CN106574891A - 使用流式细胞仪评价多峰事件 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了采用流式细胞仪评价多峰事件的方法，以从与多个颗粒相关的事件中区别出与单个颗粒相关的事件，从而适当地表征所述颗粒。

Description

使用流式细胞仪评价多峰事件
相关专利申请的交叉引用
本申请作为PCT国际专利申请提交于2015年7月20日，并且要求于2014年8月6日提交的美国专利申请序列号62/034,002的优先权，该专利申请的公开内容全文引入本文以供参考。
背景技术
流式细胞仪用于评价样品的内容物。通常，样品穿过流体喷嘴，所述流体喷嘴使样品内的颗粒对齐到大致单列线。随后将颗粒注入流体流中。激光束照明颗粒，这生成了辐射的光，包括前向散射光、侧向散射光、反向散射光和荧光。随后可检测和分析所述辐射的光以确定所述颗粒的一个或多个特征。
发明内容
一般而言，本公开涉及流式细胞仪。在一种可能的配置中且通过非限制性例子，流式细胞仪用于识别和评价多峰事件，诸如提供颗粒的更准确表征。本公开中描述的各个方面，包括但不限于以下方面。
一个方面是一种使用流式细胞仪来表征颗粒的方法，所述方法包括：使流体流中的一个或多个颗粒穿过流式细胞仪的光束；检测在流体流中的一个或多个颗粒穿过光束时辐射的光并且基于检测到的辐射光生成波形；确定该波形为多峰波形；以及通过评价该多峰波形来表征所述一个或多个颗粒，从而区分单个颗粒和多个颗粒。
另一方面是一种流式细胞仪，所述流式细胞仪包括：流体喷嘴，所述流体喷嘴被配置为生成流体流，其中所述流体流中包含颗粒；光源，所述光源被配置为生成光束以照明流体流和颗粒；检测器，所述检测器被配置为检测从流体流辐射的光并生成与颗粒相关的波形；以及至少一个处理设备，所述至少一个处理设备被配置为：识别多峰波形；评价所述多峰波形以将所述多峰波形中的至少一些识别为与单个颗粒相关，并将所述多峰波形中的至少其他多峰波形识别为与多个颗粒相关；以及基于评价将颗粒表征为单个颗粒或多个颗粒。
又一方面是一种流式细胞仪，所述流式细胞仪包括：光源，所述光源生成光束并且被布置用于照明流体流；检测器，所述检测器检测在由光源照明后从流体流辐射的光并生成输出信号；至少一个处理设备，所述至少一个处理设备执行多峰评价引擎，以便：评价输出信号并且识别多峰事件；以及将所述多峰事件表征为单个事件。
附图说明
图1是示出了流式细胞仪的例子的示意性框图。
图2(包括图2A至图2D)为描绘了由图1所示流式细胞仪的一个或多个检测器生成的示例性波形并且示出了多峰事件的例子的图。
图3是示出了一种操作流式细胞仪的示例性方法的流程图。
图4是示出了图3所示方法的设置操作的例子的流程图。
图5示出了图1所示的示例性流式细胞仪的一部分。
图6是在光束穿过图1所示流式细胞仪的光束时检测到的示例性波形的曲线图。
图7是示出了图3所示方法的采集操作的例子的流程图。
图8是示出了使用图1所示流式细胞仪检测一个或多个颗粒的操作的例子的流程图。
图9是示出了多峰事件的评价操作的例子的流程图。
图10是示出了使用谷分析评价多峰事件的方法的流程图。
图11是示出了多峰波形的相邻峰之间的轻微弯曲谷的例子的图。
图12是示出了多峰波形的相邻峰之间尖锐谷的例子的图。
图13是示出了使用多通道分析评价多峰事件的方法的流程图。
图14示出了由流式细胞仪诸如图1所示流式细胞仪的检测器的多个通道生成的波形。
具体实施方式
下面将结合附图详细描述各种实施例，其中在若干附图中，类似的附图标记表示类似的部件和组件。对各种实施例的提及并不是对本文所附权利要求书的范围进行限制。另外，本说明书中列举的任何例子并非意图加以限制，仅仅是针对所附权利要求书陈述多个可能的实施例中的一些。
图1是示出了流式细胞仪100的例子的示意性框图。在该例子中，流式细胞仪包括样品源102、流体源104、流体喷嘴106、光源108、检测器110(诸如包括检测器110A、110B和110C)、颗粒分析仪112(包括多峰评价引擎114)、分选系统116(包括分选控制器118以及分选板120和122)以及容器124(诸如包括容器124A、124B和124C)。流体喷嘴106生成其中包含颗粒128的流体流126，并且光源108生成光束130。当光束130与流体流126和其中包含的颗粒128相交时，生成辐射的光132。流式细胞仪100的其他实施例包括与图1所示例子相比更多的、更少的或不同的部件。
样品源102为提供给流式细胞仪进行分析的样品的来源。样品包括由光束130照明且由颗粒分析仪分析的单独颗粒128。多种不同类型的样品可由流式细胞仪分析。各种类型的样品的若干例子包括血液、精液、唾液、间质液、脑脊液、细胞培养物、海水和饮用水。样品可呈制备样品的形式，诸如裂解血液、悬浮液中的标记颗粒、用免疫球蛋白标记的细胞或DNA染色细胞，通常通过如本领域中通常已知的那样添加试剂和执行协议来实现。各种类型的颗粒的例子包括微珠、血液细胞、精子细胞、上皮细胞、癌细胞、病毒、细菌、酵母菌、浮游生物、微粒(例如，来自细胞的质膜)以及线粒体。样品源102可包括容纳待分析样品的一个或多个容器诸如试管。在一些实施例中，提供流体输送系统，诸如用于将样品从容器中抽出并将样品递送到流体喷嘴106。
样品通常被注入流式细胞仪内的鞘流体内，鞘流体由鞘流体源104提供。鞘流体的一个例子为盐水。流体源104的一个例子为其中储存盐水的容器，以及可操作用于将鞘流体从流体源104递送到流体喷嘴106的流体输送系统。
在一些实施例中，提供流体喷嘴106以生成流体流126并将样品的颗粒128注入流体流中。流体喷嘴106的一个例子为流动池。流体喷嘴106通常包括孔，所述孔的尺寸被选择为至少大于样品中感兴趣颗粒的尺寸，但足够小以将颗粒布置到窄流中。理想情况下，颗粒被布置成单列或近单列构型，使得单个颗粒或较少数量的颗粒(例如，1至3个)可一次穿过光束130。在一些实施例中，颗粒使用水动力、声力或磁力来聚焦。
光源108(其如本文所论述可包括一个或多个光源)生成指向流体流126的至少一个光束。光源108的例子包括激光和弧光灯。在一些实施例中，光束130穿过光学组件，诸如用于将光束聚焦到流体流126上。在一些实施例中，光束为激光束。
来自光源108的光束130与流体流126相交。光束130中包含的颗粒128干扰了光束130并且生成辐射的光132。辐射的光132的类型和模式取决于颗粒128的类型和尺寸，但辐射的光132可包括前向散射光、侧向散射光、反向散射光以及荧光(这在光线被颗粒吸收和重发射时发生，这可通过光线的波长(即，颜色)的对应变化来检测)。
提供一个或多个检测器110以检测辐射的光132。在该例子中，检测器110包括被布置用于检测前向散射光和荧光的检测器110A、被布置用于检测侧向散射光和荧光的检测器110B以及被布置用于检测反向散射光和荧光的检测器110C。检测器110的一个例子是光电倍增管。
颗粒分析仪112用于接收来自一个或多个检测器110的信号以执行各种操作来表征颗粒128。在一些实施例中，颗粒分析仪112包括一个或多个处理设备和计算机可读存储设备，所述计算机可读存储设备存储数据指令，所述数据指令在由处理设备执行时，使处理设备执行一个或多个操作，诸如本文讨论的那些操作。在一些实施例中，颗粒分析仪112包括模数转换器和固件。
在一些实施例中，颗粒分析仪112包括多峰评价引擎114，所述多峰评价引擎用于检测和评价多峰事件。本文中诸如参考图2论述了多峰事件的例子。参考图3至图14说明和描述了由多峰评价引擎114执行的操作的例子。
在一些实施例中，流式细胞仪100为分选流式细胞仪，其用于使用由颗粒分析仪112生成的颗粒的表征来将颗粒128分选到多个容器124中。分选流式细胞仪包括分选系统116，诸如包括分选控制器118以及分选板120和122。例如，分选控制器118基于颗粒的表征来向由流体流形成的液滴施加正电荷、负电荷或中性电荷。在一些实施例中，流体喷嘴电耦合至电荷生成电路，所述电荷生成电路由分选控制器118控制。当液滴穿过带电分选板时，液滴基于它们相应的电荷而朝向容器124A、124B和124C之一转向。分选流式细胞仪通常具有至少两个容器，并且也可具有超过三个容器。通常，一个容器为不需要的颗粒或被发现受到一个或多个颗粒污染的液滴所用的废物容器。
图2是描绘了当一个或多个颗粒128穿过光束130时，由一个或多个检测器110生成并且由颗粒分析仪112接收的示例性波形150、152、154和156的图。波形152、154和156也是多峰事件的例子。
第一曲线图(A)描绘了由单个颗粒生成的典型近高斯波形150。第二曲线图(B)描绘了由另一颗粒生成的示例性多峰波形152。第三曲线图(C)描绘了由两个颗粒生成的另一示例性多峰波形154。第四曲线图(D)描绘了由单个大颗粒生成的另一示例性多峰波形156。
当检测器110之一检测到光时，光导致电流流过并生成电压。所得的输出信号形成波形，诸如图2中所描绘的四个例子。波形被提供用于进行图解说明，但通常实际上并不以图形方式显示在流式细胞仪中或由流式细胞仪显示。在一些实施例中，流式细胞仪收集并记录与已生成波形有关的数据，诸如包括最大高度、半高宽度和面积。在一些实施例中，收集由多个光源在每个光源的多个通道上生成的信号的数据。在不同通道上检测到的信号的例子包括前向散射光、侧向散射光和荧光信号。曲线图描绘了y轴表示电压并且x轴表示时间的波形。
第一曲线图(A)描绘了当颗粒128穿过光束130时所预期的典型波形。当颗粒128的前沿首先与光束相交时，少量光被颗粒转向。在随时间的推移有更多颗粒128与光束130相交时，转向的光量增加，直到颗粒完全位于光束130内。当颗粒128完全位于光束130内时，波形150的峰在此时出现。随后，当颗粒128的前沿离开光束130时，转向的光开始逐渐减少，并且继续减少直到颗粒128的后沿离开光束130。
发明人已识别出有时也由流式细胞仪检测到的三个额外波形152、154和156。这些波形在第二曲线图(B)、第三曲线图(C)和第四曲线图(D)中示出。
第二曲线图(B)描绘了有时由颗粒128生成的多峰波形152。在该例子中，波形152表现出通过谷164隔开的两个峰160和162。这些峰是信号的表现出上升随后下降的部分。与第一曲线图(A)中一样，波形152在颗粒128的前沿进入光束130时开始，并且随着大部分颗粒进入光束130而迅速上升，直到峰160。然而，在这种情况下，一旦颗粒完全进入光束，在检测器处检测到的辐射的光减少，导致电压减小，从而形成谷164。当颗粒128的前沿到达光束130的边缘并且后沿被完全吞没时，电压再次上升，从而形成第二峰162。当颗粒128离开光束130时，电压随后逐渐减小。如本文更详细论述，谷164表现出平滑弯曲形状。通过实验观察和数学建模已发现，由单个颗粒生成的多峰波形152通常由颗粒宽度小于或约等于光束130的光束宽度的颗粒生成。具体地讲，宽度约等于光束宽度的颗粒表现出具有最深谷164的波形，并且因此最有可能被误表征为两个颗粒。
第三曲线图(C)描绘了另一个多峰波形154。在该例子中，多峰波形154由彼此紧邻穿过光束130的两个颗粒形成。波形154具有通过谷174隔开的第一峰170和第二峰172。在该例子中，每个颗粒生成具有近似高斯形状的波形，但由于颗粒紧邻，部分波形重叠，导致产生单个波形。
虽然多峰曲线图(B和C)描绘了仅具有两个峰的波形152和154，但也已经观察到具有额外峰诸如三个峰或四个峰的波形。
第四曲线图(D)描绘了另一个多峰波形156。在该例子中，波形156表现出通过谷192隔开的两个峰188和190。波形156是前向散射波形的一个例子。在一些实施例中，当颗粒穿过光束130时，颗粒的前沿与光束130首先相交。从前沿转向的光导致形成第一峰188。当颗粒前进到光束130中时，颗粒开始阻挡光的前向散射，导致检测的光减少，并且导致在波形156中形成谷192。颗粒的后沿随后进入光束中，并且光再次开始从该后沿转向朝向检测器，从而导致在波形156中形成第二峰190。通过实验观察和数学建模已发现，由单个颗粒生成的多峰波形156通常由颗粒宽度大于光束130的光束宽度的颗粒生成。
多峰波形(本文中有时也称为多峰事件)的存在可能导致在正确识别和表征颗粒的过程中出现一些困难。
一个困难在于第二曲线图(B)和第四曲线图(D)中示出的多峰波形152和156可被不正确地表征为两个或更多个单独颗粒。
在讨论这个困难如何发生之前，有用的是认识到流式细胞仪100通常包括可变电压阈值(有时称为触发阈值或简称为阈值)，所述可变电压阈值可被设置并且用于检测颗粒波形。电压阈值优选地被设置为大于本底噪声的电压，以避免混淆非颗粒相关噪声与颗粒波形。噪声可由各种来源而存在于系统中，这些来源包括散粒噪声、暗噪声、电噪声和其他来源。在一些实施例中，阈值为固件设置并且用于当波形电压超过阈值时触发固件的操作。
当流式细胞仪在没有利用本文所述的多峰评价引擎114的情况下操作时，正确表征颗粒可能出现困难。例如，当电压阈值被设置得相当低诸如设置为电平180(如第二曲线图(B)所示)时，颗粒分析仪将正确地识别波形152由单个颗粒生成，因为颗粒分析仪仅看到信号的一个上升沿和一个后沿通过阈值电平180。然而，如果电压阈值被设置得较高诸如设置为电平182，则颗粒分析仪将波形152不正确地识别为两个单独的颗粒，因为此时颗粒分析仪将看到与第一峰160相关的前沿和后沿，以及与第二峰162相关的第二前沿和第二后沿。不管阈值设置在哪里，第四曲线图(D)都会出现同样的困难。
正确识别多峰波形的另一个困难为，多个颗粒可被不正确地表征为单个颗粒。在第三曲线图(C)示出的例子中，当电压阈值被设置得相对高诸如设置为电平184时，颗粒分析仪112因检测到两个峰170和172的前沿和后沿而将波形154正确地识别为由两个颗粒生成。然而，如果电压阈值被设置得较低诸如设置为电平186，则颗粒分析仪112现在将波形154不正确地识别为单个颗粒，因为在该电压阈值电平186，颗粒分析仪仅看到单个前沿和后沿。
因此，尽管降低电压阈值有助于减少不正确地误表征第二曲线图(B)中所示的多峰波形152的可能性，但这样做会增加检测到的噪声和无关紧要的碎片，同时增大将第三曲线图(C)中所示的波形154不正确地误表征为单个颗粒的可能性。另外，降低电压阈值不能有助于将多峰波形156正确地表征为单个颗粒。
因此，如图1所示，流式细胞仪100的一些实施例因此包括多峰评价引擎114，所述多峰评价引擎用于识别多峰事件并正确地表征生成多峰事件的一个或多个颗粒。
图3是示出了一种操作流式细胞仪的示例性方法194的流程图。在此例子中，方法194包括设置操作196和采集操作198。
执行设置操作196以测试流式细胞仪100的当前配置并且执行初始计算。例如，设置操作196可用于确定两个或更多个光束130之间的间距，并且确定流体流126的流速(图1)。参考图4至图6进一步详细地示出并描述了设置操作196的例子。
在完成设置操作196后，执行采集操作198以使用在设置操作196期间收集到的信息来处理样品。参考图7至图12进一步详细地示出并描述了采集操作198的例子。
图4是示出了图3所示设置操作196的例子的流程图。在此例子中，设置操作196包括操作202、204、206、208、210和212。
执行操作202以将微珠注入流体流126中。在一些实施例中，微珠为具有已知尺寸的已知颗粒，诸如质量控制微珠。质量控制微珠的一个例子为超彩虹荧光颗粒(UltraRainbow Fluorescent Particles)，直径为3.0μm至3.4μm，零件号URFP-30-2，可得自美国伊利诺伊州森林湖城的Spherotech公司(Spherotech,Inc.of Lake Forest,IL)。
执行操作204以使用微珠确定流体流速。参考图5进一步详细地示出并描述了操作204的例子。
还执行操作206以测量在微珠穿过光束130(图1)时生成的波形的脉冲宽度。参考图6进一步详细地示出并描述了操作206的例子。
在操作206后执行操作208，以计算光束130的宽度。参考图6进一步详细地描述了操作208的例子。
随后执行操作210以基于操作208中计算出的微珠宽度和操作204中计算出的流体流速来确定阈值处的最小容许脉冲宽度。参考图6进一步详细地描述了操作210的例子。
执行操作212以确定阈值处的最大容许脉冲宽度。在一些实施例中，至少部分地基于最大容许粒度来计算最大容许脉冲宽度。在一些实施例中，最大容许粒度是例如流体喷嘴106(图1)的尺寸的因数。一般来讲，颗粒的可能出现的最大脉冲宽度是可穿过流体喷嘴106的最大颗粒的脉冲宽度，这会生成等于光束宽度和该颗粒直径的之和的脉冲宽度。因此，在一些实施例中，阈值处的最大容许脉冲宽度为：
最大容许脉冲宽度＝A*(最大粒度+光束宽度)
并且最大粒度为：
最大粒度＝B*喷嘴尺寸
其中A和B为常数。A可用于例如从基线转换为阈值。例如，常数A在约0.5至1的范围内，诸如在0.8至0.9的范围内。然而，在一些实施例中，A也可大于1，以确保不会丢失多颗粒事件。常数B涉及其中乃是因为非常接近喷嘴尺寸的颗粒可能仍然堵塞喷嘴这一事实。因此，最大粒度通常小于喷嘴尺寸，诸如在约40％至约60％的范围内。在一些实施例中，常数B小于50％。
流式细胞仪100通常具有尺寸范围为约50微米至约200微米的流体喷嘴。因此，在很多实施例中，范围为约20微米至约120微米的最大粒度将是适用的。
图4所示的操作204和206可按与所示例子不同的顺序执行。
在一些实施例中，利用质量控制微珠执行一次光束点宽度确定。随后在每次采集前，使用预先确定的光束点宽度和电流触发阈值来重新计算最小容许脉冲宽度，所述电流触发阈值可从一个采集轮次到下一个采集轮次变化。
图5示出了示例性流式细胞仪100的一部分，所述示例性流式细胞仪包括来自流体喷嘴106的流体流126、来自光源108A的光束130A、来自光源108B的光束130B和检测器110。图5还示出了图4所示操作202和204的例子。
在操作202(图4)中，微珠220被注入流体流126中并且连同流体流一起流过两个或更多个光束130A和130B。当微珠220经过光束130A时，检测器110检测辐射的光并且生成所得波形，诸如图2的第一曲线图(A)中示出的波形150，所述波形包含具有单个峰的脉冲。例如，脉冲在波形150的前沿经过且超过电压阈值时开始，并且在波形150的后沿经过且低于电压阈值时结束。例如，脉冲在时间t0时开始。
微珠220随后继续随流体流126一起前进并且经过光束130B，此时检测器110(其可为同一检测器或不同检测器，诸如检测器110A至110C中的任一者)检测辐射的光并生成另一波形(例如，如图2的曲线图(A)中所示的波形150)。在该例子中，脉冲在时间t1时开始。
随后执行操作204以基于这些测量值以及基于光源108A和108B之间的已知间距(距离D1)来计算流体速度。更具体地讲，流体流速(V流)可被计算为：
V流＝D1/(t1–t0)
图6是在图5所示的微珠220穿过光束130A时检测到的示例性波形230的曲线图。图6还示出了图4所示操作206的例子。
由于微珠220的尺寸和组成，由检测器110(图5)检测到的波形230具有近似高斯形状。
为了测量波形230中的脉冲的脉冲宽度，操作206首先确定波形230超过当前选定电压阈值(Vth)的时间t0。操作206随后确定波形230回到低于电压阈值的时间t1。阈值处的总脉冲宽度(t总)被计算为：
t总＝t1–t0。
这个总脉冲宽度表示两个因数的组合：(1)光束130A的光束宽度，以及(2)微珠220的直径，如下所示：
t总＝tbw+tpw
其中tbw为阈值处的光束宽度，并且tpw为阈值处的颗粒宽度。
由于微珠具有已知直径，并且由于流体流126的流速已知(例如，操作204)，因此在阈值处仅由光束宽度(诸如，使用无限小的微珠/颗粒)产生的脉冲宽度可通过以下公式来计算：
tbw＝t总–(阈值处的有效微珠直径/V流)。
阈值处的光束宽度(tbw)以流体流126中的无限小的颗粒穿过光束所需的时间来表示。阈值处的光束宽度自身(以距离为单位)也可基于已知流体速度计算为：
阈值处的有效光束宽度＝V流×tbw。
在一些实施例中，希望将阈值测量值转换为估计的基线测量值。一种将值从阈值转换为基线的方法是将波形视为近似于高斯函数。通过实验测量，已发现，事件分布从最大高度下降至最大高度的1％时近似于高斯函数，其中平均误差为-1.9％并且标准差为3.6％。在低于最大高斯高度的1％时，已发现，高斯函数的逐渐减小比实际信号的逐渐减小慢得多。因此，在以下计算中，最大脉冲宽度被视为在最大高斯高度的1％处出现。
高斯函数如下所示：
f(x)＝height_max*exp(-x^2/(2*C^2))
其中C表示标准差。
一旦经验确定该事件波形为近似高斯，则可利用已知高度处的一个脉冲宽度测量值来对C求解。这样，对于半高度处的f(x)：
height_max/2＝height_max*exp(-x^2/(2*C^2))
对C求解：
2*ln(height_max/(2*height_max))＝-(x^2/C^2)
C＝x/sqrt(ln(2)*2)
由于x＝脉冲宽度的一半，因此在半高的脉冲宽度处对C求解：
C＝PW_hh/(2*sqrt(ln(2)*2))
C＝PW_hh/2.35482
类似地，在1％高度的脉冲宽度处对C求解：
C＝PW_hh/6.06971
因此，由所测得的在半高度触发阈值处的脉冲宽度得到全脉冲宽度：
PW_full＝(PW_hh/2.35482)*6.06971
由上文可知，半高度触发阈值处的有效微珠直径为：
有效微珠直径＝微珠直径*2.35482/6.06971
在一些实施例中，一旦已计算出阈值处的光束宽度(tbw)，则执行操作210以确定将由多峰评价引擎114使用的最小容许脉冲宽度，如本文中进一步详细地论述。在一些实施例中，最小容许脉冲宽度是基于以下认识，即图2的第二曲线图(B)中示出的多峰波形152在粒度约等于光束宽度时最突出，但也可在粒度略低于光束宽度时存在。在一些实施例中，最小容许脉冲宽度被计算为：
最小容许脉冲宽度＝D×(2×tbw)。
其中D的范围为0.5至1，并且在一些实施例中，范围为0.8至0.9。
换句话讲，对于多峰事件来说，在颗粒直径等于光束宽度的情况下，出现应当根据单个颗粒预计的多个峰的最大组合脉冲宽度，在所述情况下，阈值处的脉冲宽度为“2×tbw”。因此，小于最小容许脉冲宽度的任何单个脉冲宽度有可能来自紧邻的两个或更多个小颗粒(曲线图(C)，图2)。大于最小容许脉冲宽度但小于最大容许脉冲宽度的任何单个脉冲宽度，有可能为紧邻的多个颗粒(曲线图(C)，图2)或具有多峰波形的单个颗粒(曲线图(B)，图2)，在这种情况下，可如本文所述执行进一步评价。
重新简要参考图3，一旦完成设置操作196，流式细胞仪100就已准备好开始采集操作198。参考图7至图14示出并描述了采集操作198的例子。
图7是示出了图3所示采集操作198的例子的流程图。在该例子中，采集操作198包括操作240、242和244。
执行操作240以检测一个或多个事件。参考图8进一步详细地示出并描述了操作240的例子。
执行操作242以评价多峰事件。参考图9进一步详细地示出并描述了操作242的例子。
执行操作244以表征一个或多个颗粒。参考图9-图12进一步详细地示出并描述了操作244的例子。
图8是示出了图7所示用于检测一个或多个事件的操作240的例子的流程图。在该例子中，操作240包括操作252、254、256和258。
执行操作252以检测所检测波形中的脉冲。例如，执行操作252以确定波形是否超过最小电压阈值(Vth)。如本文所论述的，可使用最小电压阈值以忽略例如可能存在的噪声。如果波形超过最小电压阈值，则操作240前进到操作254。否则，如果波形未超过最小电压阈值，则没有检测到任何颗粒(256)并且操作240继续监视下一个脉冲(操作252)。虽然所示操作256是与操作252分开的操作，但在一些实施例中，操作256是操作252的一种状态，该状态期间检测不到脉冲。
执行操作254以确定所检测脉冲的脉冲宽度是否超过最小脉冲宽度阈值。最小脉冲宽度类似地起到忽略非颗粒噪声的作用，诸如脉冲宽度非常短(如，比例如光束宽度(tbw)小得多的脉冲宽度)的电压尖峰。如果脉冲宽度超过最小脉冲宽度阈值，则执行操作258以确定已检测到至少一个颗粒。否则，执行操作256以确定尚未检测到颗粒。
图9是示出了评价多峰事件的波形的示例性方法260的流程图。图9也是图7所示操作242的一个例子。在该例子中，方法260包括操作270、272、274、275、276、277、278和280。
执行操作270以确定在波形中的最大容许脉冲宽度内是否存在多个峰。可将波形的上升和下降检测为峰，诸如电压增加而后电压减小。在一些实施例中，上升和下降必须大于预定量值以便与例如噪声区分开。在一些实施例中，将峰识别为波形中包含局部最大值的那一部分。在一些实施例中，波形中的峰和谷可被识别为波形上导数为零处的点。
在一些实施例中，操作270确定了第二检测峰的下降沿是否在从第一峰开始的时间(例如，从第一峰的前沿超过电压阈值的时间)经过了最大容许脉冲宽度之前就穿过电压阈值(Vth)。若所述下降沿没有在此前就穿过电压阈值，则执行操作272以确定在波形中不存在多峰事件，并将颗粒表征为单个颗粒。如果存在多个峰，那么方法260会在操作274中确定在波形中存在多峰事件，并且由多峰评价引擎114(图1)进行进一步评价是适当的。
随后执行操作275以确定第二峰在最小容许脉冲宽度之前是否终止。如果第二峰在最小容许脉冲宽度之前终止，则确定多峰波形由多个密集间隔开的小尺寸颗粒生成，诸如图2的曲线图(C)所示，并且在操作276中表征为多个颗粒。如果第二峰在最小容许脉冲宽度之前未终止，那么方法260继续进行操作277以进一步评价。
执行操作277以确定多个峰是否重叠。例如，在一些实施例中，操作277确定波形在多个峰之间是否低于阈值。如果未低于阈值，则操作277确定这些峰确实重叠，并且执行操作278。如果低于阈值，则操作277确定这些峰不重叠，并且执行操作280。
当两个峰重叠时，操作278对波形执行谷分析。谷分析用于通过评价波形中两个相邻波峰之间的谷形状来从多个颗粒中区分出单个颗粒。参考图10至图12更详细地示出并描述了谷分析的例子。
如果操作277确定了多个峰不重叠，那么可以确定，多峰波形要么为单个大颗粒，诸如图2的曲线图(D)所示，要么为两个单独颗粒，其中两者均具有波形，诸如图2的曲线图(A)。为了确定所存在的是哪种情况，操作280执行多通道分析。多通道分析涉及使用来自至少一个其他通道(例如，检测器110A至110C中的另一个)的波形，来确定该波形是与单个颗粒相关还是与多个颗粒相关。参考图13至图14更详细地示出并描述了多通道分析的例子。
图10是示出了使用谷分析来评价多峰事件的方法290的流程图。在该例子中，方法290包括操作292、294和296。在一些实施例中，方法290是图9所示用于执行谷分析的操作278的一个例子。
执行操作292以确定在波形中是否存在多峰事件。在图9中示出了操作292的一个例子，该操作包括操作270、275和277。如果检测到或已检测到多峰事件，那么方法290继续进行操作294。
执行操作294以评价谷处的波形形状。例如，在一些实施例中，操作294评价两个相邻峰之间谷的锐度是尖的还是弯曲的。轻微弯曲的谷由单个颗粒生成，诸如图2的曲线图(B)中示出的波形，其显示出了弯曲的谷164。尖的谷由两个单独颗粒生成，诸如图2的曲线图(C)中示出的波形，其显示出了尖的谷174。图11和图12中示出了另外的例子。
执行操作296以基于操作294的结果来表征一个或多个颗粒。如果已经确定谷轻微弯曲，那么操作296确定波形已由单个颗粒生成。如果已经确定谷是尖的，那么操作296确定波形已由多个颗粒生成。在一些实施例中，谷是轻微弯曲的还是尖的这一确定基于与阈值进行的比较。例如，可将谷区域中波形的一阶导数值(绝对值)与阈值比较，以确定谷是轻微弯曲的还是尖的。如果该值超过阈值，则波形是尖的，如果该值不超过阈值，则波形是轻微弯曲的。
在一些实施例中，在设置阶段确定阈值。在其他实施例中，阈值按事件逐一确定。例如，可通过测量初始前沿和/或后沿的导数，并将所述导数乘以常数(例如，0.9)之后与峰间导数进行比较来确定阈值。在一些实施例中，还评价或另选地评价二阶导数。
在一些实施例中，评价二阶导数以确定波形的谷内波形变化率是否超过阈值。在另一个可能的实施例中，在邻近谷中点的预定位置评价波形的宽度。例如，较窄宽度表示尖锐弯曲，而较宽宽度表示轻微弯曲。
图11是示出了多峰波形的相邻峰160与162之间的轻微弯曲谷164的例子的图。在该例子中，谷164由第一峰160的后沿302和第二峰162的前沿304形成。图11也是图2的曲线图(B)中示出的波形152的一部分的放大视图。
在该例子中，后沿302和前沿304汇合形成波形的轻微弯曲部分。在一些实施例中，将谷的位置估计为峰160与峰162之间的中点，或替代地估计为峰160的前沿与峰162的后沿之间的中点。
已发现，与图12所示的尖谷相比，由单个颗粒得到的波形中的谷164表现出轻微弯曲。
图12是示出了多峰波形的相邻峰170与172之间的尖谷174的例子的图。在该例子中，谷174由第一峰170的后沿306和第二峰172的前沿308形成。图12也是图2的曲线图(C)中示出的波形154的一部分的放大视图。
在该例子中，后沿306和前沿308汇合形成与图11所示轻微弯曲谷164相比而言更尖锐的谷174。在一些实施例中，将谷的位置估计为位于中点，如上所述。
已发现，与谷164相比，由多个颗粒得到的波形中的谷174表现出更尖锐的曲线。虽然如本文所论述，与每个颗粒相关的峰170和172近似于高斯函数，但峰170和172均参与在重叠部分中的波形，从而导致在谷174处波形加成，并在相交处形成尖锐弯曲。
图13是示出了使用多通道分析评价多峰事件的方法320的流程图。在该例子中，方法320包括操作322、324和326。在一些实施例中，方法320是图9所示用于执行多通道分析的操作280的一个例子。
执行操作322以确定在波形中是否存在多峰事件。在图9中示出了操作322的一个例子，该操作包括操作270、275和277。如果检测到或已检测到多峰事件，那么方法320继续进行操作324。
执行操作324以评价所评价的颗粒的第二波形。例如，已发现，即使流式细胞仪检测器的一个通道(诸如前向散射信号中)检测到多峰波形由单个颗粒生成，其他信号不一定会表现出相同的多峰波形，而是可以表现出如图2的曲线图(A)所示的近似高斯波形。因此，为了辨别多峰波形是由单个颗粒生成的波形还是由两个单独颗粒生成的波形，可评价第二通道的波形以确定多峰波形是由一个颗粒还是由多个颗粒生成。参考图14进一步详细示出并描述了一个例子。
执行操作326以基于操作324的结果来表征一个或多个颗粒。如果确定第二通道具有单个峰，那么操作326确定波形已由单个颗粒生成。如果确定第二通道具有多个峰，那么操作326确定波形已由多个颗粒生成。
图14示出了由流式细胞仪的检测器110(图1)的多个通道生成的波形156和330。在该例子中，波形156为前向散射信号，并且波形330为侧向散射信号和荧光信号之一。
这个例子示出了当评价单个颗粒时在多个通道上生成的波形156和330。在该例子中，波形156表现出通过谷192隔开的两个不同且间隔开的峰188和190。由于存在多个不重叠的峰，多峰评价引擎114(图1)运行起来用以评价第二通道上的波形330，从而确定多个峰是由单个颗粒还是由多个颗粒生成。在一些实施例中，所述操作确定波形330在中点处(即，峰188与190之间的中间时间)的大小。在该例子中，波形在中点具有峰332。因此，多峰波形156被确定为由单个颗粒生成。相反，如果波形330不具有任何信号或在中点处具有低于阈值的较低信号，那么多峰事件被确定为由多个颗粒生成。
在一些实施例中，除了确定波形是由单个颗粒还是多个颗粒生成之外，多峰评价引擎114也可用于修改所存储的与波形有关的波形数据。在一些实施例中，流式细胞仪存储与被检测波形有关的数据，包括最大高度、半高宽度和面积。由于本文讨论的多峰效应，实际波形并不始终准确地反映相应颗粒的特征。因此，多峰评价引擎114工作用于估计和保存关于每个颗粒的适当数据。
例如，由于图14所示的波形156已被确定为由单个颗粒生成，因此颗粒的实际特征等效于具有近似高斯波形的波形，而不是已检测到的多个峰。因此，多峰评价引擎可基于例如峰188和190的位置和大小来估计适当波形。在另一个可能的实施例中，其他通道的数据可用于估计适当波形。然而，在任一种情况下，计算完整波形是处理器密集的，这样在一些实施例中，多峰评价引擎114并不生成完整波形，而是仅计算缺少的数据，诸如调整后的最大高度和调整后的面积。例如，调整后的最大高度可按峰188和190的平均高度的倍数计算，而调整后的面积可用矩形估计，所述矩形的宽度等于脉冲宽度(包含峰188和190)、高度等于计算所得的高度。在一些实施例中，计算出的高度为谷192深度的函数，其中较深的谷使得计算出的高度更大，这表示波形中尚未检测到的更大部分。调整后的宽度为峰188的前沿与峰190的后沿之间的测量距离。
除了由多峰评价引擎进行的评价之外或作为对其替代形式，一些实施例以其他方式解决了多峰问题。一个例子是使用电子滤波器、光学滤波器和/或光学掩模。
上述各种实施例仅以举例说明的方式提供，不应被视为对本文所附权利要求书的限制。本领域的技术人员将容易地理解，在不脱离以下权利要求书的真实实质和范围的情况下，可以不遵循本文所述的示例性实施例和应用作出各种修改和变化。

Claims (23)

1.一种使用流式细胞仪表征颗粒的方法，所述方法包括：
使流体流中的一个或多个颗粒穿过所述流式细胞仪的光束；
检测在流体流中的一个或多个颗粒穿过光束时辐射的光并且基于检测到的辐射光生成波形；
确定该波形为多峰波形；以及
通过评价所述多峰波形来表征所述一个或多个颗粒，从而区分单个颗粒和多个颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中确定所述波形为多峰波形包括，将所述波形的大小与一个或多个阈值进行比较，以识别所述波形中在预定时间段内的至少两个峰。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述波形至少两次超过阈值。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一峰超过第一阈值，并且所述第二峰超过第二阈值。
5.根据权利要求2所述的方法，其中确定所述波形为多峰波形还包括识别所述至少两个峰之间的谷。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述预定时间段为最大容许脉冲宽度，并且其中所述最大容许脉冲宽度作为生成所述流体流的喷嘴尺寸的函数以及所述光束宽度的函数来计算。
7.根据权利要求6所述的方法，还包括通过以下步骤来确定所述光束的所述宽度：
使所述流体流中尺寸已知的微珠穿过所述光束并且穿过第二光束；
在所述微珠穿过所述光束时检测辐射的光；
基于在所述微珠穿过所述光束时所检测的所述辐射的光，来计算所述微珠穿过所述光束的第一时间长度；
由所述微珠从所述光束流动到所述第二光束的时间长度，并由所述光束与所述第二光束之间的已知距离，来计算所述流体流的速度；以及
由所述流体流的所述速度和所述第一时间长度，来计算所述光束的宽度。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述预定时间段小于或等于所述流体流前进所述光束的两倍宽度的距离的时间段。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述辐射的光包括前向散射光、侧向散射光和荧光中的至少一者。
10.根据权利要求1所述的方法，其中检测辐射的光并生成所述波形包括，使用光电倍增检测器生成电压波形。
11.根据权利要求1所述的方法，其中评价所述多峰波形包括，将所述多峰波形的宽度与最小容许脉冲宽度进行比较，并且当所述多峰波形的所述宽度小于所述最小容许脉冲宽度时，将所述一个或多个颗粒表征为多个颗粒。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述最小容许脉冲宽度在0.8×(阈值处光束宽度的2倍)和0.9×(阈值处光束宽度的2倍)的范围内。
13.根据权利要求1所述的方法，其中评价所述多峰波形包括，评价所述多峰波形的谷的形状。
14.根据权利要求13所述的方法，其中评价所述谷的形状包括，将所述谷的所述形状分类为轻微弯曲和尖锐弯曲之一，并在分类为轻微弯曲时将所述一个或多个颗粒表征为单个颗粒，而在分类为尖锐弯曲时表征为多个颗粒。
15.根据权利要求1所述的方法，其中评价所述多峰波形还包括执行多通道分析，所述多通道分析包括评价与所述一个或多个颗粒相关的第二波形。
16.一种流式细胞仪，所述流式细胞仪包括：
流体喷嘴，所述流体喷嘴被配置为生成流体流，其中所述流体流中包含颗粒；
光源，所述光源被配置为生成光束以照明流体流和颗粒；
检测器，所述检测器被配置为检测从流体流辐射的光并生成与颗粒相关的波形；以及
至少一个处理设备，所述处理设备被配置为：
识别多峰波形；
评价所述多峰波形以将所述多峰波形中的至少一些识别为与单个颗粒相关，并将所述多峰波形中的至少其他一些多峰波形识别为与多个颗粒相关；以及
并且基于所述评价将所述颗粒表征为单个颗粒或多个颗粒。
17.根据权利要求16所述的流式细胞仪，还包括分选系统，所述分选系统包括分选控制器，所述分选控制器被编程为使用所述颗粒的特征来作出分选决策。
18.根据权利要求16所述的流式细胞仪，其中所述检测器被定位成检测前向散射光，并且还包括第二检测器，所述第二检测器被定位成检测侧向散射光和荧光之一，并且其中所述评价所述多峰波形还包括评价由所述第二检测器生成的波形。
19.一种流式细胞仪，所述流式细胞仪包括：
光源，所述光源生成光束并且被布置用于照明流体流；
检测器，所述检测器检测在由光源照明后从流体流辐射的光并生成输出信号；
至少一个处理设备，所述处理设备执行多峰评价引擎以便：
评价所述输出信号并且识别多峰事件；以及
将所述多峰事件表征为单个事件。
20.根据权利要求19所述的流式细胞仪，其中进一步执行所述多峰评价引擎以便：
识别第二多峰事件；以及
将所述第二多峰事件表征为至少两个事件。
21.根据权利要求19所述的流式细胞仪，其中所述多峰事件包括由谷分开的至少两个峰，其中所述峰中的至少一者的大小大于阈值，并且所述谷的大小小于所述阈值。
22.根据权利要求19所述的流式细胞仪，其中还执行所述多峰评价引擎以便：在不存在所述多峰事件的情况下，估计与所述第一颗粒相关的波形的特征。
23.根据权利要求22所述的流式细胞仪，其中进一步执行用于估计所述波形的所述特征的执行操作以便：
至少部分基于所述多峰事件的多个峰的大小和所述多峰事件的宽度来估计所述波形的最大高度和面积。
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