CN111690534B - 一种基于黏弹性聚焦技术的肿瘤细胞多级分选装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于黏弹性聚焦技术的肿瘤细胞多级分选装置，包括界面黏弹性分选流道，所述界面黏弹性分选流道的双侧支路和中间支路交汇于主流道，所述双侧支路的入口处设置样品入口，所述中间支路的入口处设置鞘液入口；所述主流道末端分裂为三个分支流道，两侧的正弦流阻流道末端设置有血细胞出口，中间的非对称方形突扩流道末端分裂成第四分支流道和第五分支流道，所述第四分支流道末端设置有残余白细胞出口，所述第五分支流道末端设置有肿瘤细胞出口。本发明充分利用界面黏弹性技术的优势，样品入口可直接通入纯血或者胸腔腹腔积液，突破传统惯性分选方法需要预处理的不足，鞘液入口使用透明质酸溶液，可有效提升黏弹性分选方法的通量。

Description

一种基于黏弹性聚焦技术的肿瘤细胞多级分选装置
技术领域
本发明属于多级分选微流控器件技术，具体涉及一种基于黏弹性聚焦技术的肿瘤细胞多级分选装置。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)作为进入人体外周循环血液的种子，在临床上被认为是肿瘤发生转移的早期征兆，检测血液中循环肿瘤细胞对癌症病情的早期诊断具有重要意义。检测循环肿瘤细胞，最大的挑战在于其数量极其稀少，通常情况下其对人体正常红细胞的比例仅约为1:109，或在1mL血液中仅有1-100个循环肿瘤细胞。而目前的循环肿瘤分离方法往往需要进行预处理，如对血液进行裂解或对循环肿瘤细胞进行标记，导致循环肿瘤细胞的丢失或损伤。因此，如何高效、准确地从未处理血液中移除背景血细胞，并捕获稀有循环肿瘤细胞是后续对其检测、分析的重要前提。兴起于20世纪90年代的微流控(Microfluidics)技术通过微米级流道精确操控微升、毫升级别样品。得益于其特征尺寸与细胞尺寸相匹配，这些微流控器件具有样品消耗量低、操控精度高的优势，在细胞分选应用方面潜力巨大。依据是否借助外力场，微流控细胞分选技术可大致分别被动分选技术和主动分选技术两大类，其中被动技术包括微结构过滤、场流及水力分选、仿生分选、惯性分选、确定性侧向位移分选、亲和性分选等；而主动分选技术包括磁分选、声分选、光分选、介电泳分选等。各主动分选方法虽然具备较高的分选精度，但通常情况下通量极低，且生成外场需要昂贵的硬件设备，成本高昂且操作繁琐。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种能够提升肿瘤细胞的通量，对肿瘤细胞进行高纯度分选的基于黏弹性聚焦技术的肿瘤细胞多级分选装置。
技术方案：本发明包括界面黏弹性分选流道，所述界面黏弹性分选流道的双侧支路和中间支路交汇于主流道，所述双侧支路的入口处设置有样品入口，所述中间支路的入口处设置有鞘液入口；所述主流道末端分裂为三个分支流道，两侧的正弦流阻流道末端设置有血细胞出口，中间的非对称方形突扩流道末端分裂成第四分支流道和第五分支流道，所述第四分支流道末端设置有残余白细胞出口，所述第五分支流道末端设置有肿瘤细胞出口。
所述主流道为方形螺旋流道，可以节省幅面。
所述方形螺旋流道的垂直截面呈宽度大于高度的矩形，能够使样品流和鞘液流在方形螺旋流道内形成剪切界面并有效对细胞粒子进行不同位置聚焦。
所述非对称方形突扩流道上设置有多个方形突扩腔，且相邻的两个方形突扩腔之间等距分布。
所述方形突扩腔的长度为所述非对称方形突扩流道截面宽度的4～8倍，且所述方形突扩腔的宽度为长度的1/3～1/2，这样使得不同大小的细胞粒子能够进行二次聚焦，且尺寸较大的细胞粒子流经后将向流道的偏中下侧壁面移动；而尺寸较小的细胞粒子流经后将在流道的中间位置聚焦，最终流入不同的分支进而实现细胞或者粒子的分离。
所述主流道在分裂成所述正弦流阻流道之前，先过渡为水平流道。
所述装置的制作材料为聚二甲基硅氧烷、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、玻璃、硅和石英中的一种。
有益效果：本发明与现有技术相比，其有益效果在于：(1)鞘液入口使用透明质酸溶液，可有效提升通量；(2)利用黏弹性聚焦技术对细胞粒子进行两级被动分选；(3)可直接使用纯血或者胸腔腹腔积液作为样品，相对现有的惯性分选方法不需要预处理，且可以显著提高分选获得样品的纯度；(4)通过优化设计将直流流道拉成方形螺旋流道以节省幅面；(5)具有成本低、操作简单、易集成微型化等优点，可广泛用于临床诊断、生物学研究、生化分析等领域，尤其适用于血液中循环肿瘤细胞的早期检测、细胞学水平上的化疗药物敏感性测试等方面。
附图说明
图1为本发明整体结构的俯视图；
图2为本发明中界面黏弹性流道分选原理示意图；
图3为本发明中非对称方形缩扩流道局部放大兼分选原理示意图；
图4为本发明实施例中器件整体的分选原理示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和说明书附图对本发明做进一步详细介绍。
如图1所示，本发明包括界面黏弹性分选流道，界面黏弹性分选流道包括双侧支路和中间支路，双侧支路和中间支路交汇于主流道3，双侧支路的入口处设置有样品入口2，中间支路的入口处设置有鞘液入口1。主流道3为方形螺旋流道。方形螺旋流道的垂直截面呈宽度大于高度的矩形，其高度与宽度的比值(AR)为1/8～1/2，能够使样品流和鞘液流在方形螺旋流道内形成剪切界面并有效对细胞粒子进行不同位置聚焦。主流道3末端分裂为三个分支流道，具体包括位于两侧的正弦流阻流道4和位于中间的非对称方形突扩流道6，且主流道3在分裂成正弦流阻流道4之前，先过渡为水平流道。位于两侧的正弦流阻流道4用于平衡与中间的非对称方形突扩流道6之间的流阻，实现流阻匹配。正弦流阻流道4末端设置有血细胞出口5。非对称方形突扩流道6末端分裂成第四分支流道7和第五分支流道9，第四分支流道7末端设置有残余白细胞出口8，第五分支流道9末端设置有肿瘤细胞出口10。非对称方形突扩流道6上设置有多个方形突扩腔，且相邻的两个方形突扩腔之间等距分布。每一个方形突扩腔的长度为非对称方形突扩流道6截面宽度的4～8倍，且方形突扩腔的宽度为长度的1/3～1/2。这样的结构设计，使得不同大小的细胞粒子能够进行二次聚焦，且尺寸较大的细胞粒子流经后将向流道的偏中下侧壁面移动；而尺寸较小的细胞粒子流经后将在流道的中间位置聚焦，最终流入不同的分支进而实现细胞或者粒子的分离。
向鞘液入口1通入透明质酸溶液，样品入口2直接通入纯血或其它体液，在方形螺旋流道中，样品液和鞘液的流速不同形成剪切界面16。在此剪切界面处，弹性升力和惯性升力相互竞争，阻挡绝大部分血细胞通过，而大尺寸的肿瘤细胞和少量白细胞则可以穿透界面，最终实现不同尺寸细胞粒子聚焦至不同的平衡位置，并在方形螺旋流道的末端分别导入位于两侧的正弦流阻流道4和非对称方形突扩流道6。即通过界面黏弹性分选流道进行粗分选，可以移除绝大部分的血细胞，降低非对称方形突扩流道6中粒子的浓度，弱化粒子间碰撞导致的不规则运动，进一步提升分选精度。
而聚焦在方形螺旋流道中间位置的肿瘤细胞和少量白细胞将于流道末端一同引入非对称方形突扩流道6，在非对称方形突扩流道6内的突扩腔的作用下，肿瘤细胞和少量白细胞将在流道内进行二次聚焦，通过突扩腔后，大尺寸的肿瘤细胞有着较大的阻塞比，在强剪切速率的作用下，其近中心侧的压应力增大，将其推向侧壁；而对于尺寸相对小一些的少量白细胞，阻塞比的影响较小，颗粒会向近中心处移动。非对称方形突扩流道6的末端分裂为第四分支流道7和第五分支流道9，则可实现两种细胞的分离。通过界面黏弹性分选流道和非对称方形突扩流道6，细胞经过了两级被动分选，可以保证较高的分选纯度。
本实施例中的微流控器件使用黏弹性溶液对血液中稀有肿瘤细胞的进行高纯度分选，也可用于其它体液(如尿液、唾液、胸水、腹水等)中肿瘤细胞的分选或提纯，亦可拓展应用于其它环境下两种以上不同尺寸粒子的分选。且整个肿瘤细胞多级分选微流控器件的流道结构可由软光刻或其他微加工手段实现。
本实施例中各个流道的制备材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，也可选用玻璃、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)等光学性能良好的材料制作。原型器件通过软光刻加工工艺制备，具体包括光刻SU-8阳模、PDMS浇注以及PDMS-玻璃键合封装等步骤。该技术具有精度高、制作成本低及加工周期短等优点。除此以外，阳模的制备也可借助硅的湿法/深反应离子刻蚀、超精密机加工、金属电镀及感光电路板刻蚀加工等技术实现。
待整体器件制作完毕后，自鞘液入口1处以特定流速引入透明质酸溶液，在样品入口2处以特定流速引入样品；在血细胞出口5、残余白细胞出口8和肿瘤细胞出口10处分别收集样品。样品的引入可通过微管连接注射泵实现；样品的收集可通过微管连接收集管实现。
本实施例以血液中循环肿瘤细胞14的分选为例阐述该多级分选器件的工作步骤和原理：
如图2所示，为使界面黏弹性系统分选原理看的更加清晰，将方形螺旋流道3拉回成直流道，自鞘液入口1处以特定流速引入透明质酸溶液11(黏弹性溶液)，在样品入口2处以特定流速引入样品(包括白细胞12、红细胞13、稀有循环肿瘤细胞14、较小尺寸白细胞15等)，因鞘液相对于样品液有着更高的流速，则在流道内两侧形成了剪切界面16。样品中各个细胞起初以惯性升力FL(中心向)为主导开始向流道中心移动；在剪切界面处尺寸较小的细胞受到的弹性升力FE(壁面向)大于惯性升力FL(中心向)，则无法通过剪切界面16，在靠近壁面处平衡，较大尺寸的细胞此时受到的弹性升力FE(壁面向)小于惯性升力FL(中心向)，则可以通过剪切界面16，在近中心侧达到平衡位置。
本实例中，通过界面黏弹性分选流道，红细胞13和较小尺寸白细胞15在方形螺旋流道内最终聚焦于靠近两侧壁面处的平衡位置；残余的少量白细胞12和稀有循环肿瘤细胞14则迁移至靠近方形螺旋流道3中间的平衡位置。
如图3所示，将非对称方形突扩流道6放大并作一定的变形，方形突扩腔按一定间距均匀分布。在该设置下，白细胞12和稀有循环肿瘤细胞14将在非对称方形突扩流道6内进一步聚焦。如截面A所示，白细胞12和循环肿瘤细胞14经过初期的突扩腔时，分布相对随机；截面B处，白细胞12和循环肿瘤细胞14则能够聚焦到同一位置；截面C处，大尺寸的稀有循环肿瘤细胞14有着较大的阻塞比，在强剪切速率的作用下，其近中心侧的压应力增大，将其推向侧壁，而对于尺寸相对小一些的白细胞12，阻塞比的影响较小，则继续位于近中心侧，则两种细胞可以聚焦到不同平衡位置。
如图4所示，为更清晰标示出流道内白细胞12、红细胞13、大尺寸循环肿瘤细胞12和较小尺寸白细胞15的运动轨迹，对流道结构做出适当简化变形。由图4可见，样品入口2处引入的随机分散细胞粒子，经界面黏弹性分选流道于方形螺旋流道中不同位置进行聚焦，在流道末端分流之后汇入两侧的正弦流阻流道4和非对称方形突扩流道6，正弦流阻流道4可以移除绝大部分血细胞(含红细胞13及较小尺寸白细胞15)；而大尺寸循环肿瘤细胞14及少量白细胞12则进入非对称方形突扩流道6以进行进一步分离提纯，并最终经第四分支流道7移除残余白细胞12，经第五分支流道9收集高纯度循环肿瘤细胞14。
通过上述实施例可看出，本发明引入黏弹性溶液，巧妙地利用黏弹性聚焦技术对细胞粒子进行两级被动分选。界面黏弹性分选技术可直接使用纯血或者胸腔腹腔积液作为样品，突破现有的惯性分选方法需要预处理的局限。鞘液入口1使用透明质酸溶液，相比于传统黏弹性分选可有效提升通量。同时通过优化设计将直流流道拉成方形螺旋流道可以大大的节省幅面。本发明在简单结构基础上进一步提升了被动分选中的纯度、回收率，同时相比于现有的黏弹性分选方法则有着更高的通量。

Claims (4)

1.一种基于黏弹性聚焦技术的肿瘤细胞多级分选装置，其特征在于：包括界面黏弹性分选流道，所述界面黏弹性分选流道的双侧支路和中间支路交汇于主流道（3），所述双侧支路的入口处设置有样品入口（2），所述中间支路的入口处设置有鞘液入口（1），向鞘液入口（1）通入透明质酸溶液；所述主流道（3）末端分裂为三个分支流道，两侧的正弦流阻流道（4）末端设置有血细胞出口（5），中间的非对称方形突扩流道（6）末端分裂成第四分支流道（7）和第五分支流道（9），所述第四分支流道（7）末端设置有残余白细胞出口（8），所述第五分支流道（9）末端设置有肿瘤细胞出口（10）；
所述非对称方形突扩流道（6）上设置有多个方形突扩腔，且相邻的两个方形突扩腔之间等距分布；
所述方形突扩腔的长度为所述非对称方形突扩流道（6）截面宽度的4~8倍，且所述方形突扩腔的宽度为长度的1/3~1/2；
所述主流道（3）为方形螺旋流道。
2.根据权利要求1所述的基于黏弹性聚焦技术的肿瘤细胞多级分选装置，其特征在于：所述方形螺旋流道的垂直截面呈宽度大于高度的矩形。
3.根据权利要求1所述的基于黏弹性聚焦技术的肿瘤细胞多级分选装置，其特征在于：所述主流道（3）在分裂成所述正弦流阻流道（4）之前，先过渡为水平流道。
4.根据权利要求1至3任一项所述的基于黏弹性聚焦技术的肿瘤细胞多级分选装置，其特征在于：所述装置的制作材料为聚二甲基硅氧烷、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、玻璃、硅和石英中的一种。
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