CN108956567B - 一种细胞分析芯片及其细胞荧光检测系统和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细胞分析芯片。一种细胞分析芯片,其中,包括第一反应池、第二反应池、流道和缓冲池,所述第一反应池和第二反应池通过导管与所述流道的一端连通,所述缓冲池与所述流道另一端连接,所述流道呈蛇形往复状,蛇形往复状的流道相邻两往复段之间设有若干两端分别与该相邻两往复段连通的阱结构。本发明还提供一种具有上述细胞分析芯片的荧光检测系统和检测方法。本发明能够大大提升检测效率,能满足多色荧光检测的需求,系统整体设计简便,整个系统的检测灵敏度以及工作效率都得到提升。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分析技术领域,更具体地,涉及一种细胞分析芯片及其细胞荧光检测系统和检测方法。
背景技术
随着现代生物医学技术的发展,以及人类对抗生素的滥用,传统的群体样本检测掩盖了大量重要信息,甚至会出现错误结果,需要对单个样本进行检测分析显得尤为重要,借助芯片实验室能很好完成样本检测分析。
芯片实验室-lab on a chip,又指微流控分析芯片,是把生物、化学医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上,自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力,已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。自微流控芯片问世以来,其检测研究是人们关注的热点,而微流控芯片中各种生物和化学过程都是通常在微米两级别完成,要求检测器具有灵敏度高、相应速度快、微型化等特点。
荧光检测技术是在微流控芯片上常用的荧光检测技术,由于其无需与样品接触,对检测样品进行非破坏性的定量或定性的检测,因此该技术被广泛使用,要实现高灵敏度的荧光检测系统,需要设计合适的荧光检测光路,目前报道的有正交型、非共聚焦型、共聚焦型、平行型等。常用的光学元件包括光源、透镜、滤光片、分色镜、光纤、物镜、光电转换元件等。
由于激光具有能量高、方向性好、易聚焦等特点,特别适合作为微流控芯片中检测器激发光源,以提高检测的灵敏度。然而现有技术中的荧光检测系统往往只满足于单色荧光对样品检测,对多色荧光标记的样本则无能为力。另外,现有的多通道光学检测装置虽然能满足多色荧光检测需求,但是其往往存在一定不足之处,导致其工作时效率低。
发明内容
本发明为克服上述现有技术所述的至少一种缺陷,提供一种细胞分析芯片及其细胞荧光检测系统和检测方法。本发明能够大大提升检测效率,能满足多色荧光检测的需求,系统整体设计简便,整个系统的检测灵敏度以及工作效率都得到提升。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种细胞分析芯片,其中,包括第一反应池、第二反应池、流道和缓冲池,所述第一反应池和第二反应池通过导管与所述流道的一端连通,所述缓冲池与所述流道另一端连接,所述流道呈蛇形往复状,蛇形往复状的流道相邻两往复段之间设有若干两端分别与该相邻两往复段连通的阱结构。
进一步的,所述阱结构靠近所述第一反应池的一端为阱结构的入口,阱结构靠近所述缓冲池的一端为阱结构的出口,所述阱结构的直径R为细胞直径的1.2-1.5倍,所述阱结构的入口开口宽度L1为细胞直径的1.2-1.4倍,所述阱结构的出口开口宽度L2为细胞直径的0.4-0.6倍。
进一步的,所述流道的直径L为细胞直径的1.5-1.8倍。
进一步的,连通所述第一反应池和流道的导管设有开关。
细胞分析芯片的作用主要包括液滴的生成及捕获两个单元,细胞分析芯片上通常应用的液滴的生成结构为两种,一种为T形交叉型通道,另一种为液流聚焦型通道,两种构形均利用连续相的剪切力将分散相剪断以生成液滴。对于T形交叉通道,液滴的生成过程的研究已经有很多,其流体动力学条件亦更加清楚。对于液流聚焦型通道,液滴的生成过程如下:由于液体的流阻在通道内各处不一,液流将优先从流阻小的线路前进,当前进受阻压力足够大时,受挤压通过通道狭窄处,当有稳定剂存在时,液滴能顺利通过而不分裂,最终稳定时大部分捕获单元将被液滴填充。本发明的细胞分析芯片采用类似的原理,第一反应池用于盛放细胞悬浮液,为分散相,第二反应池用于盛放矿物油,为连续项,利用液滴进行细胞的包裹并将液滴固定在阱结构中。
本发明还提供一种细胞荧光检测系统,其中,包括工作站、与所述工作站电连接的激发光源、CCD和三维移动平台,所述三维移动平台上设有微流控芯片,所述微流控芯片为上述的细胞分析芯片,所述微流控芯片上方由下往上依次设有物镜、半反半透镜和第一整光装置,所述CCD设在所述第一整光装置上方,所述激发光源的位置满足激发光源发出的光经所述半反半透镜反射后,再经所述物镜聚焦在所述微流控芯片上,所述激发光源和半反半透镜之间设有第二整光装置。
进一步的,所述第一整光装置包括截止滤镜和聚焦透镜,所述聚焦透镜设在所述截止滤镜上方;所述第二整光装置包括扩束镜和激发滤镜,所述扩束镜设在靠近所述激发光源的一侧,所述激发滤镜设在靠近所述半反半透镜的一侧。
进一步的,所述激发光源为多波段的激发光源,所述截止滤镜和激发滤镜上设有数量和种类均与所述激发光源各波段的波长相对应的截止滤片和激发滤片,所述截止滤片和激发滤片的切换由所述工作站控制。
本发明中,整个检测系统按照类似显微镜结构系统化和集成化,光路各部分零件结构稳定,无需繁杂的结构设计,整体空间尺寸更小。
本发明还提供一种细胞荧光检测方法,其中,包括如下步骤:
S1.关闭连接第一反应池和流道的导管,向第二反应池中持续注入矿物油,待流道内部充满矿物油后,停止向第二反应池中注入矿物油,静置一定时间至流道与缓冲池连接的一端无液滴产生;
S2.将带有不同荧光染料标记的不同抗体与细胞悬浮液混合均匀,然后向第一反应池中注入细胞悬浮液,待第一反应池中充满细胞悬浮液后停止注入,然后缓缓打开连接第一反应池和流道的导管,静置一定时间以调整压力差;
S3.分别继续向第一反应池和第二反应池中注入细胞悬浮液和矿物油,控制第一反应池和第二反应池的流速,由于流道的宽度仅能容下一个细胞流过,因此细胞将一个接着一个流动并被阱结构所捕获,待所有阱结构中均捕获有细胞后,停止向第一反应池和第二反应池中注入细胞悬浮液和矿物油;
S4.将步骤S3得到的微流控芯片固定在三维移动平台上,工作站控制激发光源发出某一波长的激发光,同时控制与该激发光波长对应的截止滤片和激发滤片进入光路,激发光源发出的激发光经过扩束镜扩束后,再经过激发滤片滤去杂散光,最后通过半反半透镜将激发光反射经过物镜的作用聚焦在微流控芯片的某一区域上,该区域上的细胞所带的与激发光波长对应的荧光染料受激发发出荧光信号;
S5.物镜收集受激发的荧光信号,通过半反半透镜后将荧光信号透射出,通过截止滤片滤去其他杂散光,再经过聚焦透镜聚焦后成像到CCD上,并生成光谱信号,得到检测到的细胞的位置和数量信息,同时将检测到的细胞的位置和数量信息反馈给工作站,完成该区域的细胞荧光检测;
S6.工作站控制三维移动平台移动,使得激发光聚焦在所述微流控芯片上另一个相同大小的区域上,然后重复步骤S5,完成该区域的细胞荧光检测;
S7.重复步骤S6,使得微流控芯片上所有区域均完成细胞荧光检测;
S8.工作站自动切换激发光源的下一个激发波长,同时控制相应的激发滤片和截止滤片自动切换进入光路,并控制微流控芯片回到检测起始点,进行下一种荧光信号的检测;依次类推,当与激发光源所有激发波长对应的受激发荧光信号检测完毕后,所有待检测细胞的位置和数量信息都被工作站收集,用于后续的信息分析。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
本发明的细胞分析芯片能对细胞进行分离及捕获,可以根据待检测样品的大小和尺寸更改芯片结构设计。
本发明的检测系统所用的激发光源具有多个激发波长,能满足多色荧光检测的需求,系统整体设计较简便,采用类似显微镜结构将检测系统系统化和集成化,具有自动对焦功能,整体空间尺寸较小,光路各部分零件结构稳定,整个系统的检测灵敏度以及工作效率都得到提升。
本发明的检测方法采用区域扫描检测形式,可以根据不同检测需求来调整视野范围大小,能大大减少进行单个阱结构检测所需要的时间,检测效率大大提升。
附图说明
图1是本发明细胞分析芯片的整体结构示意图。
图2是图1中A处的局部放大图。
图3是本发明荧光检测系统的工作原理示意图。
图4是本发明荧光检测系统的结构示意图。
图5是本发明实施例3中假设检测完实际的细胞分布图。
图6是本发明实施例3中采用激发波长A对细胞①进行扫描得到的实际的样本分布图。
图7是本发明实施例3中采用激发波长B对细胞②进行扫描得到的实际的样本分布图。
具体实施方式
附图仅用于示例性说明,不能理解为对本专利的限制;为了更好说明本实施例,附图某些部件会有省略、放大或缩小,并不代表实际产品的尺寸;对于本领域技术人员来说,附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。附图中描述位置关系仅用于示例性说明,不能理解为对本专利的限制。
实施例1
如图1和图2所示,一种细胞分析芯片,其中,包括第一反应池1、第二反应池2、流道3和缓冲池4,所述第一反应池1和第二反应池2通过导管与所述流道3的一端连通,所述缓冲池4与所述流道3另一端连接,所述流道3呈蛇形往复状,蛇形往复状的流道3相邻两往复段之间设有若干两端分别与该相邻两往复段连通的阱结构5。
如图1和图2所示,所述阱结构5靠近所述第一反应池1的一端为阱结构5的入口,阱结构5靠近所述缓冲池4的一端为阱结构5的出口,所述阱结构5的直径R为细胞直径的1.2-1.5倍,所述阱结构5的入口开口宽度L1为细胞直径的1.2-1.4倍,所述阱结构5的出口开口宽度L2为细胞直径的0.4-0.6倍。
如图1和图2所示,所述流道3的直径L为细胞直径的1.5-1.8倍。
本实施例中,连通所述第一反应池1和流道3的导管设有开关。
细胞分析芯片的作用主要包括液滴的生成及捕获两个单元,细胞分析芯片上通常应用的液滴的生成结构为两种,一种为T形交叉型通道,另一种为液流聚焦型通道,两种构形均利用连续相的剪切力将分散相剪断以生成液滴。对于T形交叉通道,液滴的生成过程的研究已经有很多,其流体动力学条件亦更加清楚。对于液流聚焦型通道,液滴的生成过程如下:由于液体的流阻在通道内各处不一,液流将优先从流阻小的线路前进,当前进受阻压力足够大时,受挤压通过通道狭窄处,当有稳定剂存在时,液滴能顺利通过而不分裂,最终稳定时大部分捕获单元将被液滴填充。本发明的细胞分析芯片采用类似的原理,第一反应池1用于盛放细胞悬浮液,为分散相,第二反应池2用于盛放矿物油,为连续项,利用液滴进行细胞的包裹并将液滴固定在阱结构5中。
实施例2
如图3所示,一种细胞荧光检测系统,其中,包括工作站6、与所述工作站6电连接的激发光源7、CCD8和三维移动平台9,所述三维移动平台9上设有微流控芯片10,所述微流控芯片10为实施例1所述的细胞分析芯片,所述微流控芯片10上方由下往上依次设有物镜11、半反半透镜12和第一整光装置,所述CCD8设在所述第一整光装置上方,所述激发光源7的位置满足激发光源7发出的光经所述半反半透镜12反射后,再经所述物镜11聚焦在所述微流控芯片10上,所述激发光源7和半反半透镜12之间设有第二整光装置。
如图3所示,所述第一整光装置包括截止滤镜13和聚焦透镜14,所述聚焦透镜14设在所述截止滤镜13上方;所述第二整光装置包括扩束镜15和激发滤镜16,所述扩束镜15设在靠近所述激发光源7的一侧,所述激发滤镜16设在靠近所述半反半透镜12的一侧。
如图3所示,所述激发光源7为多波段的激发光源7,所述截止滤镜13和激发滤镜16上设有数量和种类均与所述激发光源7各波段的波长相对应的截止滤片和激发滤片,所述截止滤片和激发滤片的切换由所述工作站6控制。
本实施例中,整个检测系统按照类似显微镜结构系统化和集成化,如图4所示,光路各部分零件结构稳定,无需繁杂的结构设计,整体空间尺寸更小。
实施例3
一种细胞荧光检测方法,其中,包括如下步骤:
S1.关闭连接第一反应池1和流道3的导管,向第二反应池2中持续注入矿物油,待流道3内部充满矿物油后,停止向第二反应池2中注入矿物油,静置一定时间至流道3与缓冲池4连接的一端无液滴产生;
S2.将带有不同荧光染料标记的不同抗体与细胞悬浮液混合均匀,然后向第一反应池1中注入细胞悬浮液,待第一反应池1中充满细胞悬浮液后停止注入,然后缓缓打开连接第一反应池1和流道3的导管,静置一定时间以调整压力差;
S3.分别继续向第一反应池1和第二反应池2中注入细胞悬浮液和矿物油,控制第一反应池1和第二反应池2的流速,由于流道3的宽度仅能容下一个细胞流过,因此细胞将一个接着一个流动并被阱结构5所捕获,待所有阱结构5中均捕获有细胞后,停止向第一反应池1和第二反应池2中注入细胞悬浮液和矿物油;
S4.将步骤S3得到的微流控芯片10固定在三维移动平台9上,工作站6控制激发光源7发出某一波长的激发光,同时控制与该激发光波长对应的截止滤片和激发滤片进入光路,激发光源7发出的激发光经过扩束镜15扩束后,再经过激发滤片滤去杂散光,最后通过半反半透镜12将激发光反射经过物镜11的作用聚焦在微流控芯片10的某一区域上,该区域上的细胞所带的与激发光波长对应的荧光染料受激发发出荧光信号;
S5.物镜11收集受激发的荧光信号,通过半反半透镜12后将荧光信号透射出,通过截止滤片滤去其他杂散光,再经过聚焦透镜14聚焦后成像到CCD8上,并生成光谱信号,得到检测到的细胞的位置和数量信息,同时将检测到的细胞的位置和数量信息反馈给工作站6,完成该区域的细胞荧光检测;
S6.工作站6控制三维移动平台9移动,使得激发光聚焦在所述微流控芯片10上另一个相同大小的区域上,然后重复步骤S5,完成该区域的细胞荧光检测;
S7.重复步骤S6,使得微流控芯片10上所有区域均完成细胞荧光检测;
S8.工作站6自动切换激发光源7的下一个激发波长,同时控制相应的激发滤片和截止滤片自动切换进入光路,并控制微流控芯片10回到检测起始点,进行下一种荧光信号的检测;依次类推,当与激发光源7所有激发波长对应的受激发荧光信号检测完毕后,所有待检测细胞的位置和数量信息都被工作站6收集,用于后续的信息分析。
本实施例中,以五色荧光检测系统为例,采用区域扫描检测形式,视野范围为4*4。先进行样品捕获,假设检测完实际的细胞分布如图5所示,①②③④⑤代表五种不同的细胞。不同颜色代表它们分别受不同激发波长光源A、B、C、D、E激发后的荧光信号。第一次扫描,采用激发波长A对细胞①进行扫描,定位出一种荧光信号颜色①,且工作站6能得到实际的样本分布位置如图6所示,通过图像的标定,可以定位出有荧光信号细胞的位置。第二次扫描,采用激发波长B对细胞②进行扫描,定位出一种荧光信号颜色②,且工作站6能得到实际的样本分布位置如图7所示。以此类推,扫描五次即可区分出每种荧光信号细胞的位置,并且不同细胞的位置和数量都能被反馈出来,用于后续的分析。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为了清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种细胞分析芯片,其特征在于,包括第一反应池(1)、第二反应池(2)、流道(3)和缓冲池(4),所述第一反应池(1)和第二反应池(2)通过导管与所述流道(3)的一端连通,所述缓冲池(4)与所述流道(3)另一端连接,所述流道(3)呈蛇形往复状,蛇形往复状的流道(3)相邻两往复段之间设有若干两端分别与该相邻两往复段连通的阱结构;
所述阱结构(5)靠近所述第一反应池(1)的一端为阱结构(5)的入口,阱结构(5)靠近所述缓冲池(4)的一端为阱结构(5)的出口,所述阱结构(5)的直径R为细胞直径的1.2-1.5倍,所述阱结构(5)的入口开口宽度L1为细胞直径的1.2-1.4倍,所述阱结构(5)的出口开口宽度L2为细胞直径的0.4-0.6倍;
所述流道(3)的直径L为细胞直径的1.5-1.8倍。
2.根据权利要求1所述的一种细胞分析芯片,其特征在于,连通所述第一反应池(1)和流道(3)的导管设有开关。
3.一种细胞荧光检测系统,其特征在于,包括工作站(6)、与所述工作站(6)电连接的激发光源(7)、CCD(8)和三维移动平台(9),所述三维移动平台(9)上设有微流控芯片(10),所述微流控芯片(10)为权利要求1到2任一所述的细胞分析芯片,所述微流控芯片(10)上方由下往上依次设有物镜(11)、半反半透镜(12)和第一整光装置,所述CCD(8)设在所述第一整光装置上方,所述激发光源(7)的位置满足激发光源(7)发出的光经所述半反半透镜(12)反射后,再经所述物镜(11)聚焦在所述微流控芯片(10)上,所述激发光源(7)和半反半透镜(12)之间设有第二整光装置。
4.根据权利要求3所述的一种细胞荧光检测系统,其特征在于,所述第一整光装置包括截止滤镜(13)和聚焦透镜(14),所述聚焦透镜(14)设在所述截止滤镜(13)上方;所述第二整光装置包括扩束镜(15)和激发滤镜(16),所述扩束镜(15)设在靠近所述激发光源(7)的一侧,所述激发滤镜(16)设在靠近所述半反半透镜(12)的一侧。
5.根据权利要求4所述的一种细胞荧光检测系统,其特征在于,所述激发光源(7)为多波段的激发光源,所述截止滤镜(13)和激发滤镜(16)上设有数量和种类均与所述激发光源(7)各波段的波长相对应的截止滤片和激发滤片,所述截止滤片和激发滤片的切换由所述工作站(6)控制。
6.一种如权利要求3到5任一所述的细胞荧光检测系统的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1.关闭连接第一反应池(1)和流道(3)的导管,向第二反应池(2)中持续注入矿物油,待流道(3)内部充满矿物油后,停止向第二反应池(2)中注入矿物油,静置一定时间至流道(3)与缓冲池(4)连接的一端无液滴产生;
S2.将带有不同荧光染料标记的不同抗体与细胞悬浮液混合均匀,然后向第一反应池(1)中注入细胞悬浮液,待第一反应池(1)中充满细胞悬浮液后停止注入,然后缓缓打开连接第一反应池(1)和流道(3)的导管,静置一定时间以调整压力差;
S3.分别继续向第一反应池(1)和第二反应池(2)中注入细胞悬浮液和矿物油,控制第一反应池(1)和第二反应池(2)的流速,待所有阱结构(5)中均捕获有细胞后,停止向第一反应池(1)和第二反应池(2)中注入细胞悬浮液和矿物油;
S4.将步骤S3得到的微流控芯片(10)固定在三维移动平台(9)上,工作站(6)控制激发光源(7)发出某一波长的激发光,同时控制与该激发光波长对应的截止滤片和激发滤片进入光路,激发光源(7)发出的激发光经过扩束镜(15)扩束后,再经过激发滤片滤去杂散光,最后通过半反半透镜(12)将激发光反射经过物镜(11)的作用聚焦在微流控芯片(10)的某一区域上,该区域上的细胞所带的与激发光波长对应的荧光染料受激发发出荧光信号;
S5.物镜(11)收集受激发的荧光信号,通过半反半透镜(12)后将荧光信号透射出,通过截止滤片滤去其他杂散光,再经过聚焦透镜(14)聚焦后成像到CCD上,并生成光谱信号,得到检测到的细胞的位置和数量信息,同时将检测到的细胞的位置和数量信息反馈给工作站(6),完成该区域的细胞荧光检测;
S6.工作站(6)控制三维移动平台(9)移动,使得激发光聚焦在所述微流控芯片(10)上另一个相同大小的区域上,然后重复步骤S5,完成该区域的细胞荧光检测;
S7.重复步骤S6,使得微流控芯片(10)上所有区域均完成细胞荧光检测;
S8.工作站(6)自动切换激发光源(7)的下一个激发波长,同时控制相应的激发滤片和截止滤片自动切换进入光路,并控制微流控芯片(10)回到检测起始点,进行下一种荧光信号的检测;依次类推,当与激发光源(7)所有激发波长对应的受激发荧光信号检测完毕后,所有待检测细胞的位置和数量信息都被工作站(6)收集,用于后续的信息分析。
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