JP4488882B2

JP4488882B2 - フローサイトメータおよびフローサイトメータを用いた測定方法

Info

Publication number: JP4488882B2
Application number: JP2004361055A
Authority: JP
Inventors: 成幸中田; 弘能林
Original assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Current assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2004-12-14
Publication date: 2010-06-23
Anticipated expiration: 2024-12-14
Also published as: JP2006170687A

Description

本発明は、細胞などの被測定対象物を含む被測定流体に光ビームを照射し、被測定流体に含まれる被測定対象物からの蛍光や散乱光を測定し、被測定対象物についての各種分析を行なうフローサイトメータおよびフローサイトメータを用いた測定方法に関する。

現在、抗体が蛍光染色された細胞などのサンプル粒子を含むサンプル液を、シース液とともに細い流路に高速で流してサンプル流を形成し、このサンプル流にレーザ光を照射してサンプル粒子から放出される蛍光や散乱光を粒子１つ１つについて測定するフローサイトメータが実用化されている。
図７は、従来のフローサイトメータの一例について説明する図であり、サンプル流とサンプル流に対するレーザ光の照射部分を拡大して示す概略説明図である。図７の例では、サンプルとして細胞１１４を含むサンプル液がシース液に囲まれて内部を流れるフローセル１０２と、フローセル１０２にシース液を供給する、フローセル１０２と連続したシース液流管１０４と、シース液流管１０４内部に設けられた、フローセル１０２にサンプル液を供給するためのサンプル液流管１０６とを有して構成されている。

シース液流管１０４には、図７中の上側から下側に向けてシース液が流れ、図７中矢印で示すシース流を形成する。このシース流（シース液）はフローセル１０２に流入する。サンプル供給管１０６には、図７中の上側から下側に向けてサンプル液が流れ、このサンプル液が図中下側の開口端である吐出口１０８からシース液の流れの中に吐出されることで、シース流に囲まれたサンプル流１１０が形成される。

吐出口１０８からサンプル液が吐出された段階で、サンプル液にはシース流の影響による流体力学的絞り込みが生じ、シース流に包まれたサンプル流１１０の流径は非常に細くなり、サンプル流を流れる細胞１１４は１列に並ぶ。フローサイトメータでは、このように細胞１１４が１列となり、１個ずつ順番にフローセル１０２内部を流れて行くよう、シース液やサンプル液の供給圧力を調整する。このフローセル１０２には、図７の紙面に対して垂直方向にレーザ光１１２が照射されており、このレーザ光１１２を横切るようにして、サンプル流１１０に含まれる細胞１１４が１個づつ順番に流れる。

サンプル流１１０にレーザ光１１２が照射されると、レーザ光１１２がサンプル流１１０を流れる細胞１１４に当たって散乱し、また、抗体に付着された蛍光色素から蛍光が発生する。フローサイトメータでは、これらの蛍光や散乱光を測定して細胞に関する様々な情報を取得する。これらの散乱光や蛍光の強度は、細胞１１４に照射されるレーザ光１１２の光強度（単位時間に照射される光エネルギー総量）に依存する。蛍光や散乱光を効率的に検出したい場合、サンプル流１１０に照射するレーザ光の強度はなるべく強い方が好ましく、サンプル流１１０に照射するレーザ光のビーム径は、なるべく絞った方が好ましい。

サンプル流１１０に照射されるレーザ光１１２は、中心が最も明るく周辺は光が弱い、いわゆるガウシアンビームで、光の中心から強度が１％低下する半径はガウシアン半径の７％程度となり、例えばガウシアン直径が１５０（μｍ）になるようレーザ光を広げて設定しても、強度低下１％以内で使用するためには、サンプル流はレーザ光の中心に１０μｍ程度の幅以内に精度を上げて流す必要がある。
従来のフローサイトメータでは、なるべく強くかつ均一な光強度のレーザ光をサンプル流に照射するために、レーザ光１１２のビーム径を充分に絞り、かつ、このレーザ光１１２の中心部分をサンプル流１１０が横切って流れるように、フローセル１０２とレーザ光１１２の照射位置との相対位置を高精度に位置合わせしていた。

例えば、細胞から発する蛍光を比較的高い分解能で測定する場合など、サンプル流１１０を流れる細胞１１４に対し、充分な強度のレーザ光を照射する必要がある。このためには、小さく絞ったレーザ光１１２の中心部分とサンプル流１１０とを、例えば数μｍ程度の位置精度で位置合わせする必要がある。従来は、このようなレーザ光１１２とサンプル流１１０とを高精度に位置合わせするために、フローセル１０２とレーザ光１１２の照射位置とを、数μｍ程度の位置精度で高精度に位置合わせしていた。

フローセル１０２内で、サンプル供給管１０６の吐出口１０８とシース液流管１０４との相対位置が高精度に位置決めされていたとしても、例えば、サンプルの粒径、シース液の粘度、気泡の発生、サンプルノズルの汚れ、気圧の変化、サンプル供給コンプレッサの圧力変動などによって、フローセル１０２内において、サンプル流１１０やシース流に変動が生じることがある。このような流れの変動が生じると、吐出口１０８から吐出されるサンプル流１１０とフローセル１０２との相対位置が変動してしまう。

フローセル１０２に対するレーザ光１１２の照射位置が固定されている場合、サンプル流１１０とフローセル１０２との相対位置が変動すると、サンプル流１１０はレーザ光１１２の中心部分から外れてしまう。このように、サンプル流１１０がレーザ光１１２の中心部分から外れてしまうと、サンプル流１１０を流れる細胞１１４に充分な光強度を照射することができず、例えば、上述の比較的高い分解能の測定を行なうことができない。従来のフローサイトメータでは、フローセル１０２に対するレーザ光１１２の照射位置が固定されている場合、このように、計測環境などの変化によって、サンプル流１１０とフローセル１０２との相対位置が変動した場合、サンプル流と１１０ビーム照射位置との相対位置が変動し、測定毎に精度が一定化しないといった問題点があった。また、フローセル１０２に対するレーザ光１１２の照射位置を固定すること自体、初期の位置調整に時間や熟練が必要であり、定期的にも調整コストが発生するといった問題があった。

これに対し、例えば、下記特許文献１では、レーザ光１１２とサンプル流１１０との位置決めに関して、サンプル流１１０の幅よりも小さく絞ったレーザ光によって、フローセル１０２を流れるサンプル流１１０のエッジを検出してサンプル流１１０の中心を求め、このサンプル流１１０の中心にレーザ光が照射されるよう、フローセル１０２とレーザ光との相対位置を調整するフローセル位置決め方法およびフローセル位置調整可能なフローサイトメータが提案されている。特許文献１記載のフローサイトメータでは、フローセル１０２におけるサンプル流１１０自体の位置を検出してフローセル１０２の位置を移動させ、フローセル１０２を流れるサンプル流１１０とレーザ光１１２との相対位置を調整していた。特許文献１では、このような構成により、サンプル流１１０とフローセル１０２との相対位置が変動した場合であっても、測定の度にサンプル流１１０とレーザ光１１２との相対位置を高精度に調整している。
特開２００４−２５７７５６号公報

しかし、特許文献１記載のフローサイトメータにおいて、サンプル流１１０がフローセル１０２内で中心から大幅に偏った場合（すなわち、サンプル流１１０がシース流管１０４に近接した位置を流れた場合）、サンプル流１１０の幅がシース流管１０４の内壁面の影響を受けて拡がってしまう。サンプル流１１０の幅が拡がると、サンプル流１１０を流れるサンプル１１４の流れる位置が空間的に広がり、レーザ光１１２の中心部分をサンプル１１４が通過しない場合が生じる。また、シース流管１０４に近接して流れるサンプル流１１０にレーザ光を照射した場合、シース流管１０４の影響で、エッジ検出のためのレーザ光や測定のためのレーザ光の散乱が大きくなり、サンプル流１１０およびサンプル１１４に照射されるレーザ光強度にばらつきが生じる。このような理由から、サンプル流１１０がフローセル１０２内で中心から大幅に偏った場合、サンプル流１１０とレーザ光１１２の位置を、充分な精度に調整することができないといった問題がある。また、たとえ、このサンプル流１１０とレーザ光１１２の位置を高精度に調整できたとしても、フローセル１０２内でサンプル流１１０が大幅に偏って流れていると、蛍光や散乱光の測定を充分な精度で行なうことはできないといった問題があった。

本発明は、上記従来の問題点に着目してなされたもので、フローセルにおけるサンプル流の位置を、測定毎に高精度に調整可能なフローサイトメータ、およびフローサイトメータを用いた測定方法を提供する。

上記問題を解決するために、本発明は、シース液が内部を一方向に流れる外部流管と、前記外部流管の内側領域に設けられ、被測定サンプルを含むサンプル液が内部を流れる内部流管とを備え、前記内部流管の開口端から前記サンプル液をシース液流の中に吐出させることで、前記シース液に囲まれて流れるサンプル液流を形成する液流形成手段と、前記サンプル液流に光ビームを照射する光ビーム照射手段と、前記光ビームの照射を受けて前記サンプル液流の被測定サンプルから発する散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方を測定する測定光学系とを有するフローサイトメータであって、前記内部流管の外周面に貼付けられたバイモルフ圧電素子と、前記バイモルフ圧電素子に電圧を印加する電圧印加手段とを有し、前記電圧印加手段により前記バイモルフ圧電素子に電圧を印加して前記バイモルフ圧電素子を前記光ビームの照射方向および前記サンプル液流の流方向のいずれとも垂直な方向に歪曲させることで前記バイモルフ圧電素子とともに前記内部流管を歪曲させて、前記内部流管の吐出側開口端の位置を前記外部流管に対して変位させることにより、前記光ビームの照射位置に対する前記サンプル液流の位置を調整する吐出位置調整手段と、前記測定光学系によって測定される前記散乱光および前記蛍光の少なくともいずれか一方の強度が最も高くなるように前記バイモルフ圧電素子へ印加する印加電圧を制御して前記吐出位置調整手段による前記内部流管の吐出側開口端の位置調整を制御する制御手段とを有することを特徴とするフローサイトメータを提供する。

さらに、本発明は、上記のフローサイトメータを用い、所望の分析対象サンプルの蛍光または散乱光を測定する方法であって、前記バイモルフ圧電素子に印加する印加電圧を種々変更しつつ、テスト用サンプルを含むテストサンプル液を前記内部管路の吐出側開口端から吐出させてテストサンプル液流を形成し、前記測定光学系によって測定される前記テスト用サンプルからの前記散乱光および前記蛍光の少なくともいずれか一方の強度が最も高くなるように前記バイモルフ圧電素子へ印加する印加電圧を制御することにより、前記開口端の位置を制御する位置制御ステップと、前記内部管路の前記開口端を、前記位置制御ステップにおいて制御した状態で、前記内部管路の前記開口端から前記分析対象サンプルを含む分析対象サンプル液を吐出して分析対象サンプル液流を形成し、この分析対象サンプルに光ビームを照射して前記分析対象サンプルから発する散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方を測定する測定ステップとを有することを特徴とする、フローサイトメータを用いた測定方法を提供する。

本発明のフローサイトメータ、およびフローサイトメータを用いた測定方法によると、フローセルにおけるサンプル流の位置を、測定毎に微調整することができる。これにより、フローセル内のサンプル流を安定化させることができる。また、フローセル内を安定して流れるサンプル流と光ビームの照射位置との相対位置を、測定毎に高精度に調整することも可能となる。これにより、光ビームのビーム中心に対してサンプル流を高精度に位置合わせすることができ、サンプルからの蛍光や散乱光を高精度に測定可能となる。

以下、本発明のフローサイトメータについて、添付の図面に示される好適実施例を基に詳細に説明する。図１は、本発明のフローサイトメータの一例であるフローサイトメータ１０の概略構成図である。フローサイトメータ１０は、液流形成ユニット２０、光学ユニット４０、位置調整分析ユニット５０、および各部の動作シーケンスを制御する制御装置７０とを有して構成されている。

フローサイトメータ１０では、測定対象とする細胞である分析サンプル１２を含むサンプル液の流れ（サンプル流）にレーザ光を照射し、分析サンプル１２中の抗体に付けられた蛍光色素の発する蛍光、およびレーザー光が分析サンプル１２に当たった際の拡散光のいずれかを検出し、検出した光信号に各種の処理を施すことで、分析サンプル１２について各種の分析を行なう。フローサイトメータ１０では、このような分析サンプル１２の分析に先がけて、所定の蛍光色素が付着した、予め用意されたテスト用サンプル１４を含むテストサンプル液の流れ（テストサンプル流）にレーザ光を照射して、テスト用サンプル１４から発する蛍光や拡散光の光信号を検出し、この検出した光信号に基づいてレーザ光の照射位置に対するテストサンプル流の形成位置を調整する。テストサンプル１４については、後に詳述する。

液流形成ユニット２０は、液体供給装置２２と、流管部３０とを有して構成されている。液体供給装置２２と流管部３０は、配管２４によって接続されている。液体供給装置２２内には、分析サンプル液を貯溜しておく分析サンプル液タンク２５、テストサンプル液を貯溜しておくテストサンプル液タンク２６、シース液を貯溜しておくシース液タンク２７とを有している。流管部３０は、サンプル液がシース液に囲まれて内部を流れるフローセル３２と、フローセル３２にシース液を供給するフローセル３２と連続した外部管路３４と、外部管路３４の内部に設けられて、フローセル３２にサンプル液を供給するサンプル流管３６とを有している。サンプル液またはテストサンプル液が流れるサンプル流管３６の管壁には、バイモルフ圧電フィルム６０が設けられている。バイモルフ圧電フィルム６０については、後に詳述する。液体供給装置２２のサンプル液タンク２６およびテスト液タンク２７はサンプル流管３６に、シース液タンク２７は外部管路３４に、配管２４を介してそれぞれ接続されている。フローセル３２の出口には、回収容器４９が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に分析サンプル１２中の特定細胞等を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。

この液体供給装置２２は、図示しないエアポンプを各タンク毎に備えている。フローサイトメータ１０では、シース液タンク２７内部を図示しないエアポンプによって加圧することで外部管路３４内部にシース液を供給し、外部管路３４およびフローセル３２内を図１中上側から下側に向けて流れるシース流を形成する。そして、サンプル液タンク２５およびテストサンプル液タンク２６のいずれか一方を、図示しないエアポンプによって加圧することで、サンプル流管３６の内部にサンプル液またはテストサンプル液を供給し、サンプル流管３６の図中下側の開口端である吐出口３８から、シース液の流れの中にサンプル液またはテストサンプル液を吐出する。

液体供給装置２２は制御装置７０に接続されており、測定動作シーケンスに応じた制御装置からの指示により各エアーポンプが駆動されることで、サンプル液またはテストサンプル液のいずれか一方をサンプル流管３６の内部に供給する。具体的には、分析サンプル１２の分析の際には、サンプル液をサンプル流管３６に供給する。そして、この分析サンプル１２の分析に先がけて行なう、サンプル流管３６の吐出口３８の位置調整の際には、テスト用サンプル液をサンプル流管３６に供給する。

フローセル３２では、図７に示す従来例と同様に、サンプル液（またはテストサンプル液）は、シース液に吐出された段階で流体力学的絞り込みが生じ、シース流に囲まれたサンプル流（またはテストサンプル液の流れ）は非常に細くなり、分析サンプル１２（またはテスト用サンプル１４）が１列に並ぶ。フローセル３２では、分析サンプル１２（またはテスト用サンプル１４）は１列となり、１個ずつ順番に所定の速さでフローセル３２中を流れる。このフローセル３２には、光学ユニット４０のレーザ光照射装置４２から出射されたレーザ光が照射されており、このレーザ光を横切るようにして分析サンプル１２（またはテスト用サンプル１４）は１個づつ順番に流れる。

ここで、サンプル流管３６に貼り付けられたバイモルフ圧電フィルム６０について説明する。図２は、バイモルフ圧電フィルム６０、およびバイモルフ圧電フィルム６０の動作について説明する概略断面図である。この図２は、レーザ光の照射方向を紙面と垂直方向とした概略断面図である。フローサイトメータ１０に用いられるバイモルフ圧電フィルム６０は、分極方向の異なる圧電体フィルム６１および６２を貼り合せ、その両面に電極６４、６５を装着したバイモルフ圧電フィルムである（図中の矢印は分極の向きを示す）。圧電フィルム６１、６２は、例えばセラミックを材料とした公知の圧電体フィルムであって、電界と分極方向が同一の場合は圧電体は伸び、逆に互いに反対の場合は縮む。サンプル流管３６の壁面には、２つのバイモルフ圧電フィルム６０が、貼り付けられている。各バイモルフ圧電フィルム６０は、後述する位置調整・分析ユニット４０の電圧印加手段５５に接続されている（図３参照）。電圧印加手段４６から一対のバイモルフ圧電素子６０に電界が印加されると、２枚の圧電体フィルム６１および６２のうち一方は伸び、一方は縮んでバイモルフ圧電フィルム６０全体が屈曲する。サンプル流管３６は金属製であり、比較的高い弾性を有する。バイモルフ圧電フィルム６０が屈曲すると、それに応じてサンプル流管３６が変形し、サンプル流管３６の吐出口３８の位置が移動する（図２（ｂ）（ｃ）参照）。

２つのバイモルフ圧電素子６０は、サンプル流管３６の中心線に対して略対称な位置に貼り付けられており、電圧が印加されることで、レーザ光の照射方向およびテストサンプル液流８０の流方向のいずれとも垂直な方向に歪曲される。また、フローサイトメータ１０においては、バイモルフ圧電フィルム６０は、吐出口３８から図の上側（すなわちサンプル流の上流側）へ充分離間した位置に貼り付けられている。このような位置にバイモルフ圧電フィルム６０を貼り付けることで、バイモルフ圧電フィルム６０をシース流やサンプル流に接触させることなく、シース流やサンプル流を安定した層流のまま、フローセル３２内に流すことができる。また、吐出口３８から充分に離間した位置にバイモルフ圧電素子が貼り付けられているので、バイモルフ圧電素子の少ない屈曲で、吐出口３８の位置を大きく変位させることができる。これにより、少ない駆動電力で充分な距離だけ吐出口を変位させることができる。

本発明のフローサイトメータ１０では、このように、サンプル流管３６の壁面に設けられたバイモルフ圧電フィルム６０が屈曲することで、サンプル流管３６の位置を移動させることを特徴とする。
なお、本発明のフローサイトメータ１０において用いられるバイモルフ圧電体フィルムは、分極方向の異なる圧電体フィルムを貼り合せた圧電体フィルムでなくてもよい。例えば、分極方向が同一で、貼り合せ面に電極を介在させて、その両面に電極を装着したバイモルフ圧電フィルムを使用してもよい。

光学ユニット４０は、フローセル３２にレーザ光を照射するレーザ光源部４２と、フローセル３２を流れる分析サンプル１２またはテスト用サンプル１４による散乱光を受光し、受光した散乱光に応じた信号を出力する受光部４４と、フローセル３２を流れる分析サンプル１２またはテスト用サンプル１４から発光した蛍光を受光し、受光した蛍光に応じた信号を出力する受光部４６、とを有している。受光部４４および４６は位置調整・分析ユニット５０に接続されており、出力された光信号は、位置調整・分析ユニット５０に送られる。

レーザ光源部４２は、フローセル３２にレーザ光を出射する。フローサイトメータ１０では、レーザ光源部４２から出射されたレーザ光がフローセル３２の中心位置に照射されるよう、レーザ光源部４２から出射されるレーザ光の照射位置とフローセル３２との位置が調整されて固定されている。なお、本発明のフローサイトメータでは、このようにレーザ光の照射位置とフローセルとの位置が固定されていることに限定されず、測定の度に、レーザ光の照射位置とフローセルとの相対位置を調整可能なように構成されていてもよい。レーザ光源部４２から出射されるレーザ光は、分析サンプル１２およびテスト用サンプル１４に付着された特定の蛍光色素を励起させて特定範囲の蛍光を発生させる、特定波長のレーザ光である。レーザ光源部４２には、レーザ光がフローセル３２の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられている。レーザ光源部２２としては、固体レーザーや半導体レーザーなどの、周知のレーザー装置を用いればよい。レーザ光源部２２は、制御装置７０と接続されており、制御装置７０によってレーザ光の出射のオン／オフが制御される。

受光部４４は、フローセル３２を挟んでレーザ光源部４２と対向するように配置されており、フローセル３２を通過する分析サンプル１２やテスト用サンプル１４によるレーザー光の前方散乱光を検出し、検出した前方散乱光の強度に応じた信号を出力する。一方、受光部４６は、レーザ光源部４２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ、外部管路３０中の分析サンプル１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された分析サンプル１２が発する蛍光の光信号を検出して、検出した蛍光の強度に応じた信号を出力する。受光部４４および受光部４６における光検出には、ＰＭＴ（photomultiplier tube）を用いればよい。

図３は、フローサイトメータ１０の位置調整ユニット５０について説明する概略構成図である。位置調整・分析ユニット５０は、スイッチ部５２と、位置制御部５４と、分析部５６と、各部の動作を制御する制御部５８とを有している。位置制御部５４は、データ処理・調整手段５３および電圧印加手段５５を備えている。位置調整・分析ユニット５０は、受光部４４および受光部４６から出力された受光信号を解析して、分析サンプル１２について分析を行なう。また、このような分析に先がけて、分析サンプル１２からの蛍光や散乱光が最も効率的に検出できるように、サンプル流管３６の吐出口３８の位置調整も行なう。位置調整・分析ユニット５０は、制御装置７０と接続されており、分析動作に応じて、分析サンプル１２の分析、または吐出口３８の位置調整を行なう。

スイッチ部５２は、受光部４４および受光部４６それぞれから出力された蛍光および散乱光に応じた受光信号を受信し、この受光信号を分析動作に応じた送信先へ出力する。
具体的には、分析サンプル１２の分析の際には、受光信号を分析部５６に出力する。そして、この分析サンプル１２の分析に先がけて行なう吐出口３８の位置調整の際には、受光信号を位置制御部５４のデータ処理・調整手段５３に送信する。

位置制御部５４のデータ処理・調整手段５３は、電圧印加手段５５と接続されており、電圧印加手段５５は、１対の（すなわち２枚の）バイモルフ圧電フィルム６０にそれぞれ接続されている。電圧印加手段５５は、バイモルフ圧電フィルム６０に電圧を印加することで、バイモルフ圧電フィルム６０の歪曲の大きさを調整することで、サンプル流管３６の吐出口３８の位置を変動させる。電圧印加手段５５による印加電圧は、データ処理・調整手段５３によって制御されている。データ処理・調整手段５３は、電圧印加手段５５に指示したバイモルフ圧電フィルム６０への現在の印加電圧と、スイッチ部５２から受け取った、この現在の印加電圧における受光信号との関係に基づき、バイモルフ圧電フィルム６０への印加電圧を調整して吐出口３８の位置を制御する。吐出口３８の位置調整については、後に詳述する。

一方、分析サンプル１２の分析の際は、スイッチ部５２は、受光信号を分析部５６に送信する。分析部５６は、例えば図示しないＡ／Ｄ変換器やデータ処理装置等を備えており、スイッチ部５２を経由して受信した受信信号に基づいて、分析サンプル１２からの蛍光や散乱光についての各種の分析を行ない、分析結果を出力する。
フローサイトメータ１０は、以上のような構成となっている。

以下、フローサイトメータ１０を用いて行なわれる、分析サンプル１２の蛍光解析方法について、以下詳細に説明する。図４は、フローサイトメータ１０を用いて行う、分析サンプル１２の蛍光解析方法の一例のフローチャート図である。

まず、図示しない入力手段によって、制御装置７０に蛍光解析開始の指示が入力されて、フローサイトメータ１０を用いた蛍光解析が開始される（ステップＳ１００）。蛍光解析が開始された時点では、電圧印加手段５５によってバイモルフ圧電フィルム６０に印加される電圧はゼロである。すなわち、蛍光解析が開始された段階では、バイモルフ圧電フィルム６０の電極６４および６５の電位は、同電位となっている。

まず、テスト用サンプル１４を用い、フローセル３２に対する吐出口３８の位置調整が行なわれる（ステップＳ１０２）。図５（ａ）〜（ｃ）は、ステップＳ１０２における吐出口３８の位置調整について説明する概略図である。また、図６は、このようなステップＳ１０２においてバイモルフ圧電フィルム６０に印加される電圧の大きさと、受光部４６から出力される受光信号との相関を表すグラフである。

本発明におけるテスト用サンプルとは、フローサイトメータ１０の装置状態を把握するための被測定サンプルであり、例えば特定の蛍光色素が所定量付着されたビーズなどである。同一の蛍光色素が同一量付着された複数のテスト用サンプル１４に、同一の光強度のレーザ光を照射した場合、それぞれのテスト用サンプル１４からは、ほぼ同じ程度の光強度の蛍光が発生する。例えば、それぞれ異なる複数の測定条件下でこのテスト用サンプル１４から発生する蛍光を測定したところ、各測定条件毎に蛍光の光強度が異なっていた場合、それぞれの測定条件下ではテスト用サンプル１４に照射されるレーザ光の光強度が異なっていると判断できる。なお、本発明では、テスト用サンプルとして、実際に測定する分析用サンプルを用いてもよい。本発明のテスト用サンプルは特に限定されない。
ステップＳ１０２では、測定条件（吐出口３８の位置）を種々変更して、テスト用サンプル１４から発生する蛍光の光強度を測定することで、テスト用サンプル１４に最も強くレーザ光が照射される測定条件（吐出口３８の位置）を探索する。

ステップＳ１０２では、液体供給装置２２によって、外部流管３４にシース液が供給されてシース流が形成される。これとともに、分析サンプル液およびテストサンプル液のうちテストサンプル液が選択され、サンプル流管３６にテストサンプル液が供給される。これにより、フローセル３２にテストサンプル流８０が形成される。

そして、フローセル３２の測定位置にレーザ光源部２２によってレーザ光が照射されて、この測定位置を通過するテストサンプル流に含まれるテスト用サンプル１４にレーザ光が照射される。図５（ａ）〜（ｃ）では、紙面に対して垂直方向にレーザ光が照射されており、図５（ａ）〜（ｃ）において示す点線で囲まれた領域は、レーザ光の断面（ビーム断面形状）を示している。フローサイトメータ１０では、上述のように、予めレーザ光源部４２から出射されるレーザ光の照射位置とフローセル３２との位置が調整されて固定されており、レーザ光源部４２から出射されたレーザ光はフローセル３２の中心位置に照射される。このレーザ光によってテストサンプル流を流れるテスト用サンプル１４から蛍光が発生し、この蛍光は受光ユニット４６の受光面に入射する。受光ユニット４６からは、蛍光に応じた強度の受光信号が出力されて、位置制御・分析ユニット５０に出力される。

ステップＳ１０２では、位置調整・分析ユニット５０のスイッチ手段５２によって受光信号の経路が選択されて、受光信号がデータ処理・調整手段５３に送られる。データ処理・調整手段５３では、電圧印加手段５５によるバイモルフ圧電フィルム６０に対する現在の印加電圧と、現在の印加電圧における受光信号の強度の情報を記憶する。

ステップＳ１０２において、データ処理・調整手段５３は、電圧印加手段５５によるバイモルフ圧電フィルム６０への印加電圧を種々変更し、各印加電圧における受光信号の強度の情報を取得して記憶する。そして、各印加電圧と受光信号の強度との相関から、受光信号の強度の情報が最も大きくなる際の印加電圧（バイモルフ圧電フィルム６０への印加電圧）を探索し、この印加電圧を最適印加電圧として抽出する。そして、電圧印加手段５５によって、バイモルフ圧電フィルム６０に、この最適印加電圧を印加することで、サンプル流管３６の吐出口３８の位置を調整する。

ステップＳ１０２において吐出口３８の位置調整が開始された時点、すなわち、バイモルフ圧電フィルム６０の両電極６４および６５が同電位の状態（図５（ａ）に示す状態）では、バイモルフ圧電フィルム６０は歪曲していない。

この状態（バイモルフ圧電フィルム６０の両電極６４および６５が同電位の状態）で、サンプル流管３６からテストサンプル液を吐出し、フローセル３２内部にテストサンプル流８０を形成する。この際、図５（ａ）に示すように、形成したテストサンプル流８０が、フローセル３２の中心位置に対して、ビーム照射方向と垂直な方向に若干ずれているとする。この場合、レーザ光の中心部分（図中の×印）よりもビーム照射方向と垂直な方向に若干ずれることになる。このずれは数μｍ程度のずれであり、サンプル流管３６の内部状態や外部流管３４の内部状態、液体供給装置２２における各液体の供給圧力の乱れなどを原因としたすれであり、測定毎に度々生じるものである。このようなずれは、測定のたびにずれ量やずれる方向が変動する可能性がある。

バイモルフ圧電フィルム６０の両電極６４および６５が同電位の状態（印加電圧Ｖ＝０の状態）では、フローセル３２をテストサンプル流８０が通過しても、テストサンプル流８０は、フローセル３２の中心部（レーザ光の中心部）を通過せず、レーザ光の比較的外側の領域を通過する。フローセル３２に照射するレーザ光は、光強度に空間分布を有するガウシアンビームであり、光強度はレーザ光の中心部（フローセル３２の中心部）が最も強く、周辺部分にいくにしたがって弱い。すなわち、テストサンプル流８０は比較的低い光強度の位置を通過することとなり、テストサンプル流８０を流れるテスト用サンプル１４に照射される光強度は比較的弱い。このため、テスト用サンプル１４から発生する蛍光の光強度（単位時間に発生する蛍光のエネルギーの総量）も比較的弱くなっている。

このため、バイモルフ圧電素子の両電極６４、６５間の電位が等しい（印加電圧Ｖ＝０）状態では、受光部４６で受光される蛍光の光強度は、テストサンプル流を流れる複数のテスト用サンプル１４全体で比較的低い。当然、受光部４６から出力される受光信号も比較的低い（図６参照）。また、レーザ光の周辺部分では空間的な光強度分布が急峻であるため、テストサンプル流８０自体の位置の微小な変動、またはテストサンプル流８０におけるテスト用サンプル１４の流れる位置の微小な変動に対し、サンプル１４に照射される光強度の変動は比較的大きい。このため、発生する蛍光の光強度のばらつきも比較的大きくなり、受光部４６から出力される受光信号のばらつき（図６中Δ_０で示す）も比較的大きい。

フローサイトメータ１０を用いた蛍光の測定方法では、高い精度での蛍光解析を実現するために、ステップＳ１０２において、レーザ光に対するテストサンプル流８０の位置を調整する。具体的には、データ処理・調整手段５３が、所定の電圧範囲でバイモルフ圧電フィルム６０に印加する電圧を種々変更し、サンプル流路３６の吐出口３８の位置を変動させる（図５（ｂ）に示す状態）。そして、各印加電圧において受光部４６の受光面が受光した光強度の情報を取得し、図６に示すような印加電圧と受光信号の強度との相関を得る。そして、データ処理・調整手段では、図６に示すグラフに基づき、最も強い受光信号の強度が得られ電圧Ｖ＝Ｖ_０を最適位置調整電圧として抽出する。そして、電圧印加手段５５によって、この最適位置調整電圧Ｖ_０をバイモルフ圧電フィルム６０に印加する。

このように、電圧印加手段５５によって、バイモルフ圧電フィルム６０に電圧Ｖ_０（最適位置調整電圧）を印加することでサンプル流路３６の吐出口３８の位置が設定される。これにより、図５（ｃ）に示すように、テストサンプル流路８０が、レーザ光の中心部分（フローセル３２の中心部）を通過するようになる。このようなレーザ光の中心部分では、光強度が充分強く、測定に適した充分な強度の蛍光が発生する。また、光強度の空間分布が比較的穏やかであるため、テストサンプル流８０の位置やテストサンプル流８０における分析サンプルの位置の変動に起因した、蛍光の光強度のばらつき（図６中Δ_１で示す）を低レベルに抑えることができる。また、テストサンプル流８０がフローセル３２の中心を通過することで、テストサンプル流の幅の大きさや流速の変動が抑えられ、サンプル流８０がレーザ光の中心部分を安定して通過する。本実施形態では、図６に示すような印加電圧と受光信号の強度との相関から、最適位置調整電圧Ｖ_０を抽出したが、本発明のフローサイトメトリー法における位置調整アルゴリズムは特に限定されない。

ステップＳ１０２において吐出口３８の位置が調整されると、吐出口３８の位置をこの位置（調整位置）に設定した状態で、分光サンプル１２の蛍光解析が開始される（ステップＳ１０４）。
ステップＳ１０４においても、ステップＳ１０２に引き続き、液体供給装置２２によって、外部流管３４にシース液が供給されている。ステップＳ１０４では、液体供給装置１２において、分析サンプル液およびテストサンプル液のうち分析サンプル液が選択され、サンプル流管３６に分析サンプル液を供給する。これにより、フローセル３２に分析サンプル流９０が形成される。この際、分析サンプル液の供給圧はテストサンプル液の供給圧と同一とし、シース液供給圧もステップＳ１０２における供給圧と同一とする。

分析サンプル液供給圧をテストサンプル供給圧と同一とし、シース液供給圧および吐出口３８の位置を同一とした場合、フローセル３２内の分析サンプル流９０の位置や流径は、ステップＳ１０２で設定されたテストサンプル流８０の位置や流径とほぼ同一となる。すなわち、吐出口３８の位置を調整位置に設定した状態では、分析サンプル流９０は、テストサンプル流８０と同様にフローセル３２の中心位置、すなわちレーザ光の中心部分を通過する。このような、フローセルの中心部分では、分析サンプル流９０の幅や流速の変動がほとんど生じることなく、分析サンプル９０は安定して流れる。またレーザ光の中心部分では、レーザ光の光強度が充分強く、測定に適した充分な強度の蛍光が発生する。また、光強度の空間分布が比較的穏やかであるため、分析サンプル流９０の位置や分析サンプル流９０における分析サンプルの位置の変動に起因した、蛍光の光強度のばらつきを低レベルに抑えることができる。

このレーザ光によって分析サンプル流を流れる分析サンプル１２から発生した、測定に適した充分な強度の蛍光は、受光ユニット４６の受光面に入射する。受光ユニット４６からは、蛍光に応じた強度の受光信号が出力されて、位置制御・分析ユニット５０に出力される。ステップＳ１０４では、位置調整・分析ユニット５０のスイッチ手段５２によって受光信号の経路が選択されて、受光信号は分析部５６に送られる。

分析部５６では、受光信号について各種のデータ処理を施し、所望の蛍光解析が行なわれ、分析結果を出力する（ステップＳ１０６）。そして、所望の分析結果が得られた段階で分析を終了する（ステップＳ１０８）。受光ユニット４６によって検出されて分析部５６に送信される受光信号は、測定に適した充分な強度の蛍光に応じた、充分な強度の受光信号である。このような受光信号を用いることで高精度な分析が可能である。また、分析サンプル流９０における分析サンプル１２の位置の変動に起因した誤差を殆ど含んでいない。本発明のフローサイトメータ１０を用いた蛍光の測定方法では、このような誤差を殆ど含んでいない充分な強度の受光信号によって解析を行なうので、解析部５６において高精度な蛍光解析を行なうことができる。

本実施形態では、サンプル１２から発生する蛍光を測定してサンプル１２の分析を行なう蛍光分析、および蛍光分析における位置調整の例について説明した。本発明のフローサイトメータ１０では、サンプル１２による散乱光を測定して分析サンプル１２の分析を行なう散乱光分析を行なってもよい。この場合、受光部４４によってテスト用サンプル１４の散乱光を検出し、蛍光分析における位置調整と同様、位置調整部５４による吐出口３８の位置調整を行なうのが好ましい。

本実施形態では、レーザ光をフローセル３２の中心位置に調整し、かつ、このフローセル３２の中心位置をサンプル流が通過するよう、フローセル３２に対するサンプル供給管の吐出口の位置を調整した。本発明のフローサイトメータでは、このように、フローセルの中心位置をサンプル流が通過するよう、フローセルに対するサンプル供給管の吐出口の位置を調整することに限定されない。しかし、サンプル流がフローセルの中心位置を通過することで、サンプル流の流径や流速が安定化するといった効果がある。本発明のフローサイトメータでは、このように、フローセルの中心位置をサンプル流が通過するよう、フローセルに対するサンプル供給管の吐出口の位置を調整することが好ましい。

また、本発明のフローサイトメータおよびフローサイトメータを用いた測定方法における、フローセルに対するレーザ光の照射位置、およびレーザ光に対するサンプル流の調整位置は特に限定されない。しかし、レーザ光の照射位置をフローセルの中心位置に調整することで、レーザ光の散乱を抑制することができる。この状態でサンプル流をフローセルの中心位置に調整するとで、フローセルを安定して流れるサンプル流に対し、余分な散乱光成分を含まない安定したレーザ光を照射することが可能である。本発明のフローサイトメータおよびフローサイトメータを用いた測定方法では、レーザ光をフローセル３２の中心位置に調整し、かつ、このフローセル３２の中心位置をサンプル流が通過するよう、フローセル３２に対するサンプル供給管の吐出口の位置を調整することが好ましい。

以上、本発明のフローサイトメータおよびフローサイトメータを用いた測定方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施例に限定はされず、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良および変更を行ってもよいのはもちろんである。

本発明のフローサイトメータの一例であるフローサイトメータ１０の概略構成図である。フローサイトメータ１０におけるバイモルフ圧電フィルムの構造、およびバイモルフ圧電フィルムの動作について説明する概略断面図である。フローサイトメータ１０における位置調整ユニットについて説明する概略構成図である。本発明のフローサイトメータを用いて行う測定方法の一例である、分析サンプルの蛍光解析方法の一例のフローチャート図である。（ａ）〜（ｃ）は、分析サンプルの蛍光解析方法におけるサンプル流管の吐出口の位置調整について説明する概略図である。サンプル流管の吐出口の位置調整において、バイモルフ圧電フィルムに印加される電圧の大きさと、受光部から出力される受光信号との相関を表すグラフである。従来のフローサイトメータにおける、サンプル流とサンプル流に対するレーザ光の照射部分について説明する図である。

符号の説明

１０フローサイトメータ
１２分析サンプル
１４テスト用サンプル
２０液流形成ユニット
２２液体供給装置
２４配管
２５分析サンプル液タンク
２６テストサンプル液タンク
２７シース液タンク
３０流管部
３２、１０２フローセル
３４外部管路
３６サンプル流管
３８、１０８吐出口
４０光学ユニット
４２レーザ光源部
４４、４６受光部
５０位置調整・分析ユニット
５２スイッチ部
５３データ処理・調整手段
５５電圧印加手段
５４位置制御部
５６分析部
５８制御部
６０バイモルフ圧電フィルム
６１、６２圧電体フィルム
６４，６５電極
７０制御装置
８０テストサンプル流
９０分析サンプル流
１０４シース液供給管
１０６サンプル液供給管
１１４細胞１１４

Claims

シース液が内部を一方向に流れる外部流管と、前記外部流管の内側領域に設けられ、被測定サンプルを含むサンプル液が内部を流れる内部流管とを備え、前記内部流管の開口端から前記サンプル液をシース液流の中に吐出させることで、前記シース液に囲まれて流れるサンプル液流を形成する液流形成手段と、前記サンプル液流に光ビームを照射する光ビーム照射手段と、前記光ビームの照射を受けて前記サンプル液流の被測定サンプルから発する散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方を測定する測定光学系とを有するフローサイトメータであって、
前記内部流管の外周面に貼付けられたバイモルフ圧電素子と、前記バイモルフ圧電素子に電圧を印加する電圧印加手段とを有し、前記電圧印加手段により前記バイモルフ圧電素子に電圧を印加して前記バイモルフ圧電素子を前記光ビームの照射方向および前記サンプル液流の流方向のいずれとも垂直な方向に歪曲させることで前記バイモルフ圧電素子とともに前記内部流管を歪曲させて、前記内部流管の吐出側開口端の位置を前記外部流管に対して変位させることにより、前記光ビームの照射位置に対する前記サンプル液流の位置を調整する吐出位置調整手段と、
前記測定光学系によって測定される前記散乱光および前記蛍光の少なくともいずれか一方の強度が最も高くなるように前記バイモルフ圧電素子へ印加する印加電圧を制御して前記吐出位置調整手段による前記内部流管の吐出側開口端の位置調整を制御する制御手段と
を有することを特徴とするフローサイトメータ。
請求項１記載のフローサイトメータを用い、所望の分析対象サンプルの蛍光または散乱光を測定する方法であって、
前記バイモルフ圧電素子に印加する印加電圧を種々変更しつつ、テスト用サンプルを含むテストサンプル液を前記内部管路の吐出側開口端から吐出させてテストサンプル液流を形成し、前記測定光学系によって測定される前記テスト用サンプルからの前記散乱光および前記蛍光の少なくともいずれか一方の強度が最も高くなるように前記バイモルフ圧電素子へ印加する印加電圧を制御することにより、前記開口端の位置を制御する位置制御ステップと、
前記内部管路の前記開口端を、前記位置制御ステップにおいて制御した状態で、前記内部管路の前記開口端から前記分析対象サンプルを含む分析対象サンプル液を吐出して分析対象サンプル液流を形成し、この分析対象サンプルに光ビームを照射して前記分析対象サンプルから発する散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方を測定する測定ステップと
を有することを特徴とする、フローサイトメータを用いた測定方法。