形態では、第１のピークが開始した時間から（例えば、第１のピークの立ち上がりエッジが電圧閾値を超えた時間から）最大許容可能パルス幅が経過する前に、第２の検出されたピークの立ち下がりエッジが電圧閾値（Ｖ_ｔｈ）を通るかどうかが、操作２７０により判定される。通らない場合、操作２７２が行われ、波形に多重ピークイベントが存在しないと判定され、粒子が単一の粒子として特徴付けられる。複数のピークが存在する場合、方法２６０は、操作２７４において多重ピークイベントが波形に存在することを判定し、多重ピーク評価エンジン１１４（図１）による更なる評価が適していることを判定する。

次いで、操作２７５が行われ、最小許容可能パルス幅よりも前に第２のピークが終了するかどうかが判定される。終了する場合、図２のプロット（Ｃ）に示されるものなど、多重ピーク波形が複数の近接したサイズの小さな粒子によって生成されたものであると判定され、操作２７６において複数の粒子として特徴付けられる。第２のピークが最小許容可能パルス幅よりも前に終了しない場合、方法２６０は、更なる評価のために操作２７７へと進行する。

操作２７７は、複数のピークが重なっているかどうかを判定するために行われる。例えば、一部の実施形態では、操作２７７により、波形が複数のピーク間で閾値よりも低くなるかどうかが判定される。低くならない場合、操作２７７は、これらのピークが重複していると判定し、操作２７８が行われる。低くなる場合、操作２７７は、これらのピークが重複していないと判定し、操作２８０が行われる。

操作２７８は、２つのピークが重複している場合に、波形に谷分析を行う。谷分析は、波形における２つの隣接するピークの間の谷の形状を評価することによって、単一の粒子と複数の粒子とを区別するように機能する。谷分析の例は、図１０〜１２を参照してより詳細に例示され、説明される。

操作２７７によりピークが重複していないと判定された場合、多重ピーク波形は、図２のプロット（Ｄ）に示されるような単一の大きな粒子であるか、又は両方が図２のプロット（Ａ）などの波形を有する２つの別個の粒子であるかのいずれかであると判定される。どちらが存在しているかを判定するために、操作２８０は、多重チャネル分析を行う。多重チャネル分析は、波形が単一の粒子と関連するか又は複数の粒子と関連するかを判定するために、少なくとも１つの他のチャネル（例えば、検出器１１０Ａ〜Ｃのうちの別のもの）からの波形の使用を伴う。多重チャネル分析の例は、図１３〜１４を参照してより詳細に例示され、説明される。

図１０は、谷分析を使用して多重ピークイベントを評価する方法２９０を示すフローチャートである。この例では、方法２９０は、操作２９２、２９４、及び２９６を含む。一部の実施形態において、方法２９０は、図９に示される、谷分析を行う操作２７８の例である。

多重ピークイベントが波形に存在するかどうかを判定するための操作２９２が行われる。操作２９２の例は、図９に示される操作２７０、２７５、及び２７７を含む。多重ピークイベントが検出されるか、又は既に検出されている場合、方法２９０は、操作２９４へと進行する。

谷の波形形状を評価するための操作２９４が行われる。例えば、一部の実施形態では、操作２９４により、２つの隣接するピークの尖端又は曲線の間にある谷の鋭度が評価される。湾曲した谷１６４を示す図２のプロット（Ｂ）に示される波形など、緩やかに湾曲した谷は、単一の粒子によって生成される。尖った谷１７４を示す図２のプロット（Ｃ）に示される波形など、尖った谷は、２つの別個の粒子によって生成される。更なる例は、図１１及び１２に示される。

操作２９４の結果に基づいて１つ以上の粒子を特徴付けるための操作２９６が行われる。谷が緩やかに湾曲していると判定された場合、操作２９６により、波形が単一の粒子によって生成されていると判定される。谷が尖っていると判定された場合には、操作２９６により、波形が複数の粒子によって生成されていると判定される。一部の実施形態では、谷が緩やかに湾曲しているか尖っているかの判定は、閾値との比較に基づく。例えば、谷の領域内の波形の第１の導関数の値（絶対値）を、閾値と比較して、谷が緩やかに湾曲しているか尖っているかを判定することができる。値が閾値を上回る場合には波形は尖っており、上回らない場合には波形は緩やかな曲線をしている。

一部の実施形態では、閾値は、設定段階中に判定される。他の実施形態では、閾値は、イベントごとに判定される。例えば、閾値は、初回の立ち上がり及び／又は立ち下がりエッジの導関数を測定し、それをピーク間の導関数と比較するために定数（例えば、０．９）で乗じることによって判定することができる。一部の実施形態では、第２の導関数が、更に又は代替として評価される。

一部の実施形態において、第２の導関数により、波形の谷内における波形変化率の変化率が、閾値を上回るかどうかが評価される。別の可能性のある実施形態では、波形の幅が、谷の中点に隣接する所定の位置で評価される。例えば、狭い幅は尖った曲線を表し、広い幅は緩やかな曲線を表す。

図１１は、多重ピーク波形の隣接するピーク１６０及び１６２の間の緩やかな谷１６４の例を示す図である。この例では、谷１６４は、第１のピーク１６０の立ち下がりエッジ３０２と、第２のピーク１６２の立ち上がりエッジ３０４とによって形成されている。図１１はまた、図２のプロット（Ｂ）に示される波形１５２の一部分の拡大図でもある。

この例では、立ち下がりエッジ３０２と立ち上がりエッジ３０４とが合流して、波形の緩やかな曲線部分を形成している。一部の実施形態では、谷の位置は、ピーク１６０とピーク１６２との間の中点、あるいはピーク１６０の立ち上がりエッジとピーク１６２の立ち下がりエッジとの間の中点であると推定される。

単一の粒子による波形の谷１６４は、図１２に示される尖った谷と比較して、緩やかな曲線を呈することがわかっている。

図１２は、多重ピーク波形の隣接するピーク１７０及び１７２の間の尖った谷１７４の例を示す図である。この例では、谷１７４は、第１のピーク１７０の立ち下がりエッジ３０６と第２のピーク１７２の立ち上がりエッジ３０８とによって形成されている。図１２はまた、図２のプロット（Ｃ）に示される波形１５４の一部分の拡大図でもある。

この例では、立ち下がりエッジ３０６と立ち上がりエッジ３０８とが合流して、図１１に示される緩やかに湾曲した谷１６４と比較してより鋭利に尖った谷１７４を形成している。一部の実施形態では、谷の位置は、上述のように、中点であると推定される。

複数の粒子による波形の谷１７４は、谷１６４と比較して、より鋭利に尖った曲線を呈することがわかっている。各粒子と関連するピーク１７０及び１７２は、本明細書に考察されるように、ガウス関数に近似するが、ピーク１７０及び１７２はいずれも、重なり部分の波形に寄与しており、谷１７４の波形の追加、及び交差部に尖った曲線の形成をもたらしている。

図１３は、多重チャネル分析を使用して多重ピークイベントを評価する方法３２０を示すフローチャートである。この例では、方法３２０は、操作３２２、３２４、及び３２６を含む。一部の実施形態において、方法３２０は、図９に示される、多重チャネル分析を行う操作２８０の例である。

多重ピークイベントが波形に存在するかどうかを判定するための操作３２２が行われる。操作３２２の例は、図９に示される操作２７０、２７５、及び２７７を含む。多重ピークイベントが検出されるか、又は既に検出されている場合、方法３２０は、操作３２４へと進行する。

評価されている粒子（複数可）の第２の波形を評価するための操作３２４が行われる。例えば、多重ピーク波形が、前方散乱信号など、フローサイトメーターの１つのチャネルで検出された１つの粒子によって生成される場合であっても、他のチャネルは、同じ多重ピーク波形を呈さない場合があり、代わりに、図２のプロット（Ａ）に示されるほぼガウス波形を呈する場合があることがわかっている。したがって、多重ピーク波形を単一の粒子によって生成されたもの及び２つの別個の粒子によって生成されたものとして区別するために、第２のチャネルの波形を評価して、多重ピーク波形が１つの粒子又は複数の粒子によって生成されているかどうかを判定することができる。例は、図１４を参照してより詳細に例示され、説明される。

操作３２４の結果に基づいて１つ以上の粒子を特徴付けるための操作３２６が行われる。第２のチャネルが単一のピークを有すると判定された場合、操作３２６により、この波形が単一の粒子によって生成されていると判定される。第２のチャネルが複数のピークを有すると判定された場合、操作３２６により、この波形が複数の粒子によって生成されていると判定される。

図１４は、フローサイトメーターの検出器１１０（図１）の複数のチャネルによって生成された波形１５６及び３３０を示す。この例では、波形１５６は、前方散乱信号であり、波形３３０は、側方散乱信号及び蛍光信号である。

この例は、単一の粒子が評価されているときに複数のチャネルで生成された波形１５６及び３３０を示す。この例では、波形１５６は、谷１９２によって分離された２つの異なる離間したピーク１８８及び１９０を呈する。重なっていない複数のピークのため、多重ピーク評価エンジン１１４（図１）は、第２のチャネルの波形３３０を評価して、複数のピークが単一の粒子によって生成されているか複数の粒子によって生成されているかを判定するように機能する。一部の実施形態では、この操作により、中点（即ち、ピーク１８８と１９０との間の中間時点）における波形３３０の大きさが判定される。この例では、波形は、中点にピーク３３２を有する。結果として、多重ピーク波形１５６は、単一の粒子によって生成されていると判定される。そうではなく、波形３３０が中点において信号を有さないか、又は閾値に満たない低い信号を有する場合、多重ピークイベントは、複数の粒子によって生成されていると判定される。

一部の実施形態において、波形が単一の粒子によって生成されているか複数の粒子によって生成されているかを判定することに加えて、多重ピーク評価エンジン１１４はまた、波形に関する記憶された波形データを修正するようにも機能し得る。一部の実施形態では、フローサイトメーターは、最大高さ、半分の高さにおける幅、及び面積を含む、検出された波形に関するデータを記憶している。本明細書に考察されている多重ピーク作用に起因して、実際の波形は、必ずしも、それぞれの粒子の特徴を正確に反映するわけではない。したがって、多重ピーク評価エンジン１１４は、各粒子に対して適切なデータを推定し、それを保存するように機能する。

例えば、図１４に示される波形１５６は、単一の粒子によって生成されたものだと判定されているため、粒子の実際の特徴は、検出された複数のピークではなく、ほぼガウス波形を有する波形に相当する。それに応じて、多重ピーク評価エンジンは、例えば、ピーク１８８及び１９０の位置及び大きさに基づいて、適切な波形を推定することができる。別の可能性のある実施形態では、他のチャネルからのデータを使用して、適切な波形を推定することができる。しかしながら、いずれの場合でも、完全な波形の計算はプロセッサに集約されるため、一部の実施形態では、多重ピーク評価エンジン１１４は、完全な波形を生成するのではなく、調整された最大高さ及び調整された面積など、不足したデータのみを計算する。一例として、調整された最大高さは、ピーク１８８及び１９０の平均高さの倍数として計算することができ、調整された面積は、ピーク１８８及び１９０を含むパルス幅に等しい幅と、計算された高さとを有する長方形として推定される。一部の実施形態では、計算された高さは、谷１９２の深さの関数であり、谷が深ければ計算される高さがより大きくなり、波形の大部分が検出されていなかったこと表す。調整された幅は、ピーク１８８の立ち上がりエッジとピーク１９０の立ち下がりエッジとの間の測定距離である。

多重ピーク評価エンジンによる評価に加えて、又はその代替として、一部の実施形態は、多重ピーク問題に他の方式で対処する。一例は、電子フィルタ、光学フィルタ、及び／又は光学マスクを用いることである。

上記の様々な実施形態は、実例としてのみ提供され、本明細書に添付の特許請求の範囲を制限すると解釈されるべきではない。当業者は、本明細書に説明及び記載された例示の実施形態及び適用例に従わずに、かつ次の特許請求の範囲の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる様々な修正及び変更を容易に認識するだろう。

Claims (23)

1. フローサイトメーターを使用して粒子を特徴付ける方法であって、
   流体流中の１つ以上の粒子を、前記フローサイトメーターの光線に通すことと、
   前記流体流中の１つ以上の粒子が前記光線を通ったときに放射される光を検出し、前記検出した放射光に基づいて波形を生成することと、
   前記波形が多重ピーク波形であることを判定することと、
   前記多重ピーク波形を評価して単一の粒子と複数の粒子とを区別することによって、前記１つ以上の粒子を特徴付けることと、を含む、方法。
2. 前記波形が多重ピーク波形であることを判定することは、前記波形の大きさを、１つ以上の閾値と比較して、所定の期間内の前記波形の少なくとも２つのピークを特定することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記波形は、少なくとも２回閾値を上回る、請求項２に記載の方法。
4. 前記第１のピークは、第１の閾値を上回り、前記第２のピークは、第２の閾値を上回る、請求項２に記載の方法。
5. 前記波形が多重ピーク波形であることを判定することは、前記少なくとも２つのピーク間の谷を特定することを更に含む、請求項２に記載の方法。
6. 前記所定の期間は、最大許容可能パルス幅であり、前記最大許容可能パルス幅は、前記流体流を生成するノズルのサイズの関数及び前記光線の幅の関数として計算される、請求項２に記載の方法。
7. 前記光線の前記幅の判定を、
   前記流体流中の既知のサイズのビーズを、前記光線及び第２の光線に通すことと、
   前記ビーズが前記光線を通るときに放射される光を検出することと、
   前記ビーズが前記光線を通るときに検出された前記放射光に基づいて、前記ビーズが前記光線を通る第１の時間の長さを計算することと、
   前記ビーズが前記光線から前記第２の光線まで通る時間の長さ、及び前記光線と前記第２の光線との間の既知の距離から、前記流体流の速度を計算することと、
   前記流体流の速度及び前記第１の時間の長さから前記光線の幅を計算することと、によって行うことを更に含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記所定の期間は、前記流体流が、前記光線の前記幅の２倍の距離を進む期間よりも短いか、又はそれに等しい、請求項２に記載の方法。
9. 前記放射光は、前方散乱、側方散乱、及び蛍光のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
10. 放射光を検出し、前記波形を生成することは、光電子倍増管検出器を使用して電圧波形を生成することを含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記多重ピーク波形を評価することは、前記多重ピーク波形の幅を最小許容可能パルス幅と比較し、前記多重ピーク波形の前記幅が、前記最小許容可能パルス幅よりも狭い場合に、前記１つ以上の粒子を複数の粒子として特徴付けることを含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記最小許容可能パルス幅は、０．８倍（閾値光線幅の２倍）〜０．９倍（閾値光線幅の２倍）の範囲にある、請求項１１に記載の方法。
13. 前記多重ピーク波形を評価することは、前記多重ピーク波形の谷の形状を評価することを含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記谷の形状を評価することは、前記谷の前記形状を、緩やかな曲線及び鋭利な曲線のうちの１つとして分類し、前記１つ以上の粒子を、緩やかな曲線として分類された場合には単一の粒子として特徴付け、鋭利な曲線として分類された場合には複数の粒子として特徴付けることを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記多重ピーク波形を評価することは、前記１つ以上の粒子と関連する第２の波形を評価することを含む多重チャネル分析を行うことを更に含む、請求項１に記載の方法。
16. フローサイトメーターであって、
    流体流を生成するように構成された流体ノズルであって、前記流体流がその中に粒子を含む、流体ノズルと、
    前記流体流及び前記粒子を照射するための光線を生成するように構成された光源と、
    前記流体流からの放射光を検出し、前記粒子と関連する波形を生成するように構成された検出器と、
    少なくとも１つの処理デバイスであって、
    多重ピーク波形を特定することと、
    前記多重ピーク波形を評価して、前記多重ピーク波形のうちの少なくとも一部を単一の粒子と関連すると特定し、前記多重ピーク波形のうちの少なくとも他の部分を複数の粒子と関連すると特定することと、
    前記評価に基づいて、前記粒子を単一の粒子又は複数の粒子のいずれかとして特徴付けることと
    を行うように構成されている、少なくとも１つの処理デバイスと、
    を備える、フローサイトメーター。
17. 前記粒子の前記特徴付けを使用して、分類を決定するようにプログラムされた分類コントローラを含む、分類システムを更に備える、請求項１６に記載のフローサイトメーター。
18. 前記検出器は、前方散乱光を検出するように位置付けられており、側方散乱光及び蛍光のうちの１つを検出するように位置付けられた第２の検出器を更に備え、前記多重ピーク波形の前記評価は、前記第２の検出器によって生成された波形を評価することを更に含む、請求項１６に記載のフローサイトメーター。
19. フローサイトメーターであって、
    光線を生成し、流体流を照射するように配置される、光源と、
    前記光源による照射後に前記流体流から放射される光を検出し、出力信号を生成する、検出器と、
    １つの処理デバイスであって、
    前記出力信号を評価して多重ピークイベントを特定することと、
    前記多重ピークイベントを単一のイベントとして特徴付けることと
    を行うように多重ピーク評価エンジンを実行する、少なくとも１つの処理デバイスと、
    を備える、フローサイトメーター。
20. 前記多重ピーク評価エンジンは、更に、
    第２の多重ピークイベントを特定し、
    前記第２の多重ピークイベントを少なくとも２つのイベントとして特徴付けるように実行される、請求項１９に記載のフローサイトメーター。
21. 前記多重ピークイベントは、谷によって分離された少なくとも２つのピークを含み、前記ピークのうちの少なくとも１つが、閾値を上回る大きさを有し、前記谷は、前記閾値に満たない大きさを有する、請求項１９に記載のフローサイトメーター。
22. 前記多重ピーク評価エンジンは、更に、前記多重ピークイベントが存在しない前記第１の粒子と関連する波形の特徴を推定するように実行される、請求項１９に記載のフローサイトメーター。
23. 前記波形の前記特徴を推定するように実行することは、更に、
    前記多重ピークイベントの複数のピークの大きさ及び前記多重ピークイベントの幅に少なくとも部分的に基づいて、前記波形の最大高さ及び面積を推定するように実行される、請求項２２に記載のフローサイトメーター。