WO2021090574A1 - 位置調整方法、微小粒子分析装置、及びプログラム - Google Patents

位置調整方法、微小粒子分析装置、及びプログラム Download PDF

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axis direction
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甲斐　慎一
淳志 梶原
晃二 喜田
直久 坂本
高橋　和也
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ソニー株式会社
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Definitions

  • the present technology relates to a position adjustment method, a fine particle analyzer, and a program, and more specifically, a position adjustment method of a flow path through which fine particles flow, a fine particle analyzer that executes the position adjustment method, and the position adjustment method.
  • a program for causing a fine particle analyzer to execute is provided.
  • a laminar flow composed of a sample liquid containing cells and a sheath liquid is discharged from an orifice formed in a flow cell or a microchip.
  • a predetermined vibration is applied to the laminar flow to form droplets.
  • the moving direction of the formed droplets is electrically controlled depending on whether or not the target particles are contained, and the target particles are separated.
  • a technique for separating target particles in a microchip without forming droplets has also been developed.
  • Patent Document 1 "a sample liquid introduction flow path through which a sample liquid containing fine particles flows, and a sheath liquid that joins the sample liquid introduction flow path from both sides and introduces a sheath liquid around the sample liquid.
  • a negative pressure suction part that communicates with the merging flow path and sucks and draws in the fine particles to be collected, and at least one pair of disposal flow paths that are provided on both sides of the negative pressure suction part and communicate with the merging flow path.
  • Patent Document 2 can be mentioned as an example of a document relating to such adjustment.
  • the apparatus described in the same document uses the detection intensity of light generated by irradiating fine particles passing through the flow path with a laser to adjust the position of the flow path.
  • the fine particles used for such position adjustment are not subject to sorting.
  • the fine particles are rare or expensive cells, it is desirable that the number of cells not to be sorted is as small as possible. Therefore, the purpose of this technique is to reduce the number of fine particles used in adjusting the positional relationship between the flow path position and the light irradiation position.
  • This technology An imaging process in which the flow path is imaged at a plurality of positions in the optical axis direction while moving the flow path through which fine particles can pass in the optical axis direction. Based on the focus index for each of the plurality of images obtained in the imaging step, from the moving step of moving the flow path in the optical axis direction and the image of the flow path at the position after the movement in the moving step, An adjustment step of specifying a feature position of the flow path and adjusting the positional relationship between the feature position and a reference position in a direction perpendicular to the optical axis direction. Provide a position adjustment method including.
  • the focus index may be an index indicating whether or not the flow path is in focus.
  • the focus index may be a focus index obtained by using an autofocus function.
  • the autofocus function can be a function based on image differences.
  • the autofocus function can be a Brenner function.
  • the flow path may be used to irradiate the fine particles flowing through the flow path with a laser beam and analyze the fine particles based on the light generated by the irradiation.
  • the direction of the optical axis of the laser beam can be substantially the same as the direction of the optical axis in the imaging step.
  • the moving step includes an image specifying step of identifying an image that gives a focus index satisfying a predetermined criterion from the acquired plurality of focus indexes.
  • the flow path can be moved to a position where the image specified in the image specifying step is captured.
  • the moving step includes an image specifying step of identifying an image that gives the maximum or minimum focus index from the acquired plurality of focus indexes.
  • the flow path can be moved to a position where the image specified in the image specifying step is captured.
  • the feature position can be specified based on the position of the wall defining the flow path.
  • the feature position may be a substantially central position in the width direction of the flow path.
  • the reference position may be a position where the laser beam passing through the optical axis, which is applied to the fine particles flowing through the flow path.
  • the positional relationship may be a positional relationship in the width direction of the flow path.
  • the flow path can be moved in the width direction of the flow path.
  • the flow path may be used to irradiate the fine particles flowing through the flow path with laser light and analyze the fine particles based on the light generated by the irradiation.
  • the irradiation position of the laser beam can be adjusted.
  • the position adjusting method may further include an additional position adjusting step of irradiating the fine particles flowing through the flow path with a laser beam and further adjusting the position of the flow path based on the light generated by the irradiation.
  • the microparticles can be bioparticles.
  • this technology An imaging optical system that images a flow path at a plurality of positions in the optical axis direction while moving a flow path through which fine particles can pass in the optical axis direction. Based on the focus index for each of the plurality of images captured by the imaging optical system, it is identified from the movement control unit that moves the flow path in the optical axis direction and the image of the flow path at the position after the movement.
  • a positional relationship adjusting unit that adjusts the positional relationship between the featured position and the reference position in a direction perpendicular to the optical axis direction.
  • a microparticle analyzer including.
  • the fine particle analyzer An irradiation optical system that irradiates the fine particles flowing through the flow path with a laser beam, and a photodetection system that detects the light generated by the irradiation of the laser beam may be further included.
  • the direction of the optical axis of the laser beam may be substantially the same as the direction of the optical axis of the imaging optical system.
  • the fine particle analyzer An irradiation optical system that irradiates the fine particles flowing through the flow path with a laser beam, and a photodetection system that detects the light generated by the irradiation of the laser beam may be further included. Either or both of the irradiation optical system and the photodetection system may share at least one of the optical components included in the imaging optical system.
  • this technology An imaging process in which the flow path is imaged at a plurality of positions in the optical axis direction while moving the flow path through which fine particles can pass in the optical axis direction. Based on the focus index for each of the plurality of images obtained in the imaging step, from the moving step of moving the flow path in the optical axis direction and the image of the flow path at the position after the movement in the moving step, Also provided is a program for causing the microparticle analyzer to perform an adjustment step of identifying the feature position of the flow path and adjusting the positional relationship between the feature position and the reference position in a direction perpendicular to the optical axis direction. To do.
  • connection flow path part It is an enlarged view of the connection flow path part. It is an enlarged view of the connection flow path part.
  • This is an example of a flow chart of the position adjustment method of the present technology. It is a graph which shows the example of the plot of the focus index with respect to the position in the optical axis direction. It is a graph which shows the example of the plot of the focus index with respect to the position in the optical axis direction. It is a figure for demonstrating an example of the method of specifying a feature position. It is a figure for demonstrating the fine adjustment process which can be included in an additional position adjustment process. It is a figure for demonstrating the fine adjustment process which can be included in an additional position adjustment process.
  • First Embodiment position adjustment method
  • Description of the First Embodiment An example of a microchip for separating fine particles including a flow path which is a target of a position adjusting method of the present technology, and the microchip for separating fine particles are used.
  • Example of fine particle sorting operation (2-1) Flowing process (2-2) Judgment step (2-3) Recovery step (2-4) Optical system configuration example (2-5) Micro particle sorting micro Chips and fine particles (3) Steps included in the position adjustment method of this technology (3-1) Imaging step (3-2) Movement step (3-3) Adjustment step (3-3-1) Feature position (3-3-1) 3-2) Reference position (3-3-3) Adjustment of positional relationship (3-3-4) Advantages of performing the moving process before the adjustment process (4) Additional position adjustment process (4-1) First Fine adjustment step (4-2) Second fine adjustment step (5) Another example of a fine particle analyzer that executes the position adjustment method of the present technology 2. Second embodiment (microparticle analyzer) 3. 3. Third embodiment (program)
  • the position adjustment method of the present technology is to move the flow path based on the focus index of each of the plurality of flow path images captured at a plurality of different positions in the optical axis direction, and to move the flow path at the position after the movement. It includes adjusting the positional relationship between the feature position specified from the image and the reference position. By the movement and the adjustment, the flow path can be moved to a preferable position. Further, in the movement and the adjustment, the fine particles do not have to flow in the flow path. Therefore, the number of fine particles used for position adjustment can be reduced.
  • the position adjusting method of the present technology is, for example, in a device (for example, a device for analyzing and / or sorting fine particles) in which light (for example, laser light) is applied to fine particles flowing in a flow path. This may be done to adjust the position of the flow path.
  • the flow path may be used, for example, to irradiate the fine particles flowing through the flow path with laser light and analyze the fine particles based on the light generated by the irradiation.
  • the direction of the optical axis of the laser beam is preferably substantially the same as the direction of the optical axis in the imaging step included in the position adjusting method of the present technology.
  • the flow path is a structure for separating fine particles (for example, a flow cytometer) used in a fine particle analyzer (for example, a flow cytometer) that forms droplets and analyzes and / or sorts fine particles.
  • a fine particle analyzer for example, a flow cytometer
  • it may be a flow path in a flow cell or a microchip), or in a microchip used in a microparticle analyzer that analyzes and / or sorts fine particles in the microchip without forming droplets.
  • It may be a flow path.
  • the device on which the position adjustment method of the present technology is executed is not limited to these. For example, it may be used in other devices that require adjustment of the positional relationship between the position of the flow path and the irradiation position of light (for example, laser light) to the flow path.
  • An example of a microchip for fine particle sorting including a flow path which is a target of the position adjustment method of the present technology, and an example of a fine particle sorting operation using the microchip for fine particle sorting.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a configuration example of a microchip for separating fine particles including a flow path that is a target of the position adjustment method of the present technology and a configuration example of a microparticle analyzer including the microchip.
  • FIG. 2 shows a configuration example of the optical system of the fine particle analyzer.
  • FIG. 3 shows an example of a flow chart of a fine particle sorting operation by the fine particle analyzer.
  • the microchip 150 for collecting fine particles shown in FIG. 1 has a sample liquid flow path 152 and a sheath liquid flow path 154 that joins the sample liquid flow path 152 at the confluence portion 162.
  • the microchip 150 for collecting fine particles is further provided with a sample liquid inlet 151 and a sheath liquid inlet 153.
  • a part of the sheath liquid flow path 154 is shown by a dotted line.
  • the portion indicated by the dotted line is located at a position lower than the sample liquid flow path 152 indicated by the solid line (position shifted in the optical axis direction described later), and the flow path indicated by the dotted line and the flow path indicated by the solid line. These channels do not communicate with each other at the intersection with. Further, in FIG.
  • the sample liquid flow path 152 is shown to bend twice between the sample liquid inlet 151 and the confluence portion 162, which is the sample liquid flow path 152 and the sheath liquid flow path 154. This is to facilitate the distinction from.
  • the sample liquid flow path 152 may be formed linearly between the sample liquid inlet 151 and the confluence portion 162 without being bent in this way.
  • the sample liquid containing fine particles is introduced into the sample liquid flow path 152 from the sample liquid inlet 151, and the sheath liquid containing no fine particles is introduced into the sheath liquid flow path 154 from the sheath liquid inlet 153. Will be done.
  • the microchip 150 for collecting fine particles has a merging flow path 155 having a merging portion 162 at one end.
  • the sample liquid and the sheath liquid merge at the merging portion 162, and flow in the merging flow path 155 toward the particle sorting portion 157.
  • the sample liquid and the sheath liquid merge at the merging portion 162 to form, for example, a laminar flow in which the sample liquid is surrounded by the sheath liquid.
  • the fine particles are arranged in a substantially row in the laminar flow.
  • the samples flow in a substantially row.
  • a laminar flow containing fine particles is formed.
  • the microchip 150 for fine particle sorting further has a particle sorting portion 157 at the other end of the merging flow path 155.
  • FIG. 4 shows an enlarged view of the particle sorting unit 157.
  • the merging flow path 155 is connected to the fine particle recovery flow path 159 via the connecting flow path 170.
  • the confluence flow path 155, the connection flow path 170, and the fine particle recovery flow path 159 may be coaxial.
  • the target particles are collected in the fine particle collection channel 159.
  • the particles to be collected flow through the connecting flow path 170 to the fine particle recovery flow path 159.
  • the fine particles that are not recovery target particles flow into the branch flow path 158 as shown in FIG. 4C. In this case, the flow entering the fine particle recovery flow path 159 is not formed.
  • the fine particle recovery flow path 159 extends linearly from the particle sorting portion 157, makes a U-turn, and reaches the same surface as the surface formed by the sample liquid inlet 151 and the sheath liquid inlet 153. It is formed to do.
  • the liquid flowing through the fine particle recovery channel 159 is discharged from the end of the recovery channel 163 to the outside of the chip.
  • the two branch flow paths 158 also extend linearly from the particle sorting portion 157, make a U-turn, and reach the same surface as the surface formed by the sample liquid inlet 151 and the sheath liquid inlet 153. It is formed to do.
  • the liquid flowing through the branch flow path 158 is discharged from the end of the branch flow path 166 to the outside of the chip.
  • the display method of the fine particle recovery flow path 159 is changed to a solid line and a dotted line at a U-turn portion. This change indicates that the position in the optical axis direction changes on the way.
  • the fine particle recovery flow path 159 and the branch flow path 158 do not communicate with each other at the portion intersecting the branch flow path 158.
  • Both the recovery flow path end 163 and the two branch flow path ends 166 are formed on the surface on which the sample liquid inlet 151 and the sheath liquid inlet 153 are formed.
  • an introduction flow path inlet 164 for introducing the liquid into the introduction flow path 161 is also formed on the surface.
  • all of the inlet into which the liquid is introduced and the outlet in which the liquid is discharged are formed on one surface. This facilitates the attachment of the chip to the fine particle analyzer 100.
  • the connection between the flow path provided in the fine particle analyzer 100 and the flow path of the microchip 150 for separating fine particles is improved. It will be easier.
  • the microchip 150 for separating fine particles has an introduction flow path 161 for introducing a liquid into the connection flow path 170.
  • introduction flow path 161 for introducing a liquid into the connection flow path 170.
  • the microchip 150 for sorting fine particles has two branch flow paths 158 connected to the merging flow path 155 at the other end of the merging flow path 155.
  • the merging flow path may be branched into the connecting flow path and the at least one branch flow path.
  • the fine particles other than the recovery target particles flow to either of the two branch flow paths 158 without invading the fine particle recovery flow path 159.
  • the microchip 150 for sorting fine particles includes a part of a fine particle analyzer 100 including a light irradiation unit 101, a detection unit 102, and a control unit 103 in addition to the microchip. Configure.
  • the microparticle analyzer 100 has an imaging optical system that images the flow path at a plurality of positions in the optical axis direction while moving the flow path through which the fine particles flow in the optical axis direction. Including further.
  • a configuration example of the imaging optical system will be described in detail below with reference to FIG. 2 in “(2-4) Configuration example of the optical system”.
  • the light irradiation unit 101 and the detection unit 102 included in the optical system of the fine particle analyzer 100 are also described.
  • control unit 103 of the fine particle analyzer 100 may include a signal processing unit 104, a determination unit 105, and a preparative control unit 106.
  • the control unit 103 further includes a movement control unit 108 and a positional relationship adjusting unit 109.
  • the microparticle sorting operation using the microparticle sorting microchip 150 described above includes a flow step S101 for flowing a liquid containing fine particles into the merging flow path 155 and a merging flow path. It includes a determination step S102 for determining whether the fine particles flowing through the 155 are recovery target particles, and a recovery step S103 for recovering the recovery target particles into the fine particle recovery flow path 159. Each step will be described below.
  • the sample liquid containing fine particles and the sheath liquid containing no fine particles are introduced into the sample liquid flow path 152 and the sheath liquid flow path 154, respectively, from the sample liquid inlet 151 and the sheath liquid inlet 153.
  • the fine particles are arranged in a substantially row in the laminar flow. That is, in the flow step S101, a laminar flow containing fine particles flowing in a substantially row can be formed.
  • the liquid containing fine particles is passed through the confluence flow path 155 as a laminar flow in particular.
  • the liquid flows in the merging flow path 155 from the merging portion 162 toward the particle sorting portion 157.
  • the determination step S102 it is determined whether the fine particles flowing through the merging flow path 155 are the particles to be recovered.
  • the determination can be made by the determination unit 105.
  • the determination unit 105 can make the determination based on the light generated by the light irradiation of the fine particles by the light irradiation unit 101. An example of the determination step S102 will be described in more detail below.
  • the light irradiation unit 101 irradiates the fine particles flowing through the confluence flow path 155 (particularly the flow path in the detection region 156) in the microchip 150 for sorting fine particles with light (for example, excitation light). Then, the detection unit 102 detects the light generated by the light irradiation. Based on the characteristics of the light detected by the detection unit 102, the determination unit 105 determines whether the fine particles are the particles to be collected. For example, the determination unit 105 may make a determination based on scattered light, a determination based on fluorescence, or a determination based on an image (for example, a dark-field image and / or a bright-field image). In the recovery step S103 described later, the control unit 103 controls the flow in the microchip 150 for sorting fine particles, so that the particles to be recovered are recovered into the fine particle recovery flow path 159.
  • the control unit 103 controls the flow in the microchip 150 for sorting fine particles, so that the particles to be recovered are recovered into the fine particle recovery
  • the light irradiation unit 101 irradiates the fine particles flowing in the flow path in the microchip 150 for sorting fine particles with light (for example, excitation light).
  • the light irradiation unit 101 may include a light source that emits light and an objective lens that collects excitation light for fine particles flowing in the detection region.
  • the light source may be appropriately selected by a person skilled in the art depending on the purpose of analysis, and may be, for example, a laser diode, an SHG laser, a solid-state laser, a gas laser, a high-intensity LED, or a halogen lamp, or two of them. The above combination may be used.
  • the light irradiation unit may include other optical elements, if necessary, in addition to the light source and the objective lens.
  • the detection unit 102 detects scattered light and / or fluorescence generated from the fine particles by light irradiation by the light irradiation unit 101.
  • the detection unit 102 may include a condenser lens and a detector that collect the fluorescence and / or scattered light generated from the fine particles.
  • the detector PMT, photodiode, CCD, CMOS and the like can be used, but the detector is not limited thereto.
  • the detection unit 102 may include other optical elements, if necessary, in addition to the condenser lens and the detector.
  • the detection unit 102 may further include, for example, a spectroscopic unit.
  • Examples of the optical component constituting the spectroscopic unit include a grating, a prism, and an optical filter.
  • the spectroscopic unit can detect, for example, light having a wavelength to be detected separately from light having another wavelength.
  • the detection unit 102 can convert the detected light into an analog electric signal by photoelectric conversion.
  • the detection unit 102 can further convert the analog electric signal into a digital electric signal by AD conversion.
  • the detection unit 102 may acquire an image generated by light irradiation by the light irradiation unit 101.
  • the image may be, for example, a darkfield image, a brightfield image, or both.
  • the light irradiation unit 101 may include, for example, a halogen lamp or a laser, and the detection unit 102 may include a CCD or CMOS.
  • the detection unit 102 may be, for example, an image pickup device in which a substrate incorporating a CMOS sensor and a substrate incorporating a DSP (Digital Signal Processor) are laminated.
  • DSP Digital Signal Processor
  • the detection unit 102 including the image pickup device can determine whether or not the fine particles are recovery target particles, for example, based on a learning model.
  • the learning model may be updated in real time while the method according to the present technology is being performed.
  • the DSP may perform machine learning processing while resetting the pixel array unit in the CMOS sensor, exposing the pixel array unit, or reading a pixel signal from each unit pixel of the pixel array unit.
  • an image pickup device that operates as an AI sensor, for example, the image pickup device described in International Publication No. 2018/051809 can be mentioned.
  • the signal processing unit 104 included in the control unit 103 processes the waveform of the digital electric signal obtained by the detection unit 102 to generate information (data) regarding the characteristics of light used for the determination by the determination unit 105. sell.
  • the signal processing unit 104 may use one, two, or three of the width of the waveform, the height of the waveform, and the area of the waveform from the waveform of the digital electric signal. Can be obtained.
  • the information regarding the characteristics of the light may include, for example, the time when the light is detected.
  • the above processing by the signal processing unit 104 can be performed particularly in the embodiment in which the scattered light and / or fluorescence is detected.
  • the determination unit 105 included in the control unit 103 determines whether or not the fine particles are recovery target particles based on the light generated by irradiating the fine particles flowing in the flow path with light.
  • the waveform of the digital electrical signal obtained by the detection unit 102 is processed by the control unit 103, and based on the information regarding the characteristics of the light generated by the processing.
  • the determination unit 105 determines whether the fine particles are recovery target particles. For example, in the determination based on the scattered light, the characteristics of the outer shape and / or the internal structure of the fine particles may be specified, and it may be determined whether the fine particles are the particles to be recovered based on the characteristics.
  • the determination unit 105 included in the control unit 103 uses the acquired image (for example, a dark field image, a bright field image, or both of them) as a fine particle as a particle to be collected. Determine if there is. For example, it can be determined whether a microparticle is a particle to be recovered based on a combination of one or more of the morphology, size, and color of the microparticles (particularly cells).
  • the determination can be made, for example, by whether the information about the characteristics of the light meets a predetermined criterion.
  • the standard can be a standard indicating that the fine particles are the particles to be recovered.
  • the criteria may be appropriately set by one of ordinary skill in the art and may be criteria relating to light characteristics, such as those used in technical fields such as flow cytometry.
  • One light may be irradiated to one position in the detection area 156, or light may be irradiated to each of a plurality of positions in the detection area 156.
  • the microchip 150 may be configured such that light is applied to each of two different positions in the detection area 156 (ie, there are two positions in the detection area 156 that are irradiated with light). In this case, for example, it can be determined whether or not the fine particles are recovery target particles based on the light (for example, fluorescence and / or scattered light) generated by irradiating the fine particles at one position with light.
  • the velocity of the fine particles in the flow path is calculated based on the difference between the detection time of the light generated by the light irradiation at the one position and the detection time of the light generated by the light irradiation at the other position. You can also do it.
  • the distance between the two irradiation positions may be determined in advance, and the velocity of the fine particles can be determined based on the difference between the two detection times and the distance.
  • the arrival time at the particle sorting unit 157 described below can be accurately predicted. By accurately predicting the arrival time, it is possible to optimize the timing of forming a flow entering the fine particle recovery flow path 159.
  • the difference between the arrival time of a certain fine particle to the particle preparative unit 157 and the arrival time of the fine particle before or after the certain fine particle to the particle preparative unit 157 is equal to or less than a predetermined threshold value. Can also determine that the certain fine particles are not recovered.
  • the distance between the certain fine particles and the fine particles before or after the fine particles is small, the possibility that the fine particles before or after the fine particles are collected together with the suction of the certain fine particles is increased. ..
  • Specific examples of a microchip in which light is irradiated to each of two different positions in the detection region 156 and a device including the microchip are described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2014-202573.
  • control unit 103 may control the light irradiation by the light irradiation unit 101 and / or the light detection by the detection unit 102. Further, the control unit 103 can control the drive of the pump for supplying the fluid into the microchip 150 for sorting fine particles.
  • the control unit 103 may be composed of, for example, a hard disk, a CPU, and a memory in which a program and an OS for causing the fine particle analyzer 100 to execute a position adjusting method according to the present technology are stored.
  • the function of the control unit 103 can be realized in a general-purpose computer.
  • the program may be recorded on a recording medium such as a microSD memory card, an SD memory card, or a flash memory.
  • the program recorded on the recording medium is read by a drive (not shown) provided in the fine particle analyzer 100, and the control unit 103 reads the program according to the read program. You may have 100 perform a positioning method according to the present technique and a subsequent fine particle sorting operation.
  • the fine particles determined to be the recovery target particles in the determination step S102 are recovered into the fine particle recovery flow path 159.
  • the recovery step S103 is performed in the particle sorting unit 157 in the microchip 150.
  • the particle sorting unit 157 the laminar flow that has flowed through the confluence flow path 155 separately flows into the two branch flow paths 158.
  • the particle sorting unit 157 shown in FIG. 1 has two branch flow paths 158, but the number of branch flow paths is not limited to two.
  • the particle sorting unit 157 may be provided with, for example, one or a plurality (for example, two, three, or four) branch flow paths.
  • the branch flow path may be configured to branch in a Y shape on one plane as shown in FIG. 1, or may be configured to branch three-dimensionally.
  • FIGS. 6A and 6B Enlarged views of the vicinity of the connection flow path 170 are shown in FIGS. 6A and 6B.
  • FIG. 6A is a schematic perspective view of the vicinity of the connecting flow path 170.
  • FIG. 6B is a schematic cross-sectional view on a plane passing through the center line of the introduction flow path 161 and the center line of the connection flow path 170.
  • the connection flow path 170 includes a flow path 170a on the detection region 156 side (hereinafter, also referred to as an upstream side connection flow path 170a) and a flow path 170b on the fine particle recovery flow path 159 side (hereinafter, also referred to as a downstream side connection flow path 170b). ) And the connection portion 170c between the connection flow path 170 and the introduction flow path 161.
  • the introduction flow path 161 is provided so as to be substantially perpendicular to the axis of the flow path of the connection flow path 170.
  • the two introduction flow paths 161 are provided so as to face each other at substantially the center position of the connection flow path 170, but only one introduction flow path may be provided.
  • the shape and dimensions of the cross section of the upstream connecting flow path 170a may be the same as the shape and dimensions of the downstream connecting flow path 170b.
  • both the cross section of the upstream connecting flow path 170a and the cross section of the downstream connecting flow path 170b may be substantially circular with the same dimensions.
  • both of these two cross sections may be rectangles (eg, squares or rectangles) having the same dimensions.
  • Liquid is supplied from the two introduction channels 161 to the connection channel 170 as shown by the arrows in FIG. 6B.
  • the liquid flows from the connection portion 170c to both the upstream side connection flow path 170a and the downstream side connection flow path 170b.
  • the liquid will flow as follows.
  • the liquid that has flowed to the upstream side connecting flow path 170a exits from the connecting surface of the connecting flow path 170 with the merging flow path 155, and then flows separately into the two branch flow paths 158.
  • the liquid and the fine particles that do not need to be collected in the fine particle recovery flow path 159 pass through the connection flow path 170 to the fine particle recovery flow path 159. You can prevent it from entering.
  • the liquid that has flowed into the downstream connection flow path 170b flows into the fine particle recovery flow path 159. As a result, the inside of the fine particle recovery flow path 159 is filled with the liquid.
  • the liquid can be supplied from the two introduction flow paths 161 to the connection flow path 170.
  • the fine particle recovery flow path 159 is passed from the confluence flow path 155 through the connection flow path 170.
  • a flow is formed. That is, a flow is formed from the merging flow path 155 through the upstream side connecting flow path 170a, the connecting portion 170c, and the downstream side connecting flow path 170b in this order to the fine particle recovery flow path 159.
  • the particles to be collected are collected in the fine particle collection flow path 159.
  • connection flow path 180 includes a flow path 180a on the detection region 156 side (hereinafter, also referred to as an upstream connection flow path 180a) and a flow path 180b on the fine particle recovery flow path 159 side (hereinafter, also referred to as upstream side connection flow path 180a). , Also referred to as downstream connection flow path 180b) and a connection portion 180c between the connection flow path 180 and the introduction flow path 161.
  • Both the cross section of the upstream side connecting flow path 180a and the cross section of the downstream side connecting flow path 180b have a substantially circular shape, but the diameter of the latter cross section is larger than the diameter of the former cross section.
  • the area of the latter cross section is made larger than the area of the former cross section.
  • the recovery target particles are recovered into the fine particle recovery flow path through the connection flow path.
  • the recovery may be performed, for example, by generating a negative pressure in the fine particle recovery flow path 159 as described above.
  • the negative pressure can be generated by, for example, an actuator 107 (particularly a piezo actuator) attached to the outside of the microchip 150 deforming the wall defining the fine particle recovery flow path 159.
  • the negative pressure can form the flow into the fine particle recovery channel 159.
  • the actuator 107 can be attached to the outside of the microchip 150 so that the wall of the fine particle recovery flow path 159 can be deformed.
  • the actuator 107 can be, for example, a piezo actuator.
  • the sample liquid constituting the laminar flow or the sample liquid and the sheath liquid constituting the laminar flow can also flow into the fine particle recovery flow path 159. .. In this way, the particles to be recovered are sorted by the particle sorting unit 157 and recovered into the fine particle recovery flow path 159.
  • connection flow path 170 is provided with an introduction flow path 161 in order to prevent fine particles that are not recovery target particles from entering the fine particle recovery flow path 159 through the connection flow path 170.
  • Liquid is introduced into the connection flow path 170 from the introduction flow path 161.
  • the liquid fills the connecting flow path 170.
  • a part of the liquid forms a flow from the connecting flow path 170 to the merging flow path 155, thereby preventing fine particles other than the recovery target particles from entering the fine particle recovery flow path 159.
  • the liquid forming the flow from the connecting flow path 170 to the merging flow path 155 is the same as the liquid without flowing in the merging flow path 155 due to the flow of the liquid flowing through the merging flow path 155 to the branch flow path 158. Flows through the branch flow path 158. The rest of the liquid introduced into the connection flow path 170 flows into the fine particle recovery flow path 159. As a result, the inside of the fine particle recovery flow path 159 can be filled with the liquid.
  • the flow flowing to the branch flow path 158 can be discharged to the outside of the microchip at the branch flow path end 160. Further, the particles to be recovered collected in the fine particle recovery flow path 159 can be discharged to the outside of the microchip at the end of the recovery flow path 163.
  • a container can be connected to the recovery flow path end 163 via a flow path such as a tube. The particles to be collected may be collected in the container.
  • the merging flow path, the connecting flow path, and the collecting flow path may be arranged in a straight line.
  • these three flow paths are arranged in a straight line (particularly on the same axis)
  • the connection flow path and the recovery flow path are arranged at an angle with respect to the confluence flow path. Therefore, the recovery process can be performed more efficiently.
  • the amount of suction required to guide the particles to be collected to the connecting flow path can be reduced.
  • the fine particles are arranged in a substantially row in the confluence flow path and flow toward the connection flow path. Therefore, the suction amount in the recovery step can be reduced.
  • a liquid is supplied from the introduction flow path to the connection flow path.
  • a flow is formed in the connection flow path from the connection position between the introduction flow path and the connection flow path toward the merging flow path, and the liquid flowing through the merging flow path is transferred to the connection flow path. It is possible to prevent fine particles other than the particles to be collected from flowing into the recovery flow path through the connection flow path.
  • the particles to be recovered are recovered into the recovery flow path through the connection flow path. ..
  • the optical system 350 shown in FIG. 2 includes a laser beam generation unit 351 that generates a laser beam that irradiates the detection region 156.
  • the laser light generation unit 351 includes, for example, laser light sources 352-1, 352-2, and 352-3, and mirror groups 353-1, 353-2, which synthesize laser light emitted from these laser light sources, and Includes 353-3.
  • the laser light sources 352-1, 352-2, and 352-3 emit laser light having different wavelengths from each other.
  • the laser light source 352-1 emits a laser beam having a wavelength of, for example, 550 nm to 800 nm (for example, a wavelength of 637 nm).
  • the mirror 353-1 has an optical property of reflecting the laser beam.
  • the laser light source 352-2 emits a laser beam having a wavelength of, for example, 450 nm to 550 nm (for example, a wavelength of 488 nm).
  • the mirror 353-2 has optical characteristics that reflect the laser beam and transmit the laser beam emitted from the laser light source 352-1.
  • the laser light source 352-3 emits a laser beam having a wavelength of, for example, 380 nm to 450 nm (for example, a wavelength of 405 nm).
  • the mirror 353-3 has an optical property of reflecting the laser beam and transmitting the laser beam of two lines emitted from the laser light sources 352-1 and 352-2.
  • the combined laser beam passes through the mirror 342, is reflected by the mirror 354, passes through the shutter 355, and enters the objective lens 356.
  • the laser beam is focused by the objective lens 356 and reaches the detection region 156 of the microchip 150.
  • the laser beam is applied to the fine particles flowing through the detection region 156 to generate fluorescence and scattered light.
  • the laser light generation unit 351, the mirrors 352 and 354, and the objective lens 356 are included as the components of the light irradiation unit 101.
  • the light irradiation unit used in the present technology may include a laser light generation unit, particularly a laser light generation unit that generates a laser beam in which a plurality of laser beams are combined.
  • the light irradiation unit used in the present technology may include an objective lens in addition to the laser light generation unit, for example.
  • the light irradiation unit that irradiates the fine particles flowing through the flow path with the laser beam is also referred to as an irradiation optical system in the present specification.
  • the optical system 350 includes a fluorescence detector 357 that detects the fluorescence.
  • the fluorescence enters the objective lens 356 and is focused by the objective lens 356.
  • the fluorescence focused by the objective lens 356 passes through the shutter 355, passes through the mirror 354, and is detected by the fluorescence detector 357.
  • the optical system 350 includes a scattered light detector 358-3 that detects backscattered light among the scattered light.
  • the backscattered light enters the objective lens 356 and is focused by the objective lens 356.
  • the backscattered light collected by the objective lens 356 passes through the shutter 355, is reflected by the mirror 354, is further reflected by the mirror 342, and is detected by the scattered photodetector 358-3.
  • the scattered light detector 358-3 detects light having the same wavelength as the laser light emitted from the laser light source 352-3 (for example, light having a wavelength of 380 nm to 450 nm).
  • the optical system 350 also includes scattered photodetectors 358-1 and 358-2 that detect forward scattered light among the scattered light.
  • the forward scattered light enters the objective lens 359 and is focused by the objective lens 359.
  • the forward scattered light collected by the objective lens 359 passes through the mirror 343 and has the same wavelength as the laser light emitted from the laser light source 352-1 by the mirror 360 (for example, a wavelength of 550 nm to 800 nm).
  • Light and light having the same wavelength as the laser light emitted from the laser light source 352-2 (for example, light having a wavelength of 450 nm to 550 nm).
  • the mirror 360 may be, for example, a half mirror, and has optical characteristics of reflecting the former light and transmitting the latter light.
  • the former light is reflected by the mirror 361 and detected by the scattered photodetector 358-1.
  • the latter light is detected by a scattered photodetector 358-2.
  • the fluorescence detector 357 that detects the fluorescence generated by the irradiation of the laser light and the scattered photodetector 358-1, 358-2 that detects the scattered light generated by the irradiation.
  • And 358-3 a group of mirrors that transmit or reflect fluorescence and / or scattered light, and objective lenses 356 and 359 are included as components of the detection unit 102.
  • the detector used in the present technology may include a fluorescence detector and / or a scattered photodetector.
  • the detector used in the present technology may include an objective lens through which fluorescence and / or scattered light passes, in addition to the fluorescence detector and / or scattered photodetector.
  • the detection unit that detects the light generated by irradiating the fine particles flowing through the flow path with the laser light is also referred to as a photodetection system.
  • the optical system 350 further includes a lighting device 370 and an image sensor 371.
  • the lighting device 370 and the image sensor 371 are included in the image pickup optical system that images the flow path in the image pickup step.
  • the imaging optical system shown in FIG. 2 is a configuration example of an epi-illumination type imaging optical system.
  • the illumination device 370 irradiates the illumination light necessary for imaging the flow path of the microchip 150 for collecting fine particles (particularly, the confluence flow path 155 in the detection region 156).
  • the illumination light emitted from the illumination device 370 is reflected by the mirror 344 and the mirror 343, passes through the objective lens 359, and reaches the microchip 150 for fine particle separation.
  • the flow path of the microchip for collecting fine particles illuminated by the illumination light is imaged by the image pickup device 371 via the objective lens 359. That is, the lighting device 370 and the image sensor 371 are configured to image the flow path via the objective lens 359. As described above, the lighting device 370, the image sensor 371, and the objective lens 359 may form a part of the image pickup optical system that images the flow path at a plurality of positions in the optical axis direction.
  • the image sensor 371 may include, for example, a CCD or CMOS.
  • the illuminating device 370 may be, for example, an illuminating device used in microscopic observation, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the imaging optical system may be configured to image the flow path through an objective lens through which forward scattered light passes.
  • the imaging optical system may be configured to image the flow path via an objective lens through which backscattered light and / or fluorescence passes.
  • the illumination light of the imaging optical system may be applied to the flow path through an objective lens through which the laser light emitted to the flow path passes. Since at least one of the optical components such as the objective lens is shared by the irradiation optical system and the imaging optical system, the structure of the optical system can be simplified.
  • sharing of optical components such as an objective lens will be further described with reference to FIG. 2 below.
  • the imaging optical system images the flow path through the objective lens 359 through which the forward scattered light detected by the forward scattered photodetectors 358-1 and 358-2 passes. .. That is, the objective lens 359 is shared by the photodetection system and the imaging optical system. As described above, in the present technology, the photodetector system shares at least one optical component (for example, an objective lens or a mirror for enlarging the flow path and causing the image sensor to take an image) included in the image pickup optical system. Good. This makes it possible to simplify the configuration of the optical system. Sharing the objective lens is particularly preferable from the viewpoint of the performance and / or robustness of the microparticle analyzer.
  • the image pickup optical system and the light detection system for detecting the light generated by irradiating the fine particles with light use different objective lenses
  • the image pickup optical system and the light detection system detect by the deviation of one lens. Although there may be a deviation from the signal to be received, such a deviation hardly occurs because the objective lens is shared.
  • the imaging optical system is a transmission type illumination system, as will be described later, the illumination light for imaging by the imaging optical system passes through the objective lens 356.
  • the objective lens 356 also passes the combined laser beam.
  • the irradiation optical system may share at least one optical component (for example, an objective lens through which the laser beam irradiated to the fine particles passes) included in the imaging optical system. This makes it possible to simplify the configuration of the optical system.
  • the imaging optical system is a transmission type illumination system, as will be described later, the illumination light for imaging by the imaging optical system passes through the objective lens 356.
  • the objective lens 356 also passes fluorescence and backscattered light as described above.
  • the objective lens 356 also passes the combined laser beam.
  • the irradiation optical system and the photodetection system share at least one optical component (for example, an objective lens through which the laser beam irradiated to the fine particles passes) included in the imaging optical system. Good. This makes it possible to simplify the configuration of the optical system.
  • the optical axis direction of the imaging optical system and the optical axis direction of the irradiation optical system and / or the optical axis direction of the photodetection system may be substantially the same. This will be further described below with reference to FIG.
  • the optical axis direction of the imaging optical system (particularly, the optical axis direction of the objective lens 359 for enlarging the flow path and causing the image pickup element 371 to image) is applied to the flow path. It is substantially the same as the optical axis direction of the laser beam. As described above, in the microparticle analyzer of the present technology, the direction of the optical axis of the laser beam irradiated to the microparticles may be substantially the same as the direction of the optical axis of the imaging optical system.
  • the optical axis direction of the imaging optical system (particularly, the optical axis direction of the objective lens 359 for enlarging the flow path and causing the image pickup element 371 to image) is directed to the flow path. It is substantially the same as the optical axis direction of the objective lens 356 through which the fluorescence and backward scattered light generated by the laser light of the above pass.
  • the optical axis direction of the objective lens through which the fluorescence and / or scattered light (particularly backward scattered light) generated by irradiating the microparticles with the laser beam passes, and the imaging optics.
  • the optical axis direction of the system (particularly, the optical axis direction of the objective lens for enlarging the flow path in the imaging optical system to cause the imaging device to image) may be substantially the same.
  • the optical axis direction of the imaging optical system (particularly, the optical axis direction of the objective lens 359 for enlarging the flow path and causing the image pickup element 371 to image) is directed to the flow path. It is substantially the same as the optical axis direction of the objective lens 359 through which the forward scattered light generated by the laser beam of No. 1 passes.
  • the optical axis direction of the objective lens through which the fluorescence and / or scattered light (particularly the forward scattered light) generated by irradiating the microparticles with the laser beam passes, and the imaging optics.
  • the optical axis direction of the system (particularly, the optical axis direction of the objective lens for enlarging the flow path in the imaging optical system to cause the imaging device to image) may be substantially the same.
  • the shutter 355 may be closed when the detection region 156 is imaged by the image sensor 371. This makes it possible to prevent light generated by the mirrors 352 and 354, the fluorescence detector 357, the scattered photodetector 358-3, the laser light generator 351 and the like from affecting the imaging.
  • the illumination device 370 and the image sensor 371 may be configured to obtain an image of the flow path by, for example, an epi-illumination system, particularly a coaxial epi-illumination system.
  • an epi-illumination system particularly a coaxial epi-illumination system.
  • another lighting method may be used, for example, a transmission lighting method or a side-illumination lighting method may be adopted, and in particular, a transmission lighting method may be adopted.
  • the transmission illumination method for example, the laser light synthesized by the laser light generation unit 351 may be used as the illumination light.
  • a diffuser plate for diffusing the laser beam may be provided on the optical path of the illumination light.
  • the diffuser may be arranged, for example, between the mirror 354 and the objective lens 356.
  • the diffuser plate may be configured to be movable so as to be arranged on the optical path only when imaging by the imaging optical system is performed.
  • a combination of an illumination light source and an optical fiber connected to the illumination light source may be used.
  • the light emitted from the optical fiber can be used as illumination light.
  • the optical fiber may be arranged, for example, so that the light emitted from the optical fiber reaches the microchip 150 for microparticle sorting through at least a part of the fluorescence optical path detected by the fluorescence detector 357. ..
  • the microchip 150 for sorting fine particles can be attached to a stage 374 capable of moving the microchip in the optical axis direction of the objective lens 359.
  • the movement of the stage 374 in the optical axis direction can be controlled by, for example, the control unit 103.
  • the stage 374 may form a part of the imaging optical system.
  • micro means that at least a part of the flow path included in the microchip for microparticle sorting has a dimension of ⁇ m order, particularly a cross-sectional dimension of ⁇ m order. .. That is, in the present technology, the “microchip” refers to a chip including a flow path on the order of ⁇ m, particularly a chip including a flow path having a cross-sectional dimension on the order of ⁇ m. For example, a chip including a particle sorting portion composed of a flow path having a cross-sectional dimension of ⁇ m order can be called a microchip according to the present technology.
  • the cross section of the merging flow path 155 is, for example, a rectangle, and the width of the merging flow path 155 is, for example, 100 ⁇ m to 500 ⁇ m in the particle sorting section 157, particularly 100 ⁇ m to 300 ⁇ m. Can be.
  • the width of the branch flow path branching from the merging flow path 155 may be smaller than the width of the merging flow path 155.
  • the cross section of the connecting flow path 170 is, for example, circular, and the diameter of the connecting flow path 170 at the connection portion between the connecting flow path 170 and the merging flow path 155 can be, for example, 10 ⁇ m to 60 ⁇ m, particularly 20 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • the microchip 150 for preparative fine particles can be manufactured by a method known in the art.
  • the bioparticle preparative microchip 150 can be manufactured by laminating two or more substrates on which a predetermined flow path is formed.
  • the flow path may be formed on all of, for example, two or more substrates (particularly two substrates), or a part of two or more substrates (particularly two substrates). It may be formed only on one sheet). It is preferable that the flow path is formed on only one substrate in order to make it easier to adjust the position when the substrates are bonded. For example, as shown by the dotted line and the solid line in FIG.
  • the two flow paths are provided so as to intersect at different positions in the optical axis direction (so as not to communicate with each other) and when viewed from the optical axis direction.
  • the flow path structure can be created by laminating three or more substrates provided with a flow path.
  • a material for forming the microchip 150 for preparative fine particles a material known in the art can be used. Examples include, but are not limited to, polycarbonate, cycloolefin polymers, polypropylene, PDMS (polydimethylsiloxane), polymethylmethacrylate (PMMA), polyethylene, polystyrene, glass, and silicon.
  • polymer materials such as polycarbonate, cycloolefin polymer, and polypropylene are particularly preferable because they are excellent in processability and can be inexpensively manufactured using a molding apparatus.
  • the microchip 150 for sorting fine particles is preferably transparent.
  • the microchip 150 for preparative fine particles at least a portion through which light (laser light and scattered light) passes is transparent, for example, a detection region may be transparent.
  • the entire microchip 150 for sorting fine particles may be transparent.
  • the flow path group is not formed on the microchip 150.
  • the flow path group may be formed in a substrate such as plastic or glass.
  • the flow path group may have a two-dimensional or three-dimensional structure.
  • the fine particles may be particles having dimensions capable of flowing in the flow path in the microchip for collecting fine particles.
  • fine particles may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the fine particles include biological fine particles such as cells, cell clumps, microorganisms, and liposomes, and synthetic fine particles such as gel particles, beads, latex particles, polymer particles, and industrial particles.
  • Biological microparticles also called biological particles
  • Cells can include animal cells (such as blood cell lineage cells) and plant cells. The cells can be blood-based cells or tissue-based cells in particular.
  • the blood line cell may be a floating line cell such as T cell and B cell.
  • the tissue-based cells may be, for example, adherent cultured cells or adherent cells separated from the tissue.
  • Cell clusters can include, for example, spheroids and organoids.
  • Microorganisms may include bacteria such as Escherichia coli, viruses such as tobacco mosaic virus, and fungi such as yeast.
  • biological microparticles can also include biological macromolecules such as nucleic acids, proteins, and complexes thereof. These biological macromolecules may be, for example, those extracted from cells or may be contained in blood samples or other liquid samples. Synthetic fine particles can be fine particles made of, for example, an organic or inorganic polymer material or a metal.
  • Organic polymer materials may include polystyrene, styrene / divinylbenzene, polymethylmethacrylate and the like.
  • Inorganic polymer materials may include glass, silica, magnetic materials and the like.
  • the metal may include colloidal gold, aluminum and the like.
  • the synthetic microparticles may be, for example, gel particles or beads, and more particularly gel particles or beads to which one or more combinations selected from oligonucleotides, peptides, proteins, and enzymes are bound. You can.
  • the shape of the fine particles may be spherical, substantially spherical, or non-spherical.
  • the size and mass of the fine particles can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the size of the flow path of the microchip.
  • the size of the flow path of the microchip can also be appropriately selected depending on the size and mass of the fine particles.
  • the microparticles may be optionally attached with chemical or biological labels such as fluorescent dyes or fluorescent proteins.
  • the label may facilitate the detection of the microparticles.
  • the sign to be attached can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Molecules that specifically react with microparticles eg, antibodies, aptamers, DNA, or RNA, etc.
  • the microparticles can be biological particles, especially cells.
  • FIG. 8 shows an example of a flow chart of the position adjustment method of the present technology.
  • the position adjusting method of the present technology includes an imaging step S201, a moving step S202, and a positional relationship adjusting step S203. Each step will be described below.
  • the flow path that is the target of the position adjustment method of the present technology may or may not be filled with the liquid (it may be empty).
  • An example of a situation in which the position adjusting method of the present technology is applied to a flow path filled with a liquid can be mentioned during the priming process of the flow path.
  • the chip is subjected to a priming process for allowing a liquid to flow through the flow path, for example, in order to prevent residual bubbles in the flow path, and then the fine particles are used.
  • a particle sorting operation is performed.
  • the position adjusting method of the present technology may be performed during the priming process of the flow path. As a result, the priming process and the position adjustment are executed at the same time, so that the time required for the adjustment process before the fine particle sorting process can be shortened.
  • a microchip 150 for sorting fine particles is attached to the stage 374.
  • the flow path portion in the detection region 156 particularly the flow path portion irradiated with the laser beam synthesized as described above, passes through the objective lens 359.
  • the microchip 150 for sorting fine particles is attached to the stage 374 so that the image can be imaged by the image sensor 371.
  • the stage 374 is configured to be movable in the optical axis direction (z-axis direction) of the objective lens 359.
  • the optical axis direction can be said to be, for example, the focus direction of imaging in the imaging process, and can also be said to be the same direction as the direction of the optical axis of the objective lens 359.
  • the direction shown as the z direction is the optical axis direction.
  • the direction of the optical axis in the imaging step is substantially the same as the direction of the optical axis of the laser beam irradiating the detection region 156 of the microchip 150 for collecting fine particles.
  • the stage 374 is configured to be movable in the width direction (x-axis direction) of the merging flow path 155 and in the axial direction (y-axis direction) of the merging flow path. By moving the stage 374, the microchip 150 for collecting fine particles attached to the stage 374 and the flow path (for example, the merging flow path 155) included in the chip are also moved.
  • the stage 374 can be returned to the origin.
  • the origin is a preset position with respect to the fine particle analyzer 100. Then, after the stage 374 is moved to the origin, it is moved to the measurement start point in the optical axis direction.
  • the confluence flow path 155 is also moved by moving the stage 374 in the optical axis direction from the measurement start point.
  • the movement ends when the stage 374 reaches the measurement end point.
  • the measurement start point and the measurement end point may be appropriately set by those skilled in the art according to the configuration of the fine particle analyzer 100.
  • the movement may be controlled by the control unit 103, which can move the stage 374 in the optical axis direction.
  • the image sensor 371 images the flow path portion at a plurality of positions in the optical axis direction during the movement of the stage 374 from the measurement start point to the measurement end point in the optical axis direction. ..
  • the stage 374 can be moved in the optical axis direction, for example, by 1 ⁇ m to 300 ⁇ m, particularly by 1.5 ⁇ m to 200 ⁇ m, and more particularly by 2 ⁇ m to 150 ⁇ m.
  • the flow path portion can be imaged at the position after each movement. That is, the interval between the positions to be imaged may be within this numerical range.
  • the obtained plurality of images can be transmitted to the control unit 103 (particularly the movement control unit 108).
  • the plurality of images are stored in, for example, a storage unit (not shown) connected to the image sensor 371, and the control unit 103 acquires the plurality of images stored in the storage unit. May be good.
  • the movement control unit 108 calculates the focus index for each of the plurality of images obtained in the imaging process. As a result, a plurality of focus indexes can be obtained.
  • the focus index may mean an index indicating whether or not the flow path through which fine particles can pass is in focus.
  • the focus index is a focus index acquired by using an autofocus function.
  • the movement control unit 108 can acquire a focus index for each of a plurality of images acquired in the imaging step by using the autofocus function.
  • the autofocus function is preferably a function based on an image difference, a function based on the depth of peaks and valleys in a gray level image, a function based on image contrast, a function based on a histogram, or a function based on a correlation scale. It may be either.
  • any one of the functions shown in the following equations (1) to (13) may be used as the autofocus function, and particularly preferably any one of the following equations (1) to (3). Either one can be used as an autofocus function. Details of these equations are described in, for example, A. Santos et al., Evaluation of autofocus functions in molecular cytogenetic analysis, Journal of Microscopy, Vol. 188, Pt3, December (1997).
  • Equation (1) Function based on the absolute value of the gradient above the threshold
  • g (i, j) is the gray level intensity of the pixel (i, j)
  • v is the gradient threshold.
  • v may be 0.
  • Equation (2) Function based on the square gradient
  • g (i, j) is the gray level intensity of the pixel (i, j)
  • v is the gradient threshold.
  • v may be 0.
  • Equation (3) Brenner function
  • g (i, j) is the gray level intensity of the pixel (i, j)
  • v is the gradient threshold.
  • v may be 0.
  • Equation (4) Function based on the absolute value of the gradient above the threshold
  • T [g (i, j)] is the square of the gradient value of the pixel (i, j)
  • G x (i, j) and G y (i, j) are Image convolution by the Sobel operator.
  • Equation (5) Function based on image content above threshold
  • ⁇ is the luminance threshold
  • Equation (8) Function based on deviation
  • Equation (9) Function based on normalization deviation
  • the autofocus function is a function based on the image difference.
  • the function based on the image difference is preferable from the viewpoint of easy acquisition of the focus index.
  • a function based on the image difference is also preferable for acquiring the maximum or minimum focus index described later.
  • the autofocus function is a Brenner function.
  • the flow path is moved in the optical axis direction (for example, the z-axis direction in FIG. 2) based on a plurality of acquired focus indexes.
  • the movement may be performed by moving the position of the stage 374 by the movement control unit 108.
  • the movement control unit 108 can identify one image based on the focus index and move the flow path to the position where the image is captured.
  • the movement of the flow path in the movement step may be a movement due to the movement of the stage 374, similarly to the movement of the flow path in the imaging step.
  • the moving step may include an image specifying step of identifying an image that gives a focus index satisfying a predetermined criterion from the acquired plurality of focus indexes. Then, in the moving step, the flow path can be moved to the position where the image specified in the image specifying step is captured.
  • the image can be specified by, for example, the movement control unit 108.
  • the predetermined reference for example, an image that gives a maximum or minimum focus index, or an image that gives a focus index within a predetermined numerical range (particularly, a focus index that is equal to or more than a predetermined value or is less than or equal to a predetermined value). Whether there is or not may be adopted.
  • FIG. 9 shows an example of a graph in which a plurality of focus indexes are plotted with respect to positions in the optical axis direction.
  • the graph shown in FIG. 9 is a plot of the values obtained by using the autofocus functions shown in the equations (1) to (3) with respect to the imaging position in the optical axis direction.
  • the value itself is used as a focus index.
  • the position where the focus index is maximum can be specified, and the image at that position is specified as the imaging position of the image that gives the maximum focus index.
  • FIG. 10 shows an example of a graph in which a plurality of focus indexes are plotted with respect to positions in the optical axis direction.
  • the graph shown in FIG. 10 is a plot of the reciprocal of the values obtained by using the autofocus functions shown in the equations (1) to (3) with respect to the imaging position in the optical axis direction.
  • the reciprocal is used as the focus index.
  • the position where the focus index is minimized can be specified, and the image at that position is specified as the imaging position of the image giving the minimum focus index.
  • the moving step includes an image specifying step of identifying an image that gives the maximum or minimum focus index from the plurality of acquired focus indexes. Then, in the moving step, the flow path can be moved to the position where the image specified in the image specifying step is captured.
  • the positional relationship adjusting unit 109 identifies the characteristic position of the flow path from the image of the flow path at the position after the movement in the movement step. Then, the positional relationship adjusting unit 109 adjusts the positional relationship between the feature position and the reference position in the direction perpendicular to the optical axis direction.
  • the positional relationship may be, for example, a positional relationship in the width direction of the flow path and / or an axial direction of the flow path, and in particular, a positional relationship in the width direction of the flow path.
  • the feature position is, for example, a position where it is desirable for fine particles flowing in the flow path to pass through.
  • a more specific example of the feature position is a substantially center position in the width direction of the flow path.
  • the width direction of the flow path is a direction perpendicular to the optical axis direction and perpendicular to the axial direction of the flow path (or the flow direction of the fine particles).
  • the x-axis direction corresponds to the width direction.
  • the y-axis direction corresponds to the axial direction of the flow path.
  • the positional relationship adjusting unit 109 can specify the characteristic position based on, for example, the position of the wall that defines the flow path.
  • the position of the wall can be identified from the image identified in the moving step.
  • the image specified in the moving step is, for example, an image that gives the maximum focus index, and is a preferable image from the viewpoint of focusing adjustment to the flow path. Therefore, the image identified in the moving step is suitable for accurately identifying the position of the wall defining the flow path.
  • the positions of the two walls in the width direction of the flow path can be used to identify the feature position.
  • the cross section of the flow path is circular or rectangular, the shape of the cross section of the flow path is symmetrical with respect to the axis of the flow path. Therefore, the center of the positions of the two walls can be specified as the feature position.
  • the feature position may be, for example, a substantially center position in the width direction of the flow path.
  • Positional relationship adjustment unit 109 the pixel value at position x 1 in the x-axis direction is acquired from the position y 1 in the y-axis direction over y 2. Positional relationship adjustment unit 109, and averaging a plurality of pixel values obtained to obtain an average pixel value at the position x 1. The positional relationship adjusting unit 109 also acquires the average pixel value for other positions in the x-axis direction.
  • the position in the x-axis direction from which the average pixel value is acquired is set so as to cross the walls W1 and W2 in the x-axis direction.
  • the average pixel value of each position from x 1 to x 2 shown in Figure 11 is obtained.
  • an average pixel value of each position from x 1 to x 2 is plotted against the position of the x-axis direction, a graph of as shown in the right of FIG. 11 is obtained. Two valleys can be confirmed from the graph.
  • the positions V1 and V2 in the x-axis direction corresponding to the bottoms of these two valleys correspond to the positions of the walls W1 and W2 in the x-axis direction.
  • the center C of V1 and V2 corresponds to a substantially center position in the width direction of the flow path P.
  • the positional relationship adjusting unit 109 can specify the substantially center position as a feature position based on the acquired average pixel value. Specifically, the positional relationship adjusting unit 109 specifies, for example, the position in the x-axis direction where the average pixel value is minimized on each of both sides of the axis of the flow path P.
  • the positional relationship adjusting unit 109 can specify the centers of the two positions in the x-axis direction thus specified as feature positions.
  • the positional relationship adjusting unit 109 can specify the feature position based on the pixel value of the image of the flow path at the position after the movement in the moving step.
  • the positional relationship adjusting unit 109 more specifically, more specifically, the feature position based on the average pixel value of the image of the flow path (particularly, the average pixel value acquired for each position in the x-axis direction (width direction)).
  • the average pixel value the integrated pixel value for each position in the x-axis direction (width direction) may be used, or the x-axis direction (width direction) at a certain point in the y-axis direction. The pixel value at each position may be used.
  • the image in which the feature position is specified may be a grayscale image or a color image.
  • the pixel value can be a pixel value in a grayscale image or a pixel value in a color image.
  • the pixel value may be, for example, a pixel value for any one of the R element, the G element, and the B element.
  • the reference position may be a position that is required to coincide with the feature position from the viewpoint of irradiating the fine particles with light.
  • the reference position is a position through which light irradiated to the fine particles flowing through the flow path passes, and in particular, a position through which the optical axis of the laser light irradiated to the fine particles flowing through the flow path passes.
  • the reference position may be determined in advance according to factors such as the structure of the optical system of the microparticle analyzer and the shape of the laser beam.
  • a microchip for preparating fine particles as a reference is prepared, and fine particles (beads, etc.) are passed through the chip to measure scattered light and / or fluorescence signals, and these signals are the best.
  • the position to be the reference position may be adopted.
  • the irradiation position of the laser beam can be specified by the imaging optical system, the irradiation position (for example, the center position of the laser beam) may be adopted as the reference position.
  • the positional relationship adjusting unit 109 adjusts the positional relationship between the feature position and the reference position, and more preferably adjusts the positional relationship in the width direction of the flow path.
  • the flow path may be moved in the x-axis direction (width direction) of the flow path in the adjustment step.
  • the positional relationship between the feature position and the reference position in the width direction can be adjusted.
  • the flow path may be moved in the width direction so that the feature position coincides with the reference position.
  • the positional relationship adjusting unit 109 can drive, for example, the movement of the stage in which the microchip for collecting fine particles having the flow path is held in order to realize the movement of the flow path.
  • the irradiation position of the laser beam may be adjusted in the adjustment step.
  • the flow path is used, for example, to irradiate fine particles flowing through the flow path with laser light and analyze the fine particles based on the light generated by the irradiation. sell.
  • the positional relationship adjusting unit 109 can, for example, adjust the position or orientation of the optical component constituting the optical system for irradiating the laser beam in order to realize the adjustment of the irradiation position.
  • FIG. 18 shows an image obtained by imaging the flow path with an imaging optical system while moving the flow path in the z-axis direction.
  • the z shown at the top of these images is the number of steps of movement, that is, these images are 40 steps, 80 steps, 120 steps, 160 steps, 200 steps in the z-axis direction, where 0 is a certain position on the z-axis.
  • And 240 steps and images of the flow path at positions moved by -40 steps, -80 steps, -120 steps, -160 steps, -200 steps, and -240 steps.
  • One step is about 2.5 ⁇ m.
  • the image at position 0 is the image that is most in focus.
  • the position adjustment method of the present technology further irradiates fine particles (for example, beads) flowing through the flow path with a laser beam, and further adjusts the position of the flow path based on the light generated by the irradiation. It may include an adjustment step.
  • the additional position adjusting step is performed after the adjusting step described in the above "(3-3) Adjusting step". By performing the additional position adjusting step, the position of the flow path can be moved to a more appropriate position.
  • FIG. 17 shows an example of a flow chart of the position adjusting method of the present technology including the additional position adjusting step.
  • the imaging step S201, the moving step S202, and the positional relationship adjusting step S203 are as described in (3) above, and thus the description thereof will be omitted.
  • the additional position adjusting step is performed.
  • the additional position adjustment step may include a first fine adjustment step S300 and a second fine adjustment step S400.
  • the first fine adjustment step S300 and the second fine adjustment step S400 correspond to the first fine adjustment step S 22 and the second fine adjustment step S 23 in JP-A-2016-191715. Therefore, please refer to the relevant publication for technical matters related to these steps. The outline of these steps will be described below.
  • FIG. 12 is a diagram for explaining control in the first fine adjustment process S300.
  • the first fine adjustment step S300 may include, for example, a linear signal acquisition step S301, a one-dimensional distribution parameter estimation step S302, and a maximum position movement step S303, as shown in FIG. Each process will be described.
  • the width direction of the flow path is centered on the feature position (indicated by reference numeral P1 in FIG. 12) after the positional relationship adjustment in the above "(3-3) adjustment step".
  • Fluorescence or scattered light is detected from a plurality of detection positions d22 arranged in the (x-axis direction) (FIG. 12A).
  • the number of sequences at the detection interval W22 and the detection position d22 can be appropriately set.
  • FIG. 12A a case where 19 detection positions d22 are arranged in the x-axis direction with the feature position P1 as the center is shown as an example.
  • the detection of fluorescence or scattered light can be performed for a certain period of time at one detection position d22.
  • the fluorescence or scattered light detected in a certain time is integrated, converted into an electric signal, and output to the control unit 103.
  • the detection of fluorescence or scattered light can be performed by scanning the laser light in the x-axis direction and the z-axis direction and sequentially irradiating each detection position d22 to detect the generated fluorescence or scattered light.
  • the fluorescence may be collectively detected by the area image sensor from each detection position d22 by irradiating the laser beam.
  • the control unit 10 assumes that the relationship between each detection position d22 and the integrated value or the average value of the fluorescence detection intensity follows the one-dimensional distribution stored in the memory or the like. For example, when the detection intensity data shown in FIG. 12B is obtained, the control unit 103 can use the one-dimensional distribution as an Nth-order polynomial model and calculate the maximum value based on the least squares method.
  • Nth-order polynomial model rather than using a one-dimensional distribution as a normal distribution, variations in the distribution of optical profiles due to design variations of each component constituting a device that analyzes fine particles using the flow path, etc. Can be accurately associated with.
  • the value used for the estimation in the one-dimensional distribution parameter estimation step S302 is not limited to the above integrated value and the average value.
  • the value used for the estimation for example, the median of the detection intensity or the number of events (particularly the number of fine particles that flowed in a certain period of time) may be used.
  • the distribution is an Nth-order polynomial model
  • the higher the degree the higher the accuracy, but if it is too high, it is easily affected by the error of the detection intensity at each detection position d22. It is preferable to do so.
  • the control unit 103 moves to the position P2 where the integrated value or the average value of the detected intensities is larger, preferably the maximum value, in the one-dimensional distribution assumed in the one-dimensional parameter estimation step S302.
  • the movement signal of is output to the control unit 103.
  • the control unit 103 moves the microchip 150 for sorting fine particles so that the feature position P1 moves to the position P2.
  • the position P2 shown in FIG. 12C is shown on the detection position d22 as an example, the position P2 may be between the two detection positions d22.
  • the position of the flow path after the adjustment step can be adjusted even more accurately.
  • the position adjustment of the microchip 150 is performed based on the detection intensity of the detection positions d22 arranged in one direction. Therefore, the number of data to be detected can be reduced as compared with the case where the position adjustment is performed in a plurality of directions based on the strength of the detection positions arranged in a grid pattern, for example. Therefore, by narrowing the interval between the detection positions d22, even if the number of sequences is increased and the accuracy of the data is improved, it is possible to suppress an increase in the data detection time as compared with the case where the data is acquired in two dimensions.
  • FIG. 13 is a diagram for explaining control in the second fine adjustment step S400.
  • the second fine adjustment step S400 includes, for example, as shown in FIG. 17, a linear signal acquisition step S401, a one-dimensional parameter estimation step S402, and a maximum position movement step S403.
  • the control in this step S23 has a detection intensity of the detection positions d22 arranged in the x-axis direction as compared with the control in the first fine adjustment step S300 described with reference to FIGS. 12A to 12C.
  • the feature position P1 is z from the position P2 to P3 based on the detection intensity of the detection position d23 arranged in the z-axis direction around the position P2. It is substantially the same except that it is moved in the axial direction. Therefore, the description thereof is omitted here.
  • the position is adjusted in the x-axis direction (width direction of the flow path) in the first fine adjustment step S300, and the position is adjusted in the z-axis direction (optical axis direction) in the second fine adjustment step S400. .. Regarding the additional position adjustment step, the position may be adjusted in the z-axis direction in the first fine adjustment step S300, and the position may be adjusted in the x-axis direction in the second fine adjustment step S400.
  • the width direction of the flow path is centered on the feature position after adjustment in the above "(3-3) adjustment step". Fluorescence or scattered light is detected from a plurality of detection positions d22 arranged in the x-axis direction).
  • the center may be shifted in the z-axis direction.
  • the position in the z direction where the focus index is maximum may be shifted to the position in the z direction where the signal from the fine particles (for example, beads) is maximum.
  • the position in the z direction where the focus index is maximized in the moving step is a position specified based on image information regarding the structure of the flow path, such as a wall (for example, a wall surface) or a corner of the flow path.
  • the position where the fine particles (for example, cells or beads) flow can be the center of the flow path. Therefore, an offset may occur between the position in the z direction where the focus index is maximized and the center of the flow path. For example, as shown in FIG.
  • the position in the z-axis direction where the maximum value is obtained with respect to the plot S2 in the z-axis direction of the focus index acquired based on the autofocus function is the position of the light generated by irradiating the fine particles with light. It may be different from the position in the z-axis direction where the maximum value of the plot S1 in the z-axis direction of the signal is obtained. Therefore, the positions adopted as the centers in the linear signal acquisition step S301 are a plurality of detections arranged in the x-axis direction around the position shifted from the feature position in the z-axis direction by the amount of such a difference. Fluorescence or scattered light from position d22 may be detected. By performing such a shift, the flow path can be moved to a more appropriate position in the first fine adjustment step.
  • the position adjusting method of the present technology may be executed by a fine particle analyzer (for example, a flow cytometer) that forms droplets and analyzes and / or sorts fine particles.
  • a fine particle analyzer for example, a flow cytometer
  • the flow path in the flow cell or microchip used in the device may be the flow path whose position is adjusted in the position adjustment method of the present technology.
  • a configuration example of the device will be described.
  • FIG. 14 shows a schematic diagram for explaining the configuration of a fine particle analyzer 1 (hereinafter, also referred to as “flow cytometer 1”) that forms droplets to analyze and / or sort fine particles.
  • flow cytometer 1 a fine particle analyzer 1
  • FIG. 15A is a schematic top view
  • FIG. B is a schematic cross-sectional view corresponding to the PP cross section in A
  • 16A and 16B are views schematically explaining the configuration of the orifice 21 of the microchip 2, where A is a top view, B is a cross-sectional view, and C is a front view.
  • FIG. 16B corresponds to the PP cross section in FIG. 15A.
  • the flow cytometer 1 includes an irradiation detection unit including a light source 61 that irradiates the microchip 2 with the laser L1 and a detector 62 that detects the detection target light generated by the irradiation of the laser L1. It has a part.
  • the irradiation direction of the laser L1 with respect to the microchip 2 (optical axis of the laser L1) is shown in the Z-axis positive direction in FIG.
  • the light source 61 may be an LD, an LED, or the like.
  • the laser L1 irradiates the cells passing through the sample flow path 22 of the microchip 2.
  • the detector 62 detects the scattered light of the laser L1 by the cells and the fluorescence generated by exciting the cells or the fluorescent dye labeled on the cells by the laser L1.
  • the fluorescence generated from the cells flowing through the sample flow path 22 is indicated by the symbol F1.
  • the irradiation detection unit includes an irradiation system including a condensing lens, a dichroic mirror, a bandpass filter, and the like for guiding the laser L1 emitted from the light source 61 to cells and condensing the light. Further, the irradiation detection unit is composed of a detection system that collects the detection target light generated from the cells by the irradiation of the laser L1 and guides the light to the detector 62.
  • the detection system is composed of, for example, a PMT (photomultiplier tube), an area image sensor such as a CCD or CMOS element, and the like.
  • the detection target light detected by the detection system of the irradiation detection unit is the light generated from the cells by the irradiation of the laser L1, for example, scattered light such as forward scattered light, side scattered light, Rayleigh scattering and Mie scattering. It can be fluorescent or the like. Fluorescence may be from cells or cell-labeled fluorescent dyes. These detection target lights are converted into electrical signals and used for determining the optical characteristics of cells and automatically adjusting the optical position described later.
  • the flow cytometer 1 includes a position adjustment unit 9 that changes the relative position of the microchip 2 with respect to the irradiation detection unit.
  • the position adjusting unit 9 moves the position of the microchip 2 and / or the position of the irradiation detecting unit on a plane (XY plane) perpendicular to the optical axis of the laser L1.
  • the position adjusting unit 9 adjusts the position of the microchip 2 with respect to the optical axis of the laser L1 and optimizes the laser L1 so as to irradiate the cell flow position in the sample flow path 22.
  • the position adjusting unit 9 may be capable of moving at least one of the position of the microchip 2 or the position of the irradiation detecting unit including the light source 61 and the detector 62 in the X-axis direction and the Y-axis direction.
  • the position adjusting unit 9 is composed of, for example, a stepping motor or the like.
  • the position adjusting unit 9 may also move the relative position of the microchip 2 with respect to the irradiation detecting unit in the Z-axis direction (focal direction of the laser L1).
  • the vibrating element flow cytometer 1 applies vibration to the orifice 21 formed in the microchip 2 to flow a laminar flow of a sample liquid containing cells and a sheath liquid discharged from the orifice 21.
  • a vibrating element 3 that drip and discharge is provided.
  • the vibrating element 3 can be, for example, a piezo element.
  • the ejected droplet becomes a fluid stream S and is ejected in the positive direction of the arrow Y-axis in the figure.
  • the microchip 2 is replaceably mounted.
  • the vibrating element 3 may be integrally formed with the microchip 2, or is arranged on the device side so as to be in contact with the mounted microchip 2. May be good.
  • the droplet discharged from the charged portion orifice 21 is given a positive or negative charge by the charged portion 41.
  • the droplets are charged by an electrode 42 that is electrically connected to the charging unit 41 and is inserted into the sample inlet 23 provided on the microchip 2.
  • the electrode 42 may be inserted into any of the microchips 2 so as to be in electrical contact with the sample liquid or the sheath liquid sent through the flow path.
  • the frequency of the driving voltage of the vibrating element 3 and the switching timing of the voltage (charge voltage) of the charging unit 41 are synchronized with each other to add or add to a part of the droplets ejected from the orifice 21. Adds one of the negative charges. Some droplets may be uncharged and uncharged.
  • the flow cytometer 1 includes a pair of polarizing plates 51 and 52 arranged so as to face each other with the fluid stream S in between.
  • the deflection plates 51 and 52 change the traveling direction of each droplet in the fluid stream S by an electric force acting on the electric charge applied to the droplet.
  • the polarizing plates 51 and 52 may be electrodes that are usually used. In FIG. 14, the opposing directions of the polarizing plates 51 and 52 are shown in the X-axis direction.
  • the fluid stream that has passed between the recovery container deflection plates 51 and 52 is received by either the recovery container 81, the recovery container 82, or the recovery container 83.
  • the polarizing plate 51 is positively charged and the deflection plate 52 is negatively charged
  • the droplets negatively charged by the charging unit 41 are collected in the collection container 82, and the positively charged droplets are collected in the collection container 83.
  • the droplets not charged by the charged portion 41 fly straight without receiving the electric acting force from the polarizing plates 51 and 52, and are collected in the collection container 81.
  • the target fine particles having desired characteristics and the target fine particles have desired characteristics by controlling the traveling direction of the droplets according to the characteristics of the fine particles (for example, biological particles, particularly cells) contained in each droplet.
  • the fine particles for example, biological particles, particularly cells
  • Non-purpose fine particles other than the above can be collected in separate collection containers.
  • the collection containers 81, 82, 83 may be general-purpose plastic tubes or glass tubes for experiments. It is preferable that these collection containers are exchangeably arranged in the flow cytometer 1. Further, a drainage channel for the collected droplets may be connected to the collection container that accepts non-purpose fine particles.
  • the number of collection containers arranged in the flow cytometer 1 is not particularly limited. When more than three collection containers are arranged, each droplet is guided to one of the collection containers depending on the presence or absence of an electrical acting force between the polarizing plates 51 and 52 and the size thereof, and is collected. To be done.
  • the flow cytometer 1 includes a data analysis unit for determining the optical characteristics of cells, and a tank unit for storing sample liquid and sheath liquid, which are provided in a normal flow cytometer. And a control unit 10 for controlling each of these configurations.
  • the control unit 10 includes the movement control unit 108 and the positional relationship adjusting unit 109 described in (3) above.
  • the control unit 10 can be configured by a general-purpose computer including a CPU, a memory, a hard disk, and the like.
  • a program for causing the flow cytometer 1 to execute the position adjustment method of the present technology and a fine particle analysis operation performed after the position adjustment method of the present technology are performed on the flow cytometer.
  • a program or the like for executing 1 may be stored.
  • the program may not be stored in the hard disk provided in the flow cytometer 1, and in this case, it may be recorded in a recording medium such as a microSD memory card, an SD memory card, or a flash memory.
  • the control unit 10 can cause the flow cytometer 1 to execute the position adjusting method of the present technology according to the program.
  • the control unit 10 is a position in which the integrated value or the average value of the detection intensities of the light generated from the microchip by the irradiation of the laser L1 becomes larger (preferably the maximum value) in the preset region.
  • a movement signal to a position where the variation is small can be output to the position adjusting unit 9.
  • the microchip 2 is formed by laminating the substrate layers 2a and 2b on which the sample flow path 22 is formed.
  • the sample flow path 22 can be formed in the substrate layers 2a and 2b by injection molding of a thermoplastic resin using a mold.
  • thermoplastic resin plastics known as materials for conventional microchips such as polycarbonate, polymethyl methacrylate resin (PMMA), cyclic polyolefin, polyethylene, polystyrene, polypropylene and polydimethylsiloxane (PDMS) can be adopted.
  • the sample liquid is introduced into the sample inlet 23, merges with the sheath liquid introduced into the sheath inlet 24, and is sent to the sample flow path 22.
  • the sheath liquid introduced from the sheath inlet 24 is divided into two directions and then fed into the sample liquid so as to sandwich the sample liquid from the two directions at the confluence with the sample liquid introduced from the sample inlet 23. Meet.
  • a three-dimensional laminar flow in which the sample laminar flow is located in the center of the sheath laminar flow is formed at the confluence portion.
  • Reference numeral 25 indicates a suction flow path for eliminating clogging or bubbles by applying a negative pressure to the sample flow path 22 to temporarily reverse the flow when the sample flow path 22 is clogged or bubbles are generated. ..
  • a suction outlet 251 connected to a negative pressure source such as a vacuum pump is formed at one end of the suction flow path 25, and the other end is connected to the sample flow path 22 at the communication port 252.
  • the three-dimensional laminar flow has narrowing portions 261 (see FIG. 15) and 262 (see FIG. 16) formed so that the area of the cross section perpendicular to the liquid feeding direction gradually or gradually decreases from the upstream to the downstream in the liquid feeding direction.
  • the laminar flow width is narrowed down in. After that, the three-dimensional laminar flow is discharged from the orifice 21 provided at one end of the flow path.
  • the irradiation detection unit irradiates the cells that are sent in a line at the center of the three-dimensional laminar flow in the sample flow path 22 with the laser L1, and detects the fluorescence F1 and scattered light generated from the cells ( (See FIG. 15).
  • the position adjusting method of the present technology may be performed on the flow path between the narrowing section 261 and the narrowing section 262 of the sample flow path 22.
  • connection portion of the sample flow path 22 to the orifice 21 is a straight portion 27 formed in a straight line.
  • the straight portion 27 functions to eject the fluid stream S straight from the orifice 21 in the positive direction of the Y axis.
  • the three-dimensional laminar flow discharged from the orifice 21 is dropletized by the vibration applied to the orifice 21 by the vibrating element 31 and ejected as a fluid stream S (see FIG. 14).
  • the orifice 21 is opened in the direction of the end faces of the substrate layers 2a and 2b, and a notch 211 is provided between the opening position and the end face of the substrate layer.
  • the cutout portion 211 is formed by cutting out the substrate layers 2a and 2b between the opening position of the orifice 21 and the end surface of the substrate so that the diameter L of the cutout portion 221 is larger than the opening diameter l of the orifice 21. (See FIG. 16C). It is desirable that the diameter L of the notch portion 211 be formed to be at least twice as large as the opening diameter l of the orifice 21 so as not to hinder the movement of the droplets discharged from the orifice 21.
  • the microparticle analyzer 1 includes an imaging optical system (not shown) that images the flow path between the narrowing section 261 and the narrowing section 262 in the sample flow path 22. ..
  • the image pickup optical system may include a lighting device 370 and an image pickup element 371 as described in the above "(2-4) Configuration example of the optical system".
  • the above description in "(2-4) Configuration example of optical system” also applies to the imaging optical system included in the fine particle analyzer 1.
  • the present technology is an imaging optical system that images a flow path at a plurality of positions in the optical axis direction while moving a flow path through which fine particles can pass in the optical axis direction, and a plurality of images taken by the imaging optical system. Based on the focus index for each of the images, the movement control unit that moves the flow path in the optical axis direction, and the feature position and the reference position identified from the image of the flow path at the position after the movement. Also provided is a microparticle analyzer that includes a positional relationship adjusting unit that adjusts the positional relationship in a direction perpendicular to the optical axis direction.
  • the microparticle analyzer of the present technology includes the imaging optical system, the movement control unit, and the positional relationship adjusting unit, thereby adjusting the position described in the above "1. First embodiment (position adjusting method)". The method can be carried out. Therefore, in the microparticle analyzer of the present technology, it is possible to reduce the number of microparticles used for adjusting the position of the flow path where the light irradiation for analyzing the microparticles is performed.
  • the microparticle analyzer of the present technology may have, for example, the configuration as described in the above "1. First embodiment (position adjustment method)", and the description also applies to the present embodiment.
  • the present technology also provides a program for causing the microparticle analyzer to execute the position adjusting method of the present technology.
  • the position adjustment method is as described in the above "1.
  • First embodiment (position adjustment method) The program can be realized, for example, by the microparticle analyzer 100 described in the above "1. First embodiment (position adjusting method)", particularly by the control unit 103. Further, the program can be realized, for example, by the microparticle analyzer 1 described in the above "1. First embodiment (position adjusting method)", particularly by the control unit 10.
  • the present technology can also have the following configuration.
  • the flow path is used to irradiate the fine particles flowing through the flow path with laser light and analyze the fine particles based on the light generated by the irradiation.
  • the moving step includes an image specifying step of identifying an image that gives a focus index satisfying a predetermined criterion from the acquired plurality of focus indexes.
  • the flow path is moved to the position where the image specified in the image specifying step is captured.
  • the position adjusting method according to any one of [1] to [7].
  • the moving step includes an image specifying step of identifying an image that gives the maximum or minimum focus index from the acquired plurality of focus indexes.
  • the flow path is moved to the position where the image specified in the image specifying step is captured.
  • the position adjusting method according to any one of [1] to [8].
  • the reference position is a position where the laser beam passing through the optical axis irradiated to the fine particles flowing through the flow path.
  • the flow path is used to irradiate the fine particles flowing through the flow path with laser light and analyze the fine particles based on the light generated by the irradiation.
  • [16] Further includes an additional position adjusting step of irradiating the fine particles flowing through the flow path with a laser beam and further adjusting the position of the flow path based on the light generated by the irradiation.
  • the position adjusting method according to any one of [1] to [15].
  • [17] The position adjusting method according to any one of [1] to [16], wherein the fine particles are biological particles.
  • An imaging optical system that images a flow path at a plurality of positions in the optical axis direction while moving a flow path through which fine particles can pass in the optical axis direction.
  • Microparticle analyzer including. [19] The microparticle analyzer It further includes an irradiation optical system that irradiates the fine particles flowing through the flow path with a laser beam, and a photodetection system that detects the light generated by the irradiation of the laser beam.
  • the direction of the optical axis of the laser beam is substantially the same as the direction of the optical axis of the imaging optical system.
  • the fine particle analyzer according to [18].
  • the microparticle analyzer It further includes an irradiation optical system that irradiates the fine particles flowing through the flow path with a laser beam, and a photodetection system that detects the light generated by the irradiation of the laser beam.
  • One or both of the irradiation optical system and the photodetection system share at least one of the optical components included in the imaging optical system.
  • the fine particle analyzer according to [18] or [19].
  • Fine particle analyzer 100 Fine particle analyzer 103 Control unit 108 Movement control unit 109 Positional relationship adjustment unit 150 Microchip for fine particle sorting

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Abstract

流路位置と光照射位置との位置関係の調整方法を提供すること。　本技術は、微小粒子が通流可能な流路を光軸方向に移動させながら、当該光軸方向における複数の位置で当該流路を撮像する撮像工程、前記撮像工程において得られた複数の画像それぞれについてのフォーカス指標に基づき、前記流路を前記光軸方向に移動させる移動工程、及び前記移動工程における移動後の位置にある前記流路の画像から、前記流路の特徴位置を特定し、前記光軸方向に対して垂直な方向における、前記特徴位置と基準位置との位置関係を調整する調整工程、を含む位置調整方法を提供する。

Description

位置調整方法、微小粒子分析装置、及びプログラム
　本技術は、位置調整方法、微小粒子分析装置、及びプログラムに関し、より詳細には微小粒子が流れる流路の位置調整方法、当該位置調整方法を実行する微小粒子分析装置、及び当該位置調整方法を微小粒子分析装置に実行させるためのプログラムを提供する。
　微小粒子を分取するために、これまでに種々の微小粒子分取装置が開発されてきている。例えばフローサイトメータにおいて用いられる粒子分取系において、フローセル又はマイクロチップに形成されたオリフィスから、細胞を含むサンプル液とシース液とから構成される層流が吐出される。吐出される際に所定の振動が当該層流に与えられて、液滴が形成される。当該形成された液滴の移動方向が、目的の粒子を含むか含まないかによって電気的に制御されて、目的の粒子が分取される。
　上記のように液滴を形成せずに、マイクロチップ内で目的の粒子を分取する技術も開発されている。例えば、下記特許文献１には、「微小粒子を含むサンプル液が通流するサンプル液導入流路と、該サンプル液導入流路にその両側から合流し、前記サンプル液の周囲にシース液を導入する少なくとも１対のシース液導入流路と、前記サンプル液導入流路及びシース液導入流路に連通し、これらの流路を通流する液体が合流して通流する合流流路と、該合流流路に連通し、回収対象の微小粒子を吸引して引き込む負圧吸引部と、該負圧吸引部の両側に設けられ、前記合流流路に連通する少なくとも１対の廃棄用流路と、を有するマイクロチップ。」（請求項１）が記載されている。当該マイクロチップにおいて、目的の粒子は吸引によって負圧吸引部へと回収される。
特開２０１２－１２７９２２号公報 特開２０１６－１９１７１５号公報
　微小粒子の分取操作において、流路中を流れる微小粒子に対して光を照射し、そして、当該照射により生じた光に基づき微小粒子を分取するかが判定されうる。このような判定をより適切に行うためには、光がより適切な位置に照射されることが望ましい。そこで、例えば流路内に微小粒子を流し、当該微小粒子への光照射により生じた光に基づき、流路の位置又は光照射位置を調整することが行われうる。
　このような調整に関する文献の例として上記特許文献２を挙げることができる。同文献に記載の装置は、流路内を通流する微小粒子にレーザを照射して発生する光の検出強度を流路の位置調整のために用いている。
　しかしながら、このような位置調整のために用いられた微小粒子は分取対象とならない。微小粒子が、希少又は高価な細胞である場合においては、分取対象とならない細胞の数はできる限り少ないことが望ましい。そこで、本技術は、流路位置と光照射位置との位置関係の調整において用いられる微小粒子の数を減らすことを目的とする。
　本発明者らは、特定の位置調整方法によって上記課題を解決できることを見出した。
　すなわち、本技術は、
　微小粒子が通流可能な流路を光軸方向に移動させながら、当該光軸方向における複数の位置で当該流路を撮像する撮像工程、
　前記撮像工程において得られた複数の画像それぞれについてのフォーカス指標に基づき、前記流路を前記光軸方向に移動させる移動工程、及び
　前記移動工程における移動後の位置にある前記流路の画像から、前記流路の特徴位置を特定し、前記光軸方向に対して垂直な方向における、前記特徴位置と基準位置との位置関係を調整する調整工程、
　を含む位置調整方法を提供する。
　前記フォーカス指標は、前記流路にピントが合っているかを示す指標でありうる。
　前記フォーカス指標は、オートフォーカス関数を用いて取得されるフォーカス指標でありうる。
　前記オートフォーカス関数は、画像差分に基づく関数でありうる。
　前記オートフォーカス関数は、ブレナー関数でありうる。
　前記流路は、当該流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射し、当該照射により生じた光に基づき前記微小粒子の分析を行うために用いられるものでありうる。
　前記レーザ光の光軸の方向は、前記撮像工程における光軸方向と略同一でありうる。
　前記移動工程は、前記取得された複数のフォーカス指標から、所定の基準を満たすフォーカス指標を与える画像を特定する画像特定工程を含み、
　前記移動工程において、前記画像特定工程において特定された画像が撮像された位置へ、前記流路が移動されうる。
　前記移動工程は、前記取得された複数のフォーカス指標から、最大又は最小のフォーカス指標を与える画像を特定する画像特定工程を含み、
　前記移動工程において、前記画像特定工程において特定された画像が撮像された位置へ、前記流路が移動されうる。
　前記特徴位置は、前記流路を規定する壁の位置に基づき特定されうる。
　前記特徴位置は、前記流路の幅方向における略中心位置でありうる。
　前記基準位置は、前記流路を流れる微小粒子に照射されるレーザ光の光軸通過位置でありうる。
　前記位置関係は、前記流路の幅方向における位置関係でありうる。
　前記調整工程において、前記流路が、当該流路の幅方向に移動されうる。
　前記流路が、当該流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射し、当該照射により生じた光に基づき前記微小粒子の分析を行うために用いられるものであってよく、
　前記調整工程において、前記レーザ光の照射位置が調整されうる。
　前記位置調整方法は、前記流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射し、当該照射により生じた光に基づき前記流路の位置をさらに調整する追加位置調整工程をさらに含みうる。
　前記微小粒子は生体粒子でありうる。
　また、本技術は、
　微小粒子が通流可能な流路を光軸方向に移動させながら、当該光軸方向における複数の位置で当該流路を撮像する撮像光学系、
　前記撮像光学系により撮像された複数の画像それぞれについてのフォーカス指標に基づき、前記流路を前記光軸方向に移動させる移動制御部、及び
　前記移動後の位置にある前記流路の画像から特定された特徴位置と基準位置との、前記光軸方向に対して垂直な方向における位置関係を調整する位置関係調整部、
　を含む微小粒子分析装置も提供する。
　前記微小粒子分析装置は、
　前記流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射する照射光学系、及び
　前記レーザ光の照射により生じた光を検出する光検出系
　をさらに含んでよく、
　前記レーザ光の光軸の方向が、前記撮像光学系の光軸方向と略同一でありうる。
　前記微小粒子分析装置は、
　前記流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射する照射光学系、及び
　前記レーザ光の照射により生じた光を検出する光検出系
　をさらに含んでよく、
　前記照射光学系及び前記光検出系のいずれか一方又は両方が、前記撮像光学系に含まれる光学部品の少なくとも一つを共有していてよい。
　また、本技術は、
　微小粒子が通流可能な流路を光軸方向に移動させながら、当該光軸方向における複数の位置で当該流路を撮像する撮像工程、
　前記撮像工程において得られた複数の画像それぞれについてのフォーカス指標に基づき、前記流路を前記光軸方向に移動させる移動工程、及び
　前記移動工程における移動後の位置にある前記流路の画像から、前記流路の特徴位置を特定し、前記光軸方向に対して垂直な方向における、前記特徴位置と基準位置との位置関係を調整する調整工程
　を微小粒子分析装置に実行させるためのプログラムも提供する。
本技術の位置調整方法の対象となる微小粒子分取用マイクロチップ及び当該微小粒子分取用マイクロチップが取り付けられる微小粒子分析装置の構成例を示す図である。 本技術の位置調整方法を実行する微小粒子分析装置の光学系の構成例を示す図である。 本技術の位置調整方法を実行する微小粒子分析装置による微小粒子分取操作のフロー図の一例である。 微小粒子分取用マイクロチップの粒子分取部の模式的な拡大図である。 微小粒子分析装置の制御部の一例のブロック図である。 接続流路部分の拡大図である。 接続流路部分の拡大図である。 接続流路部分の拡大図である。 接続流路部分の拡大図である。 本技術の位置調整方法のフロー図の一例である。 光軸方向の位置に対するフォーカス指標のプロットの例を示すグラフである。 光軸方向の位置に対するフォーカス指標のプロットの例を示すグラフである。 特徴位置の特定の仕方の一例を説明するための図である。 追加位置調整工程に含まれうる微調整工程を説明するための図である。 追加位置調整工程に含まれうる微調整工程を説明するための図である。 本技術の位置調整方法を実行する微小粒子分析装置の他の構成例を示す図である。 本技術の位置調整方法を実行する微小粒子分析装置に取り付けられるマイクロチップの例を示す模式図である。 本技術の位置調整方法を実行する微小粒子分析装置に取り付けられるマイクロチップの構造を説明するための模式図である。 追加位置調整工程を含む本技術の位置調整方法のフロー図の一例である。 ｚ軸方向の複数の位置における流路の画像及びｘ軸方向の位置に対する平均画素値のプロットを示す図である。 フォーカス指標が最大となるｚ方向における前記位置と前記流路の中心との間のオフセットを説明するための図である。
　以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、本技術の範囲がこれらの実施形態のみに限定されることはない。なお、本技術の説明は以下の順序で行う。
１．第１の実施形態（位置調整方法）
（１）第１の実施形態の説明
（２）本技術の位置調整方法の対象となる流路を含む微小粒子分取用マイクロチップの例、及び、当該微小粒子分取用マイクロチップを用いた微小粒子分取操作の例
（２－１）通流工程
（２－２）判定工程
（２－３）回収工程
（２－４）光学系の構成例
（２－５）微小粒子分取用マイクロチップ及び微小粒子
（３）本技術の位置調整方法に含まれる工程
（３－１）撮像工程
（３－２）移動工程
（３－３）調整工程
（３－３－１）特徴位置
（３－３－２）基準位置
（３－３－３）位置関係の調整
（３－３－４）調整工程の前に移動工程を行うことの利点
（４）追加位置調整工程
（４－１）第１微調整工程
（４－２）第２微調整工程
（５）本技術の位置調整方法を実行する微小粒子分析装置の他の例
２．第２の実施形態（微小粒子分析装置）
３．第３の実施形態（プログラム）
１．第１の実施形態（位置調整方法）
（１）第１の実施形態の説明
　本技術の位置調整方法は、光軸方向の複数の異なる位置で撮像された複数の流路画像それぞれのフォーカス指標に基づき流路を移動させること、及び、当該移動後の位置での流路の画像から特定される特徴位置と基準位置との位置関係を調整することを含む。前記移動及び前記調整によって、流路を好ましい位置へと移動させることができる。さらに、前記移動及び前記調整において、流路内に微小粒子が流されなくてよい。そのため、位置調整のために用いられる微小粒子を減らすことができる。
　本技術の位置調整方法は、例えば流路内を流れる微小粒子への光（例えばレーザ光など）の照射が行われる装置（例えば微小粒子の分析及び／又は分取のための装置など）において、当該流路の位置を調整するために行われてよい。
　前記流路が、例えば、当該流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射し、当該照射により生じた光に基づき前記微小粒子の分析を行うために用いられるものであってよい。当該レーザ光の光軸の方向は、好ましくは、本技術の位置調整方法に含まれる撮像工程における光軸方向と略同一である。
　より具体的には、当該流路は、例えば液滴を形成して微小粒子の分析及び／又は分取を行う微小粒子分析装置（例えばフローサイトメータ）において用いられる微小粒子分取用構造体（例えばフローセル又はマイクロチップ）内の流路であってよく、又は、液滴を形成せずにマイクロチップ内で微小粒子の分析及び／又は分取を行う微小粒子分析装置において用いられるマイクロチップ内の流路であってもよい。本技術の位置調整方法が実行される装置は、これらに限られない。例えば流路の位置と当該流路への光（例えばレーザ光）の照射位置との位置関係の調整が求められる他の装置において用いられてもよい。
　以下では、まず（２）において、液滴を形成せずにマイクロチップ内で微小粒子の分析及び／又は分取を行う装置について説明し、そして次に、（３）において、当該装置における本技術の位置調整方法の実行の例を説明する。
（２）本技術の位置調整方法の対象となる流路を含む微小粒子分取用マイクロチップの例、及び、当該微小粒子分取用マイクロチップを用いた微小粒子分取操作の例
　図１に、本技術の位置調整方法の対象となる流路を含む微小粒子分取用マイクロチップの構成例及び当該マイクロチップを含む微小粒子分析装置の構成例の模式図を示す。図２に、当該微小粒子分析装置の光学系の構成例を示す。図３に、当該微小粒子分析装置による微小粒子分取操作のフロー図の一例を示す。
　図１に示される微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、サンプル液流路１５２と、サンプル液流路１５２と合流部１６２で合流するシース液流路１５４とを有する。微小粒子分取用マイクロチップ１５０には、さらに、サンプル液インレット１５１及びシース液インレット１５３が設けられている。
　なお、図１において、シース液流路１５４の一部が点線で示されている。当該点線で示されている部分は、実線で示されるサンプル液流路１５２よりも低い位置（後述する光軸方向にずれた位置）にあり、点線で示される流路と実線で示される流路とが交差する位置で、これら流路は連通していない。また、図１においては、サンプル液流路１５２は、サンプル液インレット１５１から合流部１６２までの間で２回曲がるように示されているが、これはサンプル液流路１５２とシース液流路１５４との区別を容易にするためである。サンプル液流路１５２は、サンプル液インレット１５１から合流部１６２までの間でこのように曲がることなく直線的に構成されていてよい。
　微小粒子分取操作において、サンプル液インレット１５１から微小粒子を含むサンプル液がサンプル液流路１５２に導入され、且つ、シース液インレット１５３から微小粒子を含まないシース液がシース液流路１５４に導入される。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、合流部１６２を一端に有する合流流路１５５を有する。
　前記サンプル液及び前記シース液は、合流部１６２で合流し、そして、合流流路１５５内を、粒子分取部１５７に向かって流れる。特には、前記サンプル液及び前記シース液が合流部１６２で合流して、例えばサンプル液の周囲がシース液で囲まれた層流が形成される。好ましくは、層流中には微小粒子が略一列に並んでいる。サンプル液流路１５２と２つのシース液流路１５４とが合流部１６２で合流しており且つ当該合流部１６２を一端とする合流流路１５５を有するという流路構造によって、略一列に並んで流れる微小粒子を含む層流が形成される。これにより、以下で説明する検出領域１５６における光照射において、１つの微小粒子への光照射により生じた光と他の微小粒子への光照射により生じた光とを区別しやすくなる。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、さらに、合流流路１５５の他端に粒子分取部１５７を有する。図４に、粒子分取部１５７の拡大図を示す。図４Ａに示されるとおり、当該他端で、合流流路１５５は、接続流路１７０を介して微小粒子回収流路１５９と接続されている。図４Ａに示されるとおり、合流流路１５５、接続流路１７０、及び微小粒子回収流路１５９は同軸上にあってよい。
　粒子分取部１５７に回収対象粒子が流れてきた場合に、図４Ｂに示されるとおり、合流流路１５５から接続流路１７０を通って微小粒子回収流路１５９へ入る流れが形成されて、回収対象粒子が微小粒子回収流路１５９内へ回収される。このように、回収対象粒子は、接続流路１７０を通って微小粒子回収流路１５９へと流れる。
　粒子分取部１５７に回収対象粒子でない微小粒子が流れてきた場合に、回収対象粒子でない当該微小粒子は、図４Ｃに示されるとおり、分岐流路１５８へと流れる。この場合において、微小粒子回収流路１５９へ入る流れは形成されない。
　微小粒子回収流路１５９は、図１に示されるとおり、粒子分取部１５７から直線状に伸び、Ｕターンし、そして、サンプル液インレット１５１及びシース液インレット１５３が形成する面と同じ面へ到達するように形成されている。微小粒子回収流路１５９を流れる液体は、回収流路末端１６３からチップ外へと排出される。
　２つの分岐流路１５８も、図１に示されるとおり、粒子分取部１５７から直線状に伸び、Ｕターンし、そして、サンプル液インレット１５１及びシース液インレット１５３が形成する面と同じ面へ到達するように形成されている。分岐流路１５８を流れる液体は、分岐流路末端１６６からチップ外へと排出される。
　微小粒子回収流路１５９は、図１において、Ｕターンする部分で、実線及び点線へと表示方法が変更されている。この変更は、その途中で光軸方向における位置が変化していることを示す。このように光軸方向の位置を変化させることで、分岐流路１５８と交差する部分で、微小粒子回収流路１５９及び分岐流路１５８が連通しない。
　回収流路末端１６３及び２つの分岐流路末端１６６のいずれもが、サンプル液インレット１５１及びシース液インレット１５３が形成されている面に形成されている。さらに、導入流路１６１へ液体を導入するための導入流路インレット１６４も、当該面に形成されている。このように、微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、液体が導入されるインレット及び液体が排出されるアウトレットの全てが１つの面に形成されている。これにより、当該チップの微小粒子分析装置１００への取り付けが容易になる。例えば、２以上の面にインレット及び／又はアウトレットが形成されている場合と比べて、微小粒子分析装置１００に設けられている流路と微小粒子分取用マイクロチップ１５０の流路との接続が容易になる。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、図１及び４に示されるとおり、接続流路１７０へ液体を導入するための導入流路１６１を有する。
　導入流路１６１から液体を接続流路１７０へ導入することで、接続流路１７０内が当該液体によって満たされる。これにより、目的外の微小粒子が微小粒子回収流路１５９へ侵入することを防ぐことができる。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、合流流路１５５の他端で、合流流路１５５と接続されている２つの分岐流路１５８を有する。このように、本技術において用いられる微小粒子分取用マイクロチップにおいて、前記合流流路は、前記接続流路と前記少なくとも一つの分岐流路へと分岐していてよい。
　回収対象粒子以外の微小粒子は、微小粒子回収流路１５９へ侵入することなく、２つの分岐流路１５８のいずれかへ流れる。
　また、図１に示されるとおり、微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、当該マイクロチップに加えて、光照射部１０１、検出部１０２、及び制御部１０３を含む微小粒子分析装置１００の一部を構成する。
　図１では省略されているが、微小粒子分析装置１００は、微小粒子が流れる流路を光軸方向に移動させながら、当該光軸方向における複数の位置で当該流路を撮像する撮像光学系をさらに含む。当該撮像光学系の構成例は、以下「（２－４）光学系の構成例」で図２を参照しながら詳述する。以下「（２－４）光学系の構成例」では、微小粒子分析装置１００の光学系に含まれる光照射部１０１及び検出部１０２についても説明されている。
　微小粒子分析装置１００の制御部１０３は、図５に示されるとおり、信号処理部１０４、判定部１０５、及び分取制御部１０６を含みうる。制御部１０３は、さらに、移動制御部１０８及び位置関係調整部１０９を含む。
　以上で説明した微小粒子分取用マイクロチップ１５０を用いた微小粒子分取操作は、図３に示されるとおり、微小粒子を含む液体を合流流路１５５に流す通流工程Ｓ１０１と、合流流路１５５を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程Ｓ１０２と、回収対象粒子を微小粒子回収流路１５９内へと回収する回収工程Ｓ１０３とを含む。
　以下で各工程について説明する。
（２－１）通流工程
　通流工程Ｓ１０１において、サンプル液インレット１５１及びシース液インレット１５３から、微小粒子を含むサンプル液及び微小粒子を含まないシース液が、それぞれサンプル液流路１５２及びシース液流路１５４に導入される。
　当該サンプル液及び当該シース液が合流部１６２で合流して、例えばサンプル液の周囲がシース液で囲まれた層流が形成される。好ましくは、層流中には微小粒子が略一列に並んでいる。すなわち、通流工程Ｓ１０１において、略一列に並んで流れる微小粒子を含む層流が形成されうる。
　このようにして、通流工程Ｓ１０１において、微小粒子を含む液体が、特には層流として、合流流路１５５内を通流される。前記液体は、合流流路１５５内を、合流部１６２から粒子分取部１５７へ向かって流れる。
（２－２）判定工程
　判定工程Ｓ１０２において、合流流路１５５を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかが判定される。当該判定は、判定部１０５により行われうる。判定部１０５は、当該判定を、光照射部１０１による微小粒子への光照射によって生じた光に基づき行いうる。判定工程Ｓ１０２の例について、以下でより詳細に説明する。
　判定工程Ｓ１０２において、光照射部１０１が、微小粒子分取用マイクロチップ１５０中の合流流路１５５（特には検出領域１５６中の流路）を流れる微小粒子に光（例えば励起光など）を照射し、当該光照射により生じた光を検出部１０２が検出する。検出部１０２により検出された光の特徴に基づき、判定部１０５が、微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する。例えば、判定部１０５は、散乱光に基づく判定、蛍光に基づく判定、又は、画像（例えば暗視野画像若しくは／且つ明視野画像など）に基づく判定を行いうる。後述の回収工程Ｓ１０３において、制御部１０３が、微小粒子分取用マイクロチップ１５０中の流れを制御することによって、回収対象粒子が微小粒子回収流路１５９内へ回収される。
　光照射部１０１は、微小粒子分取用マイクロチップ１５０中の流路内を流れる微小粒子に光（例えば励起光など）を照射する。光照射部１０１は、光を出射する光源と、検出領域を流れる微小粒子に対して励起光を集光する対物レンズとを含みうる。光源は、分析の目的に応じて当業者により適宜選択されてよく、例えばレーザダイオード、ＳＨＧレーザ、固体レーザ、ガスレーザ、高輝度ＬＥＤ、若しくはハロゲンランプであってよく、又は、これらのうちの２つ以上の組み合わせであってもよい。光照射部は、光源及び対物レンズに加えて、必要に応じて他の光学素子を含んでいてもよい。
　本技術の一つの実施態様において、検出部１０２は、光照射部１０１による光照射によって前記微小粒子から生じた散乱光及び／又は蛍光を検出する。検出部１０２は、微小粒子から生じた蛍光及び／又は散乱光を集光する集光レンズと検出器とを含みうる。当該検出器として、ＰＭＴ、フォトダイオード、ＣＣＤ、及びＣＭＯＳなどが用いられうるがこれらに限定されない。検出部１０２は、集光レンズ及び検出器に加えて、必要に応じて他の光学素子を含んでいてもよい。検出部１０２は、例えば分光部をさらに含みうる。分光部を構成する光学部品として、例えばグレーティング、プリズム、及び光フィルターを挙げることができる。分光部によって、例えば検出されるべき波長の光を、他の波長の光から分けて検出することができる。検出部１０２は、検出された光を光電変換によって、アナログ電気信号に変換しうる。検出部１０２は、さらに当該アナログ電気信号をＡＤ変換によってデジタル電気信号に変換しうる。
　本技術の他の実施態様において、検出部１０２は、光照射部１０１による光照射により生成される画像を取得してもよい。前記画像は、例えば暗視野画像、明視野画像、又はこれらの両方であってよい。この実施態様において、光照射部１０１は例えばハロゲンランプ又はレーザを含み、検出部１０２は、ＣＣＤ又はＣＭＯＳを含みうる。検出部１０２は、例えばＣＭＯＳセンサが組み込まれた基板とＤＳＰ（Digital Signal Processor）を組み込まれた基板とが積層された撮像素子であってもよい。当該撮像素子のＤＳＰを機械学習部として動作させることによって、当該撮像素子はいわゆるＡＩセンサとして動作することができる。当該撮像素子を含む検出部１０２は、微小粒子が回収対象粒子であるかを、例えば学習モデルに基づき判定しうる。また、当該学習モデルは、本技術に従う方法が行われている間に、リアルタイムで更新されてもよい。例えば、ＣＭＯＳセンサ中の画素アレイ部のリセット中、当該画素アレイ部の露光中、又は当該画素アレイ部の各単位画素からの画素信号の読出中に、ＤＳＰが機械学習処理を行いうる。ＡＩセンサとして動作する撮像素子の例として、例えば、国際公開第２０１８／０５１８０９号に記載された撮像装置を挙げることができる。
　制御部１０３に含まれる信号処理部１０４は、検出部１０２により得られたデジタル電気信号の波形を処理して、判定部１０５による判定のために用いられる光の特徴に関する情報（データ）を生成しうる。当該光の特徴に関する情報として、信号処理部１０４は、デジタル電気信号の波形から、例えば当該波形の幅、当該波形の高さ、及び当該波形の面積のうちの１つ、２つ、又は３つを取得しうる。また、当該光の特徴に関する情報には、例えば、当該光が検出された時刻が含まれていてよい。以上の信号処理部１０４による処理は、特には、前記散乱光及び／又は蛍光が検出される実施態様において行われうる。
　制御部１０３に含まれる判定部１０５は、流路中を流れる微小粒子への光照射により生じた光に基づき、当該微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する。
　前記散乱光及び／又は蛍光が検出される実施態様において、検出部１０２により得られたデジタル電気信号の波形が制御部１０３によって処理され、そして、当該処理によって生成された光の特徴に関する情報に基づき、判定部１０５が、当該微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する。例えば、散乱光に基づく判定において、微小粒子の外形及び／又は内部構造の特徴が特定され、当該特徴に基づき微小粒子が回収対象粒子であるかが判定されてよい。さらに、例えば細胞などの微小粒子に対して予め前処理を施しておくことで、フローサイトメトリーにおいて用いられる特徴と同様の特徴に基づき、当該微小粒子が回収対象粒子であるかを判定することもできる。また、例えば細胞などの微小粒子を抗体又は色素（特には蛍光色素）で標識を行っておくことで、当該微小粒子の表面抗原の特徴に基づき、当該微小粒子が回収対象粒子であるかを判定することもできる。
　前記画像が取得される実施態様において、制御部１０３に含まれる判定部１０５は、取得された画像（例えば暗視野画像、明視野画像、又はこれらの両方）に基づき、微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する。例えば、微小粒子（特には細胞）の形態、サイズ、及び色のうちの一つ又は二つ以上の組合せに基づき、微小粒子が回収対象粒子であるかが判定されうる。
　前記判定は、例えば、当該光の特徴に関する情報が予め指定された基準を満たすかによって行われうる。当該基準は、微小粒子が回収対象粒子であることを示す基準でありうる。当該基準は、当業者により適宜設定されてよく、例えばフローサイトメトリーなどの技術分野において用いられる基準のような、光の特徴に関する基準でありうる。
　検出領域１５６中の１つの位置に１つの光が照射されてよく、又は、検出領域１５６中の複数の位置のそれぞれに光が照射されてもよい。例えば、検出領域１５６中の２つの異なる位置のそれぞれに光が照射されるようにマイクロチップ１５０は構成されうる（すなわち、検出領域１５６中に、光が照射される位置が２つある。）。この場合において、例えば、１つの位置での微小粒子への光照射によって生じた光（例えば蛍光及び／又は散乱光など）に基づき当該微小粒子が回収対象粒子であるかが判定されうる。さらに、当該１つの位置での前記光照射によって生じた光の検出時刻ともう一つの位置での光照射によって生じた光の検出時刻との差に基づき、流路内における微小粒子の速度を算出することもできる。当該算出のために、予め、２つの照射位置の間の距離が決定されていてよく、前記２つの検出時刻の差と前記距離に基づき微小粒子の速度が決定されうる。さらに、当該速度に基づき、以下で述べる粒子分取部１５７への到達時刻を正確に予測することができる。当該到達時刻が正確に予測されることで、微小粒子回収流路１５９へ入る流れの形成のタイミングを最適化することができる。また、或る微小粒子の粒子分取部１５７への到達時刻と当該或る微小粒子の前又は後の微小粒子の粒子分取部１５７への到達時刻との差が所定の閾値以下である場合は、当該或る微小粒子を回収しないと判定することもできる。当該或る微小粒子とその前又は後の微小粒子との間の距離が狭い場合に、当該或る微小粒子の吸引の際に当該前又は後の微小粒子が一緒に回収される可能性が高まる。当該一緒に回収される可能性が高い場合には当該或る微小粒子を回収しないと判定することによって、当該前又は後の微小粒子が回収されることを防ぐことができる。これにより、回収された微小粒子のうちの目的とする微小粒子の純度を高めることができる。検出領域１５６中の２つの異なる位置のそれぞれに光が照射されるマイクロチップ及び当該マイクロチップを含む装置の具体例は、例えば特開２０１４－２０２５７３号公報に記載されている。
　なお、制御部１０３は、光照射部１０１による光照射及び／又は検出部１０２による光の検出を制御してもよい。また、制御部１０３は、微小粒子分取用マイクロチップ１５０内に流体を供給するためのポンプの駆動を制御しうる。制御部１０３は、例えば、本技術に従う位置調整方法を微小粒子分析装置１００に実行させるためのプログラムとＯＳとが格納されたハードディスク、ＣＰＵ、及びメモリにより構成されてよい。例えば汎用のコンピュータにおいて制御部１０３の機能が実現されうる。前記プログラムは、例えばｍｉｃｒｏＳＤメモリカード、ＳＤメモリカード、又はフラッシュメモリなどの記録媒体に記録されていてもよい。当該記録媒体に記録された前記プログラムを、微小粒子分析装置１００に備えられているドライブ（図示されていない）が読み出し、そして、制御部１０３が、当該読み出されたプログラムに従い、微小粒子分析装置１００に本技術に従う位置調子方法及びその後に行われる微小粒子分取操作を実行させてもよい。
（２－３）回収工程
　回収工程Ｓ１０３において、判定工程Ｓ１０２において回収対象粒子であると判定された微小粒子が、微小粒子回収流路１５９内へ回収される。回収工程Ｓ１０３は、マイクロチップ１５０中の粒子分取部１５７において行われる。粒子分取部１５７において、合流流路１５５を流れてきた前記層流は、２つの分岐流路１５８へと別れて流れる。図１に記載の粒子分取部１５７は２つの分岐流路１５８を有するが、分岐流路の数は２つに限られない。粒子分取部１５７には、例えば１つ又は複数（例えば２つ、３つ、又は４つなど）の分岐流路が設けられうる。分岐流路は、図１におけるように１平面上でＹ字状に分岐するように構成されていてよく、又は、三次元的に分岐するように構成されていてもよい。
　接続流路１７０付近の拡大図を図６Ａ及び６Ｂに示す。図６Ａは、接続流路１７０付近の模式的な斜視図である。図６Ｂは、導入流路１６１の中心線と接続流路１７０の中心線とを通る平面における模式的な断面図である。接続流路１７０は、検出領域１５６側の流路１７０ａ（以下、上流側接続流路１７０ａともいう）と、微小粒子回収流路１５９側の流路１７０ｂ（以下、下流側接続流路１７０ｂともいう）と、接続流路１７０と導入流路１６１との接続部１７０ｃとを含む。導入流路１６１は、接続流路１７０の流路の軸に対して略垂直になるように設けられている。図６Ａ及び６Ｂにおいて、２つの導入流路１６１が、接続流路１７０の略中心位置にて向かい合うように設けられているが、１つの導入流路だけが設けられていてもよい。
　上流側接続流路１７０ａの横断面の形状及び寸法は、下流側接続流路１７０ｂの形状及び寸法と、同じであってよい。例えば、図６Ａ及び６Ｂに示されるとおり、上流側接続流路１７０ａの横断面及び下流側接続流路１７０ｂの横断面のいずれもが、同じ寸法を有する略円形であってよい。代替的には、これら２つの横断面のいずれもが同じ寸法を有する矩形（例えば正方形又は長方形など）であってもよい。
　２つの導入流路１６１から、図６Ｂ中に矢印に示されるとおりに液体が接続流路１７０へと供給される。当該液体は、接続部１７０ｃから、上流側接続流路１７０ａ及び下流側接続流路１７０ｂの両方へ流れる。
　回収工程が行われない場合は、当該液体は以下のとおりに流れる。
　上流側接続流路１７０ａへ流れた液体は、接続流路１７０の合流流路１５５との接続面から出たのち、２つの分岐流路１５８へと別れて流れる。このように当該液体が当該接続面から出ていることによって、微小粒子回収流路１５９内へ回収される必要のない液体及び微小粒子が、接続流路１７０を通って微小粒子回収流路１５９へ入ることを防ぐことができる。
　下流側接続流路１７０ｂへ流れた液体は、微小粒子回収流路１５９内へと流れる。これによって、微小粒子回収流路１５９内が当該液体によって満たされる。
　回収工程が行われる場合においても、当該液体は、２つの導入流路１６１から接続流路１７０へと供給されうる。しかしながら、微小粒子回収流路１５９内の圧力変動により、特には微小粒子回収流路１５９内に負圧を発生させることによって、合流流路１５５から接続流路１７０を通って微小粒子回収流路１５９へと流れる流れが形成される。すなわち、合流流路１５５から、上流側接続流路１７０ａ、接続部１７０ｃ、及び下流側接続流路１７０ｂをこの順に通って微小粒子回収流路１５９へと流れる流れが形成される。これにより、回収対象粒子が、微小粒子回収流路１５９内に回収される。
　上流側接続流路１２０ａの横断面の形状及び／又は寸法は、下流側接続流路１２０ｂの形状及び／又は寸法と異なっていてもよい。これら２つの流路の寸法が異なる例を図７Ａ及び７Ｂに示す。図７Ａ及び７Ｂに示されるとおり、接続流路１８０は、検出領域１５６側の流路１８０ａ（以下、上流側接続流路１８０ａともいう）と、微小粒子回収流路１５９側の流路１８０ｂ（以下、下流側接続流路１８０ｂともいう）と、接続流路１８０と導入流路１６１との接続部１８０ｃとを含む。上流側接続流路１８０ａの横断面及び下流側接続流路１８０ｂの横断面はいずれも略円形の形状を有するが、後者の横断面の直径は、前者の横断面の直径よりも大きい。後者の横断面の直径を前者のものよりも大きくすることによって、両者の直径が同じ場合と比べて、上記で述べた負圧による微小粒子分取動作の直後に微小粒子回収流路１５９内に既に分取された回収対象粒子が接続流路１８０を通って合流流路１５５へと放出されることをより効果的に防ぐことができる。
　例えば、上流側接続流路１８０ａの横断面及び下流側接続流路１８０ｂの横断面がいずれも矩形である場合は、後者の横断面の面積を前者の横断面の面積よりも大きくすることによって、上記で述べたように、既に回収された微小粒子が接続流路１８０を通って合流流路１５５へと放出されることをより効果的に防ぐことができる。
　回収工程Ｓ１０３において、微小粒子回収流路１５９内の圧力変動により、前記回収対象粒子が前記接続流路を通って前記微小粒子回収流路内へと回収される。当該回収は、例えば、上記で述べた通り、微小粒子回収流路１５９内に負圧を発生させることによって行われてよい。当該負圧は、例えばマイクロチップ１５０の外部に取り付けられているアクチュエータ１０７（特にはピエゾアクチュエータ）により、微小粒子回収流路１５９を規定する壁が変形されることにより生じうる。当該負圧によって、微小粒子回収流路１５９へ入る当該流れが形成されうる。当該負圧を発生させるために、例えば、微小粒子回収流路１５９の壁を変形させることができるように、アクチュエータ１０７がマイクロチップ１５０外部に取り付けられうる。当該壁の変形によって、微小粒子回収流路１５９の内空が変化されて、負圧が発生されうる。アクチュエータ１０７は、例えばピエゾアクチュエータでありうる。回収対象粒子が微小粒子回収流路１５９へと吸い込まれる際には、前記層流を構成するサンプル液又は前記層流を構成するサンプル液及びシース液も、微小粒子回収流路１５９へと流れうる。このようにして、回収対象粒子は、粒子分取部１５７において分取されて、微小粒子回収流路１５９へと回収される。
　回収対象粒子でない微小粒子が接続流路１７０を通って微小粒子回収流路１５９へと入ることを防ぐために、接続流路１７０には導入流路１６１が備えられている。接続流路１７０には、導入流路１６１から液体が導入される。当該液体の導入によって、当該液体により接続流路１７０が満たされる。さらに、当該液体の一部によって接続流路１７０から合流流路１５５に向かう流れが形成されることで、回収対象粒子以外の微小粒子が微小粒子回収流路１５９へ入ることが防がれる。接続流路１７０から合流流路１５５に向かう流れを形成する液体は、合流流路１５５を流れる液体が分岐流路１５８へと流れる流れによって、合流流路１５５内を流れることなく、当該液体と同様に分岐流路１５８を流れる。
　なお、接続流路１７０に導入された液体の残りは、微小粒子回収流路１５９へと流れる。これにより、微小粒子回収流路１５９内は当該液体によって満たされうる。
　分岐流路１５８へと流れた流れは、分岐流路末端１６０にて、マイクロチップの外部へと吐出されうる。また、微小粒子回収流路１５９へと回収された回収対象粒子は、回収流路末端１６３にて、マイクロチップの外部へと吐出されうる。回収流路末端１６３には、チューブなどの流路を介して容器が接続されうる。当該容器に、回収対象粒子が回収されてよい。
　図１及び図４に示されるように、本技術において用いられる微小粒子分取用マイクロチップにおいて、前記合流流路、前記接続流路、及び前記回収流路が直線状に並んでいてよい。これら３つの流路が直線状（特には同軸上）に並んでいる場合、例えば前記接続流路及び前記回収流路が前記合流流路に対して角度を有して配置されている場合と比べて、回収工程をより効率的に行うことができる。例えば、回収対象粒子を接続流路へと導くために要する吸引量をより少なくすることができる。
　また、前記微小粒子分取用マイクロチップにおいて、微小粒子は、合流流路内を略一列に並び、接続流路へ向かって流れる。そのため、回収工程における吸引量を少なくすることもできる。
　以上で述べたとおり、前記微小粒子分取用マイクロチップにおいて、前記導入流路から前記接続流路へ液体が供給される。これにより、前記接続流路内に、前記導入流路と前記接続流路との接続位置から前記合流流路に向かって流れる流れが形成されて、前記合流流路を流れる液体が前記接続流路へと侵入することを防ぐことができ、回収対象粒子以外の微小粒子が接続流路を通って回収流路へ流れることを防ぐこともできる。前記回収工程を行う際には、上記で述べたとおり、例えば回収流路内に生じた負圧によって、回収対象粒子が、前記接続流路を通って、前記回収流路内へと回収される。
（２－４）光学系の構成例
　上記で説明した光照射部１０１及び検出部１０２を構成する光学系の構成例を、図２を参照しながら説明する。
　図２に示される光学系３５０は、検出領域１５６に照射されるレーザ光を生成するレーザ光生成部３５１を含む。レーザ光生成部３５１は、例えばレーザ光源３５２－１、３５２－２、及び３５２－３を含み、且つ、これらレーザ光源から射出されたレーザ光を合成するミラー群３５３－１、３５３－２、及び３５３－３を含む。
　レーザ光源３５２－１、３５２－２、及び３５２－３は、互いに異なる波長のレーザ光を射出する。
　レーザ光源３５２－１は、例えば５５０ｎｍ～８００ｎｍの波長（例えば６３７ｎｍの波長）を有するレーザ光を射出する。ミラー３５３－１は、当該レーザ光を反射する光学特性を有する。
　レーザ光源３５２－２は、例えば４５０ｎｍ～５５０ｎｍの波長（例えば４８８ｎｍの波長）を有するレーザ光を射出する。ミラー３５３－２は、当該レーザ光を反射し且つ、レーザ光源３５２－１から射出されたレーザ光を透過させる光学特性を有する。
　レーザ光源３５２－３は、例えば３８０ｎｍ～４５０ｎｍの波長（例えば４０５ｎｍの波長）を有するレーザ光を射出する。ミラー３５３－３は、当該レーザ光を反射し且つ、レーザ光源３５２－１及び３５２－２から射出された２筋のレーザ光を透過させる光学特性を有する。
　以上の３つのレーザ光源及び３つのミラーを図２に示されるとおりに配置することによって、微小粒子に照射されるレーザ光が合成される。
　当該合成されたレーザ光は、ミラー３４２を透過し、ミラー３５４により反射され、そしてシャッター３５５を通過して、対物レンズ３５６へ入射する。当該レーザ光は対物レンズ３５６により集光されて、マイクロチップ１５０の検出領域１５６に到達する。
　当該レーザ光が、検出領域１５６を流れる微小粒子に照射されて、蛍光及び散乱光が生じる。
　このように、図２に示される光学系において、レーザ光生成部３５１と、ミラー３５２及び３５４と、対物レンズ３５６とが、光照射部１０１の構成要素として含まれる。このように、本技術において用いられる光照射部は、レーザ光生成部、特には複数のレーザ光が合成されたレーザ光を生成するレーザ光生成部を含んでよい。また、本技術において用いられる光照射部は、例えば、レーザ光生成部に加えて、対物レンズを含んでもよい。このように、流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射する光照射部を、本明細書内において、照射光学系ともいう。
　光学系３５０は、前記蛍光を検出する蛍光検出器３５７を含む。前記蛍光は、対物レンズ３５６へ入射し、そして、対物レンズ３５６で集光される。対物レンズ３５６で集光された前記蛍光は、シャッター３５５を通過し、ミラー３５４を透過し、そして、蛍光検出器３５７によって検出される。
　光学系３５０は、前記散乱光のうち後方散乱光を検出する散乱光検出器３５８－３を含む。当該後方散乱光は、対物レンズ３５６へ入射し、そして、対物レンズ３５６で集光される。対物レンズ３５６で集光された当該後方散乱光は、シャッター３５５を通過し、そして、ミラー３５４によって反射され、そして、ミラー３４２によってさらに反射され、そして散乱光検出器３５８－３によって検出される。散乱光検出器３５８－３は、レーザ光源３５２－３から出射されたレーザ光の波長と同じ波長の光（例えば３８０ｎｍ～４５０ｎｍの波長の光）を検出する。
　光学系３５０は、前記散乱光のうち前方散乱光を検出する散乱光検出器３５８－１及び３５８－２も含む。当該前方散乱光は、対物レンズ３５９へ入射し、そして、対物レンズ３５９で集光される。対物レンズ３５９で集光された当該前方散乱光は、ミラー３４３を透過し、そして、ミラー３６０によってレーザ光源３５２－１から出射されたレーザ光の波長と同じ波長の光（例えば５５０ｎｍ～８００ｎｍの波長の光）及びレーザ光源３５２－２から出射されたレーザ光の波長と同じ波長の光（例えば４５０ｎｍ～５５０ｎｍの波長の光）に分離される。ミラー３６０は、例えばハーフミラーであってよく、前者の光を反射し且つ後者の光を透過させる光学特性を有する。
　前者の光は、ミラー３６１によって反射され、そして、散乱光検出器３５８－１によって検出される。
　後者の光は、散乱光検出器３５８－２によって検出される。
　このように、図２に示される光学系において、レーザ光の照射により生じた蛍光を検出する蛍光検出器３５７、当該照射により生じた散乱光を検出する散乱光検出器３５８－１、３５８－２、及び３５８－３、蛍光及び／又は散乱光を透過させ又は反射するミラー群、並びに対物レンズ３５６及び３５９が、検出部１０２の構成要素として含まれる。このように、本技術において用いられる検出部は、蛍光検出器及び／又は散乱光検出器を含みうる。本技術において用いられる検出部は、蛍光検出器及び／又は散乱光検出器に加えて、蛍光及び／又は散乱光が通過する対物レンズを含んでもよい。このように、流路を流れる微小粒子へのレーザ光の照射により生じた光を検出する検出部を、本明細書内において、光検出系ともいう。
　光学系３５０は、照明装置３７０及び撮像素子３７１をさらに含む。照明装置３７０及び撮像素子３７１が、前記撮像工程において流路を撮像する撮像光学系に含まれる。図２に示される撮像光学系は、落射照明方式の撮像光学系の構成例である。照明装置３７０は、微小粒子分取用マイクロチップ１５０の流路（特には検出領域１５６内の合流流路１５５）の撮像に必要な照明光を照射する。照明装置３７０から出射された照明光は、ミラー３４４及びミラー３４３によって反射され、そして、対物レンズ３５９を通過して、微小粒子分取用マイクロチップ１５０に到達する。当該照明光により照明された微小粒子分取用マイクロチップの流路（特には検出領域１５６内の合流流路１５６）が、対物レンズ３５９を介して、撮像素子３７１により撮像される。すなわち、照明装置３７０及び撮像素子３７１は、対物レンズ３５９を介して流路を撮像するように構成されている。このように、照明装置３７０、撮像素子３７１、及び対物レンズ３５９が、光軸方向における複数の位置で流路を撮像する撮像光学系の一部を構成するものであってよい。撮像素子３７１は、例えばＣＣＤ又はＣＭＯＳを含みうる。照明装置３７０は、例えば顕微鏡観察において用いられる照明装置であってよく、当業者により適宜選択されてよい。
　本技術において、前記撮像光学系は、前方散乱光が通過する対物レンズを介して前記流路を撮像するように構成されていてよい。代替的には、前記撮像光学系は、後方散乱光及び／又は蛍光が通過する対物レンズを介して前記流路を撮像するように構成されていてもよい。対物レンズなどの光学部品の少なくとも一つが光検出系と撮像光学系とによってこのように共有されることで、光学系の構造を簡素化することができる。
　また、本技術において、前記撮像光学系の照明光は、前記流路に照射されるレーザ光が通過する対物レンズを介して流路に照射されてもよい。対物レンズなどの光学部品の少なくとも一つが照射光学系と撮像光学系とによって共有されることで、光学系の構造を簡素化することができる。
　以下で、対物レンズなどの光学部品の共有について、以下で図２を参照しながら、さらに説明する。
　図２に示される光学系３５０において、前記撮像光学系は、前方散乱光検出器３５８－１及び３５８－２によって検出される前方散乱光が通過する対物レンズ３５９を介して前記流路を撮像する。すなわち、対物レンズ３５９は、光検出系と撮像光学系とによって共有されている。このように、本技術において、光検出系が、撮像光学系に含まれる少なくとも一つの光学部品（例えば流路を拡大して撮像素子に撮像させるための対物レンズやミラーなど）を共有していてよい。これにより、光学系の構成を簡素化することができる。対物レンズの共有は、微小粒子分析装置の性能及び／又はロバスト性の観点から特に好ましい。例えば、前記撮像光学系と微小粒子への光照射により生じた光を検出するための光検出系が別の対物レンズを用いる場合は、一方のレンズのずれによって撮像光学系と光検出系により検出される信号との間にずれが生じうるが、対物レンズが共有されていることでこのようなずれはほとんど生じない。
　また、撮像光学系が透過型照明方式である場合において、後述するとおり、撮像光学系による撮像のための照明光が対物レンズ３５６を通過する。対物レンズ３５６は、上記のとおり、合成されたレーザ光も通過する。このように、本技術において、照射光学系が、撮像光学系に含まれる少なくとも一つの光学部品（例えば微小粒子に照射されるレーザ光が通過する対物レンズなど）を共有していてよい。これにより、光学系の構成を簡素化することができる。
　また、撮像光学系が透過型照明方式である場合において、後述するとおり、撮像光学系による撮像のための照明光が対物レンズ３５６を通過する。対物レンズ３５６は、上記のとおり、蛍光及び後方散乱光も通過する。対物レンズ３５６は、上記のとおり、合成されたレーザ光も通過する。このように、本技術において、照射光学系及び光検出系が、撮像光学系に含まれる少なくとも一つの光学部品（例えば微小粒子に照射されるレーザ光が通過する対物レンズなど）を共有していてよい。これにより、光学系の構成を簡素化することができる。
　本技術において、撮像光学系の光軸方向と照射光学系の光軸方向及び／又は光検出系の光軸方向とは略同一であってよい。これについて、以下で図２を参照しながら、さらに説明する。
　図２に示される光学系３５０において、撮像光学系の光軸方向（特には流路を拡大して撮像素子３７１により撮像させるための対物レンズ３５９の光軸方向）が、流路に照射されるレーザ光の光軸方向と略同一である。このように、本技術の微小粒子分析装置において、微小粒子に対して照射されるレーザ光の光軸の方向は、撮像光学系の光軸方向と略同一であってよい。
　また、図２に示される光学系３５０において、撮像光学系の光軸方向（特には流路を拡大して撮像素子３７１により撮像させるための対物レンズ３５９の光軸方向）が、流路にへのレーザ光により生じた蛍光及び後方散乱光が通過する対物レンズ３５６の光軸方向と略同一である。このように、本技術の微小粒子分析装置において、微小粒子へのレーザ光の照射により生じた蛍光及び／又は散乱光（特には後方散乱光）が通過する対物レンズの光軸方向と、撮像光学系の光軸方向（特には撮像光学系のうち流路を拡大して撮像装置に撮像させるための対物レンズの光軸方向）とが、略同一であってよい。
　また、図２に示される光学系３５０において、撮像光学系の光軸方向（特には流路を拡大して撮像素子３７１により撮像させるための対物レンズ３５９の光軸方向）が、流路にへのレーザ光により生じた前方散乱光が通過する対物レンズ３５９の光軸方向と略同一である。このように、本技術の微小粒子分析装置において、微小粒子へのレーザ光の照射により生じた蛍光及び／又は散乱光（特には前方散乱光）が通過する対物レンズの光軸方向と、撮像光学系の光軸方向（特には撮像光学系のうち流路を拡大して撮像装置に撮像させるための対物レンズの光軸方向）とが、略同一であってよい。
　撮像素子３７１による検出領域１５６の撮像が行われる場合において、シャッター３５５が閉じられていてよい。これにより、ミラー３５２及び３５４、蛍光検出器３５７、散乱光検出器３５８－３、及びレーザ光生成部３５１などに起因する光が、撮像に影響することを防ぐことができる。
　図２に示されるとおり、照明装置３７０及び撮像素子３７１は、例えば落射照明方式、特には同軸落射照明方式により流路の画像を得るように構成されていてよい。
　本技術において、当該流路の画像を得ることができれば、他の照明方式であってよく、例えば透過照明方式又は側射照明方式が採用されてもよく、特には透過照明方式が採用されうる。
　透過照明方式を採用する場合、例えば、レーザ光生成部３５１により合成されたレーザ光が、照明光として用いられてよい。当該レーザ光を照明光として用いるために、例えば、当該レーザ光を拡散させる拡散板が照明光の光路上に設けられていてよい。当該拡散板は、例えばミラー３５４と対物レンズ３５６との間に配置されうる。当該拡散板は、前記撮像光学系による撮像が行われる場合にだけ前記光路上に配置されるように、移動可能に構成されていてよい。
　また、透過照明方式を採用する場合、照明用光源と当該照明用光源に接続された光ファイバとの組合せが用いられてもよい。当該光ファイバから出射した光が、照明光として用いられうる。当該光ファイバは、例えば、当該光ファイバから出射する光が、蛍光検出器３５７により検出される蛍光の光路の少なくとも一部を通って微小粒子分取用マイクロチップ１５０に到達するように配置されうる。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、対物レンズ３５９の光軸方向に当該マイクロチップ移動させることができるステージ３７４に取り付けられうる。ステージ３７４は、例えば制御部１０３によって、その光軸方向の移動が制御されうる。このように、ステージ３７４が前記撮像光学系の一部を構成するものであってよい。
（２－５）微小粒子分取用マイクロチップ及び微小粒子
　本技術において、「マイクロ」とは、微小粒子分取用マイクロチップに含まれる流路の少なくとも一部が、μｍオーダの寸法を有すること、特にはμｍオーダの横断面寸法を有することを意味する。すなわち、本技術において、「マイクロチップ」とは、μｍオーダの流路を含むチップ、特にはμｍオーダの横断面寸法を有する流路を含むチップをいう。例えば、μｍオーダの横断面寸法を有する流路から構成されている粒子分取部を含むチップが、本技術に従うマイクロチップと呼ばれうる。例えば、粒子分取部１５７のうち、合流流路１５５の横断面は例えば矩形であり、合流流路１５５の幅は、粒子分取部１５７内において例えば１００μｍ～５００μｍであり、特には１００μｍ～３００μｍでありうる。合流流路１５５から分岐する分岐流路の幅は、合流流路１５５の幅よりも小さくてよい。接続流路１７０の横断面は例えば円形であり、接続流路１７０と合流流路１５５との接続部における接続流路１７０の直径は例えば１０μｍ～６０μｍ、特には２０μｍ～５０μｍでありうる。流路に関するこれらの寸法は、微小粒子のサイズ、特には回収対象粒子のサイズに応じて適宜変更されてよい。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、当技術分野で既知の方法により製造されうる。例えば、当該生体粒子分取用マイクロチップ１５０は、所定の流路が形成された２枚以上の基板を貼り合わせることにより製造することができる。流路は、例えば２枚以上の基板（特には２枚の基板）の全てに形成されていてもよく、又は、２枚以上の基板の一部の基板（特には２枚の基板のうちの一枚）にのみ形成されていてもよい。基板を貼り合わせる時の位置の調整をより容易にするために、流路は、一枚の基板にのみ形成されていることが好ましい。例えば、図１において点線と実線で示されるように、２つの流路が、光軸方向の異なる位置で（互いに連通しないように）且つ光軸方向から見た場合に交差するように設けられている流路構造は、流路が設けられた３枚以上の基板を積層することによって作成することができる。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０を形成する材料として、当技術分野で既知の材料が用いられうる。例えば、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリプロピレン、ＰＤＭＳ（polydimethylsiloxane）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリエチレン、ポリスチレン、ガラス、及びシリコンが挙げられるがこれらに限定されない。特に、加工性に優れており且つ成形装置を使用して安価にマイクロチップを製造することができることから、例えばポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、及びポリプロピレンなどの高分子材料が特に好ましい。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、好ましくは透明である。例えば、微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、少なくとも光（レーザ光及び散乱光）が通過する部分が透明であり、例えば検出領域が透明でありうる。微小粒子分取用マイクロチップ１５０全体が透明であってもよい。
　なお、以上では、使い捨て可能な微小粒子分取用マイクロチップ１５０に上記流路群が形成されている実施態様を説明したが、本技術において、上記流路群はマイクロチップ１５０に形成されていなくてもよい。例えば、上記流路群は、例えばプラスチック又はガラスなどの基板内に形成されてもよい。また、上記流路群は、２次元的又は３次元的な構造を有していてもよい。
　本技術において、微小粒子は、微小粒子分取用マイクロチップ中の流路内を流れることができる寸法を有する粒子であってよい。本技術において、微小粒子は当業者により適宜選択されてよい。本技術において、微小粒子には、細胞、細胞塊、微生物、及びリポソームなどの生物学的微小粒子、並びに、ゲル粒子、ビーズ、ラテックス粒子、ポリマー粒子、及び工業用粒子などの合成微小粒子などが包含されうる。
　生物学的微小粒子（生体粒子ともいう）には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれうる。細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれうる。細胞は、特には血液系細胞又は組織系細胞でありうる。前記血液系細胞は、例えばＴ細胞及びＢ細胞などの浮遊系細胞であってよい。前記組織系細胞は、例えば接着系の培養細胞又は組織からばらされた接着系細胞などであってよい。細胞塊には、例えばスフェロイド及びオルガノイドなどが含まれうる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれうる。さらに、生物学的微小粒子には、核酸、タンパク質、これらの複合体などの生物学的高分子も包含されうる。これら生物学的高分子は、例えば細胞から抽出されたものであってよく又は血液サンプル若しくは他の液状サンプルに含まれるものであってもよい。
　合成微小粒子は、例えば有機若しくは無機高分子材料又は金属などからなる微小粒子でありうる。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、及びポリメチルメタクリレートなどが含まれうる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、及び磁性体材料などが含まれうる。金属には、金コロイド及びアルミなどが含まれうる。前記合成微小粒子は、例えばゲル粒子又はビーズなどであってよく、より特にはオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、及び酵素から選ばれる１つ又は２つ以上の組合せが結合されたゲル粒子又はビーズであってよい。
　微小粒子の形状は、球形若しくは略球形であってよく、又は非球形であってもよい。微小粒子の大きさ及び質量は、マイクロチップの流路のサイズによって当業者により適宜選択されうる。他方で、マイクロチップの流路のサイズも、微小粒子の大きさ及び質量によって適宜選択されうる。本技術において、微小粒子には、必要に応じて化学的又は生物学的な標識、例えば蛍光色素又は蛍光タンパクなど、が取り付けられうる。当該標識によって、当該微小粒子の検出がより容易になりうる。取り付けられるべき標識は、当業者により適宜選択されうる。当該標識には、微小粒子に特異的に反応する分子（例えば抗体、アプタマー、ＤＮＡ、又はＲＮＡなど）が結合しうる。
　本技術の一つの実施態様に従い、前記微小粒子は生体粒子であり、特には細胞でありうる。
（３）本技術の位置調整方法に含まれる工程
　本技術の位置調整方法のフロー図の一例を図８に示す。図８に示されるとおり、本技術の位置調整方法は、撮像工程Ｓ２０１、移動工程Ｓ２０２、及び位置関係調整工程Ｓ２０３を含む。以下で、各工程について説明する。
　なお、本技術の位置調整方法の対象となる流路は、液体によって満たされていてよく又は液体によって満たされていなくてもよい（空であってもよい）。液体によって満たされた流路に対して本技術の位置調整方法が適用される場面の例として、当該流路のプライミング処理時を挙げることができる。例えば微小粒子分取用マイクロチップが初めて使用される場合は、当該チップは、例えば流路内の気泡残留を防ぐために、流路内に液体を通流させるプライミング処理が行われ、そして、その後微小粒子分取操作が行われる。流路のプライミング処理時に、本技術の位置調整方法が行われてもよい。これにより、プライミング処理と位置調整とを同時に実行されるので、微小粒子分取処理前の調整処理に要する時間を短縮することができる。
（３－１）撮像工程
　図２に示されるとおりに、微小粒子分取用マイクロチップ１５０が、ステージ３７４に取り付けられている。微小粒子分取用マイクロチップ１５０の合流流路１５５のうち検出領域１５６中にある流路部分、特には上記のとおりに合成されたレーザ光が照射される流路部分が、対物レンズ３５９を介して撮像素子３７１によって撮像可能であるように、微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、ステージ３７４に取り付けられる。
　ステージ３７４は、対物レンズ３５９の光軸方向（ｚ軸方向）に移動することができるように構成されている。前記光軸方向とは、例えば撮像工程における撮像のフォーカス方向であるということができ、また、対物レンズ３５９の光軸の方向と同一の方向ということもできる。図２においては、ｚ方向として示されている方向が、光軸方向である。
　撮像工程における当該光軸方向は、微小粒子分取用マイクロチップ１５０の検出領域１５６に照射されるレーザ光の光軸の方向と略同一である。
　また、ステージ３７４は、合流流路１５５の幅方向（ｘ軸方向）及び合流流路の軸方向（ｙ軸方向）にも移動可能であるように構成されている。
　ステージ３７４の移動によって、ステージ３７４に取り付けられた微小粒子分取用マイクロチップ１５０及び当該チップに含まれる流路（例えば合流流路１５５）も移動する。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０がステージ３７４に取り付けられた後に、ステージ３７４は、原点復帰されうる。当該原点は、微小粒子分析装置１００に関して予め設定されている位置である。そして、ステージ３７４は原点へと移動された後に、光軸方向における測定開始点へ移動される。
　撮像工程Ｓ２０１において、ステージ３７４が前記測定開始点から光軸方向に移動されることによって、合流流路１５５も移動される。当該移動は、ステージ３７４が測定終了点に到達したら終了される。前記測定開始点及び前記測定終了点は、微小粒子分析装置１００の構成に応じて、当業者により適宜設定されてよい。当該移動は、制御部１０３によって制御されてよく、制御部１０３が、ステージ３７４を光軸方向に移動させうる。
　撮像工程Ｓ２０１において、前記測定開始点から前記測定終了点までのステージ３７４の光軸方向の移動の間に、撮像素子３７１が、当該光軸方向の複数の位置で、前記流路部分を撮像する。
　ステージ３７４は、例えば１μｍ～３００μｍ、特には１．５μｍ～２００μｍずつ、より特には２μｍ～１５０μｍずつ、当該光軸方向に移動されうる。各移動後の位置で前記流路部分が撮像されうる。すなわち、撮像される位置の間隔がこの数値範囲内にあってよい。
　得られた複数の画像は、制御部１０３（特には移動制御部１０８）に送信されうる。当該複数の画像は、例えば、撮像素子３７１に接続された記憶部（図示されていない）に格納され、そして、制御部１０３が、当該記憶部に格納されている当該複数の画像を取得してもよい。
（３－２）移動工程
　移動制御部１０８が、撮像工程において得られた複数の画像それぞれについてのフォーカス指標を算出する。これにより、複数のフォーカス指標が得られる。本明細書内において、フォーカス指標とは、微小粒子が通流可能な流路にピントが合っているかを示す指標を意味しうる。
　本技術の好ましい実施態様において、前記フォーカス指標は、オートフォーカス関数を用いて取得されるフォーカス指標である。移動制御部１０８は、前記オートフォーカス関数を用いて、前記撮像工程において取得された複数の画像のそれぞれについてフォーカス指標を取得しうる。前記オートフォーカス関数は、好ましくは、画像差分に基づく関数、グレーレベル画像における山及び谷の深さに基づく関数、画像コントラストに基づく関数、ヒストグラムに基づく関数、又は、相関尺度に基づく関数のうちのいずれかであってよい。例えば、以下の式（１）～（１３）に示される関数のうちのいずれか一つが、オートフォーカス関数として用いられてよく、特に好ましくは以下の式（１）～（３）のうちのいずれか一つがオートフォーカス関数として用いられうる。これらの式の詳細は、例えば、A. Santos et al., Evaluation of autofocus functions in molecular cytogenetic analysis, Journal of Microscopy, Vol. 188, Pt3, December (1997)に記載されている。
　前記画像差分に基づく関数の例として、例えば以下の式（１）～（４）により表される関数を挙げることができる。特に好ましくは、
式（１）：閾値以上の勾配絶対値に基づく関数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 　式（１）において、ｇ（ｉ，ｊ）は、ピクセル（ｉ，ｊ）のグレーレベル輝度（grey level intensity）であり、且つ、ｖは勾配閾値である。例えばｖは０であってよい。
式（２）：二乗勾配に基づく関数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 　式（２）において、ｇ（ｉ，ｊ）は、ピクセル（ｉ，ｊ）のグレーレベル輝度（grey level intensity）であり、且つ、ｖは勾配閾値である。例えばｖは０であってよい。
式（３）：ブレナー関数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 　式（３）において、ｇ（ｉ，ｊ）は、ピクセル（ｉ，ｊ）のグレーレベル輝度（grey level intensity）であり、且つ、ｖは勾配閾値である。例えばｖは０であってよい。
式（４）：閾値以上の勾配絶対値に基づく関数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 　式（４）において、Ｔ［ｇ（ｉ，ｊ）］は、ピクセル（ｉ，ｊ）の勾配値の二乗であり、且つ、Ｇｘ（ｉ，ｊ）及びＧｙ（ｉ，ｊ）は、Ｓｏｂｅｌオペレータによる画像のコンボリューションである。
　前記グレーレベル画像における山及び谷の深さに基づく関数の例として、例えば以下の式（５）～（７）により表される関数を挙げることができる。
式（５）：閾値以上の画像含有量に基づく関数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
 　式（５）において、Θは輝度閾値である。
式（６）：Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｅｄ　ｐｉｘｅｌ　ｃｏｕｎｔ関数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
式（７）：Ｉｍａｇｅ　ｐｏｗｅｒ関数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
　前記画像コントラストに基づく関数の例として、例えば以下の式（８）～（９）により表される関数を挙げることができる。
式（８）：偏差に基づく関数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
式（９）：正規化偏差に基づく関数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　前記ヒストグラムに基づく関数の例として、例えば以下の式（１０）～（１１）により表される関数を挙げることができる。
式（１０）：範囲に基づく関数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
（１１）エントロピーに基づく関数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
　前記画像コントラストに基づく関数の例として、例えば以下の式（１２）～（１３）により表される関数を挙げることができる。
式（１２）：ＶｏｌｌａｔｈのＦ４関数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
式（１３）：ＶｏｌｌａｔｈのＦ５関数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000013
　特に好ましくは、前記オートフォーカス関数は、画像差分に基づく関数である。画像差分に基づく関数は、フォーカス指標の取得のし易さの観点から好ましい。また、画像差分に基づく関数は、後述する最大又は最小のフォーカス指標を取得するためにも好ましい。より好ましくは、前記オートフォーカス関数は、ブレナー関数である。
　前記移動工程において、取得された複数のフォーカス指標に基づき、前記流路を前記光軸方向（例えば図２におけるｚ軸方向）に移動させる。例えば、移動制御部１０８がステージ３７４の位置を移動させることによって、当該移動が行われてよい。例えば、移動制御部１０８は、当該フォーカス指標に基づき、１つの画像を特定し、そして、当該画像が撮像された位置へ前記流路を移動させうる。前記移動工程における流路の移動は、撮像工程における流路の移動と同じく、ステージ３７４の移動による移動であってよい。
　本技術の一つの実施態様に従い、前記移動工程は、前記取得された複数のフォーカス指標から、所定の基準を満たすフォーカス指標を与える画像を特定する画像特定工程を含みうる。そして、前記移動工程において、前記画像特定工程において特定された画像が撮像された位置へ、前記流路が移動されうる。当該画像の特定は、例えば移動制御部１０８により行われうる。当該所定の基準として、例えば最大若しくは最小のフォーカス指標を与える画像であるか、又は、所定の数値範囲にあるフォーカス指標（特には所定の値以上若しくは所定の値以下のフォーカス指標）を与える画像であるかなどが採用されてよい。
　例えばオートフォーカス関数を用いて得られる値自体がフォーカス指標として採用される場合、最大のフォーカス指標を与える画像又は所定の値以上のフォーカス指標を与えるが画像が当該画像特定工程において特定されうる。複数のフォーカス指標を光軸方向の位置に対してプロットしたグラフの例を図９に示す。図９に示されるグラフは、式（１）～（３）に示されるオートフォーカス関数を用いて得られた値自体の光軸方向の撮像位置に対するプロットである。当該値自体がフォーカス指標として用いられる。図９に示されるとおり、フォーカス指標が最大となる位置を特定することができ、当該位置での画像が、最大のフォーカス指標を与える画像の撮像位置として特定される。
　代替的には、オートフォーカス関数を用いて得られる値の逆数がフォーカス指標として採用される場合、最小のフォーカス指標を与える画像又は所定の値以下のフォーカス指標を与える画像が当該画像特定工程において特定されうる。複数のフォーカス指標を光軸方向の位置に対してプロットしたグラフの例を図１０に示す。図１０に示されるグラフは、式（１）～（３）に示されるオートフォーカス関数を用いて得られた値の逆数の光軸方向の撮像位置に対するプロットである。当該逆数がフォーカス指標として用いられる。図１０に示されるとおり、フォーカス指標が最小となる位置を特定することができ、当該位置での画像が、最小のフォーカス指標を与える画像の撮像位置として特定される。
　特に好ましくは、前記移動工程が、前記取得された複数のフォーカス指標から、最大又は最小のフォーカス指標を与える画像を特定する画像特定工程を含む。そして、前記移動工程において、前記画像特定工程において特定された画像が撮像された位置へ、前記流路が移動されうる。
（３－３）調整工程
　位置関係調整部１０９が、前記移動工程における移動後の位置にある前記流路の画像から、前記流路の特徴位置を特定する。そして、位置関係調整部１０９は、前記光軸方向に対して垂直な方向における、前記特徴位置と基準位置との位置関係を調整する。当該位置関係は、例えば前記流路の幅方向及び／又は前記流路の軸方向における位置関係であってよく、特には前記流路の幅方向における位置関係である。
（３－３－１）特徴位置
　前記特徴位置は、例えば前記流路内に流される微小粒子が通過することが望ましい位置である。前記特徴位置のより具体的な例は、前記流路の幅方向における略中心位置である。前記流路の幅方向は、前記光軸方向に対して垂直であり且つ前記流路の軸方向（又は前記微小粒子の通流方向）に対して垂直である方向である。例えば図１１の左に示される流路Ｐに関して、ｘ軸方向が幅方向に相当する。この図において、ｙ軸方向が、流路の軸方向に相当する。
　位置関係調整部１０９は、前記特徴位置を、例えば前記流路を規定する壁の位置に基づき特定しうる。当該壁の位置は、前記移動工程において特定された画像から特定されうる。前記移動工程において特定された画像は、例えば最大のフォーカス指標を与える画像であり、流路へのピント調節の観点から好ましい画像である。そのため、前記移動工程において特定された画像は、前記流路を規定する壁の位置を正確に特定するために適している。
　流路の幅方向における２つの壁の位置が、前記特徴位置を特定するために用いられうる。例えば流路の横断面が円形又は矩形である場合、流路の横断面の形状は、流路の軸に対して対称である。そのため、前記２つの壁の位置の中心が、前記特徴位置として特定されうる。このように、本技術において、前記特徴位置は、例えば前記流路の幅方向における略中心位置であってよい。
　位置関係調整部１０９による特徴位置の特定の仕方の例を以下で図１１を参照しながら説明する。
　図１１の左の画像に示されるとおり、流路Ｐの２つの壁Ｗ１及びＷ２が確認できる。
　位置関係調整部１０９は、ｘ軸方向の位置ｘ１における画素値を、ｙ軸方向の位置ｙ１からｙ２にわたって取得する。位置関係調整部１０９は、取得された複数の画素値を平均して、位置ｘ１における平均画素値を得る。位置関係調整部１０９は、ｘ軸方向における他の位置についても同様に、平均画素値を取得する。当該平均画素値が取得されるｘ軸方向の位置は、壁Ｗ１及びＷ２をｘ軸方向に横切るように設定される。例えば、図１１に示されるｘ１からｘ２までの各位置の平均画素値が取得される。
　ｘ１からｘ２までの各位置の平均画素値を、ｘ軸方向の位置に対してプロットすると、図１１の右に示されるとおりのグラフが得られる。当該グラフから、２つの谷を確認することができる。これら２つの谷の底に対応するｘ軸方向の位置Ｖ１及びＶ２（各谷において平均画素値が最小となるｘ軸方向の位置）が、壁Ｗ１及びＷ２のｘ軸方向における位置に相当する。Ｖ１及びＶ２の中心Ｃが、流路Ｐの幅方向における略中心位置に相当する。
　位置関係調整部１０９は、当該略中心位置を、前記取得された平均画素値に基づき特徴位置として特定しうる。具体的には、位置関係調整部１０９は、例えば、流路Ｐの軸の両側のそれぞれにおいて平均画素値が最小となるｘ軸方向の位置を特定する。位置関係調整部１０９は、これにより特定されたｘ軸方向の２つの位置の中心を特徴位置として特定しうる。
　以上で述べたように、位置関係調整部１０９は、前記移動工程における移動後の位置にある前記流路の画像の画素値に基づき、特徴位置を特定しうる。好ましくは、位置関係調整部１０９は、より具体的には、前記流路の画像の平均画素値（特にはｘ軸方向（幅方向）の各位置について取得された平均画素値）に基づき特徴位置を特定しうる。
　なお、平均画素値の代わりに、ｘ軸方向（幅方向）の各位置について積算された画素値が用いられてよく、又は、ｙ軸方向の或る１点におけるｘ軸方向（幅方向）の各位置における画素値が用いられてもよい。
　特徴位置の特定が行われる画像は、グレースケール画像であってよく又はカラー画像であってもよい。前記画素値は、グレースケール画像における画素値又はカラー画像における画素値でありうる。前記画像がカラー画像である場合は、前記画素値は、例えばＲ要素、Ｇ要素、及びＢ要素のうちのいずれか一つの要素についての画素値であってよい。
（３－３－２）基準位置
　前記基準位置は、微小粒子への光の照射の観点から、前記特徴位置と一致することが求められる位置であってよい。例えば、前記基準位置は、前記流路を流れる微小粒子に照射される光が通過する位置であり、特には例えば前記流路を流れる微小粒子に照射されるレーザ光の光軸通過位置である。前記基準位置は、例えば微小粒子分析装置の光学系の構造及びレーザ光の形状などの要因に応じて、予め決定されていてよい。
　前記基準位置は、例えば、基準となる微小粒子分取用マイクロチップを用意し、当該チップに微小粒子（ビーズなど）を流して散乱光及び／又は蛍光の信号測定を行い、これらの信号が最良となる位置が基準位置として採用されてよい。
　また、レーザ光の照射位置を、前記撮像光学系によって特定することができるので、当該照射位置（例えばレーザ光の中心位置）が、基準位置として採用されてもよい。
（３－３－３）位置関係の調整
　前記調整工程において、位置関係調整部１０９は、前記特徴位置と前記基準位置との位置関係を調整し、より好ましくは前記流路の幅方向における位置関係を調整する。
　本技術の一つの実施態様において、前記調整工程において、前記流路が、当該流路のｘ軸方向（幅方向）に移動されうる。これにより、前記特徴位置と前記基準位置との幅方向における位置関係が調整されうる。例えば、前記特徴位置が、前記基準位置に一致するように、前記流路が幅方向に移動されうる。位置関係調整部１０９は、例えば、前記流路の当該移動を実現するために、例えば前記流路を有する微小粒子分取用マイクロチップが保持されているステージの移動を駆動しうる。
　本技術の他の実施態様において、前記調整工程において、前記レーザ光の照射位置が調整されてもよい。この実施態様において、前記流路は、例えば、当該流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射し、当該照射により生じた光に基づき前記微小粒子の分析を行うために用いられるものでありうる。位置関係調整部１０９は、例えば、前記照射位置の調整を実現するために、例えば前記レーザ光を照射するための光学系を構成する光学部品の位置又は向きを調整しうる。
（３－３－４）調整工程の前に移動工程を行うことの利点
　以下で、前記調整工程の前に前記移動工程を行うことの利点を、図１８を参照しながら説明する。
　図１８の上部に、流路をｚ軸方向に移動させながら流路を撮像光学系により撮像して得られた画像が示されている。これら画像の上部に示されているｚは、移動のstep数であり、すなわち、これらの画像は、ｚ軸上の或る位置を０として、ｚ軸方向に４０step、８０step、１２０step、１６０step、２００step、及び２４０step、並びに、－４０step、－８０step、－１２０step、－１６０step、－２００step、及び－２４０stepだけ移動させた位置にある流路の画像である。１stepは約２．５μｍである。これらの画像のうち、位置０における画像が、最もピントが合っている画像である。
　図１８の下部に示されるプロットは、ｚが－２４０step、－１２０step、０、１２０step、及び－２４０stepである位置のそれぞれにおける画像から、上記「（３－３－１）特徴位置」において図１１を参照して説明したように作成された、ｘ軸方向の位置に対する平均画素値のプロットである。これらプロットから分かるとおり、ｚ＝０の場合、すなわち最もピントが合っている画像において、平均画素値の谷が最も鋭い。そのため、ｚ＝０の場合において、これらの谷において平均画素値が最小となる位置が、最も特定しやすい。このように、前記移動工程を行うことによって、前記調整工程において特徴位置を特定しやすくなる。
（４）追加位置調整工程
　本技術の位置調整方法は、さらに、前記流路を流れる微小粒子（例えばビーズなど）に対してレーザ光を照射し、当該照射により生じた光に基づき前記流路の位置をさらに調整する追加位置調整工程を含んでもよい。当該追加位置調整工程は、上記「（３－３）調整工程」において述べた調整工程後に行われる。当該追加位置調整工程を行うことによって、流路の位置をより適切な位置に移動させることができる。当該追加位置調整工程を含む本技術の位置調整方法のフロー図の一例を図１７に示す。
　図１７のうち、撮像工程Ｓ２０１、移動工程Ｓ２０２、及び位置関係調整工程Ｓ２０３は、上記（３）において説明したとおりであるので、その説明は省略する。位置関係調整工程Ｓ２０３の後に、前記追加位置調整工程が行われる。前記追加位置調整工程は、図１７に示されるとおり、第１微調整工程Ｓ３００及び第２微調整工程Ｓ４００を含みうる。第１微調整工程Ｓ３００及び第２微調整工程Ｓ４００は、特開第２０１６－１９１７１５号公報における第１微調整ステップＳ２２及び第２微調整ステップＳ２３に相当するものである。そのため、これら工程に関連する技術的事項について、当該公報を参照されたい。以下では、これら工程の概要を説明する。
（４－１）第１微調整工程
図１２は、第１微調整工程Ｓ３００における制御を説明するための図である。第１微調整工程Ｓ３００は、例えば、図１７に示されるとおり、直線状信号取得工程Ｓ３０１、一次元分布パラメータ推定工程Ｓ３０２、及び、最大位置移動工程Ｓ３０３を含みうる。各工程について説明する。
（４－１－１）直線状信号取得工程Ｓ３０１
　直線状信号取得工程Ｓ３０１では、上記「（３－３）調整工程」における位置関係調整後の前記特徴位置（図１２において符号Ｐ１により示されている）を中心にして、前記流路の幅方向（ｘ軸方向）に配列した複数の検出位置ｄ２２からの蛍光又は散乱光の検出が行われる（図１２Ａ）。検出される間隔Ｗ２２及び検出位置ｄ２２の配列数は適宜設定され得る。図１２Ａでは、特徴位置Ｐ１を中心として、ｘ軸方向に検出位置ｄ２２が１９個配列される場合を例に示した。
　蛍光又は散乱光の検出は、一つの検出位置ｄ２２について一定時間行われうる。一定時間に検出された蛍光又は散乱光は積算されて電気信号に変換され制御部１０３に出力される。蛍光又は散乱光の検出は、レーザ光をｘ軸方向及びｚ軸方向に走査して各検出位置ｄ２２に順次照射して、発生する蛍光又は散乱光を検出することによって行われうる。あるいは、レーザ光の照射により各検出位置ｄ２２から蛍光をエリア撮像素子によって一括検出してもよい。
（４－１－２）一次元分布パラメータ推定工程Ｓ３０２
　一次元分布パラメータ推定工程Ｓ３０２では、制御部１０は、各検出位置ｄ２２と蛍光の検出強度の積算値又は平均値の関係がメモリ等に記憶された一次元の分布に従うと仮定する。例えば、図１２Ｂに示す検出強度のデータが得られた場合には、制御部１０３は、一次元の分布をＮ次多項式モデルとし、最小二乗法に基づいて最大値を算出することができる。一次元の分布を正規分布とするよりも、Ｎ次多項式モデルとすることで、前記流路を用いて微小粒子の分析を行う装置を構成する各部品の設計ばらつき等による光学プロファイルの分布のばらつきに精度よく対応させることができる。
　また、一次元分布パラメータ推定工程Ｓ３０２における推定に用いられる値は、上記積算値及び平均値に限られない。当該推定に用いられる値として、例えば、検出強度の中央値(median)又はイベント数（特には一定時間中に流れた微小粒子の数）が用いられてもよい。
　ここで、分布をＮ次多項式モデルとする場合、次数については、高い程精度が上がる一方で、高すぎると各検出位置ｄ２２の検出強度の誤差による影響を受けやすくなるため、例えば、４次とすることが好ましい。
（４－１－３）最大位値移動工程Ｓ３０３
　最大位値移動工程Ｓ３０３では、制御部１０３は、一次元パラメータ推定工程Ｓ３０２で仮定された一次元の分布において、検出強度の積算値又は平均値がより大きな、好ましくは最大値となる位置Ｐ２への移動信号を制御部１０３に出力する。これにより、図１２Ｃに示すように、制御部１０３は、前記特徴位置Ｐ１が位置Ｐ２に移動するように、微小粒子分取用マイクロチップ１５０を移動させる。なお、図１２Ｃに示す位置Ｐ２は、検出位置ｄ２２上にある場合を例に示したが、位置Ｐ２は、２つの検出位置ｄ２２の間にあってもよい。
　このように、第１微調整工程Ｓ３００では、前記調整工程後の流路の位置をさらにより精度よく調整することができる。特に、マイクロチップ１５０の位置調整は、一方向に配列した検出位置ｄ２２の検出強度に基づいて行われる。そのため、複数方向に、例えば、格子状に配列した検出位置の強度に基づいて位置調整を行うよりも、検出するデータ数を少なくすることができる。従って、検出位置ｄ２２の間隔を狭くすることで、配列数を増やし、データの精度を上げても、二次元でデータを取得する場合と比較してデータ検出時間の増大を抑制することができる。
（４－２）第２微調整工程
　図１３は、第２微調整工程Ｓ４００における制御を説明するための図である。第２微調整工程Ｓ４００は、例えば図１７に示されるとおり、直線状信号取得工程Ｓ４０１、一次元パラメータ推定工程Ｓ４０２、及び、最大位置移動工程Ｓ４０３を含む。
　図１３Ａ～Ｃに示すように、本ステップＳ２３における制御は、図１２Ａ～Ｃを参照しながら説明した第１微調整工程Ｓ３００における制御と比べ、ｘ軸方向に配列した検出位置ｄ２２の検出強度に基づいて位置Ｐ１からＰ２に特徴位置Ｐ１をｘ軸方向に移動させる代わりに、位置Ｐ２を中心にｚ軸方向に配列した検出位置ｄ２３の検出強度に基づいて位置Ｐ２からＰ３に特徴位置Ｐ１をｚ軸方向に移動させる点以外は、実質的に同様である。そのため、ここでは、その説明は省略する。
　以上の説明では、第１微調整工程Ｓ３００においてｘ軸方向（流路の幅方向）で位置調整をし、そして、第２微調整工程Ｓ４００においてｚ軸方向（光軸方向）で位置調整をする。追加位置調整工程に関して、第１微調整工程Ｓ３００においてｚ軸方向で位置調整をし、そして、第２微調整工程Ｓ４００においてｘ軸方向で位置調整が行われてもよい。
　上記で述べたとおり、第１微調整工程Ｓ３００の直線状信号取得工程Ｓ３０１では、上記「（３－３）調整工程」における調整後の前記特徴位置を中心にして、前記流路の幅方向（ｘ軸方向）に配列した複数の検出位置ｄ２２からの蛍光又は散乱光の検出が行われる。ここで、当該中心は、ｚ軸方向にシフトされていてもよい。例えば、前記フォーカス指標が最大となるｚ方向における位置から、微小粒子（例えばビーズなど）からの信号が最大となるｚ方向における位置までシフトされていてよい。
　例えば、前記移動工程においてフォーカス指標が最大となるｚ方向における位置は、流路の壁（例えば壁面）又は角など、流路の構造に関する画像情報に基づき特定された位置である。一方で、微小粒子分取操作において微小粒子（例えば細胞又はビーズなど）が流れる位置は流路の中心でありうる。そのため、フォーカス指標が最大となるｚ方向における前記位置と前記流路の中心との間にオフセットが生じうる。例えば、図１９に示されるとおり、オートフォーカス関数に基づき取得されたフォーカス指標のｚ軸方向におけるプロットＳ２に関して最大値が得られるｚ軸方向の位置は、微小粒子への光照射により生じた光のシグナルのｚ軸方向におけるプロットＳ１の最大値が得られるｚ軸方向の位置と、相違しうる。そこで、直線状信号取得工程Ｓ３０１において中心として採用される位置は、このような相違の分だけ前記特徴位置からｚ軸方向にシフトさせた位置を中心にしてｘ軸方向に配列された複数の検出位置ｄ２２からの蛍光又は散乱光の検出が行われてよい。
　このようなシフトを行うことによって、前記第１微調整工程において、より適切な位置へ流路が移動させることができる。
（５）本技術の位置調整方法を実行する微小粒子分析装置の他の例
　本技術の位置調整方法は、液滴を形成して微小粒子の分析及び／又は分取を行う微小粒子分析装置（例えばフローサイトメータ）により実行されてもよい。例えば、当該装置において用いられるフローセル若しくはマイクロチップ内の流路が、本技術の位置調整方法において位置調整される流路であってよい。以下では、当該装置の構成例について説明する。
　図１４に、液滴を形成して微小粒子の分析及び／又は分取を行う微小粒子分析装置１（以下「フローサイトメータ１」とも称する）の構成を説明するための模式図が示されている。また、図１５及び図１６は、フローサイトメータ１に搭載可能なマイクロチップ２の一例を示す。図１５Ａは上面模式図、ＢはＡ中Ｐ－Ｐ断面に対応する断面模式図を示す。また、図１６は、マイクロチップ２のオリフィス２１の構成を模式的に説明する図であり、Ａは上面図、Ｂは断面図、Ｃは正面図を示す。図１６Ｂは、図１５Ａ中Ｐ－Ｐ断面に対応する。
（５－１）照射検出部
フローサイトメータ１は、マイクロチップ２にレーザＬ１を照射する光源６１と、レーザＬ１の照射により発生する検出対象光を検出する検出器６２とを含んでなる照射検出部を備える。マイクロチップ２に対するレーザＬ１の照射方向（レーザＬ１の光軸）を図１中Ｚ軸正方向で示す。光源６１は、ＬＤ、ＬＥＤなどであってよい。
レーザＬ１は、マイクロチップ２のサンプル流路２２を通流する細胞に照射される。検出器６２は、細胞によるレーザＬ１の散乱光、及び、細胞又は細胞に標識された蛍光色素がレーザＬ１により励起されて生じる蛍光を検出する。図１４中、サンプル流路２２を通流する細胞から発生する蛍光を符合Ｆ１で示す。
照射検出部は、光源６１から出射されたレーザＬ１を細胞に導光して集光するための集光レンズやダイクロイックミラー、バンドパスフィルター等からなる照射系を含む。また、照射検出部は、レーザＬ１の照射によって細胞から発生する検出対象光を集光して検出器６２に導光する検出系によって構成される。検出系は、例えば、ＰＭＴ（photo multiplier tube）や、ＣＣＤやＣＭＯＳ素子等のエリア撮像素子などによって構成される。
照射検出部の検出系により検出される検出対象光は、レーザＬ１の照射によって細胞から発生する光であって、例えば、前方散乱光や側方散乱光、レイリー散乱やミー散乱等の散乱光や蛍光などとすることができる。蛍光は、細胞又は細胞に標識された蛍光色素から発生するものであってよい。これらの検出対象光は電気信号に変換され、細胞の光学特性判定及び後述する光学位置の自動調整のために利用される。
（５－２）位置調整部
フローサイトメータ１は、照射検出部に対するマイクロチップ２の相対位置を変更する位置調整部９を備える。位置調整部９は、マイクロチップ２の位置及び／又は照射検出部の位置を、レーザＬ１の光軸に対する垂直平面（ＸＹ平面）上で移動させる。これにより、位置調整部９は、レーザＬ１の光軸に対するマイクロチップ２の位置を調整して、レーザＬ１がサンプル流路２２内の細胞の通流位置に照射されるように最適化する。
位置調整部９は、マイクロチップ２の位置、又は、光源６１及び検出器６２を含む照射検出部の位置の少なくとも一方を、Ｘ軸方向及びＹ軸方向に移動可能なものであればよい。位置調整部９は、例えばステッピングモータなどにより構成される。なお、位置調整部９は、照射検出部に対するマイクロチップ２の相対位置をＺ軸方向（レーザＬ１の焦点方向）においても移動させるものであってよい。
（５－３）振動素子
フローサイトメータ１は、マイクロチップ２に形成されたオリフィス２１に振動を印加して、オリフィス２１から排出される、細胞を含むサンプル液とシース液との層流を液滴化して吐出させる振動素子３を備える。振動素子３は、例えばピエゾ素子とできる。吐出された液滴は、流体ストリームＳとなって図中矢印Ｙ軸正方向に射出される。なお、フローサイトメータ１において、マイクロチップ２は交換可能に搭載されるものである。
フローサイトメータ１において、振動素子３は、マイクロチップ２と一体に構成されたものであってもよく、搭載されたマイクロチップ２と接触可能なように装置側に配設されたものであってもよい。
（５－４）荷電部
オリフィス２１から吐出される液滴は、荷電部４１によって正又は負の電荷を付与される。液滴のチャージは、荷電部４１と電気的に接続され、マイクロチップ２に設けられたサンプルインレット２３に挿入されている電極４２によって行われる。なお、電極４２は、マイクロチップ２のいずれかの箇所に、流路を送液されるサンプル液又はシース液に電気的に接触するように挿入されていればよいものとする。
フローサイトメータ１では、振動素子３の駆動電圧の周波数と、荷電部４１の電圧（チャージ電圧）の切り換えタイミングと、を同期させることにより、オリフィス２１から吐出される液滴の一部にプラス又はマイナスのいずれかの電荷を付与する。一部の液滴は、電荷を付与されず、チャージなしとされていてもよい。
（５－５）偏向板
さらに、フローサイトメータ１は、流体ストリームＳを挟んで対向して配置された一対の偏向板５１，５２を備える。偏向板５１，５２は、液滴に付与された電荷との間に作用する電気的な力によって流体ストリームＳ中の各液滴の進行方向を変化させる。偏向板５１，５２は、通常使用される電極であってよい。図１４中、偏光板５１，５２の対向方向をＸ軸方向によって示す。
（５－６）回収容器
偏向板５１，５２の間を通過した流体ストリームは、回収容器８１、回収容器８２又は回収容器８３のいずれかに受け入れられる。例えば、偏向板５１を正、偏向板５２を負に帯電させる場合、荷電部４１により負にチャージされた液滴は回収容器８２に、正にチャージされた液滴は回収容器８３にそれぞれ回収される。また、荷電部４１によりチャージされていない液滴は、偏向板５１，５２からの電気的な作用力を受けずに真っ直ぐ飛行し、回収容器８１に回収される。フローサイトメータ１では、各液滴に含まれる微小粒子（例えば生体粒子、特には細胞）の特性に応じて該液滴の進行方向を制御することで、所望の特性を有する目的微小粒子とそれ以外の非目的微小粒子とを別々の回収容器に回収できる。
回収容器８１，８２，８３は、実験用として汎用のプラスチック製チューブあるいはガラス製チューブであってよい。これらの回収容器は、交換可能にフローサイトメータ１に配置されるものであることが好ましい。また、回収容器のうち非目的微小粒子を受け入れるものには、回収した液滴の排液路を接続してもよい。なお、フローサイトメータ１において、配置される回収容器の数は特に限定されないものとする。回収容器を３つよりも多く配置する場合には、各液滴が、偏向板５１，５２との間の電気的な作用力の有無及びその大小によっていずれか一つの回収容器に誘導され、回収されるようにする。
（５－７）制御部等
フローサイトメータ１は、上述の構成に加え、通常のフローサイトメータが備える、細胞の光学特性判定のためのデータ解析部、サンプル液及びシース液を貯留するタンク部及びこれらの各構成を制御するための制御部１０などを備える。制御部１０は、上記（３）で説明した移動制御部１０８及び位置関係調整部１０９を含む。
制御部１０は、ＣＰＵ、メモリ及びハードディスクなどを備える汎用のコンピュータによって構成できる。制御部１０には、ハードディスク内にはＯＳに加えて、本技術の位置調整方法をフローサイトメータ１に実行させるためのプログラム及び本技術の位置調整方法後に行われる微小粒子分析操作をフローサイトメータ１に実行させるためのプログラムなどが格納されていてよい。当該プログラムは、フローサイトメータ１に備えられているハードディスクに格納されていなくてもよく、この場合、例えばｍｉｃｒｏＳＤメモリカード、ＳＤメモリカード、又はフラッシュメモリなどの記録媒体に記録されていてもよい。制御部１０が、当該プログラムに従い、本技術の位置調整方法をフローサイトメータ１に実行させうる。
制御部１０は、予め設定された領域のうち、レーザＬ１の照射によりマイクロチップから発生する光の検出強度の積算値又は平均値がより大きくなる（好ましくは最大値となる）位置であって、ばらつきが少なくなる位置への移動信号を位置調整部９に出力しうる。
（５－８）マイクロチップ
マイクロチップ２は、サンプル流路２２が形成された基板層２ａ、２ｂが貼り合わされてなる。基板層２ａ、２ｂへのサンプル流路２２の形成は、金型を用いた熱可塑性樹脂の射出成形により行うことができる。熱可塑性樹脂には、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの従来マイクロチップの材料として公知のプラスチックを採用できる。
サンプル液は、サンプルインレット２３に導入され、シースインレット２４に導入されるシース液と合流して、サンプル流路２２を送液される。シースインレット２４から導入されたシース液は、２方向に分かれて送液された後、サンプルインレット２３から導入されたサンプル液との合流部において、サンプル液を２方向から挟み込むようにしてサンプル液に合流する。これにより、合流部において、シース液層流の中央にサンプル液層流が位置された３次元層流が形成される。
符号２５は、サンプル流路２２に詰まりや気泡が生じた際に、サンプル流路２２内に負圧を加えて流れを一時的に逆流させて詰まりや気泡を解消するための吸引流路を示す。吸引流路２５の一端には、真空ポンプ等の負圧源に接続される吸引アウトレット２５１が形成され、他端は連通口２５２においてサンプル流路２２に接続している。
３次元層流は、送液方向に対する垂直断面の面積が送液方向上流から下流へ次第にあるいは段階的に小さくなるように形成された絞込部２６１（図１５参照），２６２（図１６参照）において層流幅を絞り込まれる。その後、３次元層流は、流路の一端に設けられたオリフィス２１から排出される。
サンプル流路２２の絞込部２６１と絞込部２６２との間では、細胞の特性検出が行われる。照射検出部によって、サンプル流路２２中を３次元層流の中心に一列に配列して送流される細胞に対してレーザＬ１が照射され、細胞から発生する蛍光Ｆ１及び散乱光が検出される（図１５参照）。
　本技術の位置調整方法は、サンプル流路２２のうち絞込部２６１と絞込部２６２との間の流路に対して行われてよい。
サンプル流路２２のオリフィス２１への接続部は、直線状に形成されたストレート部２７とされている。ストレート部２７は、オリフィス２１から流体ストリームＳをＹ軸正方向に真っ直ぐ射出するために機能する。
オリフィス２１から排出される３次元層流は、振動素子３１によりオリフィス２１に印加される振動によって液滴化され、流体ストリームＳとして射出される（図１４参照）。オリフィス２１は基板層２ａ、２ｂの端面方向に開口しており、その開口位置と基板層端面との間には切欠部２１１が設けられている。切欠部２１１は、オリフィス２１の開口位置と基板端面との間の基板層２ａ、２ｂを、切欠部２２１の径Ｌがオリフィス２１の開口径ｌよりも大きくなるように切り欠くことによって形成されている（図１６Ｃ参照）。切欠部２１１の径Ｌは、オリフィス２１から吐出される液滴の移動を阻害しないように、オリフィス２１の開口径ｌよりも２倍以上大きく形成することが望ましい。
（５－９）撮像光学系
　微小粒子分析装置１は、サンプル流路２２のうち絞込部２６１と絞込部２６２との間の流路を撮像する撮像光学系（図示されていない）を含む。当該撮像光学系は、上記「（２－４）光学系の構成例」において説明したように、照明装置３７０及び撮像素子３７１を含みうる。上記「（２－４）光学系の構成例」における説明が、微小粒子分析装置1に含まれる撮像光学系についても当てはまる。
２．第２の実施形態（微小粒子分析装置）
　本技術は、微小粒子が通流可能な流路を光軸方向に移動させながら、当該光軸方向における複数の位置で当該流路を撮像する撮像光学系、前記撮像光学系により撮像された複数の画像それぞれについてのフォーカス指標に基づき、前記流路を前記光軸方向に移動させる移動制御部、及び前記移動後の位置にある前記流路の画像から特定された特徴位置と基準位置との、前記光軸方向に対して垂直な方向における位置関係を調整する位置関係調整部を含む微小粒子分析装置も提供する。
　本技術の微小粒子分析装置は、前記撮像光学系、前記移動制御部、及び前記位置関係調整部を含むことによって、上記「１．第１の実施形態（位置調整方法）」において説明した位置調整方法を実行することができる。そのため、本技術の微小粒子分析装置では、微小粒子の分析のための光照射が行われる流路の位置を調整するために用いられる微小粒子の数を減らすことができる。
　本技術の微小粒子分析装置は、例えば上記「１．第１の実施形態（位置調整方法）」において説明したとおりの構成を有していてよく、その説明が本実施形態においてもあてはまる。
３．第３の実施形態（プログラム）
　本技術は、本技術の位置調整方法を微小粒子分析装置に実行させるためのプログラムも提供する。当該位置調整方法は、上記「１．第１の実施形態（位置調整方法）」において述べたとおりである。
　当該プログラムは、例えば上記「１．第１の実施形態（位置調整方法）」において説明した微小粒子分析装置１００によって、特には制御部１０３によって実現されうる。
　また、当該プログラムは、例えば上記「１．第１の実施形態（位置調整方法）」において説明した微小粒子分析装置１によって、特には制御部１０によって実現されうる。
　なお、本技術は、以下のような構成をとることもできる。
〔１〕微小粒子が通流可能な流路を光軸方向に移動させながら、当該光軸方向における複数の位置で当該流路を撮像する撮像工程、
　前記撮像工程において得られた複数の画像それぞれについてのフォーカス指標に基づき、前記流路を前記光軸方向に移動させる移動工程、及び
　前記移動工程における移動後の位置にある前記流路の画像から、前記流路の特徴位置を特定し、前記光軸方向に対して垂直な方向における、前記特徴位置と基準位置との位置関係を調整する調整工程、
　を含む位置調整方法。
〔２〕前記フォーカス指標が、前記流路にピントが合っているかを示す指標である、〔１〕に記載の位置調整方法。
〔３〕前記フォーカス指標が、オートフォーカス関数を用いて取得されるフォーカス指標である、〔１〕又は〔２〕に記載の位置調整方法。
〔４〕前記オートフォーカス関数が、画像差分に基づく関数である、〔３〕に記載の位置調整方法。
〔５〕前記オートフォーカス関数が、ブレナー関数である、〔３〕又は〔４〕に記載の位置調整方法。
〔６〕前記流路が、当該流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射し、当該照射により生じた光に基づき前記微小粒子の分析を行うために用いられるものである、〔１〕～〔５〕のいずれか一項に記載の位置調整方法。
〔７〕前記レーザ光の光軸の方向が、前記撮像工程における光軸方向と略同一である、〔６〕に記載の位置調整方法。
〔８〕前記移動工程が、前記取得された複数のフォーカス指標から、所定の基準を満たすフォーカス指標を与える画像を特定する画像特定工程を含み、
　前記移動工程において、前記画像特定工程において特定された画像が撮像された位置へ、前記流路が移動される、
　〔１〕～〔７〕のいずれか一項に記載の位置調整方法。
〔９〕前記移動工程が、前記取得された複数のフォーカス指標から、最大又は最小のフォーカス指標を与える画像を特定する画像特定工程を含み、
　前記移動工程において、前記画像特定工程において特定された画像が撮像された位置へ、前記流路が移動される、
　〔１〕～〔８〕のいずれか一項に記載の位置調整方法。
〔１０〕前記特徴位置が、前記流路を規定する壁の位置に基づき特定される、〔１〕～〔９〕のいずれか一項に記載の位置調整方法。
〔１１〕前記特徴位置が、前記流路の幅方向における略中心位置である、〔１〕～〔１０〕のいずれか一項に記載の位置調整方法。
〔１２〕前記基準位置が、前記流路を流れる微小粒子に照射されるレーザ光の光軸通過位置である、〔１〕～〔１１〕のいずれか一項に記載の位置調整方法。
〔１３〕前記位置関係が、前記流路の幅方向における位置関係である、〔１〕～〔１２〕のいずれか一項に記載の位置調整方法。
〔１４〕前記調整工程において、前記流路が、当該流路の幅方向に移動される、〔１〕～〔１３〕のいずれか一項に記載の位置調整方法。
〔１５〕前記流路が、当該流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射し、当該照射により生じた光に基づき前記微小粒子の分析を行うために用いられるものであり、
　前記調整工程において、前記レーザ光の照射位置が調整される、〔１〕～〔１４〕のいずれか一項に記載の位置調整方法。
〔１６〕前記流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射し、当該照射により生じた光に基づき前記流路の位置をさらに調整する追加位置調整工程をさらに含む、
　〔１〕～〔１５〕のいずれか一項に記載の位置調整方法。
〔１７〕前記微小粒子が生体粒子である、〔１〕～〔１６〕のいずれか一項に記載の位置調整方法。
〔１８〕微小粒子が通流可能な流路を光軸方向に移動させながら、当該光軸方向における複数の位置で当該流路を撮像する撮像光学系、
　前記撮像光学系により撮像された複数の画像それぞれについてのフォーカス指標に基づき、前記流路を前記光軸方向に移動させる移動制御部、及び
　前記移動後の位置にある前記流路の画像から特定された特徴位置と基準位置との、前記光軸方向に対して垂直な方向における位置関係を調整する位置関係調整部、
　を含む微小粒子分析装置。
〔１９〕前記微小粒子分析装置が、
　前記流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射する照射光学系、及び
　前記レーザ光の照射により生じた光を検出する光検出系
　をさらに含み、
　前記レーザ光の光軸の方向が、前記撮像光学系の光軸方向と略同一である、
　〔１８〕に記載の微小粒子分析装置。
〔２０〕前記微小粒子分析装置が、
　前記流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射する照射光学系、及び
　前記レーザ光の照射により生じた光を検出する光検出系
　をさらに含み、
　前記照射光学系及び前記光検出系のいずれか一方又は両方が、前記撮像光学系に含まれる光学部品の少なくとも一つを共有している、
　〔１８〕又は〔１９〕に記載の微小粒子分析装置。
〔２１〕微小粒子が通流可能な流路を光軸方向に移動させながら、当該光軸方向における複数の位置で当該流路を撮像する撮像工程、
　前記撮像工程において得られた複数の画像それぞれについてのフォーカス指標に基づき、前記流路を前記光軸方向に移動させる移動工程、及び
　前記移動工程における移動後の位置にある前記流路の画像から、前記流路の特徴位置を特定し、前記光軸方向に対して垂直な方向における、前記特徴位置と基準位置との位置関係を調整する調整工程
　を微小粒子分析装置に実行させるためのプログラム。
１００　微小粒子分析装置
１０３　制御部
１０８　移動制御部
１０９　位置関係調整部
１５０　微小粒子分取用マイクロチップ

Claims (21)

  1. 　微小粒子が通流可能な流路を光軸方向に移動させながら、当該光軸方向における複数の位置で当該流路を撮像する撮像工程、
    　前記撮像工程において得られた複数の画像それぞれについてのフォーカス指標に基づき、前記流路を前記光軸方向に移動させる移動工程、及び
    　前記移動工程における移動後の位置にある前記流路の画像から、前記流路の特徴位置を特定し、前記光軸方向に対して垂直な方向における、前記特徴位置と基準位置との位置関係を調整する調整工程、
    　を含む位置調整方法。
  2. 　前記フォーカス指標が、前記流路にピントが合っているかを示す指標である、請求項１に記載の位置調整方法。
  3. 　前記フォーカス指標が、オートフォーカス関数を用いて取得されるフォーカス指標である、請求項１に記載の位置調整方法。
  4. 　前記オートフォーカス関数が、画像差分に基づく関数である、請求項３に記載の位置調整方法。
  5. 　前記オートフォーカス関数が、ブレナー関数である、請求項３に記載の位置調整方法。
  6. 　前記流路が、当該流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射し、当該照射により生じた光に基づき前記微小粒子の分析を行うために用いられるものである、請求項１に記載の位置調整方法。
  7. 　前記レーザ光の光軸の方向が、前記撮像工程における光軸方向と略同一である、請求項６に記載の位置調整方法。
  8. 　前記移動工程が、前記取得された複数のフォーカス指標から、所定の基準を満たすフォーカス指標を与える画像を特定する画像特定工程を含み、
    　前記移動工程において、前記画像特定工程において特定された画像が撮像された位置へ、前記流路が移動される、
    　請求項１に記載の位置調整方法。
  9. 　前記移動工程が、前記取得された複数のフォーカス指標から、最大又は最小のフォーカス指標を与える画像を特定する画像特定工程を含み、
    　前記移動工程において、前記画像特定工程において特定された画像が撮像された位置へ、前記流路が移動される、
    　請求項１に記載の位置調整方法。
  10. 　前記特徴位置が、前記流路を規定する壁の位置に基づき特定される、請求項１に記載の位置調整方法。
  11. 　前記特徴位置が、前記流路の幅方向における略中心位置である、請求項１に記載の位置調整方法。
  12. 　前記基準位置が、前記流路を流れる微小粒子に照射されるレーザ光の光軸通過位置である、請求項１に記載の位置調整方法。
  13. 　前記位置関係が、前記流路の幅方向における位置関係である、請求項１に記載の位置調整方法。
  14. 　前記調整工程において、前記流路が、当該流路の幅方向に移動される、請求項１に記載の位置調整方法。
  15. 　前記流路が、当該流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射し、当該照射により生じた光に基づき前記微小粒子の分析を行うために用いられるものであり、
    　前記調整工程において、前記レーザ光の照射位置が調整される、請求項１に記載の位置調整方法。
  16. 　前記流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射し、当該照射により生じた光に基づき前記流路の位置をさらに調整する追加位置調整工程をさらに含む、
    　請求項１に記載の位置調整方法。
  17. 　前記微小粒子が生体粒子である、請求項１に記載の位置調整方法。
  18. 　微小粒子が通流可能な流路を光軸方向に移動させながら、当該光軸方向における複数の位置で当該流路を撮像する撮像光学系、
    　前記撮像光学系により撮像された複数の画像それぞれについてのフォーカス指標に基づき、前記流路を前記光軸方向に移動させる移動制御部、及び
    　前記移動後の位置にある前記流路の画像から特定された特徴位置と基準位置との、前記光軸方向に対して垂直な方向における位置関係を調整する位置関係調整部、
    　を含む微小粒子分析装置。
  19. 　前記微小粒子分析装置が、
    　前記流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射する照射光学系、及び
    　前記レーザ光の照射により生じた光を検出する光検出系
    　をさらに含み、
    　前記レーザ光の光軸の方向が、前記撮像光学系の光軸方向と略同一である、
    　請求項１８に記載の微小粒子分析装置。
  20. 　前記微小粒子分析装置が、
    　前記流路を流れる微小粒子に対してレーザ光を照射する照射光学系、及び
    　前記レーザ光の照射により生じた光を検出する光検出系
    　をさらに含み、
    　前記照射光学系及び前記光検出系のいずれか一方又は両方が、前記撮像光学系に含まれる光学部品の少なくとも一つを共有している、
    　請求項１８に記載の微小粒子分析装置。
  21. 　微小粒子が通流可能な流路を光軸方向に移動させながら、当該光軸方向における複数の位置で当該流路を撮像する撮像工程、
    　前記撮像工程において得られた複数の画像それぞれについてのフォーカス指標に基づき、前記流路を前記光軸方向に移動させる移動工程、及び
    　前記移動工程における移動後の位置にある前記流路の画像から、前記流路の特徴位置を特定し、前記光軸方向に対して垂直な方向における、前記特徴位置と基準位置との位置関係を調整する調整工程
    　を微小粒子分析装置に実行させるためのプログラム。
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