JP3891925B2 - 生物学的粒子の情報を得る装置 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的粒子（例えば、細胞、染色体）の生物学的情報を得る装置に関する。特に、本発明は、蛍光色素などを用いて染色された細胞や染色体を層流状態で流し、その流れにレーザ光などの光を照射して得られる情報光（散乱光、蛍光）を検出し、検出された情報光に含まれる光学的情報を電気信号に変換して細胞や染色体の生物学的情報を取得し、さらに必要であればその生物学的情報をもとに特定の細胞や染色体の集団を採取するフローサイトメータまたはセルソータに関する。
【０００２】
【従来の技術】
バイオテクノロジーの発展に伴い、医学や生物学などの分野では、細胞や染色体など（以下「細胞」という。）の自動分析および分別を行う流動式細胞分析装置（フローサイトメータ）が用いられている。この流動式細胞分析装置は、分析対象である細胞粒子を、細胞整列手段である流路内で一列にして流し、この流れてくる粒子にレーザ光を照射し、粒子より生じる情報光（前方散乱光、蛍光・側方散乱光）を検出して電気信号に変換し、これらの電気信号に基づいて細胞を分析するものであり、多数の細胞を高速で分析し、必要であれば特定の細胞の集団を採取できるものである。
【０００３】
図１２は一般的なフローサイトメータの構成と、その作動を説明するための模式図である。この図に示すフローサイトメータ２００では、容器中にあって細胞を含む懸濁液２０１は、別の容器中にあるシース液２０２とともに、エアーポンプ２０３によって漏斗状のフローチャンバ（ノズル）２０４に導かれる。フローチャンバ２０４の内部では、シース液２０２が懸濁液２０１を円筒状に包み込む層流、すなわち細胞をフローセルの中心軸に沿って一つ一つ正確に流すシースフローが形成される。フローチャンバ２０４の下部ではシースフローの高速流が形成され、そこにレーザ光源２０５から出射されて集束レンズ２０６によって絞り込まれたレーザ光２０７が照射される。懸濁液２０１に含まれる細胞は、多くの場合、蛍光染料や蛍光ラブルモノクロナール抗体などの蛍光物質で蛍光標識されている。したがって、細胞がレーザ光２０７中を経過するとき、散乱光と蛍光が発生する。
【０００４】
散乱光は、集光レンズ２０８とビームブロック２０９からなる集光光学系を経て、例えばフォトダイオードなどの検出器２１０で検出される。一方、蛍光については、赤色蛍光が集光レンズ２１１、ハーフミラー２１２、集光レンズ２１３、フィルタ２１４からなる集光光学系で集められ、光検出器２１５で検出され、また緑色蛍光はハーフミラー２１２から集光レンズ２１６、フィルタ２１７で集められ、光検出器２１８で検出される。通常、蛍光の検出器２１５、２１８には、微弱光の検出が可能な光電子増倍管が用いられる。散乱光を検出する検出器２１０、赤色蛍光を検出する光検出器２１５および緑色蛍光を検出する光検出器２１８からの信号は、それぞれ信号処理回路２１９に送られ、ここで散乱光と蛍光の強度を分析することにより細胞の同定が行われる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このように、従来の細胞分析装置は、集光レンズ２１１、ハーフミラー２１２、集光レンズ２１３、フィルタ２１４からなる集光光学系で集めた散乱光や蛍光を光検出器２１５、２１８で検出するように構成されている。また、集光レンズ２１１は、高速水流の中心を１個づつ流れる細胞から発する蛍光を対物レンズで集光している（例えば、特許文献１〜４参照）。しかし、フローチャンバ２０４のオリフィス部分で粒子の詰まりが発生したり、流れが乱れたり、また流れが傾いたりすることがある。この場合、フローチャンバ２０４を取り外して洗浄しなければならないわけけであるが、その度に光軸調整（レーザの照射位置・焦点距離、ノズルの位置・角度、対物レンズの位置・焦点距離等）を要し、しかもそれらの調整作業は相当煩雑であった。また、このようなレンズの構成は高開口率のレンズを使用しているため、光学系を小型化するのが非常に難しかった。
【０００６】
このような問題を解決するため、光学検出をフローセル内の一定流路の中で行う試みが提案されており、そこでは蛍光を集光するためにフローセルに高開口率のレンズが融着されている。しかし、この小径レンズでは集光した蛍光をコリメートできない。また、多くの場合はさらに集光用のレンズを数枚結合させる必要があり、その場合、レンズ間に空気層を挟むために感度の向上が実現できない。そのため、光学系を小型化することは不可能である。
【０００７】
【特許文献１】
特開昭５９−６４３号公報
【特許文献２】
特開昭５９−１８４８６２号公報
【特許文献３】
特開昭６０−１９５４３６号公報
【特許文献４】
特表平３−５０３８０８号公報
【０００８】
そこで、本発明は、容易に光軸調整ができるフローサイトメータを提供することを目的とする。また、本発明は、生物学的粒子の生物学的性質をより正確に検出できるフローサイトメータを提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
これらの目的を達成するために、本発明に係る生物学的粒子の生物学的情報を得る装置（１）は、染色処理された生物学的粒子を含む液体に光を当て、該生物学的粒子からの情報光を検出して、該生物学的粒子の生物学的情報を得るものであり、染色処理された生物学的試料を含む液体が流れる流路（３）を形成する流路形成部材（２）と、上記流路（３）を流れる粒子に光を当てる照明部（５）と、上記粒子に当てられた光から得られる第１の情報光を検出する第１の検出部（２１）と、上記粒子に当てられた光から得られる第２の情報光を検出する第２の検出部（２５）とを備えており、上記第１の検出部（２１）、第２の検出部（２５）の少なくともいずれか一方は、一つまたは複数の光ファイバ（２６，２７）を備えており、上記光ファイバ（２６，２７）の一端面（６１，６２）が上記情報光を集光できるように流路（２）の近傍に配置されており、おり、上記流路形成部材（２）は、上記光ファイバ（２６，２７）の一端面（６１，６２）とこの一端面（６１，６２）が対向する壁面（５６）との間に仕切り壁（７８）を有し、上記光ファイバ（２６，２７）は上記一端面（６１，６２）が上記仕切り壁（７８）に接触させて又は透明の充填材（８６）を介して接触させて配置されていることを特徴とする装置。
【００１０】
本発明に係る生物学的粒子の生物学的情報を得る装置の他の形態は、染色処理された生物学的粒子を含む液体に光を当て、該生物学的粒子からの情報光を検出して、該生物学的粒子の生物学的情報を得る装置において、光を透過する材料からなり、染色処理された生物学的試料を含む液体が流れる流路（３）を形成する流路形成部材（２）と、上記流路（３）を流れる粒子に光を当てる照明部（５）と、上記粒子に当てられた光から得られる第１の情報光を検出する第１の検出部（２１）と、上記粒子に当てられた光から得られる第２の情報光を検出する第２の検出部（２５）とを有し、上記照明部（５）は上記流路（３）の中心軸方向に所定の間隔をあけた第１の位置（１５１）と第２の位置（１５２）にそれぞれ光を集光する第１の光学部（６，９，１０，１１）と第２の光学部（７，１３，１４，１５，１６）を有し、上記第１の検出部（２１）、第２の検出部（２５）の少なくともいずれか一方は第１の光ファイバ（２６）と第２の光ファイバ（２７）を備えており、
上記第１の光ファイバ（２６）と第２の光ファイバ（２７）の一端面（６１，６２）は上記第１の位置（１５１）と第２の位置（１５２）で光が当てられた粒子からの上記情報光をそれぞれ集光できるように流路（３）の近傍に配置されており、上記流路形成部材（２）は、少なくとも一つの平坦面（７６）を有する第１の透光部材（７５）と、一対の平行な平坦面を有し且つ一方の平坦面を上記第１の透光部材（７５）と所定の間隔をあけて対向させた第２の透光部材（７８）と、第１の透光部材（７５）の平坦面とこれに対向する第２の透光部材（７８）の平坦面との間に挟持されかつ所定の間隔をあけて対向し、上記第１の透光部材（７５）と第２の透光部材（７８）とともに四角形の流路（３）を形成する一対の第３の透光部材（７７）とを備えており、上記光ファイバ（２６，２７）は上記一端面（６１，６２）が上記第２の透光部材（７８）に接触させて又は透明の充填材（８６）を介して接触させて配置されていることを特徴とする。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明に係るフローサイトメータを説明する。
【００１２】
Ｉ．光学的要素：
図１は、フローサイトメータの光学的要素を示す。この図に示すように、フローサイトメータ１は、蛍光染料または蛍光抗体で染色された生物学的粒子（細胞または染色体）を含む液体（通常、細胞を含む懸濁液とシース液とからなる。）が流れる細い流路を形成する流路ブロック（流路形成部材）２を有する。流路ブロック２に形成されている流路３の中を流れるシースフロー（流れ）４に光を照射する照明部５は、２つの励起光源を備えている。これら２つの光源には、異なる波長のレーザ光を発生するレーザ発生器が好適に利用される。例えば、本実施の形態では、第１の光源として波長４８８ｎｍの第１のレーザ光（アルゴンレーザ）を発生する第１のレーザ発生器６が使用され、第２の光源には波長６３５ｎｍの第２のレーザ光（ヘリウムネオンレーザ）を発生する第２のレーザ発生器７が使用されている。しかし、２つの光源に、水銀ランプやキセノンランプなどのランプを使用することができる。
【００１３】
照明部５はまた、第１のレーザ発生器６から出射された第１のレーザ光８をシースフロー４に集光するために、光ファイバ９、ビームエキスパンダ１０、集光レンズ１１を備えており、第１のレーザ発生器６で生成された第１のレーザ光８が光ファイバ９、ビームエキスパンダ１０、集光レンズ１１を通ってシースフロー４のほぼ中心に集光されるようにしてある。同様に、照明部５は、第２のレーザ発生器７から出射された第２のレーザ光１２をシースフロー４に導くために、光ファイバ１３、ビームエキスパンダ１４、集光レンズ１５、ミラー１６を備えており、第２のレーザ発生器７で生成された第２のレーザ光１２が光ファイバ１３、ビームエキスパンダ１４、集光レンズ１５、ミラー１６を通ってシースフロー４のほぼ中心に集光されるようにしてある。また、シースフロー４における第１と第２のレーザ光８，１２の集光高さはδｈ（図５参照）だけ異なり、本実施の形態では第１のレーザ光８の集光位置が第２のレーザ光１２の集光位置よりもδｈだけ高く設定されている。
【００１４】
ビームエキスパンダ１０，１４と集光レンズ１１，１５はそれぞれ集光位置調整装置１６，１７，１８，１９によって支持されており、シースフロー４の流れ方向と直交する面（通常は水平面）上でそれらの光軸と直交する二方向（Ｘ方向とＹ方向）に移動できるようにしてある。ミラー１６もまた別の集光位置調整装置２０によって支持されており、上述の二方向または垂直方向（Ｘ，Ｙ方向と直交するＺ方向）に移動できるようにしてある。
【００１５】
流路ブロック２を挟むようにして入射レーザ光８，１２の反対側には、流路ブロック２内の流路を流れる粒子に照射された光の前方散乱光を検出する第１の検出装置２１が配置されている。この第１の検出装置２１は、図１２を参照して説明した従来のフローサイトメータと同様に、集光レンズ２２、光検出器２３を備えており、細胞からの前方散乱光を集光レンズ２２で光検出器２３に集光するようにしてある。また、光検出器２３は信号処理装置２４に接続されており、光検出器２３で検出された情報が信号処理装置２４に送信されて処理されるようにしてある。一方、細胞の蛍光・側方散乱光を検出する第２の検出装置２５は、第１のレーザ光８に対する蛍光・側方散乱光を検出する第１の光ファイバ２６と、第２のレーザ光１２に対する蛍光・側方散乱光を検出する第２の光ファイバ２７を備えており、これら第１と第２の光ファイバ２６、２７の一端が第１と第２のレーザ光８、１２の集光高さに対応する位置にそれぞれ固定されている（図５参照）。第１と第２の光ファイバ２６、２７の他端は、ファイバコネクタ２８，２９を介して第１と第２の分光器３０，３１にそれぞれ光接続されている。各ファイバコネクタ２８，２９には、光ファイバの出力光をコリメートするセルフォックスレンズ３２，３３または他の光学レンズを内蔵するのが好ましい。
【００１６】
第１の分光器３０は、第１の光ファイバ２６から出力された光を分光する複数の分光フィルタ（ハーフミラー）３４ａを備えている。これら複数の分光フィルタ３４ａは、予め決められたそれぞれの周波数領域の波長を反射・透過する性能を備えている。具体的に、本実施の形態では４つの分光フィルタを備えており、セルフォックスレンズ３２側から、５０５ｎｍ未満の光を反射する（５０５ｎｍ以上の波長光を透過する）第１のフィルタ、５５０ｎｍ未満の光を反射する（５５０ｎｍ以上の波長光を透過する）第２のフィルタ、６００ｎｍ未満の光を反射する（６００ｎｍ以上の波長光を透過する）第３のフィルタ、及び７３０ｎｍ未満の光を反射する（７３０ｎｍ以上の波長光を透過する）第４のフィルタが配置されている。また、光の進行方向に関して分光フィルタ３４ａの下流側には、各分光フィルタで反射された光の中から特定の波長域の光だけを選択的に透過して取得するバンドパスフィルタ３４ｂが配置されている。本実施の形態では、第１から第４の分光フィルタで反射された光と第４の分光フィルタを透過した光の中から特定の波長域の光だけを透過する５つのバンドパスフィルタが設けてあり、５つのバンドパスフィルタのそれぞれを透過する光の中心波長が４８８ｎｍ、５３０ｎｍ、５７０ｎｍ、６８０ｎｍ、波長幅が１０ｎｍ、４０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍとしてある。さらに、光の進行方向に関して複数のバンドパスフィルタ３４ｂの下流側には各バンドパスフィルタを透過した情報光（側方散乱光と所定の蛍光色素に対応した蛍光）を検出するために複数の光検出器３５（ＳＳＣ，ＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３，ＦＬ４が用意されている。
【００１７】
一方、第２の分光器３１は、第２の光ファイバ２７から出力された光のうち７３０ｎｍ未満の光を反射すると共に７３０ｎｍ以上の光を透過する分光フィルタ３６ａと、この分光フィルタ３６ａで反射した光と透過した光の中から、中心波長が６６０ｎｍで波長幅が３０ｎｍの光、中心波長が７８５ｎｍで波長幅が５０ｎｍの光をそれぞれ選択的に透過するバンドパスフィルタ３６ｂと、これらのバンドパスフィルタ３７を透過した情報光（所定の蛍光色素に対応した蛍光）を検出するために２つの光検出器３７（ＦＬ５，ＦＬ６）を備えている。これら光検出器３５，３７は、第１の検出装置２１の光検出器２３と同様に、信号処理装置２４に接続されており、光検出器３５，３７で検出された情報が信号処理装置２４に送信されて処理されるようにしてある。
【００１８】
このように構成されたフローサイトメータ１によれば、第１のレーザ発生器６で生成された第１のレーザ光８は、光ファイバ９、ビームエキスパンダ１０、集光レンズ１１を介して、流路ブロック２の流路３内を流れるシースフロー４によって導光されて粒子に集光される。同様に、第２のレーザ発生器７で生成された第２のレーザ光１２は、光ファイバ１３、ビームエキスパンダ１４、集光レンズ１５を介して、流路ブロック２の流路３内を流れるシースフロー４によって搬送される粒子に集光されて照射される。このとき、第１と第２のレーザ光８，１２が集光される焦点位置（高さ）は異なる。
【００１９】
シースフロー４によって搬送される生物学的粒子は、予め決められた複数の蛍光色素または蛍光抗体によって染色されている。そして、入射光の前方に散乱した前方散乱光が第１の検出装置２１の集光レンズ２２によって集光されて光検出器２３に入射され、この光検出器２３によって前方散乱光に含まれる光情報が読み取られて対応する電気信号に変換される。第１のレーザ光８が照射された粒子から出た側方散乱光と蛍光は入射光の側方に配置された第２の検出装置２５の第１の光ファイバ２６によって受光される。また、第２のレーザ光１２が照射された粒子から出た側方散乱光と蛍光は第２の検出装置２５の第２の光ファイバ２７によって受光される。そして、第１の光ファイバ２６に受光された光はファイバコネクタ２８を介して第１の分光器３０に送られ、そこで複数の分光フィルタ３４ａによって複数の光に分解された後、バンドパスフィルタ３４ｂを介して光検出器３５によって検出される。このとき、各光検出器３５（ＳＳＣ，ＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３，ＦＬ４）は、バンドパスフィルタ３４ｂを通過した異なる波長域の光だけを検出する。同様に、第２の光ファイバ２７に受光された光はファイバコネクタ２９を介して第２の分光器３１に送られ、そこで分光フィルタ３６ａによって２つの光に分解された後、分解された２つの光がバンドパスフィルタ３６ｂを介して光検出器３７で検出される。これら光検出器３７で検出される光の波長域は異なる。以上のようにして光検出器に検出された光は、その光に含まれる情報に対応した電気信号に変換された後、信号処理装置２４に送信されて処理され、処理後の信号が粒子の生物学的性質の同定や後に説明するソーティング処理に利用される。
【００２０】
ＩＩ．流体力学的要素：
フローサイトメータの流体力学的要素を説明する。まず、図２は、フローサイトメータ１の層流形成容器４０と該容器４０の下端部に連結された流路ブロック２を模式的に表した図である。この図に示すように、容器４０は、概略、上部の大径筒部４１と、下部の小径筒部４２と、これらの大径筒部４１と小径筒部４２を連結するテーパ部４３を同心的に備えており、内部に層流形成室４４を形成している。容器４０の上端部は、シース液供給部４５にシース液供給管４６を介して接続されている。容器４０の天井部には容器４０の中心軸に沿って伸びる鞘管４７が固定されており、懸濁液供給部４８に接続された懸濁液供給管４９が鞘管４７に挿入されている。鞘管４７の内径と懸濁液供給管４９の外径は、鞘管４７に対して懸濁液供給管４９が上下に移動できるとともに鞘管４７に対して懸濁液供給管４９が若干角度調整できるように決められている。そのため、鞘管４７と懸濁液供給管４９との間には隙間が存在するが、この隙間はゴム製のＯリング等の適宜シール部材によってシールされている。
【００２１】
懸濁液供給管４９の懸濁液吐出口５０の位置を調整するために、懸濁液供給管４９の上部は角度調整装置５１に連結されている。この角度調整装置５１は、容器４０または容器４０を固定している基台（図示せず）に固定されている。角度調整装置５１に採用する傾斜調整機構としては種々の技術が利用可能であるが、例えば図３に示すように、懸濁液供給管４９を囲うように基台に設けた正方形枠５２に容器中心軸を挟んで対向する複数のねじ孔５３を設けるとともにこれらのねじ孔５３にねじ５４を取り付け、これらのねじ５４を操作することによって懸濁液供給管４９の角度を調整できる機構がある。このねじ式角度調整機構は、鞘管４７と懸濁液供給管４９との隙間に配置されるシール部材とともに、懸濁液供給管４９の上下方向の位置決めとして機能する。
【００２２】
容器４０の下端部に連結された流路ブロック２は、光を透過できる材料、例えば水晶、ガラス、溶融シリカまたは透明プラスティックからなる群から選択された材料で作られており、容器中心軸と同軸上に細い流路３が形成されている。図４に示すように、流路３は長方形の断面を有し、長手方向の壁面５５，５６をＸ方向に向け、短手方向の壁面５７，５８をＹ方向に向け、一方の短手方向壁面５７から第１と第２のレーザ光８，１２が入射され、前方散乱光５９が対向する他方の短手方向壁面５８から出射するとともに一方の長手方向壁面５６から蛍光・側方散乱光６０が出射するように配置される。
【００２３】
流路ブロック２はまた、図４と図５に拡大して示すように、蛍光・側方散乱光を検出する第１と第２の光ファイバ２６，２７を保持している。これらの光ファイバ２６，２７は、通常の光ファイバと同様に、光を導光するコアと、コアの周囲を被覆するクラッドからなる。これら第１と第２の光ファイバ２６，２７の一端面６１，６２は、それらの中心軸と直交する方向に加工されており、流路３の長手方向壁面５６と所定の距離δｇをあけて、容器中心軸と直交する水平方向（Ｙ方向）に垂直に向けて配置されている。また、図５に示すように、第１と第２の光ファイバ２６，２７は容器中心軸方向に一列に整列して配置されており、上述のように第１と第２の光ファイバ２７の中心高さが第１と第２のレーザ光１２の入射位置（高さ）１５１，１５２に一致させてある。
【００２４】
図４に示すように、流路３の大きさ（すなわち、寸法ｄｘ、ｄｙ）、第１と第２の光ファイバ２６，２７と流路３との距離（ｄｇ）は、光ファイバ２６，２７のコア径（ｄｆ）及び開口率（ＮＡ）を考慮したうえで、流路３中で細胞の通過する可能性がある楕円形の領域６３の外縁から出た光が光ファイバ２６，２７のコアに入射し得ること、また流路３の角部６４〜６７に当たった第１と第２のレーザ光８，１２の散乱光がコアに入射しない条件に決められる。これら２つの条件が満足されることで、細胞から出た蛍光・側方散乱光が確実に光ファイバ２６，２７に入射されるとともに、角部の散乱光に起因するノイズが検出結果から除去される。例えば、これら２つの条件は、Ｘ、Ｙ方向に関する領域６３の寸法δｘ、δｙをそれぞれ流路寸法ｄｘ、ｄｙの約１／４〜１／１０の範囲に設定することにより満足される。具体例として、流路３の大きさはｄｘ＝２００μｍ、ｄｙ＝１００μｍに設定される。
【００２５】
流路ブロック２の製造及びこの流路ブロック２に光ファイバを固定する方法について説明する。図５に示すように、流路ブロック２は、容器下部の小径筒部４２に連結された上部ブロック７０と、この上部ブロック７０の下部に連結された下部ブロック７１と、下部ブロック７１の下端に連結されたオリフィスプレート７２から構成されている。これら３つの部材は、接着剤で接着してもよいし、熱を加えて熱融着してもよい。上部ブロック７０には液体の流れる流路を小径筒部４２の内空断面から流路３の断面まで狭くするためにテーパ流路７３が形成されており、下部ブロック７１に流路３が形成されている。また、オリフィスプレート７２には、容器中心軸と同軸的に、検出流路３よりも狭い流路（オリフィス）７４が形成されている。
【００２６】
下部ブロック７１は複数の部材を組み合わせて構成する。例えば、図６に示すように、まずプレート７５を用意する。次に、プレート７５の一方の平坦面７６上に、検出流路３の長辺寸法ｄｘに相当する間隔をあけて、同一の厚み（ｄｙ）を有する２つのスペースプレート７７を配置し固定する。続いて、２つのスペースプレート７７の上に、所定の厚み（ｄｇ）を有するカバープレート（仕切り壁）７８を配置し固定する。最後に、カバープレート７８の上にボルダブロック７９を配置して固定する。
【００２７】
ホルダブロック７９には、カバープレート７８に対向する面とこれに対向する反対側の面とを貫通する長方形の凹部８０が形成されており、この凹部８０にファイバホルダ８１が挿入されて固定されている。ファイバホルダ８１は、図７Ａと図７Ｂに示すように、複数のファイバ８２を並列に保持するための溝（ファイバ収容室）８３が形成されたブラケット状の第１のブロック８４と、溝８３を覆うプレート状の第２のブロック８５からなる。第１と第２のブロック８４，８５の大きさは、これらのブロック８４，８５を組み合わせたときの外形が丁度凹部８０と一致するようにしてある。また、溝８３の大きさは、出来るだけ隙間の無い状態で複数の光ファイバ（少なくとも、第１と第２の光ファイバ２６，２７を含む。）を並列に収容できる大きさとしてある。そして、溝８３に光ファイバ８２を収容したファイバホルダ８１はホルダブロック７９の凹部８０に挿入されて固定される。このとき、光ファイバの端面はカバープレート７８にほぼ接触させる。また、必要であれば、光ファイバ８２は接着剤を用いてファイバホルダ８１に固定する。
【００２８】
高感度をもって蛍光を測定するために、光ファイバ２６，２７の端面とカバープレート７８との間は、空気の無い状態に保つことが好ましい。そのため、両者の間には、透明の接着剤、オイル、ゲルなどの充填材８６（図４参照）を充填することが好ましい。また、カバープレート７８を光ファイバ２６，２７（特に、コア）とほぼ同一の屈折率を有する材料で形成するとともに、それらの間に充填する透明の接着剤、オイル、ゲルの屈折率はカバープレート７８と光ファイバ２６，２７（特に、コア）の屈折率とほぼ同一であることが好ましい。この場合、蛍光と散乱光を効率良く光ファイバ２６，２７に集光できる。
【００２９】
上述の実施例では、複数の光ファイバ８２を長方形の溝８３に収容して固定したが、図８Ａと図８Ｂに示すように、一本の光ファイバとその周囲に配置された６本の光ファイバとからなるファイババンドル８７を対応する大きさの円筒ファイバホルダ８８に挿入して固定し、これら７本の光ファイバのうちの２本の光ファイバを第１と第２の光ファイバ２６、２７として使用してもよい。ただし、本実施例の場合、円筒ファイバホルダ８８がホルダブロック７９に対して回転しないようにするために、円筒ファイバホルダ８８の外周面に突起８９（または窪み）を形成するとともにホルダブロック７９には対応する窪み（または突起）〔図示せず〕を形成して両者を係合させることが好ましい。
【００３０】
図２に戻り、容器４０の小径筒部４２には、流路ブロック２の下端オリフィス７４から吐出される液体をそれぞれが細胞を含む液滴に分離するために、小径筒部４２の外周から容器中心に向かって液体に振動を与える振動装置９０が固定されている。この振動装置９０は、小径筒部４２の周囲に対称に複数配置するのが好ましい。また、振動装置９０には、ピエゾ素子（ＰＺＴ）を用いるのが好ましい。
【００３１】
図５に示すように、フローサイトメータ１はまた、流路ブロック２の下方に、特定の粒子集団を採取するソーティング装置９１を備えている。このソーティング装置９１は、電源回路９１と、オリフィス７４から噴射される液体に接触する電極９３と、オリフィス７４の下方に該オリフィス７４から噴射される液体の両側に配置された一対の導電性電極板（偏向板）９４ａ，９５ａを有する。なお、電極９３の設置場所は限定的ではなく、流路ブロック２内の流路を流れる液体と接触することができればよい。また、電極板９４ａ，９５ａは、これに水分が付着すると両者の間に形成される電界の分布に変化を生じる。そのため、これら電極板９４ａ，９５ａは多孔性の金属板で構成され、それらの背面に吸引装置（真空装置）９４ｂ、９５ｂが設けられ、電極板９４ａ，９５ａの表面に付着した液体がそれらの背後に設けた吸引装置９４ｂ、９５ｂで吸引されるようにしてある。したがって、正極性に帯電した水分粒子は、電極板９４ａ、９５ａに付着すると、この電極板９４ａ、９５ａに形成されている微小の孔を通ってその背面に移動する。その結果、電極板９４ａ，９５ａの間に形成される電界は安定した状態を保つ。
【００３２】
このような構成によれば、図２に示すように、シース液供給部４５から供給されたシース液は容器４０の内部を下方に向けて移動する。単位時間当たりのシース液の供給量は、容器４０の内部をシース液が容器中心軸を中心として層流状態で移動するように決定する。一方、懸濁液供給部４８から供給された懸濁液は、懸濁液供給管４９を介して、層流状態で流れるシース液の中心に供給される。これにより、シース液が懸濁液の周囲を囲む円筒状の層流、すなわち粒子を容器４０の中心軸に沿って一つ一つ正確に流すシースフローが形成される。次に、懸濁液とシース液は、容器４０のテーパ部４３で加速された後、小径筒部４２に送られるた後、流路ブロック２に入ってテーパ流路３で再び加速されて流路３に入る。
【００３３】
図４に示すように、流路３を通過する粒子は第１と第２のレーザ光８，１２が照射されることにより、前方散乱光５９と蛍光・側方散乱光６０を生じる。前方散乱光５９は、第１と第２のレーザ光１２の延長上にある壁面５８から流路ブロック２の外部に出て、第１の検出装置２１で検出される。他方、第１と第２のレーザ光８，１２による蛍光・側方散乱光６０は第１と第２の光ファイバ２６，２７にそれぞれ集光され、第２の検出装置２５で検出される。このとき、検出流路３の角部６４〜６７で散乱した光が第１と第２の光ファイバ２７に集光されることがないので、蛍光・側方散乱光に含まれるノイズを最小限に抑えることができる。第１と第２の検出装置２５で検出された粒子の生物学的性質は、電源回路９２（図５参照）に送られる。
【００３４】
流路３を通過したシース液は、オリフィス７４からジェット噴射される。噴射されたシース液は、振動装置９０から容器４０の小径筒部４２に加えられた振動によって、それぞれに粒子を収容した液滴となる。特に、本実施の形態では、振動装置９０が容器４０の小径筒部４２に設けてあるので、振動装置９０が発生した振動が効率良く層流混合液に伝達され、図５に示すように良好に液滴９６に分離される。
【００３５】
オリフィス７４から噴射されるシース液に含まれる液滴は、電源回路９２から電極９３に印加される電圧によって正極性又は負極性に荷電される。電源回路９２は、信号処理装置２４で検出された該粒子の生物学的性質から作成された信号に基づいて制御され、特定の液滴のみ荷電される。荷電された液滴９６は、電極板９４ａ，９５ａの間を通過する際に偏向され、特定の粒子だけが採取される。また、電極板９４ａ、９５ａに付着した水分は、背後に設けた吸引装置９４ｂ、９５ｂによって、多孔板で形成されたこれら電極板９４ａ，９５ａを透過して吸引装置９４ｂ、９５ｂに吸引される。そのため、電極板９４ａ，９５ａの間には一定の電界が維持される。
【００３６】
なお、容器４０または流路ブロック２の内部で細胞が詰まった場合、基台から容器４０と流路ブロック２を取り外し洗浄して詰まった細胞を除去する。また、洗浄後の容器４０と流路ブロック２を再びもとの状態に組み立てる。このとき、流路ブロック２の検出流路中心に励起光の集光位置を一致させる必要があり、ビームエキスパンダ、集光レンズに付設された集光位置調整装置を操作し、第１と第２のレーザ光の集光位置を調整する。しかし、蛍光・側方散乱光を検出する第２の検出装置については、その蛍光・側方散乱光を集光する手段として流路ブロックに固定された光ファイバを用いているので、同様の調整はまったく不要である。
【００３７】
また、上述の実施の形態では、振動装置９０を容器４０の小径筒部４２に固定し、この小径筒部４２を流れる層流混合液に振動を加えたが、図９に示すように、流路ブロック２の上端に振動装置９０を設置し、上下方向（液滴の吐出方向）に向けて振動を加えてもよい。この場合、液滴のきれが良くなり、効率的に液滴が形成される。当然ながら、振動装置９０の設置場所や加振方向に関する技術は、本発明のフローサイトメータに限らず、従来のフローサイトメータにも適用できる。
【００３８】
さらに、上述の実施の形態では、容器４０の中心軸に沿って真っ直ぐの懸濁液供給管４９を配置したが、図１０に示すように、上部を斜めに曲げた別の懸濁液供給管４９を利用し、下部直管部を容器中心軸と平行に配置した状態で、容器４０に対する上部直管部の挿入量を調整することにより、懸濁液供給管４９から吐出する懸濁液の位置を調整することができる。なお、懸濁液４９の吐出口を調整する機構については、本発明のフローサイトメータに限らず、他のフローサイトメータにも適用できる。
【００３９】
さらにまた、図１０に示すように、容器４０の大径筒部４１と小径筒部４２の少なくともいずれか一方にシース液を排出するドレーン管９７を接続するとともに、シース液供給管４６とドレーン管９７を弁機構９８を介してシース液供給部４５とシース液回収部９９に接続し、弁機構９８を操作することによって、シース液供給管４６をシース液供給部４５またはシース液回収部９９のいずれか一方に選択的に流体接続し、ドレーン管９７をシース液供給部４５またはシース液回収部９９のいずれか一方に選択的に流体接続するようにしてもよい。この場合、弁機構９８を操作することによって、容器４０内に滞留している細胞・ごみ・空気を抜き取って回収したり、シース液の交換を行うことが自由にできる。また、このような細胞等を回収する配管についても、本発明のフローサイトメータに限らず、他のフローサイトメータにも適用できる技術である。
【００４０】
ＩＩＩ．信号処理系
図１１は、信号処理装置２４の回路を示す。図示するように、信号処理装置２４は複数のアンプ１０１を備えており、第１の検出部２１と第２の検出部２５の光検出器から出力された信号（前方散乱光、側方散乱光、蛍光に対応する信号）がそれぞれ増幅される。増幅された信号はパラメータセレクタ１０２に送信され、予め決められた波長域のパルス波形の信号として取り出される。パラメータセレクタ１０２で取り出された信号は、アナログ信号の状態でＡ／Ｗ／Ｈ演算器１０３に送信され、その面積、幅、高さ、面積が計算される。次に、アナログ信号はＡ／Ｄ変換器１０４でデジタル信号に変換された後、先入れ先だし（ＦＩＦＯ）メモリ１０５に送信されて記憶される。
【００４１】
上述のように、第２の検出部における２つの光ファイバ２６，２７は、流路３の流れの方向に関して異なる位置に配置されている。したがって、一つの粒子から出た蛍光・散乱光を第２の光ファイバ２７で検出する時刻は、同一の粒子から出た蛍光・散乱光を第１の光ファイバ２６で検出する時刻よりも所定時間遅れる。その結果、一つの粒子について、第１の光ファイバ２６に関係する信号がＦＩＦＯメモリ１０５に入力される時間と、第２の光ファイバ２７に関係する信号がＦＩＦＯメモリ１０５に入力される時間との間に上記所定時間の差を生じる。そのため、ＦＩＦＯメモリ１０５はタイミング制御部１０６に接続されており、上記所定の時間遅れを考慮したタイミングをもってタイミング制御部１０６から送信される信号に基づき、一つの粒子に関連した信号がＦＩＦＯメモリ１０５から同時に出力される。
【００４２】
ＦＩＦＯメモリ１０５から出力されたデジタル信号はコンペンセーション回路１０７に送信され、そこで予め決められた比率をもとに各蛍光成分からその蛍光成分に含まれていると思われる別の蛍光成分が除去される。コンペンセーションが行われたデジタル信号はｌｏｇ変換／増幅回路１０８に送られ、そこでｌｏｇ変換または増幅される。変換または増幅されたデジタル信号は、ホストコンピュータ１０９とソーティング制御回路１１０に送られる。ホストコンピュータ１０９に送信された信号は、例えば粒子の生物学的性質の検出に利用される。また、ソーティング制御回路１１０に送信された信号は、ソーティング装置における電源回路の制御に利用される。
【００４３】
このように、信号処理装置２４では、パラメータセレクタ１０２から出力されたアナログ信号をＡ／Ｗ／Ｈ演算器１０３でその面積、幅、高さ、面積を計算しているので、例えば、デジタル信号プロセッサの中でコンペンセーション回路とｌｏｇ変換回路との間にＡ／Ｗ／Ｈ演算器を設けた場合に比べて、分解性・精度の点で優れた結果が得られる。また、アンプから出力されたアナログ信号をｌｏｇ変換する一方、デジタル信号プロセッサではＦＩＦＯメモリから出力されたデジタル信号をコンペンセーション回路でコンペンセーションし更にＡ／Ｗ／Ｈ演算器でその面積等を計算する場合には、アナログ信号を用いたｌｏｇ変換の精度が悪く、またコンペンセーションされたデジタル信号をｌｏｇ変換し更に再ｌｏｇ変換しなければならないという問題があるのに対し、上述した信号処理装置２４ではそのような問題がないという利点を有する。
【００４４】
以上に説明した本発明のフローサイトメータでは、蛍光・側方散乱光を検出するための集光手段として光ファイバを利用しているが、前方散乱光を集光するための手段として光ファイバを利用することもできる。この場合、前方散乱光を集光するための光ファイバも、図６を参照して説明した方法と同様の方法で、流路の近傍に固定することができる。また、照明部についても、集光レンズなどの光学機器を用いることなく、レーザ発生器から出力された光を光ファイバを介して流路まで導光してもよい。この場合、光ファイバから出力された光を集光するために、この光ファイバの出光端を凸レンズ状に曲面加工するのが好ましい。そして、このような構成を採用すれば、洗浄後の光軸調整が更に簡単になる、またはまったく不要になる。
【００４５】
また、上述のフローサイトメータでは、蛍光・側方散乱光を検出するための第１と第２の光ファイバを流路の片側に並列して配置したが、流路を挟むようにしてその左右両側にそれぞれ分けて配置することもできる。
【００４６】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明に係るフローサイトメータによれば、洗浄後の光軸調整が容易になる。また、高精度で生物学的粒子の生物学的性質が検出できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明に係る生物学的粒子の生物学的性質を得る装置の光学的要素を示す図。
【図２】 本発明に係る生物学的粒子の生物学的性質を得る装置の流体力学的構成を示す側面図。
【図３】 図２に示す装置に付設された角度調整装置の断面図。
【図４】 図１に示す装置の検出流路とその近傍に配置された光ファイバの一部を拡大した拡大横断面図。
【図５】 図１に示す装置の検出流路とその近傍に配置された光ファイバの一部を拡大した拡大縦断面図。
【図６】 図１に示す装置の流路形成部材（流路ブロック）の拡大斜視図。
【図７Ａ】 図６に示す流路形成部材に組み込まれるファイバホルダの拡大正面図。
【図７Ｂ】 図６に示す流路形成部材に組み込まれるファイバホルダの拡大側面図。
【図８Ａ】 ファイババンドルを用いたファイバホルダの拡大正面図。
【図８Ｂ】 図８Ａに示すファイバホルダの拡大断面図。
【図９】 本発明に係る装置の他の形態の側面図。
【図１０】 本発明に係る装置の他の形態の側面図で、シーズ液から異物を除去する流体回路を示す図。
【図１１】 信号処理装置の回路図。
【図１２】 生物学的粒子の生物学的性質を得る従来装置を示す斜視図。
【符号の説明】
１：装置
２：流路形成部材（流路ブロック）
３：流路
４：シースフロー
５：照明部
６：第１のレーザ発生器
７：第２のレーザ発生器
８：第１のレーザ光
９：光ファイバ
１０：ビームエキスパンダ
１１：集光レンズ
１２：第２のレーザ光
１３：光ファイバ
１４：ビームエキスパンダ
１５：集光レンズ
１６：ミラー
１７〜２０：集光位置調整装置
２１：第１の検出部
２２：集光レンズ
２３：光検出器
２４：信号処理装置
２５：第２の検出器
２６：第１の光ファイバ
２７：第２の光ファイバ
２８、２９：ファイバコネクタ
３０，３１：分光器
３２，３３：セルフォックスレンズ
３４ａ，３６ａ：分光フィルタ
３５，３７：光検出器
４０：容器
４１：大径筒部
４２：小径筒部
４３：テーパ部
４４：層流形成室
４５：シース液供給部
４６：シース液供給管
４７：鞘管
４８：懸濁液供給部
４９：懸濁液供給管
５０：吐出口
５１：角度調整機構
５５〜５８：流路壁面
５９：前方散乱光
６０：蛍光・側方散乱光
６１，６２：光ファイバ端面
６４〜６７：流路角部
７０：上部ブロック
７１：下部ブロック
７２：オリフィスプレート
７５：プレート
７７：スペースプレート
７８：カバープレート（仕切り壁）
８０：凹部
８１：ファイバホルダ
９１：ソーティング装置
９２：電源回路
９３：電極
９４ａ，９５ａ：電極板（偏向板）
１０５：先入れ先だし（FIFO）メモリ

Claims (16)

1. 染色処理された生物学的粒子を含む液体に光を当て、該生物学的粒子からの情報光を検出して、該生物学的粒子の生物学的情報を得る装置（１）において、
   光を透過する材料からなり、染色処理された生物学的試料を含む液体が流れる流路（３）を形成する流路形成部材（２）と、
   上記流路（３）を流れる粒子に光を当てる照明部（５）と、
   上記粒子に当てられた光から得られる第１の情報光を検出する第１の検出部（２１）と、
   上記粒子に当てられた光から得られる第２の情報光を検出する第２の検出部（２５）とを有し、
   上記第１の検出部（２１）、第２の検出部（２５）の少なくともいずれか一方は一つまたは複数の光ファイバ（２６，２７）を備えており、
   上記光ファイバ（２６，２７）の一端面（６１，６２）は上記情報光を集光できるように流路（３）の近傍に配置されており、
   上記流路形成部材（２）は、上記光ファイバ（２６，２７）の一端面（６１，６２）とこの一端面（６１，６２）が対向する壁面（５６）との間に仕切り壁（７８）を有し、
   上記光ファイバ（２６，２７）は上記一端面（６１，６２）が上記仕切り壁（７８）に接触させて又は透明の充填材（８６）を介して接触させて配置されていることを特徴とする装置。
2. 上記流路形成部材（２）に形成された流路は、対向する一対の平坦な第１の壁面（５７，５８）と、上記第１の壁面（５７，５８）と直交する方向に伸びた対向する一対の平坦な第２の壁面（５５，５６）によって形成された四角形の断面を有し、
   上記照明部（５）は上記一対の第１の壁面（５７，５８）の一方の壁面（５７）に光を入射し、
   上記第１の検出部（２１）は上記一対の第１の壁面（５７，５８）の他方の壁面（５８）を透過した光を検出し、
   上記第２の検出部（２５）は上記一対の第２の壁面（５５，５６）の一方の壁面（５６）を透過した光を検出することを特徴とする請求項１に記載の装置。
3. 上記光ファイバ（２６，２７）の一端面（６１，６２）は上記一対の第２の壁面（５５，５６）の一方の壁面（５６）に平行に配置されていることを特徴とする請求項２に記載の装置。
4. 上記四角形の断面を有する流路（３）は、上記一対の第１の壁面（５７，５８）と一対の第２の壁面（５５，５６）が交差する角部（６４〜６７）から生じる拡散散乱光が上記光ファイバ（２６，２７）に入らないように決められていることを特徴とする請求項２または３のいずれか一に記載の装置。
5. 染色処理された生物学的粒子を含む液体に光を当て、該生物学的粒子からの情報光を検出して、該生物学的粒子の生物学的情報を得る装置において、
   光を透過する材料からなり、染色処理された生物学的試料を含む液体が流れる流路（３）を形成する流路形成部材（２）と、
   上記流路（３）を流れる粒子に光を当てる照明部（５）と、
   上記粒子に当てられた光から得られる第１の情報光を検出する第１の検出部（２１）と、
   上記粒子に当てられた光から得られる第２の情報光を検出する第２の検出部（２５）とを有し、
   上記照明部（５）は上記流路（３）の中心軸方向に所定の間隔をあけた第１の位置（１５１）と第２の位置（１５２）にそれぞれ光を集光する第１の光学部（６，９，１０，１１）と第２の光学部（７，１３，１４，１５，１６）を有し、
   上記第１の検出部（２１）、第２の検出部（２５）の少なくともいずれか一方は第１の光ファイバ（２６）と第２の光ファイバ（２７）を備えており、
   上記第１の光ファイバ（２６）と第２の光ファイバ（２７）の一端面（６１，６２）は 上記第１の位置（１５１）と第２の位置（１５２）で光が当てられた粒子からの上記情報光をそれぞれ集光できるように流路（３）の近傍に配置されており、
   上記流路形成部材（２）は、少なくとも一つの平坦面（７６）を有する第１の透光部材（７５）と、一対の平行な平坦面を有し且つ一方の平坦面を上記第１の透光部材（７５）と所定の間隔をあけて対向させた第２の透光部材（７８）と、第１の透光部材（７５）の平坦面とこれに対向する第２の透光部材（７８）の平坦面との間に挟持されかつ所定の間隔をあけて対向し、上記第１の透光部材（７５）と第２の透光部材（７８）とともに四角形の流路（３）を形成する一対の第３の透光部材（７７）とを備えており、
   上記光ファイバ（２６，２７）は上記一端面（６１，６２）が上記第２の透光部材（７８）に接触させて又は透明の充填材（８６）を介して接触させて配置されていることを特徴とする装置。
6. 上記第１の位置（１５１）と第２の位置（１５２）は、第１の位置（１５１）で光を当てられた粒子からの散乱光が第２の光ファイバ（２７）に検出されず且つ第２の位置（１５２）で光を当てられた粒子からの散乱光が第１の光ファイバ（２６）に検出されないように決められていることを特徴とする請求項５に記載の装置。
7. 一本の光ファイバの周りに六本の光ファイバを隙間無く配置したファイババンドル（８７）を有し、上記ファイババンドル（８７）に含まれた複数の光ファイバの中から選択された２つの光ファイバが上記第１の光ファイバ（２６）と第２の光ファイバ（２７）として使用されていることを特徴とする請求項５または６のいずれか一に記載の装置。
8. 上記流路形成部材（２）は、上記第２の透光部材（７８）の他方の平坦面に対向する第４の部材（７９）を備えており、上記第４の部材（７９）は上記一以上の光ファイバ（２６，２７）の一端を保持するファイバブロック（８１）を保持していることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の装置。
9. 上記第１の検出部（２１）と第２の検出部（２５）の少なくともいずれか一方は、上記光ファイバ（２６，２７）の他端にファイバコネクタ（２８，２９）を備えており、このファイバコネクタ（２８，２９）に上記光ファイバ（２６，２７）を通じて送られる光をコリメートするレンズ（３２，３３）が収容されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一に記載の装置。
10. 上記第１の検出部（２１）と第２の検出部（２６）の少なくともいずれか一方は、上記光ファイバ（２６，２７）から出力された光を分光する分光器（３０，３１）と、上記分光器（３０，３１）で分光された光に含まれる情報を読み取る複数の光検出器（３５，３７）を備えていることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一に記載の装置。
11. 上記複数の光検出器（３５，３７）から出力された複数のアナログ信号の面積・幅・高さを演算するＡ／Ｗ／Ｈ回路（１０３）と、上記Ａ／Ｗ／Ｈ回路（１０３）から出力されたアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換器（１０４）と、上記Ａ／Ｄ変換器（１０４）から出力されたデジタル信号に基づくデジタル情報を保存するとともに保存されている複数のデジタル情報を同時に出力する先入れ先だしメモリ（１０５）と、上記メモリ（１０５）から出力されたデジタル情報を補正するコンペンセーション部（１０７）と、上記コンペンセーション部（１０７）から出力されたデジタル情報を対数演算する Log 演算部（１０８）を有する信号処理部（２４）を備えていることを特徴とする請求項１０に記載の装置。
12. 上記流路（３）の上流側に配置されて層流形成室（４４）を形成する筒状容器（４０）と、
    上記筒状容器（４０）の上部から上記液体の主要部を構成するシース液を供給するシース液供給管（４６）と、
    上記筒状容器（４０）の中心軸に沿って配置され、上記粒子を含む懸濁液を上記層流形成室（４４）の中を流れているシース液に対して供給する懸濁液供給管（４９）と、
    上記懸濁液供給管（４９）の懸濁液吐出口（５０）の位置を調整する機構（５１）を備 えたことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一に記載の装置。
13. 上記層流形成室の下部に接続されたドレーン管（９７）と、
    上記シース液の供給部（４５）と、
    上記シース液の回収部（９９）と、
    上記シース液供給管（４６）を上記供給部（４５）または回収部（９９）のいずれか一方に選択的に流体接続する手段（９８）と、
    上記ドレーン管（９７）を上記供給部（４５）または回収部（９９）のいずれか一方に選択的に流体接続する手段（９８）を備えた請求項１〜１２のいずれか一に記載の装置。
14. 上記液体の流れに対してその直交方向から振動を与える手段（９０）を備えていることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一に記載の装置。
15. 上記液体の流れに対してその流れの方向に振動（９０）を与える手段を備えていることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一に記載の装置。
16. 上記流路から流出する液滴に電荷を付与する荷電手段（９３）と、
    荷電された液滴の落下経路の近傍に配置され一対の偏向板（９４ａ，９５ａ）と、
    上記一対の偏向板（９４ａ，９５ａ）の間に電界を形成する電源回路（９２）を有し、
    上記偏向板（９４ａ，９５ａ）の少なくとも一方を多孔板で形成し、
    上記多孔板の背後には上記多孔板の表面に付着した液滴を背面に向けて吸引する吸引部（９４ｂ、９５ｂ）を設けたことを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一に記載の装置。

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