CN109456875B - 集成惯性与确定性侧向位移技术的稀有细胞多级分选微流控器件 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种集成惯性与确定性侧向位移技术的稀有细胞多级分选微流控器件，集成器件上一端设有样品入口，样品入口下方连通于螺旋流道，螺旋流道另一端连通有突扩结构，突扩结构另一端分裂为第一分支流道和确定性侧向位移流道，第一分支流道末端设有血细胞出口；确定性侧向位移流道另一端分裂为第二分支流道和第三分支流道，第二分支流道末端设有残余血细胞出口，第三分支流道末端设有稀有细胞出口。本发明通过集成惯性螺旋及确定性侧向位移两级流道，充分利用惯性螺旋的高通量优势及确定性侧向位移的高精度优势，并通过巧妙集成在简单结构基础上实现对稀有癌细胞的高通量、高纯度分选，克服现有分选芯片只基于某种单一技术，难以同时实现高通量与高纯度分选的不足。

Description

集成惯性与确定性侧向位移技术的稀有细胞多级分选微流控 器件

技术领域

本发明专利属于多级分选微流控器件技术，尤其涉及的是一种用于稀有细胞粒子高通量、高纯度分选的微流控器件。

背景技术

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)作为进入人体外周循环血液的种子，在临床上被认为是肿瘤发生转移的早期征兆，检测血液中循环肿瘤细胞对癌症病情的早期诊断具有重要意义。CTCs检测最大的挑战在于其数量极其稀少，通常情况下其对人体正常血细胞的比例仅约为1:10⁹，或在1mL血液中仅有1-100个CTCs。因此，如何高效、准确地从全血中移除背景血细胞，并捕获稀有循环肿瘤细胞是后续对其检测、分析的重要前提。兴起于20世纪90年代的微流控(Microfluidics)技术通过微米级流道精确操控微升、毫升级别样品。得益于其特征尺寸与细胞尺寸刚好匹配，这些微流控器件具有样品消耗量低、操控精度高的先天优势，在细胞分选应用方面潜力巨大。依据是否借助外力场，微流控细胞分选技术可大致分别被动分选技术和主动分选技术两大类，其中被动技术包括微结构过滤、场流及水力分选、仿生分选、惯性分选、确定性侧向位移分选、亲和性分选等；而主动分选技术包括磁分选、声分选、光分选、介电泳分选等。各主动分选方法虽然具备较高的分选精度，但通常情况下通量极低，且生成外场需要昂贵的硬件设备，成本高昂且操作繁琐。而各被动分选技术在高通连条件下兼能保证一定的分选精度，且结构更为简单，故而应用更为广泛。

各主、被动分选技术虽然在近些年都取得了长足的发展，但也在纯度、回收率及通量三个重要指标上存在各自的不足，尤其是考虑到三者之间一般存在互相博弈的关系，如通量的上升会导致纯度的下降，为追求高纯度往往要牺牲回收率等，单一分选技术很难同时满足CTCs高通量、高纯度、高回收率的分选要求。在综合考虑各种分选方法技术特点的基础上，本发明专利巧妙的将具备高通量优势的惯性螺旋技术及具备高精度优势的确定性侧向位移技术相集成，在简单结构的基础上，力求实现CTCs的高通量、高精度分选。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于解决现有技术中存在的不足，提供一种集成惯性与确定性侧向位移技术的稀有细胞多级分选微流控器件，用于稀有细胞粒子的高通量、高纯度分选。

技术方案：本发明的一种集成惯性与确定性侧向位移技术的稀有细胞多级分选微流控器件，包括集成器件，所述集成器件上一端设有样品入口，在集成器件内，样品入口的下方连通于螺旋流道，螺旋流道的另一端连通有突扩结构，突扩结构的另一端分裂为两个支路，一个为第一分支流道，另一个为确定性侧向位移流道；所述第一分支流道与确定性侧向位移流道相并联，第一分支流道的末端设有血细胞出口；所述确定性侧向位移流道的另一端分裂为相并联的第二分支流道和第三分支流道，第二分支流道的末端设有残余血细胞出口，第三分支流道的末端设有稀有细胞出口。

其中，通过突扩结构以及后续的分支，分别将大部分血细胞经第一分支流道导入血细胞出口，同时将残余血细胞及稀有细胞导入二级确定性侧向位移流道。

进一步的，所述第一分支流道与确定性侧向位移流道并联后作为一个整体串联于突扩结构之后；所述第二分支流道与第三分支流道并联后作为一个整体串接于确定性侧向位移流道之后。

进一步的，所述螺旋流道的截面呈低深宽比(例如1/2～1/8)的矩形或者两侧高度不等的梯形，所述细胞直径和螺旋流道的截面高度间满足0.07<ap/h<0.3，ap为细胞粒子直径，h为螺旋流道截面高度，可使较大尺寸的稀有细胞与较小尺寸的血细胞粒子聚焦至流道截面的不同平衡位置处。

进一步的，在突扩结构末端处，第一分支流道最前端与确定性侧向位移流道的宽度比为1:2(此处所述“最前端”即是指与突扩结构相连接的一端，也就是第一分支流道和确定性侧向位移流道的宽度是1/2，当然还可以设置为1:3)，且第一分支流道上从与突扩结构的连接处至血细胞出口处之间逐渐收聚，用于平衡与确定性侧向位移流道7之间的流阻，实现流阻匹配。

进一步的，所述确定性侧向位移流道内排布有微柱阵列，微柱阵列中的各个微柱之间保持一定间距均匀分布，所述微柱的横截面为圆形、三角形和“I”形中的任意一种或组合。这样的结构设计，使得大于相应尺寸的粒子流经时将沿微柱阵列倾斜方向迁移；而小于相应尺寸的粒子流经时则随主流动运动，整体上呈水平方向迁移。

进一步的，所述突扩结构上靠近螺旋流道一端的两侧的流道壁先互成60°夹角，然后经平直延伸以120°夹角扩张至所需宽度，并随后分裂出第一分支流道与确定性侧向位移流道。

进一步的，所述集成器件的制作材质为聚二甲基硅氧烷、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、玻璃、硅和石英中的一种。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明通过集成惯性螺旋及确定性侧向位移两级流道，充分利用惯性螺旋的高通量优势及确定性侧向位移的高精度优势，并通过巧妙集成在简单结构基础上实现对稀有癌细胞的高通量、高纯度分选，克服现有分选芯片只基于某种单一技术，难以同时实现高通量与高纯度分选的不足。

(2)本发明专利还具有成本低、操作简单、易集成微型化等优点，且本发明专利提出的器件可广泛用于临床诊断、生物学研究、生化分析等领域，尤其适用于血液中循环肿瘤细胞的早期检测、细胞学水平上的化疗药物敏感性测试等方面。

附图说明

图1是本发明整体结构的俯视图；

图2是本发明中螺旋流道惯性分选原理示意图；

图3是本发明中微柱阵列的局部放大兼分选原理示意图；

图4是本发明实施例中集成器件的分选原理示意图。

具体实施方式

下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

如图1所示，本实施例的集成惯性与确定性侧向位移技术的稀有细胞多级分选微流控器件包括集成器件1，该集成器件1设有样品入口2、螺旋流道3、突扩结构4、第一分支流道5、血细胞出口6、确定性侧向位移流道7、第二分支流道8、残余血细胞的出口9、第三分支流道10和稀有细胞出口11。

其中，样品入口2、螺旋流道3与突扩结构4顺序相连通；第一分支流道5与确定性侧向位移流道7呈并联关系，并作为一个整体串接于突扩结构4之后；第一分支流道5末端连接于血细胞出口6；第二分支流道8与第三分支流道10呈并联关系，并作为一个整体串接于确定性侧向位移流道7之后；第二分支流道8末端与残余血细胞出口9相连；第三分支流道10末端与稀有细胞出口11相连。

为使细胞粒子能够在螺旋流道3内实现聚焦，细胞直径和螺旋流道3的截面高度间满足0.07<ap/h<0.3，ap为粒子直径，h为螺旋流道3截面高度。同时，螺旋流道3的截面形状应设计成低深宽比矩形(深宽比AR＝h/w<1)，以便对经过螺旋流道3的粒子沿流道宽度方向进行分选；螺旋流道3截面还可设计成两侧高度不相同的梯形。

突扩结构4靠近螺旋流道3一端两侧流道壁互成60°的角度，经适当平直延伸后，以120°的角度扩张至所需宽度，并随后分裂出第一分支流道5与确定性侧向位移流道7。第一分支流道5前端与突扩结构4相连处的宽度与确定性侧向位移流道7的宽度比值约为1:2，且第一分支流道5整体逐渐收窄并曲折眼神成一细长流道，以平衡各分支流阻。确定性侧向位移流道7的末端处分裂出第二分支流道8与第三分支流道10。

本实施例中集成器件用于血液中稀有癌细胞的高通量、高纯度分选，也可用于其它体液(如尿液、唾液、胸水、腹水等)中稀有粒子的分选或提纯，亦可拓展应用于其它环境下两种不同尺寸粒子的分选。且整个稀有细胞多级分选微流控器件的流道结构可由软光刻或其他微加工手段实现。

上述实施例中，第一级流道(即螺旋流道3)充分利用惯性技术的高通量优势，通过螺旋流道3的弯流道中Dean流和惯性迁移，将大尺寸稀有细胞粒子与小尺寸血细胞聚焦至不同的平衡位置，并通过突扩结构4分别导入二级确定性侧向位移流道7和血细胞出口6。即通过第一级的螺旋流道3粗分选，可在高通量条件下移除大部分血细胞，降低确定性侧向位移流道7中的粒子浓度，弱化粒子间碰撞导致的不规则运动，提升分选精度。

而位于螺旋流道3出口中间位置的稀有细胞和残余血细胞，以及外侧的无粒子流一同引入确定性侧向位移流道7，在确定性侧向位移流道7内的微柱阵列14的作用下，小尺寸血细胞随主流动运动，整体上呈水平方向迁移；而大尺寸稀有细胞则沿微柱阵列14倾斜方向运动，逐渐向下迁移，实现对稀有肿瘤细胞17的精确提纯。确定性侧向位移技术虽然作为一种被动技术，但其在分选精度方面独树一帜，特定结构下对粒子的尺寸识别甚至可达到纳米级别。

本实施例中各个流道的制备材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，也可选用玻璃、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)等光学性能良好的材料制作。原型器件通过软光刻加工工艺制备，具体包括光刻SU-8阳模、PDMS浇注以及PDMS-玻璃键合封装等步骤。该技术具有精度高、制作成本低及加工周期短等优点。除此以外，阳模的制备也可借助硅的湿法/深反应离子刻蚀、超精密机加工、金属电镀及感光电路板刻蚀加工等技术实现。

待整体器件制作完毕后，自样品入口2处以特定流速引入样品；在血细胞出口6、残余血细胞出口9和稀有细胞出口11处分别收集样品。样品的引入可通过微管连接注射泵实现；样品的收集可通过微管连接收集管实现。本实施例以血液中循环肿瘤细胞17的分选为例阐述该多级分选器件的工作步骤和原理。

如图2所示，为一级螺旋流道3分选原理，螺旋流道3的内壁面12、外壁面13如图所示。以特定流速经样品入口2向螺旋流道3内注入粒子悬浮液后，因弯流道内中心线附近流体较壁面附近流体具有更高的流速，在离心力和径向压力梯度不平衡的作用下向外流动；同时基于封闭流道内的质量守恒，靠近外壁面13处的流体将沿着螺旋流道3的上下壁面回流，于是在垂直主流动方向上产生两个旋转方向相反的涡，称为Dean流或二次流。在惯性升力F_L及由Dean流诱导产生的Dean拽力F_D的共同作用下，粒子将达到稳定的平衡位置a、b处，且不同尺寸的粒子具有不同的平衡位置。

本实施例中，通过调整螺旋流道3的横截面尺寸及样品流速，使得螺旋流道3出口处小尺寸血细胞迁移至靠近内壁面12的平衡位置；大尺寸稀有细胞迁移至靠近螺旋流道3中间的平衡位置；而流道外壁面13处为不含粒子的无粒子流。

将确定性侧向位移流道7中微柱阵列的局部放大，如图3所示，微柱阵列14与水平方向呈一定倾角排布。大于临界尺寸的粒子将沿倾斜排布方向迁移；而小于临界尺寸的粒子将随主流动运动，整体上沿水平方向迁移。临界尺寸主要由微柱阵列的倾斜角度及各个微柱在垂直方向上的间距决定。本实施例中，调整临界尺寸在10-15μm之间，以使小尺寸红细胞(直径约7μm，后2-3μm)及白细胞(直径约8-10μm)随主流动水平迁移，而大尺寸循环肿瘤细胞(直径约20μm)沿微柱阵列倾斜方向迁移。本实施例中，微柱阵列14横截面为三角形，但也可是圆形、“I”形等其它形状。

集成器件分选原理示意如图4所示，为更清晰标示出流道内红细胞15、白细胞16以及大尺寸循环肿瘤细胞17的运动轨迹，对流道结构做出适当变形。由图4可见，样品入口2处引入的随机分散细胞粒子，经螺旋流道3惯性聚焦后，可经突扩结构4及分支流道5移除绝大部分血细胞(含红细胞15及白细胞16)；而大尺寸循环肿瘤细胞17及残余血细胞则进入二级确定性侧向位移流道7进行进一步分离提纯，并最终经第二分支流道8移除残余血细胞，经第三分支流道10收集高纯度循环肿瘤细胞17。

通过上述实施例可看出，本发明巧妙地将位于螺旋流道外壁面处的无粒子流引入DLD流道，并用之取代传统结构需额外引入的鞘液流，极大程度上简化了芯片结构与操作复杂度。另外，本发明通过结合惯性流与确定性侧向位移技术，突破传统单一技术微流控器件难以同时实现高通量与高精度分选的局限，实现稀有细胞高通量、高精度分选。

Claims (3)

1.一种集成惯性与确定性侧向位移技术的稀有细胞多级分选微流控器件，其特征在于：包括集成器件，所述集成器件上一端设有样品入口，在集成器件内，样品入口的下方连通于螺旋流道，螺旋流道的另一端连通有突扩结构，突扩结构的另一端分裂为两个支路，一个为第一分支流道，另一个为确定性侧向位移流道；所述第一分支流道与确定性侧向位移流道相并联，第一分支流道的末端设有血细胞出口；所述确定性侧向位移流道的另一端分裂为相并联的第二分支流道和第三分支流道，第二分支流道的末端设有残余血细胞出口，第三分支流道的末端设有稀有细胞出口，其中，所述细胞直径和螺旋流道的截面高度间满足0.07<ap/h<0.3，ap为细胞直径，h为螺旋流道截面高度；螺旋流道的垂直截面为低深宽比矩形，深宽比为1/2～1/8，所述确定性侧向位移流道内排布有微柱阵列，微柱阵列中的各个微柱之间保持一定间距均匀分布，微柱阵列与水平方向呈一定倾角排布，大于临界尺寸的粒子将沿倾斜排布方向迁移，而小于临界尺寸的粒子将随主流动运动，整体上沿水平方向迁移，临界尺寸为10-15μm，所述微柱的横截面为圆形、三角形和“I”形中的任意一种，所述突扩结构末端处，第一分支流道最前端与确定性侧向位移流道的宽度比为1:2，且第一分支流道上从与突扩结构的连接处至血细胞出口处之间逐渐收聚，所述突扩结构上靠近螺旋流道的一端两侧的流道壁先互成60°夹角，然后经平直延伸以120°夹角扩张至所需宽度，并随后分裂出第一分支流道与确定性侧向位移流道。

2.根据权利要求1所述的集成惯性与确定性侧向位移技术的稀有细胞多级分选微流控器件，其特征在于：所述第一分支流道与确定性侧向位移流道并联后作为一个整体串联于突扩结构之后；所述第二分支流道与第三分支流道并联后作为一个整体串接于确定性侧向位移流道之后。

3.根据权利要求1所述的集成惯性与确定性侧向位移技术的稀有细胞多级分选微流控器件，其特征在于：所述集成器件的制作材质为聚二甲基硅氧烷、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、玻璃、硅和石英中的一种。

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