JPH0481640A - フローイメージングサイトメータにおける自動焦点調整方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は補液、尿等の試料全適宜の朱色液で染色したも
のをフローセルに導いてこのセル内で平面シースフロー
を形成させ、ストロボ元をシースフロー流域に照射しビ
デオカメラで撮像された細胞画像全信号処理し分析する
フローイメージングサイトメトリーに関し、さらに評言
するとこのサイトメトリーにおける自動焦点調整方法に
関するものである。

平面（フラフト）ンースフローとして流動する細胞を撮
像し、画像処理技術を利用してこの細胞全自動的に分類
し計数する細胞分析装置は特開昭５７−５００９９５号
公報、米国特許第４．３３８゜０２４号明細書などで公
表さおできた。

一方、レンズによる物体１象ヲ既定の位置に自動的にピ
ントが合った状態で結像させる方法すなわちオートフォ
ーカス方法も公知である。例えば。

特公昭４２−１４０９６号公報には、微小面積の光電素
子を列設し、隣接する光電素子の出力差を合計すると合
焦時にその出力差の合計値が最大となることに注目し、
この最大点を検出する技法が記載さｎている。また、画
１象そのものの鮮明度を評価する評価関係もいろいろと
知らｎており一例えば特公昭５８−４１４８５号公報に
は二乗平均関数を利用することが記載さｆている。

スチルカメラ、ビデオカメラなどでは、連続し７’ｖ７
レームで変化がほとんどない画面全敗り扱うので、レン
ズまたは撮像素子群を微動させながら焦点調整すること
は、比較的たやすい。

しかしながら−フローイメージングサイトメータにおけ
る細胞画ｆ象などの撮像に際しては１画像が１フレーム
（１／３０秒）ごとに異った画像となり、−画面中に写
る細胞の位置と個数はたえず変化して一定でないので、
レンズ等を微動させながら同じ画像について比較したり
調節することが困難であり、オートフォーカスを実施す
ることはたやすいことでなかった。

本発明は１以上のような細胞分析技術における問題点を
解決し、迅速かつ適正な焦点調整を行う方法を提供する
ものであり、このため、細胞等の粒子成分を含む試料′
＃！ｊ、ヲ、フローセル内の扁平な流路に沿ってシース
液を外層にして扁平な試料流として流し、フローセルの
両側に光照射手段と撮像手段とを配置したうえ、試料流
の静止画像を撮像し１画像処理により試料流中の粒子成
分の分類および計数等の分析を行うフローイメージング
サイトメ）　ＩＪ−において、例えば寸法および形状の
揃った粒子を含むコントロール用液をフローセルに模擬
試料液（ダミー）として流し、フローセルまたは光学測
定用部品の位置をステッピングモタ等の微動装置で移動
させながら、順次撮像していきそｎらの画像の鮮明度全
適確に表わす評価パラメータを算定し、その評価パラメ
ータの値が最大値を与えるように上記フローセルまたは
光学測定用部品の位置調聚ゲ行って最終的に焦点調整金
達成することを特色とするものである。

不発明の実施例について、以下添付図を参照しながら詳
述する。

本発明によるフローイメージングサイトメトリにあって
は一細胞等の画像に対するピントの合い具合を表わす評
価パラメータとして１画像の局所における微分値を画面
全体にわたって合計した累算値を用いる。この画像の局
所における微分値を求めるためのオペレータ（演算子）
の例として。

第１図（ｂｌに示す５ｏｂｅｌ　　オペレータを用いる
ことにする。第１図（ａ）に示したような着目する画素
ＸｉＪ　の周囲３ｘ３＝９画素分の各テークに対応する
係数として、水平方向、垂直方向の５ｏｂｅｌオペレー
タを上記画素に乗じて？画素分の値をもって着目する画
素点ｘ＝　　に対応する新たな値とＩＪ する。このことを６×６コンポルーシヨンといい。

画面全体のすべての画素についてこのような新たな値を
算出する。

すなわち１着目した画素点について水平方向。

垂直方向に微分した値としてそれぞれ、５ｂＸＩＪ”Ｘ
ｌ−１＋２Ｘｉ＋ｘｉ＋１−Ｘｉ−１−２Ｘｉ−ｘｉ＋
１ｊ−１ｊ−１ｊ−１コ＋１　　　　ｊ＋１　　　　ｊ
＋１・・・・（式１） ％式％ ・・・・（式２） に従って新たな値が算出される。画面中の粒子の写って
いないバックグラウンドの部分では、この新たな値はほ
ぼ０となるが一粒子が画面内に入ってくるとその輪郭部
における演算値はピントが合ってコントラストが強くな
るほど大きな値となる。

従って−このような演算値を画面全体にわたって累算し
た値をピントの合い具合を示す評価パラメタとして利用
することができる。

本発明は、前述したように寸法と形状の揃った精度管理
用コントロール粒子を含む液をフローセルに導いて、こ
の粒子の写った画像を処理することによりピント調整を
して、実際の多様な粒子成分を含む試料の分類分析にお
ける精度の向上を図る。この場合、１画面（フレーム）
中に写る粒子の数は、低倍率時に数１０個、高倍率時に
は数個と少なく、従って１画面の累積微分値は他の画面
と対比したとき大きくばらつきを生ずる。

そこで、１画面に対する累積微分値を、数フレームない
し数１０フレーム分合計した値を最終的な評価パラメー
タとするが、このパラメータＰは次式による： 表わす 上式の評価パラメータを計算する式においてｓｂｘ　＊
　ｓｂｙを２乗しているのはピントの合い具合の感度お
よびＱ値を高めるために有効であシ、になる係数はオー
バーフローを防ぐための値とする。

サイトメータに偏設した画像処理部で画像データをリア
ルタイム処理することにより上記評価パラメータを求め
るが、１画面についてフローセルまたはレンズを微動さ
せながら評価パラメータをプロットすると、第２図のよ
うになる。最大値の点がピントの合った位置である。前
記式６の評価パラメータは第６図示の画像処理部で求め
られる。

さらに、第６図の核となる画像処理プロセッサボドの回
路例を第４図に示す。先にも述べたように−モホロジー
プロセッサボードは、細胞画１象を処理するために必要
な一般的機能を塔載したボードであって、画像の焦点調
整のために特別に塔載するというものではない。以下に
１フイールド（１／６０秒）を１ステツプとした複数両
面分の評価パラメータの求め方を示す。

第６図シよび第４図において、１）、ビデオ信号アナロ
グ／デジタル変換ボードであるＡ／ＤボードでＡ／Ｄ変
換された奇数フィールド画面のブタを画像データバスＣ
を介してモホロジープロセッサボードＭＰのプロセスチ
ャンネル２に入力し、水平方向の微分値（ｓｂｘ）／ｋ
をリアルタイムに求めそのデータを画像データバスＥを
介してワーキングメモリＷＮｌに記憶させていく。１１
）。

Ａ／Ｄボードでアナログ／デジタルに変換された偶数フ
ィールド画面のデータを画像データバスＣを介してモホ
ロジープロセッサＭＰのプロセスチャンネル２に入力し
、垂直方向の微分値（ｓｂｙ）／ｌ（を求め、そのデー
タを画像、データバスＥを介してプロセスチャンネル１
に入力させ一同時にワーキングメモリに記憶されている
（ｓｂｘ）／ｋ　のデータを画像バスへ読み出し、プロ
セスチャンネル１に入力させてＡＬＵに加算させ、ヒス
トグラマーでこの加算値のヒストグラムをリアルタイム
に作成させる。１ｉｉ）−デジタルシグナルプロセ）Ｖ
サポート内のデジタル信号プロセッサＤＳＰで、１１）
のステップで作成された第５図に示すようなヒストグラ
ムの結果を積算させ、１画面（フレーム）に対する評価
パラメータを求める。

汎用の高速マイクロプロセッサまたはデジタルシグナル
プロセッサを用いた場合、１画面を２５６×２５６画素
とすると、１画面のリアルタイム処理に１秒程度かかり
、２０画面分の評価パラメ−タ値を得るには約２０秒を
要することになる。さらに、実際にはレンズあるいはフ
ローセルラｅｔｂさせながらピント調整を行うのでこれ
よりも長時間を要することになる。−万、１７６０　秒
ごとに出現する１画面に対してリアルタイムに評価パラ
メータを求める場合、２０ｉ面分の評価パラメータを得
るのに２０／３０　秒を要する。このため、高速の乗算
器と累積加算器を内蔵したデジタルフィルタ、すなわち
後述する６×６コンポルーンヨンフイルタを用いてピン
ト調歪のための評価値を求めることが好適である。また
、同時に１１１）と併行して、次の画面に対してｌ）の
ステップと同様の処理をする。ｉｖ）、次の画面に対し
てステップ１１）と同様の処理をする。■）、次の画面
に対してステップ１１１）と同様の処理をしてから、さ
らに最初の画面の評価パラメータと次の画面の評価パラ
メータとを加算する。これと同時に、次々画面に対して
ステップ１）と同じ処理をする。以下同様にして１次々
画面も処理していく。

１フレ一ム画面は奇数フィールド画面と偶数フィールド
画面との和であるから（式３）の微分値ｓｂｘ、ｓｂｙ
　　は、プロセスチャンネル２の３×６コンボルータ（
第４ス１）として使用するＦＩＲフィルタで、リアルタ
イムに求めることができ、さらに上記両微分値を２乗し
てから１／ｋ　にする処理は、ルックアンプテーブルＬ
ＵＴ３てリアルタイムで行うことができる。

上記評価パラメータＰを用いた実際の焦点調整アルゴリ
ズムについて以下に説明する。基本的なねらいを効率よ
く正確な焦点調整におき１倍率を変えて撮像する必要の
ある／ステムについて、ピント調整の概略フローを第６
図に従って説明する。

本発明におけるピント調整は、粗調整工程と微調整行程
の２段階に分けられる。

先ずフローセルにコントロール用液を流してビデオカメ
ラにより撮丁象し、低倍率側での画像の評価パラメータ
初期値Ｐｏｌ　　を求める。この場合。

フローセルまたはレンズを微動させながら数フレム分ご
との累積微分値を求めるが、微調整時には上記微動のス
ピードを余り速めることができないが、粗調整時には微
動スピードを速めることができ、ピントが大きく外れて
いると判定されたときすなわち微調整領域か粗調整領域
かの境界を与えるスレシホールドｔｈｌ　　に対して、
Ｐｏ１（ｔｈｉＯ時は、微動スピードの速い粗調整をな
す５ＴＥＰ１を経ることによって、より一層早く微調聚
領域にもっていく必要がある。

上記のスレソホールドｔｈｌ　　は例えば次のようにし
て決定する。ピント調整しようとする装置が初めて調整
を受ける場合には、同型式の調整ずみの他の数台の装置
における温度、シース圧力を実用範囲内で最大限度まで
変化させた時の評価パラメータの平均値と平均変動率と
を求めておき、この平均値に例えば０．９を乗じた値を
ｔｈｌ　　の初期値とする。−度ピント調整のすんだ装
置に対し再調整する場合のｔｈｌは、初回調整時または
前回調整時の評価パラメータ値Ｐｐｌを使って次式によ
り求める。

ｔｈｌ＝Ｐｐ１　　（１−平均変動率）×０．９このよ
うに、ｔｈｉ　　を決定することにより、−度ピント調
整された装置に対する再調整ではほとんどの場合、粗調
整をとはして５ＴＥＰ２　　の微調整からが始められる
。

以上を前提として本発明における焦点調整行程を１とめ
ると第６図のようになるが、各手順を示すと次のとうり
である。

（１）　　コントロール用液をフローセルに流す。

（２）低倍率側で評価パラメータの初期値Ｐｏ］を求め
る。

（３）その評価パラメータの初期値Ｐｏｌと所定値Ｔｈ
ｌ　　とを比較し、 Ｐｏ　１　（’ｒｈ、　ｌ　　なら５ＴＥＰ　１へＰｏ
ｌ＞Ｔｈｌ　なら５ＴＥＰ　　１をとばして５ＴＥＰ　
２へ （４）　　５ＴＥＰ　１ 低倍率側でのピントの粗調整 フローセルを移動させながら評価パラメータＰｎを求め
。

Ｐｎ＞Ｔｈｌになれば５ＴＥＰ２へ （５）　　５ＴＥＰ　　２ 低倍率側でのピントの微調整 フローセルを移動させながら評価パラメータＰｎを求め
、評価パラメータＰｎが最大となる位置にフローセルを
移動させる。

（６）　　５ＴＥＰ　　３ 高倍率側でのピントの微調整及び確認 第７図は、上記ΩＭ整手順を５ＴＥＰ１．２．３を通じ
て適用可能とする調整アルゴリズムを示すものである。

これは−各ステップに対し６フレームで約１８０個の粒
子が写る画像ムつき調整エラーと判定されたときの異常
例をも扱う。Ｓ　’Ｌ”　Ｅ　Ｐ　１を要する調整時間
は０．５〜１１秒であった。

次に、低倍率時でピントが少しすれている時は。

上記調整アルゴリズムにおいて５ＴＥＰ２　　が次の手
順で行われる。このＳ　’Ｌ’　Ｅ　Ｐ　２　の調整時
間には６〜７秒要する。

５ＴＥＰ２（微調整）Ｐｏ＞ｔｈｌ ■　右方向に６フレーム当たり１ｔ１５　連続移動させ
ながら、６フレ一ム分ごとのＰｎを求めていく。

■　Ｐｎ（ｔｈｌになりかつ４ポイント以上のＰｎを得
たら右方向の連続移動をストップさせる。

■　左方向に■と同様に６フレーム当たりＩｔ　１５連
続移動させながら、６フレ一ム分ごとのＰｎを求めてい
く。

■　Ｐｎ（ｔｈｌになったら左方向の連続移動をストッ
プさせる。

■　■と■で求めた各ポイントのＰの値をスムージング
処理して。

・パラクララツユがどのくらいあるか求める。

・Ｐが最大となるポイントを求める。

■　■で求めたポイントへ、パラクララツユを考慮して
移動させる。

■　その位置での３ｏフレ一ム分のＰの値を求めて、そ
の値Ｐ　　と位置Ｐｓ□を記憶しておく。

■　Ｐｐｌ　　が規定値Ｐｐｉｓより小さい時、調整エ
ラー２とする。

■５ＴＥＰ３へ 次に、低倍率側でピント調整をした後、高倍率側で微調
整を行う５ＴＥＰ　３は次のような手順に従う。

５ＴＥＰ３　　高倍率側での微調整 ■　高倍率側に切換えて、低倍率側で調整されたポイン
トでの６０フレ一ム分のＰｏｈ　　を求める。（６０フ
レームで約６０個の粒子）■・Ｐｏｈ＞ｔｈｈ（高倍率
側スレソホールド）の確認 Ｐｏｈ　（ｔｈｈなら調整エラー６とする。

■　右方向に６０フレーム当たり１ｔｈ１５連続移動さ
せながら６０フレ一ム分ごとのＰｎｈを求めていく。

■　Ｐｎｈ（ｔｈｈになったら連続移動ストップ。

■　左方向に■と同様に６０フレーム轟たり１ｔｈ１５
連続移動させながら６０フレ一ム分ごとのＰｎｈ　　を
求めていく。

■　■で得られた各ポイントのＰの値をスムーング処理
して、Ｐが最大となるポイントを求める。

の　■で求めたポイントへ、パラクララツユを考慮して
移動させる。

■　その位置での９０フレ一ム分のＰの値を求めて、そ
の値Ｐｐｈと位置Ｐｓｈを記憶しておく。

■　Ｐｐｈ　が規定値Ｐｐｈ、より小さい時、調整エラ
ー４とする。

Ｏ低倍率側に切換えて、高倍率側で調整されたポイント
での３０フレ一ム分のＰｏｌ　　を求める。

Ｑ　　５ＴＥＰ２で求めたＰｐｌ　　と比較してＰｏｌ
＜ｋ２Ｐｐ１の時調整エラー５とする。

（ｋ２昇０．８〜０．８５） ■　初回ピント調整時、前々回調整時、前回調整時およ
び今回調整時のｐｐｌ　、　Ｐｐｈ　、Ｐｓｌ　。

Ｐｓｈ　　を比較チエツクして、それらの差が規定値を
超えている時は、調整エラー６とする。

上記５ＴＥＰ　３の調整に要した時間は２８〜３２秒で
あった。

以上の各５ＴＥＰで派生したピント調整エラはそれぞれ
次のような原因によるものと考えられる。

１）調整エラート スチッピングモータによる駆動機構の異常。

・流体系の異常で、フローセルにコントロール粒子が正
常に流れない。ノズルのつ壕り等。

２）調整エラー２ ・フローセル内を流れるサンプル流の位置がくるってい
る。

・フローセル内を流れるサンプル流の厚みが厚過ぎる。

・ストロボの劣化。

６）調整エラー６ ・フローセル内を流れるサンプル流の中心位置が、低倍
率時と高倍率時とで厚み方向に変動する。

・フローセル内を流れるサンプル流の厚みが厚過きる。

４）調整エラー４ ・フローセル内を流れるサンフル流の厚みが厚過ぎる。

・ストロボの劣化。

５）調整エラー５ ・フローセル内を流れるサンプル流の中心位置が、低倍
率時と高倍率時とで厚み方１７−１］に変動する。

６）調整エラー６ ・フローセルまたはレンズ駆動部のゆるみ、磨耗。

・ストロボの劣化。

・レンズ、フローセル等にホコリが付着。

・フローセル内壁面の汚れ。

本発明の調整方法によれば、試料流の静止画像を１／６
０秒ごとに撮１象しているため、同一の画面は生じない
。これら時時刻刻変わっていく画像を用いて評価パラメ
ータを求めるから、画面ごとの評価パラメータは大きく
ばらつくが複数フレム分の評価パラメータを足し合わせ
た値を評価・ぐラメータとすれば、大数の法則により複
数フレムの画面間のばらつきを吸収させ、画像の特徴を
顕著化し細胞像の合焦状態を適確に反映することができ
る。

フローセルやレンズを連続的に移動させながら、評価パ
ラメータの値をリアルタイムで求めその値の最大値の位
置を迅速に求める。また、ます、低倍率側でピントを粗
調整し高倍率側で微調整をすることで調整の所要時間を
短縮し得る。

なお、焦点調整ごとに得られた評価パラメータの最大値
をその都度記憶しておくと、その変動の監視によってシ
ステムの異常を発見することができる。

本発明方法は１以上に述べたところから次のような諸効
果を達成し得る。

（１）複数フレーム分の画面を使って評価・ぐラメータ
を求め、その際、精度管理用コントロール粒子を焦点調
整に流用することで、比較的短時間内に粗調整と微調整
を効率よく高精度で遂行できる。

（２）倍率切換の行程をさらに加えて、一画面中に多数
の粒子が写る低倍率側でますピントの粗調整を５次で高
倍率側でピントの微（精）調整を行い効率をより一層同
上できる。

（３）　　ピントの合ったと判定された位置での評価パ
ラメータ値を記憶しておくことにより、この値の変動を
監視してシステムの異常を検知することができる。

（４４）本来的に細胞画像を処理するための細胞分析シ
ステムのハードウェアをその１＼利用する。

換言すれば焦点調整のために別（固の・・−ドウエアを
付加する必要はないから、上述の諸効果の実現に際して
コストを最小限に抑えることがでさる。

【図面の簡単な説明】

添付図は本発明の詳細な説明するためのもので、第１図
（ａ）　、　（ｂ）は画像の評価パラメータを求める際
の原画像データ＋　５ｏｂｅｌ　　オペレータの例。 第２図は評価パラメータ曲線の例、第６図はイメージン
グフローサイトメータ用の画像処理７ステムの実施例、
第４図は第６図のシステムに用いるのに好適なモホロジ
ーグロセノサボー トのブロン 第 図 り回路例、 第５図は評価パラ７ タのヒストグラ ム例。 第６図はピント調整の基本フロ ダイアグ ｒｂ） ラム。 第７図（はピント粗調整の基本フロ ダイア ダラムを示す。 ａｌ 原画像データ 水平方向 ５ｏｂｅｌオペレータ 垂直方面

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞等の粒子成分を含む試料液をシース液で挾んで
   フローセルの扁平な流路に流し、上記フローセルの両側
   に配置された照光手段と撮像手段とによって試料流の静
   止画像を撮像し、画像処理により上記試料液中の粒子成
   分の分類、計数等の分析を行うフローイメージングサイ
   トメータにおいて、上記フローセルに対して寸法、形状
   の揃った粒子を含む精度管理用液を導入し、上記フロー
   セル等光学測定系の部品を移動せしめながら上記液の静
   止画像を撮像し、上記画像の鮮明度を表わす評価パラメ
   ータを算出し、該評価パラメータの値を最大ならしめる
   ように位置調整を行うことによって、試料流に対する焦
   点調整を行うこと、を特徴とするフローイメージングサ
   イトメータにおける自動焦点調整方法。 ２、請求項１記載の方法において、上記精度管理用液を
   フローセルに流した時、上記評価パラメータの初期値Ｐ
   ＿０と所定基準値ｔｈとを比較し、Ｐ＿０＜ｔｈのとき
   フローセルを移動させながら評価パラメータＰｎを求め
   てＰｎ＞ｔｈの状態となし、次で上記フローセルをさら
   に移動させながら評価パラメータＰｎが最大値となる位
   置にフローセルを移動させ位置設定すること、を特徴と
   するフローイメージングサイトメータにおける自動焦点
   調整方法。 ３、請求項２記載の方法において、上記フローセルの位
   置に代えてフローサイトメータのレンズ系等光学部品の
   位置を移動せしめること、を特徴とするフローイメージ
   ングサイトメータにおける自動焦点調整方法。 ４、請求項１ないし６のいずれかに記載の方法において
   、上記評価パラメータを先ず光学系の低倍率側で算出し
   、該評価パラメータが最大値となったとき上記光学系の
   高倍率側でさらに評価パラメータを最大ならしめること
   、を特徴とするフローイメージングサイトメータにおけ
   る自動焦点調整方法。 ５、請求項１ないし４のいずれかに記載の方法において
   、上記評価パラメータの最大値を記憶し、該評価パラメ
   ータの最大値の変動を監視することによって測定系の異
   常を検知するようにしたこと、を特徴とするフローイメ
   ージングサイトメータにおける自動焦点調整方法。