CN108865650B - 微流控液滴散射光和荧光计数芯片 - Google Patents

微流控液滴散射光和荧光计数芯片 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种微流控液滴散射光和荧光计数芯片，包括芯片本体、激发光纤、检测光纤以及反光镜，芯片本体内设有激发光纤预留槽和检测光纤预留槽、检测流道以及检测区域，激发光纤预留槽、检测光纤预留槽交汇于检测区域，检测区域上装设有反光镜，激发光纤的光线经过激发光纤预留槽以照射到达检测区域的液滴，反光镜用于将经激发光纤照射的液滴所产生的散射光反射，散射光的阴性信号以及阳性信号经过检测光纤预留槽被检测光纤收集，检测光纤将阴性信号以及阳性信号传送。本发明的微流控液滴散射光和荧光计数芯片解决了由于拍照面积的限制对样品浓度测定的准确性，且解决了传统的空间光学方案的光学空间自身体积庞大、调焦操控复杂的问题。

Description

微流控液滴散射光和荧光计数芯片
技术领域
本发明涉及微流控技术领域，特别涉及一种微流控液滴散射光和荧光计数芯片。
背景技术
近几年来，伴随着微纳加工技术的不断发展，更多的创新方法将应用于数字PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术中。数字PCR技术一般包括两部分内容，PCR扩增和荧光信号分析。在PCR扩增阶段，数字PCR先将样品荧光处理并稀释到单分子水平，再平均分配到几十至几万个单元中进行反应。数字PCR是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集，有荧光信号记为1，无荧光信号记为0，有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的模板，即至少携带一个样品，然后根据泊松分布推算出样品浓度。
数字PCR起步阶段通常使用CCD(Charge Coupled Device，电荷耦合器件)数字拍照的方式识别携带样品的液滴和空液滴，但该方法需要在整个区域内不断的拍照来实现，同时将空液滴的信号标记为0的相应，称为阴信号，将携带样品的液滴的信号标记为1的相应，称为阳信号，根据阴阳信号计算样品的浓度。该操作过程通常为通过油相隔离出大量单元，并保证每个单元中存在0和1的响应，根据确定面积上的腔体个数，通过统计阳性信号计算样品的浓度。由于液滴的统计数越多，样品浓度计算结果准确性越高，因此为了统计大量的液滴，就需要不断扩大成像面积反复拍照，该方法不仅操作过于繁琐，而且受限于拍照面积，即在有限的面积会影响液滴的统计，进而影响样品浓度计算结果的准确性；且该空间光学方案的光学空间自身体积庞大、调焦操控复杂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微流控液滴散射光和荧光计数芯片，解决了由于拍照面积的限制对样品浓度测定的准确性，且解决了传统的空间光学方案的光学空间自身体积庞大、调焦操控复杂的问题。
本发明提供一种微流控液滴散射光和荧光计数芯片，用于统计单分子液滴的阳性信号，包括芯片本体、激发光纤、检测光纤以及反光镜，所述芯片本体内设有激发光纤预留槽和检测光纤预留槽、检测流道以及检测区域，所述激发光纤预留槽、所述检测光纤预留槽交汇于所述检测区域，所述检测区域上装设有所述反光镜，所述激发光纤的光线经过所述激发光纤预留槽以照射流过所述检测流道且到达所述检测区域的所述液滴，所述反光镜用于将到达所述检测区域的经所述激发光纤照射的所述液滴所产生的散射光反射，所述散射光的阴性信号以及所述阳性信号经过所述检测光纤预留槽被所述检测光纤收集，所述检测光纤将所述阴性信号以及所述阳性信号传送。
其中，所述芯片本体包括底层芯片以及层叠于所述底层芯片上的顶层芯片，所述底层芯片上设有第一缺口以及第二缺口，所述顶层芯片上设有与所述第一缺口适配的第一槽以及与所述第二缺口适配的第二槽，所述底层芯片与所述顶层芯片对接时，所述第一缺口与所述第一槽形成收容所述激发光纤的所述激发光纤预留槽，所述第二缺口与所述第二槽形成收容所述检测光纤的所述检测光纤预留槽。
其中，所述激发光纤预留槽、所述检测光纤预留槽以及所述检测流道的中心轴位于同一平面上。
其中，所述微流控液滴散射光和荧光计数芯片包括光电倍增管，所述光电倍增管用于接收所述阴性信号以及所述阳性信号，且用于检测所述阴性信号以及所述阳性信号。
其中，所述检测流道包括混合入口，所述顶层芯片上设有第一注入口、连通于所述第一注入口的调节相流道、第二注入口以及连通于所述第二注入口的液滴流道，所述液滴流道、所述调节相流道交汇于所述混合入口，在所述混合入口处所述调节相流道中的调节相间隔形成于所述液滴流道中的所述液滴之间以调节所述液滴之间的间距。
其中，所述激发光纤的数值孔径、内径以及外径分别为0.1、62.5微米以及125微米。
其中，所述检测光纤的数值孔径、内径以及外径分别为0.38、200微米以及225微米。
其中，所述反光镜的介质包括液态金属。
其中，所述反光镜采用微纳加工技术制成。
其中，所述阴性信号的强度小于所述阳性信号的强度。
综上所述，本发明微流控液滴散射光和荧光计数芯片中的所述激发光纤、所述检测光纤以及所述反光镜集成于所述微流控液滴散射光和荧光计数芯片内，实现减小了所述微流控液滴散射光和荧光计数芯片的空间操作体积，制作简单；解决了为增加拍照面积而降低放大倍数导致的单个液滴识别受到影响；同时避免了传统的空间光学方案的光学空间自身体积庞大、调焦操控复杂的问题，进而解决了由于拍照面积的限制对样品浓度测定的准确性。本发明的光电倍增管对所述阴性信号与所述阳性信号的同时检测实现了只需一个所述光电倍增管即可实现对所述阴性信号与所述阳性信号的同时检测，避免了传统的设计中需要两个探测器来实现阴性信号和阳性信号的响应检测，进而避免了传统的空间光学方案的光学空间自身体积庞大、调焦操控复杂的问题，且避免了该方案中阴性信号的检测还需要另一个种荧光染料造成的光电倍增管的额外增加，光路成本的上升。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的微流控液滴散射光和荧光计数芯片的结构示意图。
图2是图1所示微流控液滴散射光和荧光计数芯片的侧面结构示意图。
图3是图1中顶层芯片的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供一种微流控液滴散射光和荧光计数芯片，用于统计单分子液滴PCR后的阳性信号，包括芯片本体1、激发光纤10、检测光纤20以及反光镜30，所述芯片本体内设有激发光纤预留槽40和检测光纤预留槽50、检测流道60以及检测区域70，所述激发光纤预留槽40、所述检测光纤预留槽50交汇于所述检测区域70，所述检测区域70上装设有所述反光镜30，所述激发光纤10的光线经过所述激发光纤预留槽40以照射流过所述检测流道60且到达所述检测区域70的PCR后的所述液滴，所述反光镜30用于将到达所述检测区域70的经所述激发光纤10照射的所述液滴所产生的散射光反射，所述散射光的阴性信号以及所述阳性信号经过所述检测光纤预留槽50被所述检测光纤20收集，所述检测光纤20将所述阴性信号以及所述阳性信号传送至外界。
在本实施例中，所述液滴包括PCR后的空液滴以及携带荧光的荧光单分子液滴，所述空液滴对应的光信号为所述阴性信号，所述荧光单分子液滴所对应的光信号为所述阳性信号。
本发明微流控液滴散射光和荧光计数芯片的所述激发光纤10传输光线向所述液滴照射，所述反光镜30将所述液滴产生的散射光反射，进而将所述空液滴的光信号转化为所述阴性信号以及将所述荧光单分子液滴的光信号转化为所述阳性信号；所述检测光纤20收集PCR后所述空液滴的所述阴性信号和含有荧光单分子的所述荧光单分子液滴的所述阳性信号并将所述阴性信号和阳性信号传输到外界进行统计。所述激发光纤10、所述检测光纤20以及所述反光镜30集成于所述微流控液滴散射光和荧光计数芯片内，实现减小了所述微流控液滴散射光和荧光计数芯片的空间操作体积，制作简单；解决了为增加拍照面积而降低放大倍数导致的单个液滴识别受到影响；同时避免了传统的空间光学方案的光学空间自身体积庞大、调焦操控复杂的问题。本发明的微流控液滴散射光和荧光计数芯片同时实现了在有限的面积上可以无限的计数，提高了荧光单分子液滴计算结果的准确性。
在本实施例中，所述激发光纤10的数值孔径为0.1，所述激发光纤10的内径以及外径分别为62.5微米以及125微米。本发明的所述激发光纤10实现了满足对所需光线的传输，且避免了由于照射区域太大而造成的液滴之间的信号串扰。所述检测光纤20的数值孔径为0.38，所述检测光纤20的内径以及外径分别200微米以及225微米。本发明的所述检测光纤20实现了满足对被反射的所述散射光在被反射的角度内的收集。
请参阅图2，所述芯片本体1包括底层芯片11以及层叠于所述底层芯片11上的顶层芯片12，所述底层芯片体11上设有第一缺口111以及第二缺口112，所述顶层芯片12上设有与所述第一缺口111适配的第一槽121以及与所述第二缺口112适配的第二槽122，所述底层芯片11与所述顶层芯片12对接时，所述第一缺口111与所述第一槽121形成收容所述激发光纤10的所述激发光纤预留槽40，所述第二缺口112与所述第二槽122形成收容所述检测光纤20的所述检测光纤预留槽50。在本实施例中，所述底层芯片11以及所述顶层芯片12的对接采用对准键合的方法进行对接。
在本发明中，所述激发光纤预留槽40、所述检测光纤预留槽50以及所述检测流道60的中心轴位于同一平面上。具体为，由于所述激发光纤预留槽40、所述检测光纤预留槽50以及所述检测流道60的中心轴位于同一平面上，进而所述激发光纤10的中心轴、所述检测光纤20的中心轴、以及所述检测流道60中的所述液滴的中心位于同一条平面上，进而所述激发光纤10的光线可最大面积地照射到所述液滴上，所述检测光纤20可最大面积地收集所述散射光的光信号，进而提高了收光效率，提高了检测的灵敏性。在本实施例中，所述激发光纤预留槽40与所述检测光纤预留槽50通过光刻方法形成。
请参阅图3，所述检测流道60包括混合入口601，所述顶层芯片12上设有第一注入口123、连通于所述第一注入口123的调节相流道124、第二注入口125以及连通于所述第二注入口125的液滴流道126，所述液滴流道126、所述调节相流道124交汇于所述混合入口601，在所述混合入口601处所述调节相流道124中的调节相间隔形成于所述液滴流道126中的所述液滴之间以调节所述液滴之间的间距。具体为，所述第一注入口123用于所述调节相注入所述调节相流道124，所述第二注入口125用于所述液滴注入所述液滴流道126，所述液滴与所述油相在所述混合入口601相遇，所述调节相间隔形成于所述液滴之间，进而所述液滴彼此有规律的间隔分开，避免了所述液滴过于紧密所导致的所述液滴之间的散射光相互串扰，所述散射光的光信号之间相互串扰，无法分辨，进而提高了荧光单分子液滴计算结果的准确性。在本实施例中，所述调节相为油相。
所述反光镜30的介质包括液态金属。且所述反光镜30采用微纳加工技术制成。具体为，所述顶层芯片12上还设有第三注入口128以及与所述第三注入口128连通的液态金属流道129，所述第三注入口128用于液态金属的注入，所述液态金属从所述第三注入口128注入所述液态金属流道129，进而达到所述反光镜30。本发明所述反光镜30的介质采用所述液态金属实现了利用液体的流动性使得所述反光镜30的制作简单，成本低，避免了通常使用的磁控溅射镀膜和化学氧化还原沉积的方法制作所导致的制作复杂，成本高。本发明采用所述微纳加工技术手段制作所述反光镜30实现了可在所述微流控液滴散射光和荧光计数芯片1中设计不同结构的所述反光镜30，且可以实现微小光学元件的集成和复杂设计。
在本发明中，所述阴性信号为所述激发光纤10的光线中混有荧光波段的光所对应的光信号，所述阳性信号为所述激发光纤10的光线中混有荧光波段的光所对应的光信号与所述荧光单分子液滴反射的散射光所对应的荧光信号的混合信号。故所述阴性信号与所述阳性信号为不同强度的光信号，且所述阴性信号的强度小于所述阳性信号的强度。
在本发明中，所述阴性信号为所述激发光纤10的光线中混有荧光波段的光所对应的空液滴散射光信号，所述阳性信号为所述激发光纤10的光线中混有荧光波段的光所对应的空液滴散射光信号与所述荧光单分子液滴所对应的荧光信号的混合信号。故所述阴性信号与所述阳性信号为不同强度的光信号，且所述阴性信号的强度小于所述阳性信号的强度。
所述微流控液滴散射光和荧光计数芯片1包括光电倍增管(图中未示出)，所述光电倍增管用于接收所述阴性信号以及所述阳性信号，且用于检测所述阴性信号以及所述阳性信号。具体为，所述光电倍增管接收所述检测光纤20传输的所述阴性信号以及所述阳性信号，并将所述阴性信号以及所述阳性信号转化为相应的电信号，并对相应的所述电信号进行放大。同时根据所述阴性信号对应的所述电信号以及根据所述阳性信号对应的所述电信号计算所述荧光单分子液滴中的样品浓度。在本发明中，由于所述阴性信号为所述空液滴的光信号，所述阳性信号为携带荧光单分子的荧光单分子液滴的光信号，且所述阴性信号的强度小于所述阳性信号的强度，进而在检测所述散射光的光信号时，只需一个所述光电倍增管即可实现对所述阴性信号与所述阳性信号的同时检测，避免了传统的设计中需要两个探测器来实现阴性信号和阳性信号的响应检测，进而避免了传统的空间光学方案的光学空间自身体积庞大、调焦操控复杂的问题，且避免了该方案中阴性信号的检测还需要另一个种荧光染料造成的光电倍增管的额外增加，光路成本的上升。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。

Claims (8)

1.一种微流控液滴散射光和荧光计数芯片，用于统计单分子液滴的阳性信号，其特征在于，包括芯片本体、激发光纤、检测光纤以及反光镜，所述芯片本体内设有激发光纤预留槽和检测光纤预留槽、检测流道以及检测区域，所述激发光纤预留槽、所述检测光纤预留槽交汇于所述检测区域，所述检测区域上装设有所述反光镜，所述反光镜设于所述检测区域背向所述检测光纤预留槽的一侧，所述激发光纤的光线经过所述激发光纤预留槽以照射流过所述检测流道且到达所述检测区域的所述液滴，所述反光镜用于将到达所述检测区域的经所述激发光纤照射的所述液滴所产生的散射光反射，所述散射光的阴性信号以及所述阳性信号经过所述检测光纤预留槽被所述检测光纤收集，所述检测光纤将所述阴性信号以及所述阳性信号传送;
所述芯片本体包括底层芯片以及层叠于所述底层芯片上的顶层芯片，所述底层芯片上设有第一缺口以及第二缺口，所述顶层芯片上设有与所述第一缺口适配的第一槽以及与所述第二缺口适配的第二槽，所述底层芯片与所述顶层芯片对接时，所述第一缺口与所述第一槽形成收容所述激发光纤的所述激发光纤预留槽，所述第二缺口与所述第二槽形成收容所述检测光纤的所述检测光纤预留槽；
所述激发光纤预留槽、所述检测光纤预留槽以及所述检测流道的中心轴位于同一平面上。
2.根据权利要求1所述的微流控液滴散射光和荧光计数芯片，其特征在于，所述微流控液滴散射光和荧光计数芯片包括光电倍增管，所述光电倍增管用于接收所述阴性信号以及所述阳性信号，且用于检测所述阴性信号以及所述阳性信号。
3.根据权利要求1所述的微流控液滴散射光和荧光计数芯片，其特征在于，所述检测流道包括混合入口，所述顶层芯片上设有第一注入口、连通于所述第一注入口的调节相流道、第二注入口以及连通于所述第二注入口的液滴流道，所述液滴流道、所述调节相流道交汇于所述混合入口，在所述混合入口处所述调节相流道中的调节相间隔形成于所述液滴流道中的所述液滴之间以调节所述液滴之间的间距。
4.根据权利要求1-3任一项所述的微流控液滴散射光和荧光计数芯片，其特征在于，所述激发光纤的数值孔径、内径以及外径分别为0.1微米、62.5微米以及125微米。
5.根据权利要求1-3任一项所述的微流控液滴散射光和荧光计数芯片，其特征在于，所述检测光纤的数值孔径、内径以及外径分别为0.38微米、200微米以及225微米。
6.根据权利要求1-3任一项所述的微流控液滴散射光和荧光计数芯片，其特征在于，所述反光镜的介质包括液态金属。
7.根据权利要求6所述的微流控液滴散射光和荧光计数芯片，其特征在于，所述反光镜采用微纳加工技术制成。
8.根据权利要求1所述的微流控液滴散射光和荧光计数芯片，其特征在于，所述阴性信号的强度小于所述阳性信号的强度。
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