CN110186836B - 循环肿瘤细胞分离分析与分型计数的光流控流式细胞仪 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肿瘤细胞检测技术领域，尤其涉及循环肿瘤细胞分离分析与分型计数的光流控流式细胞仪。该仪器包括进样模块、多级微流控芯片、光学检测模块、信号采集与数据处理模块和系统控制模块；所述进样模块、多级微流控芯片、光学检测模块、信号采集与数据处理模块依次连接，所述系统控制模块与进样模块、光学检测模块、信号采集与数据处理模块均连接。本发明结合了微流控芯片、流体力学和流式细胞术的优势，并通过独特的硬件和软件系统的架构与集成，实现了自动、连续的血液样品注入、循环肿瘤细胞的高效分离、3D聚焦和高灵敏、多参数、实时原位的单细胞分析等操作与敏感、高通量的分型计数检测。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤细胞检测技术领域，尤其涉及一种用于外周血中循环肿瘤细胞分离分析与分型计数检测的光流控流式细胞仪。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
针对癌症的早期诊断和病程进展实时监测是提高患者生活质量及生存率的重要保障。但现有组织活检、影像学手段、血清标志物等检验方法，或取样困难、侵入性大，或灵敏度不足，或漏检率高，都难以为癌症的早期诊断及实时疗效评估提供有效帮助。近年来，基于循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)检测的液体活检因具有肿瘤分子信息全面、取样方便、侵入性小、无放射性污染、成本低等优势，而成为目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段之一。CTCs是存在于外周血中各类肿瘤细胞的统称，从肿瘤母体脱离、浸润周围组织而进入血液中，通过血液循环抵达其他器官和组织，是肿瘤转移的重要途径。研究表明，CTCs在形成可见实体瘤之前就可出现，而且它们的数量和类型与肿瘤的进展之间存在相关性。因此，在疾病的不同阶段，对CTCs进行分型计数检测有助于癌症的早期诊断、预后评估和疗效监测。
然而，由于分析对象的特殊性，使得如何从外周血中高效的分离和检测这些细胞面临着巨大的挑战。首先，CTCs数量稀少，通常每1mL外周血中可能只含有几至几十个CTC，却有高达约109个红细胞和106个白细胞，这便要求所用检测技术能够在数以亿计的背景细胞中高效地分离与测出CTCs。其次，CTCs具有较大的生物和物理异质性，同时存在不同类型(包括上皮型、间质型和混合型)，对分离的CTCs进行分型分析与计数，这便要求所用检测技术具有高灵敏、多参数、原位实时的高通量单细胞分析能力。最后，考虑到便于临床应用(如总的检测时间、通量、所需样本大小等)以及可重复性好等因素，要求所用检测技术能够集分离分析与分型计数等功能于一体。受限于CTCs数量稀少以及靶细胞的检测敏感度等因素，传统的细胞分析手段用于CTCs的分离和检测显得不再适合。例如，流式细胞仪(FCM)检测一个样本的时间可能超过24h。
为了应对这一挑战，近年来探索了一些方法。已发展的CTCs检测方法大多是利用偶联在磁珠或微流控芯片上的上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体捕获CTCs，然后用免疫荧光成像或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对CTCs进行定性。有些方法根据肿瘤细胞与正常细胞在大小、密度等物理特性方面的差别，利用包括微孔过滤、密度梯度离心，以及基于微流控芯片的微结构过滤、惯性迁移、确定性侧向偏移(DLD)等方法对CTCs进行分离，然后对收集的CTCs重新进行定性与计数。然而，本发明人认为：尽管这些方法代表了这一领域的重要进展，但其技术瓶颈依旧存在。首先，由于肿瘤细胞的扩散需经历上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)这一重要过程，导致部分EMT细胞中EpCAM表达缺失；而依赖于上皮标志物EpCAM的单一抗体捕获，无法捕获上皮源性缺失的CTCs，从而造成漏检。例如，利用CellSearch系统已表明有相当大的细胞损失(约20％-40％)，这是因为该技术捕获CTCs的磁球采用单一EpCAM抗体修饰，使得低表达或不表达EpCAM抗原的CTCs不被检出。因此，这类单一EpCAM抗体捕获的CTCs检测方法存在很大的局限性。其次，基于物理特性的分离方法，尽管操作相对简单、通量高、不依赖细胞表面标志物表达，但受限于CTCs在物理特性上的异质性，以及CTCs与白细胞在尺寸上的重叠性(重叠尺寸范围约为10-12μm)，使得这类方法往往会丢失尺寸小的CTCs，从而导致分离不完全且纯度不高。因此，对于极具生物和物理异质性的CTCs而言，目前仅仅依靠单一标记物或特性，无论是生物学特性的捕获，还是物理学特性的分离，都会低估CTCs的数量，并导致重要亚群的丧失。更为重要的是，当前的CTCs检测方法几乎都是先将CTCs从血液中捕获分离后，再用传统的细胞分析手段对其进行定性与计数。这种分离和分析技术相互独立的CTCs检测方法，不仅自动化程度低、耗时长，而且在细胞转移、容器更换等环节极易造成样品的损失和污染，导致较大的系统误差。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明认为：如能将光学和微流控技术相结合，实现外周血中循环肿瘤细胞高效分离的同时、对单个循环肿瘤细胞进行高通量、多参数的实时原位分析，并提供循环肿瘤细胞的分型与计数信息，将明显有助于癌症的早期诊断和病程进展实时监测。为此，本发明提供一种用于外周血中循环肿瘤细胞分离分析与分型计数检测的光流控流式细胞仪。本发明的细胞仪实现了自动、连续的血液样品注入、循环肿瘤细胞的高效分离、3D聚焦和高灵敏、多参数、实时原位的单细胞分析等操作与敏感、高通量的分型计数检测。
为实现上述发明目的，本发明公开了下述技术方案：
一种用于外周血中循环肿瘤细胞分离分析与分型计数检测的光流控流式细胞仪，包括：进样模块、多级微流控芯片、光学检测模块、信号采集与数据处理模块和系统控制模块；所述进样模块、多级微流控芯片、光学检测模块、信号采集与数据处理模块依次连接，所述系统控制模块与进样模块、光学检测模块、信号采集与数据处理模块均连接。
所述进样模块的功能是将血液样品及鞘液输送到多级微流控芯片的相应入口，并在系统控制模块的控制下，对血样及鞘液的流速与流量进行调节和可编程控制。
所述多级微流控芯片的主要功能是支撑“血液样品、鞘液的注入，血液样品中循环肿瘤细胞的一级分离、二级3D聚焦”等操作。
所述光学检测模块和信号采集与数据处理模块的主要功能是对经过多级微流控芯片一级分离和二级3D聚焦处理的细胞(包括循环肿瘤细胞和部分体积较大的白细胞)进行高灵敏、多参数、实时原位的单细胞分析与灵敏、快速的检测，以获取循环肿瘤细胞的分型计数等信息。
所述系统控制模块的主要功能是对进样、光学检测、信号采集与数据处理等功能模块进行自动化控制，以确保各个功能模块的输出流程与多级微流控芯片上的循环肿瘤细胞的分离分析与分型计数的操作步骤对应一致。
本发明结合了微流控芯片、流体力学和流式细胞术的优势，并通过独特的硬件和软件系统的架构与集成来实现，与现有技术相比，本发明有以下显著特点与有益效果：
(1)采用多级微流控芯片(包括一级分离单元、二级3D聚焦单元、光学检测通道和流阻匹配单元)的设计，不仅将CTCs分离分析的多步操作集成在一块芯片上完成，而且兼顾了灵敏和通量这两个指标，便于在数以亿计的背景细胞中敏感、高通量地分离和检出CTCs。具体来讲，一级分离单元在保持高通量实现CTCs分离与显著提高CTCs浓度的同时，避免了小尺寸CTCs的丢失，从而提高了CTCs分离的灵敏度；二级3D聚焦单元将经一级分离单元处理的细胞聚焦于检测通道横断面中心并呈单排列流过检测区，进而提高了CTCs检测的灵敏度和重现性。
(2)采用“双波长激光同时激发、四色荧光同步检测”的光学检测模块的设计，能够对经一级分离和二级3D聚焦单元处理的、并逐个流经检测区的细胞进行高灵敏、多参数、实时原位的单细胞分析，从而便于灵敏、快速地获取CTCs的分型与计数信息。
(3)集成进样模块、多级微流控芯片、光学检测模块、信号采集与数据处理和系统控制模块的光流控流式细胞仪，可以将一次外周血实验中CTCs的分离、3D聚焦、单细胞分析等操作与灵敏、高通量的分型计数检测集成为自动化一体系统，从而克服现有分离和分析技术独立、人工参与程度高、耗时长、易导致较大的系统误差等不足。
附图说明
构成本发明的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明的整体组成示意图以及光学检测模块的光路原理图。
图2为本发明的多级微流控芯片的结构示意图。
图3为本发明的系统控制模块的组成示意图。
图4为本发明测试添加到健康人血液中两种乳腺癌细胞(SKBR-3和MDA-MB-231细胞)的流型成像图。其中，图(i)和(ii)分别代表在一级分离单元的进口处和出口处的流型成像图；图(iii)和(iV)分别代表一级分离单元内侧出口流出的癌细胞(包括部分尺寸较小的癌细胞和尺寸较大的白细胞)在3D聚焦单元及其出口下游的检测通道区域的流型成像图；实线剪头指示的为SKBR-3和MDA-MB-231的癌细胞(包括部分尺寸较小的癌细胞和尺寸较大的白细胞)；虚线剪头指示的为血细胞(红细胞和白细胞)。
图5为本发明测试添加到健康人血液中两种乳腺癌细胞(SKBR-3和MDA-MB-231细胞)的典型荧光峰图。其中，图(i)和(ii)分别代表一个上皮型且HER2阳性的CTC(即SKBR-3细胞)和一个间质型CTC(即MDA-MB-231细胞)被检测到的典型荧光峰与计数事件。
图6为用本发明和CellSearch系统对15例Ⅳ期转移性乳腺癌患者的分析结果的比对图。
上述附图中标记分别代表：1-进样模块；2-多级微流控芯片；3-光学检测模块；4-信号采集与数据处理模块；5-系统控制模块；201-鞘液入口；202-样品入口；203-一级分离单元的内出口；204-一级分离单元的外出口；205-二级3D聚焦单元的弯道入口的内侧通道；206-二级3D聚焦单元的弯道入口的外侧通道；207-二级3D聚焦单元的弯道；208-垂直鞘液入口；209-光学检测通道；210-水平鞘液入口；211-循环肿瘤细胞出口；212-流阻匹配单元；213-废液出口；214-水平鞘液通道；301-双波长激光器；302-扩束、准直组件；303-第一反射镜1；304-多频带二向色镜；305-第二反射镜2；306-平场消复色差物镜；307-第一二向色镜1；308-第一滤波器；309-第一透镜；310-第一针孔；311-第一光电探测器；312-第二二向色镜；313-第二滤波器；314-第二透镜；315-第二针孔；316-第二光电探测器；317-第三二向色镜；318-第三滤波器；319-第三透镜；320-第三针孔；321-第三光电探测器；322-第四滤波器；323-第四透镜；324-第四针孔；325-第四光电探测器；327-三维平移执行机构；328-三维平移台；501-RS242通讯接口；502-嵌入式微处理器；503-微型注射泵驱动电路；504-三维平移驱动电路；505-双波长激光器的控制电路；506-信号采集与数据处理的控制电路；507-外部计算机(PC机)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如，在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如前文所述，现有的分离和分析技术相互独立的CTCs检测方法，不仅自动化程度低、耗时长，而且在细胞转移、容器更换等环节极易造成样品的损失和污染，导致较大的系统误差。因此，本发明提出一种用于外周血中循环肿瘤细胞分离分析与分型计数检测的光流控流式细胞仪；现结合附图和具体实施方式对本发明进一步进行说明。
实施例1
参考图1-3，一种用于外周血中循环肿瘤细胞分离分析与分型计数检测的光流控流式细胞仪，包括：进样模块1、多级微流控芯片2、光学检测模块3、信号采集与数据处理模块4和系统控制模块5。
所述进样模块1由四路微型注射泵组成；所述四路微型注射泵的输入端与系统控制模块5的微型注射泵驱动电路503相连，构成对四路微型注射泵的独立或/和同步的可编程控制。
所述多级微流控芯片2，包括一级分离单元、二级3D聚焦单元、光学检测通道和流阻匹配单元212；其中：所述一级分离单元为顺时针或逆时针的螺旋通道结构，所述螺旋通道结构的一端设置有鞘液入口201和样品入口202，另一端设置有内出口203和外出口204。
所述二级3D聚焦单元为基于“弯道”的垂直聚焦与基于两个水平鞘液通道的水平聚焦的结合，所述弯道207的弯曲度为90°，所述弯道207的入口端连接有内侧流道205和外侧流道206，所述内侧流道205的另一端和内出口203相连，所述外侧流道206的入口与垂直鞘液入口208相连，所述弯道207的出口端连接有光学检测通道209和水平鞘液通道214，所述水平鞘液通道214为两个，对称分布于光学检测通道209两侧，且水平鞘液通道214与光学检测通道209垂直，所述两个水平鞘液通道的另一端均与水平鞘液入口210相连，构成对来自一级分离单元的循环肿瘤细胞在弯道的出口下游的光学检测通道209横断面上的3D聚焦，并使其以单排列方式流过光学检测通道209；所述光学检测通道209的另一端为循环肿瘤细胞出口211，构成对经一级分离、二级3D聚焦处理的循环肿瘤细胞的实时单细胞分析与快速、准确检测；所述流阻匹配单元为蛇形弯管结构，所述蛇形弯管结构的入口与一级分离单元的外出口204相连，所述蛇形弯管结构的出口为废液出口213，构成对一级分离单元的内、外两个出口的流阻一致,以确保一级分离单元的内、外两个出口203、204的流阻一致以及一级分离单元的分离效果。
所述光学检测模块3包括激光激发光路、荧光收集与探测光路；其中，所述激光激发光路包括：双波长激光器301，扩束、准直组件302，第一反射镜303，多频带二向色镜304，第二反射镜305和平场消复色差物镜306；其中：所述双波长激光器301出射的水平光路上同轴地设有扩束、准直组件302和第一反射镜303，所述第一反射镜303的反射光路上同轴地设有多频带二向色镜304，所述多频带二向色镜304的反射光路上同轴地设有第二反射镜305，所述第二反射镜305的反射光路上同轴地设有平场消复色差物镜306，所述平场消复色差物镜306的作用是：将经扩束、准直组件302整形，以及经第一反射镜303、多频带二向色镜304和第二反射镜305反射的双波长激光聚焦到多级微流控芯片2的检测通道中，以激发样品产生荧光。
所述荧光收集与探测光路包括：平场消复色差物镜306、第二反射镜305、多频带二向色镜304、第一二向色镜307、第一滤波器308、第一透镜309、第一针孔310、第一光电探测器311、第二二向色镜312、第二滤波器313、第二透镜314、第二针孔315、第二光电探测器316、第三二向色镜317、第三滤波器318、第三透镜319、第三针孔320、第三光电探测器321、第四滤波器322、第四透镜323、第四针孔324和第四光电探测器325；其中：
所述第四透镜323的轴与平场消复色差物镜306、第一透镜309、第二透镜314和第三透镜319的轴垂直并相交，且交点处分别设置有第二反射镜305、第一二向色镜307、第二二向色镜312和第三二向色镜317，所述第二反射镜305和第一二向色镜307之间同轴地设有多频带二向色镜304，构成无限远校正荧光收集与探测系统；
所述第一二向色镜1307的反射光路上同轴地依次设置有第一滤波器308、第一透镜309、第一针孔310和第一光电探测器311，构成绿色荧光检测；
所述第二二向色镜312的反射光路上同轴地依次设置有第二滤波器313、第二透镜314、第二针孔315和第二光电探测器316，构成黄色荧光检测；
所述第三二向色镜317的反射光路上同轴地依次设置有第三滤波器318、第三透镜319、第三针孔320和第三光电探测器321，构成红色荧光检测；
所述第三二向色镜317的透射光路上同轴地依次设置有第四滤波器322、第四透镜323、第四针孔324和第四光电探测器325，构成近红外荧光检测。
所述信号采集与数据处理模块4包括四通道数据采集卡和数据处理软件；其中：所述四通道数据采集卡的输入端分别与第一光电探测器311、第二光电探测器316、第三光电探测器321和第四光电探测器325的输出端连接，所述四通道数据采集卡的输出端和系统控制模块5相连，构成对第一光电探测器311、第二光电探测器316、第三光电探测器321和第四光电探测器325的输出电压信号的实时采集。
所述系统控制模块5包括：嵌入式微处理器502和安装有系统控制软件的外部计算机(PC机)507；其中：所述嵌入式微处理器502与外部计算机(PC机)507机之间设有RS242通讯接口501；所述嵌入式微处理器502分别与微型注射泵驱动电路503、三维平移驱动电路504、双波长激光器的控制电路505和信号采集与数据处理的控制电路506相连；所述外部计算机(PC机)507用于对试验参数的设定以及四路微型注射泵、双波长激光器、四通道数据采集卡、三维平移执行机构327和三维平移台328等设备的控制与自动化运行。
实施例2
在实施例1所述的一种用于外周血中循环肿瘤细胞分离分析与分型计数检测的光流控流式细胞仪的技术措施中，所述多级微流控芯片2由PDMS材质的微通道层和玻璃材质的基底层对准键合而成。
实施例3
在实施例1所述的一种用于外周血中循环肿瘤细胞分离分析与分型计数检测的光流控流式细胞仪的技术措施中，所述多级微流控芯片2水平放置于三维平移台328上，通过调节三维平移台，实现多级微流控芯片的光学检测通道209与平场消复色差物镜306焦平面的对中。
实施例4
在实施例1所述的一种用于外周血中循环肿瘤细胞分离分析与分型计数检测的光流控流式细胞仪的技术措施中，所述四路微型注射泵的出口通过注射针管和PTFE导管分别与所述鞘液入口201、样品入口202、垂直鞘液入口208和水平鞘液入口210对应相连，构成对血液样品及鞘液的输送与流速调节；
实施例5
在实施例1所述的一种用于外周血中循环肿瘤细胞分离分析与分型计数检测的光流控流式细胞仪的技术措施中，所述双波长激光器301为蓝色和红色两种固定波长激光器的组合。
实施例6
在实施例1所述的一种用于外周血中循环肿瘤细胞分离分析与分型计数检测的光流控流式细胞仪的技术措施中，所述第一光电探测器311、第二光电探测器316、第三光电探测器321和第四光电探测器325为单光子雪崩二极管。
实施例7
本实施例以实施例1所述的一种用于外周血中循环肿瘤细胞分离分析与分型计数检测的光流控流式细胞仪为测量装置，以添加到健康人血液中的两种乳腺癌细胞(SKBR-3和MDA-MB-231细胞)的测试来阐述本发明细胞仪的工作流程与基本原理，测试结果如图4和5所示。
首先，用针对肿瘤生物标记物的四种抗体直接标记血液标本。例如，对于添加到健康人血液中的乳腺癌CTCs(即SKBR-3和MDA-MB-231细胞)而言，用四种不同荧光的抗体(FTIC-anti-EpCAM、PE-anti-HER2、APC-anti-N-cad和L Alexa
700-anti-CD45)直接标记，任何被认为是上皮型CTC的细胞都有表达EpCAM的阳性荧光信号，HER2的阳性或阴性荧光信号，但没有与N-cad和CD 45相关的信号；任何被认为是间质型CTC的细胞都有表达N-cad的阳性荧光信号，HER2的阳性或阴性荧光信号，但没有与EpCAM和CD45相关的信号；而有EpCAM和N-cad的阳性荧光信号，HER2的阳性或阴性荧光信号，但没有CD 45相关信号的细胞则被认为是混合型CTC。类似的，对于其他类型癌症的CTCs的分型计数检测而言，可选择其他的四种抗体组合。
其次，被标记的血液样品和鞘液被并排注入多级微流控芯片的一级分离单元。在这个单元(即基于螺旋通道的惯性分离)中，利用惯性升力FL和迪恩拖拽力FD与颗粒大小的依赖关系(FL/FD∝aP 3)，可以将CTCs(包括尺寸较小的CTCs和部分尺寸较大的白细胞，即图4(ii)中实线剪头所指的细胞)最终聚焦至通道内壁的稳定平衡位置，而血细胞(白细胞和红细胞，即图4(ii)中虚线剪头所指的细胞)则最终进入通道外壁区域，从而使入口处随机分布的CTCs与白细胞和红细胞(图4(i))在出口处实现分离(图4(ii))，同时避免了较小尺寸CTCs的丢失。与此同时，来自于一级分离单元内侧出口的两束高度方向上的细胞流以及垂直鞘液进入二级3D聚焦单元(即基于弯道的垂直聚焦和水动力的水平聚焦)的弯道的入口后，两束细胞流随Dean涡运动，在高度方向逐渐汇聚，并最终在弯道出口的下游实现垂直方向上的聚焦(图4(iii))；同时在两侧对称分布的水平通道上通入水平鞘液，实现细胞在水平方向上的聚焦(图4(iV))，从而实现细胞在检测通道上的3D汇聚。
最后，对于经过一级分离和二级3D聚焦单元处理并被运输到检测区的每一个细胞，由光学检测模块进行四色荧光的同步探测，同时用信号采集与数据处理模块对这四个荧光参量进行实时在线检测(图5)，从而获取CTCs的分型与计数信息。例如，在497毫秒处的记录中(图5(i))，EpCAM和Her2检测通道(即绿色和黄色荧光检测通道)中都有阳性荧光峰，而N-cad和CD45检测通道(即红色和经红外荧光检测通道)中没有任何显著信号，表明一个上皮型且HER2阳性的CTC(即SKBR-3细胞)在检测区中流过并被计数。类似的，在1100毫秒处(图5(ii))，EpCAM、Her2和CD45检测通道中没有任何显著信号，而N-cad检测通道中有阳性荧光峰，表明一个间质型CTC(即MDA-MB-231细胞)在检测区中流过并被计数。
此外，在上述原理验证的基础上，本实施例还进一步测量了这两种乳腺癌细胞(SKBR-3和MDA-MB-231)的回收率。结果显示：添加到同一健康人血样中两种癌细胞(SKBR-3和MDA-MB-231)的平均回收率优于为953％(n＝8)，且在50分钟内自动完成了1mL全血的整个分离分析过程,包括四种抗体标记的血液样品的注入，以及血样中CTCs的分离、3D聚焦、实时单细胞测量、分型计数和结果输出。
实施例8
本实施例以实施例1所述的一种用于外周血中循环肿瘤细胞分离分析与分型计数检测的光流控流式细胞仪为测量装置，通过对15例Ⅳ期转移性乳腺癌患者血液中CTCs的测试，并结合与CellSearch系统测试结果的比对，进一步阐述本发明用于临床血液样本中CTCs分离分析与分型计数的可行性。基于上述血样样品标记方法和荧光信号峰值的分型计数标准(即上皮型CTCs为EpCAM+/Her2+或Her2-/N-cad-/CD 45-，间质型CTCs为EpCAM-/Her2+或Her2-/N-cad+/CD45-，混合型CTCs为EpCAM+/Her2+或Her2-/N-cad+/CD45-)。得到这15例Ⅳ期转移性乳腺癌患者血液中总的CTCs的平均计数结果为11.2个/mL全血(范围为2-28个/mL全血)，其中上皮型、间质型和混合型CTC的平均数目分别为5.3个/mL全血(范围为1-13个/mL全血)、3.7个/mL(范围为0-16个/mL)和2.2个/mL全血(范围为0-8个/mL全血)。与此同时，我们用FDA批准的CellSearch系统对这15例Ⅳ期转移性乳腺癌患者血液中的CTCs进行了比对检测试验。图6总结了本发明和CellSearch系统的分析结果。归一化后，本发明发现在这15例患者中均有CTCs,每7.5毫升全血中总的CTCs数量为15-210个，平均为84个。而用CellSearch系统只在60％的样本(9例患者)中发现CTCs，每7.5毫升全血中总的CTCs数量为0-62个，平均为23.2个。这种比对清楚地说明：相对于CellSearch系统，本发明设计的这种光流控流式细胞仪是一种更有效的分离分析与分型计数CTCs的技术，并具有更高的灵敏度和通量。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.循环肿瘤细胞分离分析与分型计数的光流控流式细胞仪，其特征在于，包括：进样模块、多级微流控芯片、光学检测模块、信号采集与数据处理模块和系统控制模块；
所述进样模块由四路微型注射泵组成；所述四路微型注射泵的输入端与系统控制模块的微型注射泵驱动电路相连，构成对四路微型注射泵的独立或/和同步的可编程控制；
所述多级微流控芯片包括：一级分离单元、二级3D聚焦单元、光学检测通道和流阻匹配单元；其中：所述一级分离单元为顺时针或逆时针的螺旋通道结构，所述螺旋通道结构的一端设置有鞘液入口和样品入口，另一端设置有内出口和外出口；所述二级3D聚焦单元为基于“弯道”的垂直聚焦与基于两个水平鞘液通道的水平聚焦的结合，所述弯道的弯曲度为90°，所述弯道的入口端连接有内侧流道和外侧流道，所述内侧流道的另一端和一级分离单元的内出口相连，所述外侧流道的入口与垂直鞘液入口相连，所述弯道的出口端连接有光学检测通道和水平鞘液通道，所述水平鞘液通道为两个，对称分布于光学检测通道两侧，且水平鞘液通道与光学检测通道垂直，所述两个水平鞘液通道的另一端均与水平鞘液入口相连；所述光学检测通道的另一端为循环肿瘤细胞出口；所述流阻匹配单元为蛇形弯管结构，所述蛇形弯管结构的入口与一级分离单元的外出口相连，所述蛇形弯管结构的出口为废液出口；
所述光学检测模块包括激光激发光路、荧光收集与探测光路；其中，所述激光激发光路包括：双波长激光器，扩束、准直组件，第一反射镜，多频带二向色镜，第二反射镜和平场消复色差物镜；其中：所述双波长激光器出射的水平光路上同轴地设有扩束、准直组件和第一反射镜，所述第一反射镜的反射光路上同轴地设有多频带二向色镜，所述多频带二向色镜的反射光路上同轴地设有第二反射镜，所述第二反射镜的反射光路上同轴地设有平场消复色差物镜；
所述荧光收集与探测光路包括：平场消复色差物镜、第二反射镜、多频带二向色镜、第一二向色镜、第一滤波器、第一透镜、第一针孔、第一光电探测器、第二二向色镜、第二滤波器、第二透镜、第二针孔、第二光电探测器、第三二向色镜、第三滤波器、第三透镜、第三针孔、第三光电探测器、第四滤波器、第四透镜、第四针孔和第四光电探测器；其中：
所述第四透镜的轴与平场消复色差物镜、第一透镜、第二透镜和第三透镜的轴垂直并相交，且交点处分别设置有第二反射镜、第一二向色镜、第二二向色镜和第三二向色镜，所述第二反射镜和第一二向色镜之间同轴地设有多频带二向色镜；
所述第一二向色镜的反射光路上同轴地依次设置有第一滤波器、第一透镜、第一针孔和第一光电探测器，构成绿色荧光检测；
所述第二二向色镜的反射光路上同轴地依次设置有第二滤波器、第二透镜、第二针孔和第二光电探测器，构成黄色荧光检测；
所述第三二向色镜的反射光路上同轴地依次设置有第三滤波器、第三透镜、第三针孔和第三光电探测器，构成红色荧光检测；
所述第三二向色镜的透射光路上同轴地依次设置有第四滤波器、第四透镜、第四针孔和第四光电探测器，构成近红外荧光检测；
所述信号采集与数据处理模块包括四通道数据采集卡和数据处理软件；其中：所述四通道数据采集卡的输入端分别与第一光电探测器、第二光电探测器、第三光电探测器和第四光电探测器的输出端连接，所述四通道数据采集卡的输出端和系统控制模块相连；
所述系统控制模块包括：嵌入式微处理器和安装有系统控制软件的外部计算机；其中：所述嵌入式微处理器与外部计算机之间设有RS242通讯接口；所述嵌入式微处理器分别与微型注射泵驱动电路、三维平移驱动电路、双波长激光器的控制电路和信号采集与数据处理的控制电路相连；所述外部计算机用于对试验参数的设定以及四路微型注射泵、双波长激光器、四通道数据采集卡、三维平移执行机构和三维平移台的控制与自动化运行；
所述四路微型注射泵的出口通过注射针管和PTFE导管分别与所述鞘液入口、样品入口、垂直鞘液入口和水平鞘液入口对应相连。
2.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离分析与分型计数的光流控流式细胞仪，其特征在于，所述多级微流控芯片由PDMS材质的微通道层和玻璃材质的基底层对准键合而成。
3.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离分析与分型计数的光流控流式细胞仪，其特征在于，所述多级微流控芯片水平放置于三维平移台上，通过调节三维平移台，实现多级微流控芯片的光学检测通道与平场消复色差物镜焦平面的对中。
4.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离分析与分型计数的光流控流式细胞仪，其特征在于，所述双波长激光器为蓝色和红色两种固定波长激光器的组合。
5.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离分析与分型计数的光流控流式细胞仪，其特征在于，所述第一光电探测器、第二光电探测器、第三光电探测器和第四光电探测器为单光子雪崩二极管。
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