CN114260037B - 一种3d堆叠式多级惯性微流控分选芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片及其制备方法。该芯片包括依次堆叠的六层芯片单元；第一芯片单元上设置有梯形截面螺旋管道。第二芯片单元上设置有第二级主蛇形管道。第三芯片单元上设置有第三级主蛇形管道。第四芯片单元上设置有第四级主蛇形管道。本发明通过平面工艺制得每一层结构后，依靠标记点，相互堆叠键合，制备简单，提高了多级微流控芯片的集成度。本发明制备完成的芯片，仅需要在特定流速下输入混合样本的溶液，能够实现高效分选和降速的自动化，得到的样本溶液可以直接与成像检测系统相连，进行下一步的分析诊断。此外，本发明能够通过堵塞部分出口的方式，在三种模式中切换，以适应不同的分选要求。

Description

一种3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及细胞分选技术、微流控技术，尤其是涉及了基于惯性原理的微流控分选技术。

背景技术

疾病的诊断和药物分析往往需要获得纯化的目标样本，比如癌症或者败血症，需要从血液中分离获得循环肿瘤细胞或者白细胞。但是，用于疾病诊断的目标细胞在血液中含量很少，如何将目标样本从大量细胞的异质背景中分离出来显得极为重要。这也是为什么细胞分选技术作为生物样本制备的关键技术，一直备受关注。如今临床应用的细胞分选技术已经趋于成熟，包括密度梯度离心，荧光激活细胞分选和磁激活细胞分选等。但是这些技术在操作上依赖专业人员，无法满足现场即时诊疗(POCT)的应用。

而微流控分选技术能在微尺度上精确控制液滴或者细胞的位移，具有设备尺寸小，消耗低，自动化等优点，在POCT的细胞分选技术应用中具有巨大潜力。特别是基于惯性原理的惯性微流控分选技术，其仅依赖纯流体动力和管道结构能够以高流速实现基于尺寸的分选。惯性微流控分选技术其分选主要依赖惯性聚焦效应和Dean涡流现象。粒子或者细胞在直流道中受到剪切诱导升力和壁诱导升力的作用，即受到惯性升力，聚集到管道的平衡位置。该现象称为惯性聚焦效应。当在直流道中加入障碍物或者缩扩腔，或者是弯流道中，在横向上会产生上下相反的两个涡流，称为Dean涡流。粒子/细胞受Dean涡流影响会受粘性力，即Dean曳力随着涡流运动，最终在惯性升力和Dean曳力的平衡下达到平衡位置。因为粒子/细胞的尺寸不同，其平衡位置不同，从而实现分离。

因此惯性微流控分选技术是一种结构简单，操作容易的高通量分选技术。但是仅依靠单一结构的惯性微流控管道，无法实现高纯度的分选性能，也无法直接和下游的分析检测技术集成。因此一种能够提高分选性能并降低流速的多级惯性微流控芯片可以解决这些问题。而多级结构往往会增大整个芯片的面积，所以一种好的管道设计和堆叠结构能够克服这个问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片，旨在解决现有惯性微流控芯片的不足，为便携快捷的医疗诊断提供解决方案。该多级分选芯片能够实现不同尺寸细胞的分选，例如血细胞和肿瘤细胞；经过多级降速后能够直接和下游成像检测系统相结合。

一种3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片，包括依次堆叠的六层芯片单元；六层芯片单元分别为第一芯片单元、第二芯片单元、第三芯片单元、第四芯片单元、第五芯片单元和第六芯片单元。第一芯片单元上设置有梯形截面螺旋管道。第二芯片单元上设置有第二级主蛇形管道。第三芯片单元上设置有第三级主蛇形管道。第四芯片单元上设置有第四级主蛇形管道。第一芯片单元上的梯形截面螺旋管道的收集口与第二芯片单元上的第二级主蛇形管道的输入端对齐并连通；第二芯片单元上的第二级主蛇形管道的收集口与第三芯片单元上的第三级主蛇形管道的输入端对齐并连通；第三芯片单元上的第三级主蛇形管道的收集口与第四芯片单元上的第四级主蛇形管道的输入端对齐并连通。第四芯片单元上的第四级主蛇形管道的收集口与贯穿第五芯片单元和第六芯片单元的芯片细胞出口对齐并连通。

作为优选，所述的第二芯片单元上设置有用于流阻匹配的蛇形管道；第三芯片单元上设置有用于流阻匹配的蛇形管道；第四芯片单元上均设置有用于流阻匹配的蛇形管道和直管道。

作为优选，所述的第二芯片单元上设置有第二级副蛇形管道。第三芯片单元上设置有第三级一号副蛇形管道、第三级二号副蛇形管道和第三级三号副蛇形管道。第四芯片单元上设置有第四级一号副蛇形管道、第四级二号副蛇形管道、第四级一号直管道、第四级二号直管道和第四级三号直管道。

芯片的顶面开设有入液口、第一级细胞通流孔、第一级废液通流孔、第二级细胞通流孔及其对应的废液通流孔、第三级细胞通流孔及其对应的废液通流孔。入液口仅在第一芯片单元上，并位于梯形截面螺旋管道的输入端；第一级细胞通流孔和第一级废液通流孔从第一芯片单元延伸至第二芯片单元，并将梯形截面螺旋管道的收集口和废液口分别与第二级主蛇形管道和第二级副蛇形管道的输入端连接在一起。第二级细胞通流孔、第二级一号废液通流孔、第二级二号废液通流孔和第二级三号废液通流孔从第一芯片单元延伸至第三芯片单元，并将第二级主蛇形管道的收集口和两个废液口、第二级副蛇形管道的输出端分别与第三级主蛇形管道、第三级一号副蛇形管道、第三级二号副蛇形管道和第三级三号副蛇形管道的输入端相连接。

第三级细胞通流孔、第三级一号废液通流孔、第三级二号废液通流孔、第三级三号废液通流孔、第三级四号废液通流孔、第三级五号废液通流孔从第一芯片单元延伸至第四芯片单元，并将第三级主蛇形管道的收集口和两个废液口、第三级一号副蛇形管道的输出端、第三级二号副蛇形管道的输出端和第三级三号副蛇形管道的输出端分别与第四级主蛇形管道、第四级一号副蛇形管道、第四级二号副蛇形管道、第四级一号直管道、第四级二号直管道、第四级三号直管道的输入端连接在一起。

作为优选，芯片底面开设有一号废液出口、二号废液出口和芯片细胞出口。一号废液出口和二号废液出口从第六芯片单元延伸至第五芯片单元，作为芯片的废液出口。

作为优选，芯片内部开设有第四级一号废液通流孔、第四级二号废液通流孔、第四级三号废液通流孔、第四级四号废液通流孔、第四级五号废液通流孔、第四级六号废液通流孔和第四级七号废液通流孔。第四级一号废液通流孔、第四级二号废液通流孔、第四级三号废液通流孔、四级四号废液通流孔、第四级五号废液通流孔、第四级六号废液通流孔和第四级七号废液通流孔均从第四芯片单元延伸至第五芯片单元，将第四级主蛇形管道、第四级一号副蛇形管道、第四级二号副蛇形管道、第四级一号直管道、第四级二号直管道和第四级三号直管道的输出端和两个汇流通道的输入端连接在一起。第五芯片单元上设置有连接第四级一号废液通流孔、第四级二号废液通流孔、第四级三号废液通流孔与一号废液出口的第一汇流通道；第五芯片单元上设置有连接第四级四号废液通流孔、第四级五号废液通流孔、第四级六号废液通流孔和第四级七号废液通流孔与二号废液出口的第二汇流通道。

作为优选，芯片上开设有不在同一直线上的一号标记点、二号标记点和三号标记点。一号标记点、二号标记点、三号标记点贯穿六层芯片单元。

作为优选，所述梯形截面螺旋管道的圈数为七圈，截面为梯形截面，具体是宽400μm，内壁高60μm，外壁高90μm的直角梯形，能够在1.3mL/min的最佳流速下分离血细胞和肿瘤细胞。

所述第二级主蛇形管道b1的结构为折叠型，管道高度为50μm，管道宽度为200μm，周期数为9，用作分选降速，能够在600μL/min的最佳流速下分离血细胞和肿瘤细胞，经过该管道流速减小到1/3。

所述第三级主蛇形管道c1的结构为折叠型，管道高度为50μm，管道宽度为150μm，周期数为12，用作分选降速，能在200μL/min的最佳流速下分离血细胞和肿瘤细胞，经过该管道流速减小到1/3。

所述第四级主蛇形管道d1的结构为折叠型，管道高度为50μm，管道宽度为100μm，周期数为16，用作分选降速，能在60μL/min的最佳流速下分离血细胞和肿瘤细胞，经过该管道流速减小到1/3。

作为优选，该3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片具有三种使用模式，分别为二级分选模式、三级分选模式和四级分选模式。

四级分选模式下，入口为入液口，出口为细胞出口，样本经过四级分选后输出。

三级分选模式下，第四芯片单元上第四级主蛇形管道、第四级一号副蛇形管道、第四级二号副蛇形管道、第四级一号直管道、第四级二号直管道、第四级三号直管道的输入端封闭，入口为入液口，出口为第三级细胞通流孔，样本经过三级分选后输出。

二级分选模式下，当第三芯片单元上第三级主蛇形管道、第三级一号副蛇形管道、第三级二号副蛇形管道、第三级三号副蛇形管道的输入端封闭，入口为入液口，出口为第二级细胞通流孔，样本经过两级分选后输出。

该3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)在第六芯片单元上开设第四级细胞通流孔、一号废液出口、二号废液出口；在第五芯片单元上开设第四级一号废液通流孔、第四级二号废液通流孔和第四级三号废液通流孔、第四级四号废液通流孔、第四级五号废液通流孔、第四级六号废液通流孔、第四级七号废液通流孔。

(2)将第五芯片单元通过标记点和第六芯片单元键合。

(3)在第四芯片单元上开设第三级细胞通流孔、第三级一号废液通流孔、第三级二号废液通流孔、第三级三号废液通流孔、第三级四号废液通流孔、第三级五号废液通流孔；然后将第四芯片单元通过标记点和第五芯片单元精准键合。

(4)在第三芯片单元上开设第二级细胞通流孔、第二级一号废液通流孔、第二级二号废液通流孔、第二级三号废液通流孔；在第二芯片单元上开设第一级细胞通流孔、第一级废液通流孔；在第一芯片单元上开设入液口。

(5)依次进行第三芯片单元、第二芯片单元和第一芯片单元的键合，3D堆叠式惯性微流控分选芯片制备完成。

本发明的有益效果为：

本发明通过平面工艺制得每一层结构后，依靠标记点，相互堆叠键合，制备简单，提高了多级微流控芯片的集成度。本发明制备完成的芯片，仅需要在特定流速下输入混合样本的溶液，能够实现高效分选和降速的自动化，得到的样本溶液可以直接与成像检测系统相连，进行下一步的分析诊断。此外，本发明能够通过堵塞部分出口的方式，在三种模式中切换，以适应不同的分选要求。

附图说明

图1为本发明的堆叠结构示意图；

图2为本发明中各层结构的分离示意图；

图3为本发明的芯片概念和管道截面图；

其中，A、第一芯片单元，B、第二芯片单元，C、第三芯片单元，D、第四芯片单元，E、第五芯片单元，F、第六芯片单元；a、梯形截面螺旋管道，b1、第二级主蛇形管道，b2、第二级副蛇形管道，c1、第三级主蛇形管道，c2、第三级一号副蛇形管道，c3、第三级二号副蛇形管道，c4、第三级三号副蛇形管道，d1、第四级主蛇形管道，d2、第四级一号副蛇形管道，d3、第四级二号副蛇形管道，d4、第四级一号直管道，d5、第四级二号直管道，d6、第四级三号直管道；1、入液口，2、第一级细胞通流孔，3、第一级废液通流孔，4、第二级细胞通流孔，5、第二级一号废液通流孔，6、第二级二号废液通流孔，7、第二级三号废液通流孔，8、第三级细胞通流孔，9、第三级一号废液通流孔，10、第三级二号废液通流孔，11、第三级三号废液通流孔，12、第三级四号废液通流孔，13、第三级五号废液通流孔，14、芯片细胞出口，15、第四级一号废液通流孔，16、第四级二号废液通流孔，17、第四级三号废液通流孔，18、第四级四号废液通流孔，19、第四级五号废液通流孔，20、第四级六号废液通流孔，21、第四级七号废液通流孔，22、一号废液出口，23、二号废液出口，24、一号标记点，25、二号标记点，26、三号标记点；Ⅰ、梯形截面，Ⅱ、第一矩形截面，Ⅲ、第二矩形截面，Ⅳ、第三矩形截面。

具体实施方式

下面结合说明书附图对本发明的技术方案做进一步说明。

如图1所示，本发明的3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片，由6层芯片单元堆叠而成；6层芯片单元分别为第一芯片单元A、第二芯片单元B、第三芯片单元C、第四芯片单元D、第五芯片单元E和第六芯片单元F。第一芯片单元A采用梯形截面螺旋管道，用于初步的细胞分选；第二芯片单元B采用对称矩形截面蛇形管道，用于分选和降速；第三芯片单元C采用对称矩形蛇形管道，用于进一步的分选和降速；第四芯片单元D采用对称矩形截面蛇形管道，用于最终的分选和降速；第五芯片单元E用于出口匹配，减少输出的出口数目；第六芯片单元F为出口层，用于最终的分选输出。

如图2所示，本发明的3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片的每一层芯片单元的详细结构。

第一芯片单元A上设置有梯形截面螺旋管道a1。第二芯片单元B上设置有第二级主蛇形管道b1和第二级副蛇形管道b2。第三芯片单元C上设置有第三级主蛇形管道c1、第三级一号副蛇形管道c2、第三级二号副蛇形管道c3和第三级三号副蛇形管道c4。第四芯片单元D上设置有第四级主蛇形管道d1、第四级一号副蛇形管道d2、第四级二号副蛇形管道d3、第四级一号直管道d4、第四级二号直管道d5和第四级三号直管道d6。

梯形截面螺旋管道a1能够在1.3mL/min的最佳流速下分离血细胞和肿瘤细胞。

第二级主蛇形管道b1的结构为折叠型(折两次)，管道高度为50μm，管道宽度为200μm，周期数为9，用作分选降速，能够在600μL/min的最佳流速下分离血细胞和肿瘤细胞，经过该管道流速减小到1/3。

第三级主蛇形管道c1的结构为折叠型(折一次)，管道高度为50μm，管道宽度为150μm，周期数为12，用作分选降速，能在200μL/min的最佳流速下分离血细胞和肿瘤细胞，经过该管道流速减小到1/3。

第四级主蛇形管道d1的结构为折叠型(折一次)，管道高度为50μm，管道宽度为100μm，周期数为16，用作分选降速，能在60μL/min的最佳流速下分离血细胞和肿瘤细胞，经过该管道流速减小到1/3。

该3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片的顶面开设有入液口1、第一级细胞通流孔2、第一级废液通流孔3、第二级细胞通流孔4及其对应的废液通流孔、第三级细胞通流孔8及其对应的废液通流孔。入液口1仅在第一芯片单元A上，并位于梯形截面螺旋管道a1的输入端；第一级细胞通流孔2和第一级废液通流孔3从第一芯片单元A延伸至第二芯片单元B，并将梯形截面螺旋管道a1的收集口和废液口分别与第二级主蛇形管道b1和第二级副蛇形管道b2的输入端连接在一起。第二级细胞通流孔4、第二级一号废液通流孔5、第二级二号废液通流孔6和第二级三号废液通流孔7从第一芯片单元A延伸至第三芯片单元C，并将第二级主蛇形管道b1的收集口和两个废液口、第二级副蛇形管道b2的输出端分别与第三级主蛇形管道c1、第三级一号副蛇形管道c2、第三级二号副蛇形管道c3和第三级三号副蛇形管道c4的输入端相连接。

第三级细胞通流孔8、第三级一号废液通流孔9、第三级二号废液通流孔10、第三级三号废液通流孔11、第三级四号废液通流孔12、第三级五号废液通流孔13从第一芯片单元A延伸至第四芯片单元D，并将第三级主蛇形管道c1的收集口和两个废液口、第三级一号副蛇形管道c2的输出端、第三级二号副蛇形管道c3的输出端和第三级三号副蛇形管道c4的输出端分别与第四级主蛇形管道d1、第四级一号副蛇形管道d2、第四级二号副蛇形管道d3、第四级一号直管道d4、第四级二号直管道d5、第四级三号直管道d6的输入端连接在一起。

该3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片的底面开设有一号废液出口22、二号废液出口23和芯片细胞出口14。一号废液出口22和二号废液出口23从第六芯片单元F延伸至第五芯片单元E，作为芯片的废液出口。芯片细胞出口14从第六芯片单元F延伸至第四芯片单元D，将第四级主蛇形管道d1的收集口和芯片的细胞出口连接在一起。

该3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片的内部开设有第四级一号废液通流孔15、第四级二号废液通流孔16、第四级三号废液通流孔17、第四级四号废液通流孔18、第四级五号废液通流孔19、第四级六号废液通流孔20和第四级七号废液通流孔21。其中，第四级一号废液通流孔15、第四级二号废液通流孔16、第四级三号废液通流孔17、四级四号废液通流孔18、第四级五号废液通流孔19、第四级六号废液通流孔20和第四级七号废液通流孔21均从第四芯片单元D延伸至第五芯片单元E，将第四级主蛇形管道d1、第四级一号副蛇形管道d2、第四级二号副蛇形管道d3、第四级一号直管道d4、第四级二号直管道d5和第四级三号直管道d6的输出端和两个汇流通道的输入端连接在一起。

第五芯片单元E上设置有连接第四级一号废液通流孔15、第四级二号废液通流孔16、第四级三号废液通流孔17与一号废液出口22的第一汇流通道；第五芯片单元E上设置有连接第四级四号废液通流孔18、第四级五号废液通流孔19、第四级六号废液通流孔20和第四级七号废液通流孔21与二号废液出口23的第二汇流通道；

该3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片上开设有不在同一直线上的一号标记点24、二号标记点25和三号标记点26。一号标记点24、二号标记点25、三号标记点26贯穿整个芯片，用作精准键合。

本发明的3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片的多级概念图和每一级的管道截面结构如图3所示。整个多级惯性微流控分选芯片由4级管道组成，梯形截面螺旋管道a1的截面为梯形截面Ⅰ，其是宽度400μm，内壁高60μm，外壁高90μm的直角梯形；第二级主蛇形管道b1的截面为第一矩形截面Ⅱ，其是宽度200μm，高度为50μm的矩形截面；第三级主蛇形管道c1的第二矩形截面Ⅲ为宽度150μm，高度为50μm的矩形截面；第四级主蛇形管道d1的截面为第三矩形截面Ⅳ，其是宽度为100μm，高度为50μm的矩形截面。

芯片堆叠集成的具体步骤：

(1)在第六芯片单元F上开设第四级细胞通流孔14、一号废液出口22、二号废液出口23；在第五芯片单元E上开设第四级一号废液通流孔15、第四级二号废液通流孔16和第四级三号废液通流孔17、第四级四号废液通流孔18、第四级五号废液通流孔19、第四级六号废液通流孔20、第四级七号废液通流孔21。

(2)将第六芯片单元F固定作为底部，第五芯片单元E通过标记点和第六芯片单元精准键合。

(3)在第四芯片单元D上开设第三级细胞通流孔8、第三级一号废液通流孔9、第三级二号废液通流孔10、第三级三号废液通流孔11、第三级四号废液通流孔12、第三级五号废液通流孔13；然后将第四芯片单元D通过标记点和第五芯片单元E精准键合。

(4)在第三芯片单元C上开设第二级细胞通流孔4、第二级一号废液通流孔5、第二级二号废液通流孔6、第二级三号废液通流孔7；在第二芯片单元上开设第一级细胞通流孔2、第一级废液通流孔3；在第一芯片单元上开设入液口1。

(5)将第三芯片单元、第二芯片单元和第一芯片单元依次和下一层芯片单元对准并键合，至此3D堆叠式惯性微流控分选芯片制备完成。

该3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片的使用方法如下：

该芯片具有三种使用模式，分别为二级分选模式、三级分选模式和四级分选模式，能够满足下游不同检测技术的各种流速要求。

四级分选模式即使用整体3D堆叠式惯性微流控分选芯片，由一级梯形截面螺旋管道和三级矩形截面蛇形管道组成，入口为入液口1，出口为细胞出口14、一号废液出口22和二号废液出口23。

三级分选模式主要由一级梯形截面螺旋管道和二级矩形截面蛇形管道组成，入口为入液口1，出口为第三级细胞通流孔8、第三级一号废液通流孔9、第三级二号废液通流孔10、第三级三号废液通流孔11、第三级四号废液通流孔12、第三级五号废液通流孔13。

需要进入三级分选模式时，将第四芯片单元D上第四级主蛇形管道d1、第四级一号副蛇形管道d2、第四级二号副蛇形管道d3、第四级一号直管道d4、第四级二号直管道d5、第四级三号直管道d6的输入端封闭，并在第一芯片单元A上开设第三级细胞通流孔8、第三级一号废液通流孔9、第三级二号废液通流孔10、第三级三号废液通流孔11、第三级四号废液通流孔12、第三级五号废液通流孔13，得到第一芯片单元至第三芯片单元集成的三级分选芯片。

二级分选模式主要由一级梯形截面螺旋管道和一级矩形截面蛇形管道组成，入口为入液口1，出口为第二级细胞通流孔4、第二级一号废液通流孔5、第二级二号废液通流孔6和第二级三号废液通流孔7。

需要进入二级分选模式时，当第三芯片单元C上第三级主蛇形管道c1、第三级一号副蛇形管道c2、第三级二号副蛇形管道c3、第三级三号副蛇形管道c4的输入端封闭，并在第一芯片单元A上开设第二级细胞通流孔4、第二级一号废液通流孔5、第二级二号废液通流孔6和第二级三号废液通流孔7，得到第一芯片单元和第二芯片单元集成的两级分选芯片。

Claims (5)

1.一种3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片，其特征在于：包括依次叠置的六层芯片单元；六层芯片单元分别为第一芯片单元（A）、第二芯片单元（B）、第三芯片单元（C）、第四芯片单元（D）、第五芯片单元（E）和第六芯片单元（F）；第一芯片单元（A）上设置有梯形截面螺旋管道（a1）；第二芯片单元（B）上设置有第二级主蛇形管道（b1）；第三芯片单元（C）上设置有第三级主蛇形管道（c1）；第四芯片单元（D）上设置有第四级主蛇形管道（d1）；第一芯片单元（A）上的梯形截面螺旋管道（a1）的收集口与第二芯片单元（B）上的第二级主蛇形管道（b1）的输入端对齐并连通；

梯形截面螺旋管道（a1）的收集口和废液口位于梯形截面螺旋管道（a1）的内部；梯形截面螺旋管道（a1）的输入端位于梯形截面螺旋管道（a1）的外部；

第二芯片单元（B）上的第二级主蛇形管道（b1）的收集口与第三芯片单元（C）上的第三级主蛇形管道（c1）的输入端对齐并连通；第三芯片单元（C）上的第三级主蛇形管道（c1）的收集口与第四芯片单元（D）上的第四级主蛇形管道（d1）的输入端对齐并连通；第四芯片单元（D）上的第四级主蛇形管道（d1）的收集口与贯穿第五芯片单元（E）和第六芯片单元（F）的芯片细胞出口（14）对齐并连通；

所述的第二芯片单元（B）上设置有第二级副蛇形管道（b2）；第三芯片单元（C）上设置有第三级一号副蛇形管道（c2）、第三级二号副蛇形管道（c3）和第三级三号副蛇形管道（c4）；第四芯片单元（D）上设置有第四级一号副蛇形管道（d2）、第四级二号副蛇形管道（d3）、第四级一号直管道（d4）、第四级二号直管道（d5）和第四级三号直管道（d6）；

芯片的顶面开设有入液口（1）、第一级细胞通流孔（2）、第一级废液通流孔（3）、第二级细胞通流孔（4）及其对应的废液通流孔、第三级细胞通流孔（8）及其对应的废液通流孔；入液口（1）仅在第一芯片单元（A）上，并位于梯形截面螺旋管道（a1）的输入端；第一级细胞通流孔（2）和第一级废液通流孔（3）从第一芯片单元（A）延伸至第二芯片单元（B），并将梯形截面螺旋管道（a1）的收集口和废液口分别与第二级主蛇形管道（b1）和第二级副蛇形管道（b2）的输入端连接在一起；第二级细胞通流孔（4）、第二级一号废液通流孔（5）、第二级二号废液通流孔（6）和第二级三号废液通流孔（7）从第一芯片单元（A）延伸至第三芯片单元（C），并将第二级主蛇形管道（b1）的收集口和两个废液口、第二级副蛇形管道（b2）的输出端分别与第三级主蛇形管道（c1）、第三级一号副蛇形管道（c2）、第三级二号副蛇形管道（c3）和第三级三号副蛇形管道（c4）的输入端相连接；

第三级细胞通流孔（8）、第三级一号废液通流孔（9）、第三级二号废液通流孔（10）、第三级三号废液通流孔（11）、第三级四号废液通流孔（12）、第三级五号废液通流孔（13）从第一芯片单元（A）延伸至第四芯片单元（D），并将第三级主蛇形管道（c1）的收集口和两个废液口、第三级一号副蛇形管道（c2）的输出端、第三级二号副蛇形管道（c3）的输出端和第三级三号副蛇形管道（c4）的输出端分别与第四级主蛇形管道（d1）、第四级一号副蛇形管道（d2）、第四级二号副蛇形管道（d3）、第四级一号直管道（d4）、第四级二号直管道（d5）、第四级三号直管道（d6）的输入端连接在一起；

芯片底面开设有一号废液出口（22）、二号废液出口（23）和芯片细胞出口（14）；一号废液出口（22）和二号废液出口（23）从第六芯片单元（F）延伸至第五芯片单元（E），作为芯片的废液出口；

芯片内部开设有第四级一号废液通流孔（15）、第四级二号废液通流孔（16）、第四级三号废液通流孔（17）、第四级四号废液通流孔（18）、第四级五号废液通流孔（19）、第四级六号废液通流孔（20）和第四级七号废液通流孔（21）；第四级一号废液通流孔（15）、第四级二号废液通流孔（16）、第四级三号废液通流孔（17）、第四级四号废液通流孔（18）、第四级五号废液通流孔（19）、第四级六号废液通流孔（20）和第四级七号废液通流孔（21）均从第四芯片单元（D）延伸至第五芯片单元（E），将第四级主蛇形管道（d1）、第四级一号副蛇形管道（d2）、第四级二号副蛇形管道（d3）、第四级一号直管道（d4）、第四级二号直管道（d5）和第四级三号直管道（d6）的输出端与汇流通道的输入端连接在一起；第五芯片单元（E）上设置有连接第四级一号废液通流孔（15）、第四级二号废液通流孔（16）、第四级三号废液通流孔（17）与一号废液出口（22）的第一汇流通道；第五芯片单元（E）上设置有连接第四级四号废液通流孔（18）、第四级五号废液通流孔（19）、第四级六号废液通流孔（20）和第四级七号废液通流孔（21）与二号废液出口（23）的第二汇流通道；

所述梯形截面螺旋管道（a1）的圈数为七圈，截面为梯形截面，具体是宽度400μm，内壁高60μm，外壁高90μm的直角梯形，能够在1.3mL/min的最佳流速下分离血细胞和肿瘤细胞；

所述第二级主蛇形管道（b1）的结构为折叠型，管道高度为50μm，管道宽度为200μm，周期数为9，用作分选降速，能够在600μL/min的最佳流速下分离血细胞和肿瘤细胞，经过该管道流速减小到1/3；

所述第三级主蛇形管道（c1）的结构为折叠型，管道高度为50μm，管道宽度为150μm，周期数为12，用作分选降速，能在200μL/min的最佳流速下分离血细胞和肿瘤细胞，经过该管道流速减小到1/3；

所述第四级主蛇形管道（d1）的结构为折叠型，管道高度为50μm，管道宽度为100μm，周期数为16，用作分选降速，能在60μL/min的最佳流速下分离血细胞和肿瘤细胞，经过该管道流速减小到1/3。

2.根据权利要求1所述的一种3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片，其特征在于：所述的第二芯片单元（B）上设置有用于流阻匹配的蛇形管道；第三芯片单元（C）上设置有用于流阻匹配的蛇形管道；第四芯片单元（D）上设置有用于流阻匹配的蛇形管道和直管道。

3.根据权利要求1所述的一种3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片，其特征在于：芯片上开设有不在同一直线上的一号标记点（24）、二号标记点（25）和三号标记点（26）；一号标记点（24）、二号标记点（25）、三号标记点（26）贯穿六层芯片单元。

4.根据权利要求1所述的一种3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片，其特征在于：该3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片具有三种使用模式，分别为二级分选模式、三级分选模式和四级分选模式；

四级分选模式下，入口为入液口（1），出口为芯片细胞出口（14），样本经过四级分选后输出；

三级分选模式下，第四芯片单元（D）上第四级主蛇形管道（d1）、第四级一号副蛇形管道（d2）、第四级二号副蛇形管道（d3）、第四级一号直管道（d4）、第四级二号直管道（d5）、第四级三号直管道（d6）的输入端封闭，入口为入液口（1），出口为第三级细胞通流孔（8），样本经过三级分选后输出；

二级分选模式下，当第三芯片单元（C）上第三级主蛇形管道（c1）、第三级一号副蛇形管道（c2）、第三级二号副蛇形管道（c3）、第三级三号副蛇形管道（c4）的输入端封闭，入口为入液口（1），出口为第二级细胞通流孔（4），样本经过两级分选后输出。

5.如权利要求1所述的一种3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）在第六芯片单元（F）上开设芯片细胞出口（14）、一号废液出口（22）、二号废液出口（23）；在第五芯片单元（E）上开设第四级一号废液通流孔（15）、第四级二号废液通流孔（16）和第四级三号废液通流孔（17）、第四级四号废液通流孔（18）、第四级五号废液通流孔（19）、第四级六号废液通流孔（20）、第四级七号废液通流孔（21）；

（2）将第五芯片单元（E）通过标记点和第六芯片单元键合；

（3）在第四芯片单元（D）上开设第三级细胞通流孔（8）、第三级一号废液通流孔（9）、第三级二号废液通流孔（10）、第三级三号废液通流孔（11）、第三级四号废液通流孔（12）、第三级五号废液通流孔（13）；然后将第四芯片单元（D）通过标记点和第五芯片单元（E）精准键合；

（4）在第三芯片单元（C）上开设第二级细胞通流孔（4）、第二级一号废液通流孔（5）、第二级二号废液通流孔（6）、第二级三号废液通流孔（7）；在第二芯片单元上开设第一级细胞通流孔（2）、第一级废液通流孔（3）；在第一芯片单元上开设入液口（1）；

（5）依次进行第三芯片单元、第二芯片单元和第一芯片单元的键合，得到3D堆叠式惯性微流控分选芯片制备完成。

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