CN105784653A - 一种宽场超分辨荧光显微成像装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种宽场超分辨荧光显微成像装置，包括：光源；调制单元，将光源发出的光束调制为可发生干涉的两束p偏振光和两束s偏振光，并用于改变两组光束的干涉相位差；二向色镜，两束p偏振光和两束s偏振光在其表面形成干涉条纹，并由其反射作为照射样品的结构散斑照明光，所述结构散斑照明光具有阵列分布的亮斑；成像单元，包括将所述结构散斑照明光投影到样品的显微物镜，以及用于对样品受激辐射荧光成像的相机。本发明可以同时兼顾宽的成像视场和实现超衍射极限的分辨率，通过多幅图像的移频迭代，不依赖结构光函数，因而可以很好地保证图像的超分辨率，且可以提高图像信噪比。
Description
技术领域
本发明涉及光学超分辨显微领域，尤其涉及一种兼顾宽视场和超分辨的显微成像装置。
背景技术
超分辨荧光显微成像作为一种非接触、无损的检测手段，可以揭示细胞内分子尺度的动态和结构特征，在生命科学领域有着极为重要的作用。
根据傅里叶光学理论，传统光学系统受限于其空间带宽积(spatial-bandwidthproduct，SBP)，在单次成像过程中，超分辨和宽视场往往很难兼顾，这也是目前超分辨显微成像技术发展的瓶颈问题之一。
目前，比较成功的超分辨荧光显微成像技术主要由以下几种：单分子荧光成像(PALM和STORM)，受激辐射损耗显微技术(STED)，结构光照明显微技术(SIM和SSIM)，荧光辐射微分超分辨显微技术(FED)。
PALM和STORM采用随机光照明成像的方式结合光斑中心定位算法来实现超分辨成像，因此要完成重构算法进而得到一幅超分辨图像，牺牲了系统的时间分辨率。STED是将一束空心光斑叠加在一个高斯光斑上，抑制了高斯光斑四周的荧光辐射，进而实现了超分辨成像，但其成像采用逐点扫描的办法，限制了成像视场，要实现宽场成像，必须牺牲时间分辨率。SIM和SSIM本身采用结构光对样品进行照明，因此其具有较大的视场，但SIM的分辨率理论上只能突破衍射极限两倍，而SSIM其超分辨图像反演过程很大程度上依赖结构光函数的正确性，但在操作过程中，受到实际系统设置误差、激光散斑、系统噪声等因素的影响，结构光函数与预期总有一些出入，因而会影响超分辨反演效果，且整个图像的信噪比还有待进一步提高。
因此，如何能够实现一种既具有较高的超分辨能力，又可以达到宽场、高信噪比成像，并且不以牺牲时间分辨率为代价的超分辨荧光显微技术，已成为当今超分辨领域的研究焦点。
发明内容
本发明提供了一种宽场超分辨荧光显微成像装置，可以同时兼顾宽的成像视场和实现超衍射极限的分辨率，通过多幅图像的移频迭代，不依赖结构光函数，因而可以很好地保证图像的超分辨率，而且可以提高图像信噪比，很好的服务于生物、医学等领域。
本发明的具体技术方案如下：
一种宽场超分辨荧光显微成像装置，包括：
光源；
调制单元，将光源发出的光束调制为可发生干涉的两束p偏振光和两束s偏振光，并用于改变两组光束的干涉相位差；
二向色镜，两束p偏振光和两束s偏振光在其表面形成干涉条纹，并由其反射作为照射样品的结构散斑照明光，所述结构散斑照明光具有阵列分布的亮斑；
成像单元，包括将所述结构散斑照明光投影到样品的显微物镜，以及用于对样品受激辐射荧光成像的相机。
作为改进的，所述的调制单元包括位于光源光路上的第一二分之一波片和第一分束器；并由第一分束器分束为第一p偏振光和第一s偏振光；所述第一p偏振光光路上依次设有第二二分之一波片和第二分束器，所述第二分束器将光束分束为第二p偏振光和第二s偏振光，所述第二s偏振光经光路上的第一四分之一波片和第一反射镜成为第三p偏振光；所述第三p偏振光和第二p偏振光为在二向色镜表面产生水平干涉条纹的两束p偏振光。
其中，二分之一波片用于光束的偏振转换，分束器用于将光束分为p偏振光和s偏振光。
同样，为得到两束可发生干涉的s偏振光，所述第一s偏振光的光路上依次设置有第三二分之一波片和第三分束器，并由第三分束器为第四p偏振光和第三s偏振光；所述第三s偏振光经光路上设置的第二四分之一波片和第二反射镜变成第五偏振光；所述第五偏振光的光路上设置有第四二分之一波片，所述第四二分之一波片出射的第四s偏振光与第三s偏振光为在二向色镜表面产生垂直干涉条纹的两束s偏振光。
优选的，所述的第一二分之一波片、第二二分之一波片和第三二分之一波片的快轴与对应入射光成22.5°夹角，使得由其出射的偏振光与水平面成45°角。
优选的，所述的第一四分之一波片和第二四分之一波片的快轴与入射的s偏振光成22.5°夹角，以使得出射的偏振光变成p偏振光。
进一步的，由所述第一分束器和第三分束器出射的四束光具有相等光程。
优选的，所述的第一反射镜和第二反射镜分别固定相应的压电陶瓷上，所述的压电陶瓷控制反射镜移动以用于改变两组光束的干涉相位差，以实现结构散斑照明光的扫描。
其中，所述的第一分束器、第二分束器和第三分束器均采用偏振分束立方体，即偏振分光棱镜。
优选的，所述的宽场超分辨荧光显微成像装置还包括处理单元，所述处理单元根据傅里叶移频迭代算法对相机拍摄的图像进行处理，并得到宽场超分辨图像。
其中，所述傅里叶移频迭代算法的处理步骤如下：
a)从所获得的n张低分辨图像In中选择一张作为初始样品图像Iobj；
b)利用Iobj与结构散光照明光函数Pn相乘，获得目标图像Itn，在空间域，即有Itn＝Iobj·Pn；
c)利用公式FT(Itn)updated＝FT(Itn)+OTF·(FT(In)-OTF·FT(Itn))，对Itn进行对应的移频迭代；其中，OTF是显微物镜的光学传递函数，FT()是傅里叶变换；
d)利用傅里叶变换将FT(Itn)updated转换回空间域为并利用公式对初始样品图像Iobj进行迭代提升，所得的替换原来的Iobj；其中max(P)表示结构散斑照明光的最大光强值；
e)重复步骤b)～d)的操作，直至所有图像迭代完成，最后生成超分辨图像
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)可实现宽场成像与超分辨显微成像的有机结合，在生物活细胞成像方面有很大的应用潜力；
(2)超分辨反演过程不依赖结构光函数的正确性，提高了系统的可操作性和实用性；
(3)傅里叶移频迭代算法，将多张低分辨率图像迭代至一张超分辨图像，提高了图像超分辨信息的对比度。
附图说明
图1为宽场超分辨荧光显微成像装置的示意图。
图2为本发明中压电陶瓷在垂直方向反射光路的示意图。
图3为本发明中反射镜在垂直方向反射光路的示意图。
图4为本发明中由偏振分束立方体为核心的垂直方向光束分路并汇聚的立体示意图。
图5为宽场超分辨荧光显微成像装置的工作流程图。
图6为所生成的结构散斑照明光效果图。
图7(a)为超分辨率靶图像。
图7(b)为宽场显微镜镜下得到的图像分辨率。
图7(c)为结构散斑照明条件下得到的图像分辨率。
图7(d)为饱和结构散斑照明条件下得到的图像分辨率。
具体实施方式
如图1所示：一种宽场超分辨荧光显微成像装置，包括：
作为光源的激光器1，以及沿激光器1光路依次布置的单模光纤2、准直透镜3、平面反射镜4和平面反射镜5；
调制单元包括二分之一波片6和偏振分束立方体7；位于偏振分束立方体7透射光路上的二分之一波片8、偏振分束立方体11、四分之一波片12、反射镜15、压电陶瓷25、反射镜16、反射镜18和反射镜20；位于偏振分束立方体7反射光路上的二分之一波片9、偏振分束立方体10、四分之一波片13、反射镜14、压电陶瓷24、反射镜17、反射镜19、反射镜21、二分之一波片22和偏振分束立方体23；
二向色镜，由调制单元出射的两组光束在其表面形成干涉条纹，并由其反射作为照射样品的结构散斑照明光，结构散斑照明光具有阵列间隔分布的亮斑；
成像单元，包含镜筒透镜27、显微物镜29、成像透镜31和相机32；
以及上位机，与相机32、压电陶瓷24和压电陶瓷25连接，用于压电陶瓷的触发和图像处理。
本实施例中，上述宽场超分辨荧光显微成像装置的实施步骤如下：
(1)激光器1出射光经过单模光纤2传输至准直透镜3的焦点处，形成准直光束，通过平面反射镜4、平面反射镜5反射后，进入二分之一波片6形成与水平面夹角45°偏振光束，经由偏振分束立方体7分成p-偏振和s-偏振两束平行光；
p-偏振光通过二分之一波片8生成与水平面夹角45°偏振光束，经由偏振分束立方体11分为两束p-偏振和s-偏振两束平行光；
s-偏振光通过二分之一波片9生成与水平面夹角45°偏振光束，经由偏振分束立方体10分为两束p-偏振和s-偏振两束平行光；
(2)如图2、图3和图4所示，由偏振分束立方体11产生的s-偏振光经由反射镜15两次通过四分之一波片12，进而变成p-偏振光，再透射通过11，到达反射镜20处，再由反射镜20反射并透射通过偏振分束立方体23，直至二向色镜26表面；
由11产生的p-偏振光经由反射镜16、反射镜18反射，透射通过偏振分束立方体23，到达二向色镜26表面，两束光在二向色镜26表面产生水平干涉条纹；
(3)由偏振分束立方体10产生的s-偏振光经由反射镜14两次通过四分之一波片13，进而变成p-偏振光，再透射通过偏振分束立方体10，到达反射镜21处，再由反射镜21反射至二分之一波片22；
由偏振分束立方体10产生的p-偏振光经由反射镜17、反射镜19反射，到达二分之一波片22；
两束光通过二分之一波片22后，变成s-偏振光，再通过偏振分束立方体23的反射至二向色镜26处，并在二向色镜26表面产生垂直干涉条纹；
(4)在二向色镜26表面产生一幅二维正交的结构散斑照明光；该结构散斑照明光通过镜筒透镜27和显微物镜29构成的4f系统投影至放有样品的盖玻片30处，样品受激辐射的荧光通过显微物镜29、镜筒透镜27、二向色镜26以及成像透镜31构成的显微镜系统成像到相机32上；
(5)通过压电陶瓷24、压电陶瓷25，带动反射镜14、反射镜15移动，改变干涉相位差，进而改变二维结构散斑的亮暗位置，实现一个艾里斑区域内不同结构散斑照明，每次照明，相机32都将记录一张宽场低分辨率图像，并由上位机33记录并保存，通过傅里叶移频迭代算法，实现宽场超分辨图像。
在本实施案例中，反射镜17所摆放位置应与x轴成44°角，反射镜14应与z轴成1°角，以保证由偏振分束立方体10分出的两束光左右对称；反射镜15和反射镜16应与y轴成±1°角，以保证由11分出的两束光上下对称；四束光与其中心轴各成1°角的方式传输并汇聚至26处。
反射镜20为D型反射镜，并以上下方式放置，以保证经反射镜18反射的光束不被遮挡，同时有效的将经反射镜15反射出的光束反射至二向色镜26处，21为D型反射镜，并以左右方式放置，以保证经反射镜19反射的光束不被遮挡，同时有效的将经反射镜14反射出的光束反射至二向色镜26处。
在本实施案例中，二分之一波片6、二分之一波片8、二分之一波片9的快轴必须与入射偏振光成22.5°夹角，以使得出射的偏振光与水平面成45°角；四分之一波片12、四分之一波片13的快轴必须与入射的s-偏振光成22.5°夹角，以使得出射的偏振光变成p-偏振。
反射镜14应倾斜放置，并与y-z面成一定夹角，反射镜17应与45°面成一定夹角，且二者倾斜角度应相等，反射镜19和反射镜21应成45°角，以使得两束光在汇聚的过程中光程保持相等。
反射镜15应倾斜放置，并与z-x面成一定角度，反射镜16应与z-x面成大小相同但方向相反的倾斜角度，反射镜18和反射镜20应按45°角放置，以使得两束光在汇聚的过程中光程保持相等。
偏振分束立方体10和偏振分束立方体11以及相应的反射镜、波片构成的子分束系统必须相对于偏振分束立方体7和偏振分束立方体23的连线对称分布于两侧，以保证四束光的光程相等。
反射镜14和反射镜15分别对应固定在压电陶瓷24和压电陶瓷25上，以保证系统可以由压电陶瓷的步进移动产生干涉光程差的改变，进而实现结构散斑照明光的扫描。
镜筒透镜27的焦面应与显微物镜29的后焦面28重合，以保证四束偏振光经过显微物镜29后，以平行光的方式在盖玻片30表面汇聚，并干涉产生结构散斑，实现宽场照明。
在本实施案例中，所采用的显微物镜29为100X，NA＝1.49浸油物镜，为使得光束以平行光汇聚的形式对盖玻片30进行照明，显微物镜29与镜筒透镜27应当构成4f系统，其办法为：镜筒透镜27的前焦面应与显微物镜29的后焦面重合，且镜筒透镜27的焦距f应当不小于d/sinθ，其中，d为镜筒透镜29的入瞳半径，θ为光束的汇聚角，此处为1°以保证生成的结构散斑照明光达到衍射极限。
在本实施案例中，采用逐行扫描的方式来实现整个图像区域的结构散斑照明，如图5所示，具体方式为：系统初始化，激光器工作并在盖玻片30处生成结构散斑照明光，对样品进行照明，所生成的结构散斑照明光如图6所示，相邻两个亮斑之间的暗区大小约为一个艾里斑大小Δr≈λ/2NA，并产生荧光信号经由显微系统成像至相机32处，照明及图像采集次序为：上位机33给一个触发信号至压电陶瓷24，压电陶瓷24以Δr/10长度步进一次并反馈信号至上位机33，上位机33发送图像采集信号给相机32，相机32开始曝光，曝光完成后再将图像传递至上位机33，传输完成后，上位机33再次触发压电陶瓷24步进一步，如此循环10步后，压电陶瓷25以Δr/10长度步进一步，再次重复上述过程，如此10次后，完成一个艾里斑区域内100次照明与图像采集，所得到低分辨率图像通过傅里叶移频迭代算法生成1张宽场超分辨图像。
为显示本实施案例的最终效果，采用图7(a)为原始分辨率靶，将该目标放置在盖玻片30处，通过本发明所述宽场超分辨显微系统后，将得到n张低分辨率图像，从所获得的n张低分辨图像In中选择一张作为初始样品图像Iobj，如图7(b)所示；
利用Iobj与结构散光照明光函数Pn相乘，获得目标图像Itn，在空间域，即有Itn＝Iobj·Pn；
利用公式FT(Itn)updated＝FT(Itn)+OTF·(FT(In)-OTF·FT(Itn))，对Itn进行对应的移频迭代，其中，OTF是显微物镜的光学传递函数，FT()是傅里叶变换；
利用傅里叶变换将FT(Itn)updated转换回空间域为并利用公式对初始样品图像Iobj进行迭代提升，所得的替换原来的Iobj；
重复上述过程，直至所有图像迭代完成，最后生成超分辨图像如图7(c)所示，其图像分辨率比图7(b)有显著提高，实现了超分辨成像；
当增大照明激光强度至一定大小时，荧光将处于饱和激发状态，在此条件下，重复本实施案例的过程，将进一步提高图像的超分辨率，其效果如图7(d)所示，可以看到，在保证视场和信噪比不变的前提下，系统的超分辨率将进一步提高。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种宽场超分辨荧光显微成像装置，其特征在于，包括：
光源；
调制单元，将光源发出的光束调制为可发生干涉的两束p偏振光和两束s偏振光，并用于改变两组光束的干涉相位差；
二向色镜(26)，两束p偏振光和两束s偏振光在其表面形成干涉条纹，并由其反射作为照射样品的结构散斑照明光，所述结构散斑照明光具有阵列分布的亮斑；
成像单元，包括将所述结构散斑照明光投影到样品的显微物镜(29)，以及用于对样品受激辐射荧光成像的相机(32)。
2.如权利要求1所述的宽场超分辨荧光显微成像装置，其特征在于，所述的调制单元包括位于光源光路上的第一二分之一波片(6)和第一分束器；并由第一分束器分束为第一p偏振光和第一s偏振光；
所述第一p偏振光光路上依次设有第二二分之一波片(8)和第二分束器，所述第二分束器将光束分束为第二p偏振光和第二s偏振光，所述第二s偏振光经光路上的第一四分之一波片(12)和第一反射镜(15)成为第三p偏振光；所述第三p偏振光和第二p偏振光为在二向色镜(26)表面产生水平干涉条纹的两束p偏振光。
3.如权利要求2所述的宽场超分辨荧光显微成像装置，其特征在于，所述第一s偏振光的光路上依次设置有第三二分之一波片(9)和第三分束器，并由第三分束器为第四p偏振光和第三s偏振光；
所述第三s偏振光经光路上设置的第二四分之一波片(13)和第二反射镜(14)变成第五偏振光；
所述第五偏振光的光路上设置有第四二分之一波片(22)，所述第四二分之一波片(22)出射的第四s偏振光与第三s偏振光为在二向色镜(26)表面产生垂直干涉条纹的两束s偏振光。
4.如权利要求3所述的宽场超分辨荧光显微成像装置，其特征在于，所述的第一二分之一波片(6)、第二二分之一波片(8)和第三二分之一波片(9)的快轴与对应入射光成22.5°夹角。
5.如权利要求3所述的宽场超分辨荧光显微成像装置，其特征在于，所述的第一四分之一波片(12)和第二四分之一波片(13)的快轴与入射的s偏振光成22.5°夹角。
6.如权利要求3所述的宽场超分辨荧光显微成像装置，其特征在于，由所述第一分束器和第三分束器出射的四束光具有相等光程。
7.如权利要求3所述的宽场超分辨荧光显微成像装置，其特征在于，所述的第一反射镜(15)和第二反射镜(14)分别固定相应的压电陶瓷上，所述的压电陶瓷控制反射镜移动以用于改变两组光束的干涉相位差。
8.如权利要求3所述的宽场超分辨荧光显微成像装置，其特征在于，所述的第一分束器、第二分束器和第三分束器均采用偏振分束立方体。
9.如权利要求1所述的宽场超分辨荧光显微成像装置，其特征在于，所述的宽场超分辨荧光显微成像装置还包括处理单元，所述处理单元根据傅里叶移频迭代算法对相机拍摄的图像进行处理，并得到宽场超分辨图像。
10.如权利要求9所述的宽场超分辨荧光显微成像装置，其特征在于，所述傅里叶移频迭代算法的处理步骤如下：
a)从所获得的n张低分辨图像In中选择一张作为初始样品图像Iobj；
b)利用Iobj与结构散光照明光函数Pn相乘，获得目标图像Itn，在空间域，即有Itn＝Iobj·Pn；
c)利用公式FT(Itn)updated＝FT(Itn)+OTF·(FT(In)-OTF·FT(Itn))，对Itn进行对应的移频迭代；其中，OTF是显微物镜的光学传递函数，FT()是傅里叶变换；
d)利用傅里叶变换将FT(Itn)updated转换回空间域为并利用公式对初始样品图像Iobj进行迭代提升，所得的替换原来的Iobj；其中max(P)表示结构散斑照明光的最大光强值；
e)重复步骤b)～d)的操作，直至所有图像迭代完成，最后生成超分辨图像
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