CN1353305A - 超高灵敏度荧光显微探测与处理系统 - Google Patents

Abstract

一种超高灵敏度荧光显微探测与处理系统,包括高灵敏度荧光显微镜和软件处理两部分,高灵敏度荧光显微镜包括图像采集光路,图像配准,像增强器及其保护装置。本发明灵敏度高,结合处理软件可对样品实现小样本光子图象探测;运用图像融合技术,实现荧光的准确定位;可研究细胞荧光图像的动力学特征;样品适用范围广,适合于观察切片和活细胞;可实现对小样本光子图象的处理,提高图象的分辨率;可实现生物超微弱发光的计算机模拟,对实验具有指导作用。

Description

超高灵敏度荧光显微探测与处理系统

本发明属于荧光显微成像探测与处理技术。

目前在生物医学领域中已经有很多发展成熟的用于各种发光现象的检测仪器，为推动生物发光的研究发挥了重要作用。同时，在应用过程中又不断提出新问题，对探测仪器提出新的要求，也促进了探测仪器的发展，仅荧光显微成像系统近年来又有了长足进步。

所谓荧光显微成像技术包含两方面的含义。首先，显微技术研究的对象是以细胞为代表的微观对象，细胞作为有机体结构与生命活动的基本单位，具有独立的、有序的自控代谢体系，在生命科学研究中具有不可替代的位置，对细胞生命活动基本规律的研究是一切生命科学的重要基础。对细胞形态结构的观察主要有光学显微镜技术，电子显微镜技术和扫描隧道显微镜；尽管光学显微镜的分辨率不及后两者，但是由于电子显微镜和扫描隧道显微镜只能观察死细胞，而且对实验条件和操作条件的要求都非常严格，仪器的价格也非常昂贵，在细胞学研究中光学显微镜仍然是最重要的观察工具。

荧光显微成像技术的另一方面是荧光成像。荧光显微镜依据受激荧光的原理，利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和分辨样品中某些物质及其性质，在生物学和医学中有着广泛的用途。当细胞中某些固有物质(如蛋白质、DNA等)或细胞中有外部引进的荧光物质如荧光标记物、光敏化剂等在受到外部短波长光的激发时，会发出比激发波长略长的另一种波长的荧光。用荧光显微镜观察吸收了荧光物质的细胞，就能够观察到荧光物质在细胞内部的分布情况，如果能够通过图象采集系统得到分布图象，就成为荧光显微成像技术。它与常规的显微镜所得到的细胞染色图象不同，从另一个侧面反映了细胞内部物质的分布和组成。尽管光学显微镜的分辨极限一般只能达到微米量级，荧光显微镜借助于荧光标记物对不同细胞器的特异性结合，可以观察到一些较小的亚细胞结构。

80年代以来，光电技术和计算机技术的飞速发展，为荧光显微技术的进步创造了良好的条件，许多新型荧光显微镜应运而生，其中具有代表性的有：激光共聚焦荧光显微镜，时间分辨荧光显微镜，偏振荧光显微镜，三维成像荧光显微镜和快速多光谱荧光显微镜等。这些荧光显微镜的出现为生物医学的发展提供了新的手段和方法。

进入90年代以后，由于科学研究的需要又使荧光显微成像技术面临新的问题。第一，由于生物学中对细胞的研究趋向于近真实条件，为尽量减少外界环境对细胞正常生理状态的影响，这就要求采用更低浓度的荧光标记物，减弱激发光的强度等；但是普通荧光显微镜的灵敏度不高，很难获得微弱的荧光图像。第二，尽管细胞是生物体的基本单位，其内部结构仍然可分为许多细微结构；如果需要进一步分析这些结构，层析技术是必需的；目前能够实现细胞层析技术的只有激光共聚焦荧光显微镜。但由于第三，一般的荧光显微镜无法定量地给出图像发光的强度数值，而大量的科学研究，如细胞第二信使(如Ca²⁺)实验机理的分析，需要定量显示。第四，由于荧光图像是由暗背景上分布的亮斑组成，现有荧光显微镜不能准确判断荧光在细胞中的发光位置；第五，需要研究细胞荧光图像的动力学特征，以及适合荧光图像特点的图像处理软件。

针对这些问题，使得荧光显微镜的发展向快速采集，高分辨率，高灵敏度，宽动态范围，多功能化的方向发展。除了前面提到的激光共聚焦荧光显微镜得到进一步的完善外，一些著名的显微镜生产厂家，如Olympus，Zeiss等都先后推出了以光电倍增管为探测器的高灵敏度的荧光显微镜，我国自行研制的同类产品至今没有推向市场。此类高精度仪器不仅价格昂贵，而且维持运转的费用也相当可观，非一般的用户所能承受。因此，研制适用于科研和一般观察需要，充分利用现有实验基础的新型微弱光信息探测仪器，就成了一个急待解决的问题。

为此，将图象融合技术引入显微图象的探测与处理，提供了一种具有图象融合处理功能的超高灵敏度荧光显微探测与处理系统。该系统运用了信号检测与评估的方法对小样本光子图像进行统计处理，得到信噪比改善的光子图像。该系统中还增加了对光子图象进行计算机模拟的功能。

本发明为实现上述目的提出如下技术方案：该系统包括高灵敏度荧光显微镜和图象处理软件两部分：荧光显微镜中的显微镜由同轴的超高压汞灯、聚光镜、滤色片、可调光孔、暗视野集光器、物镜、半反射镜、耦合透镜及目镜组成，其耦合透镜与可移动反射镜相连，与光轴成45°角的可移动反射镜与像增强器相连，像增强器阴极面入射面附近设置有可插入干涉滤色片或挡光板的多功能插孔，可移动反射镜分别与像增强器和CCD相连，像增强器和CCD相连，像增强器与CCD之间设置有耦合透镜，CCD与图象采集板相连，图象采集板与计算机相连；显微镜中的暗视野集光器的焦距为3mm～30mm；像增强器上设置有保护装置，该保护装置包括磁铁、干簧继电器及电源，干簧继电器固定于显微镜上，暗视野集光器上装磁铁，电源与像增强器、干簧继电器串联；本系统的光源由超高压汞灯、循环水冷却器、金属遮光盒、出水管、入水管、循环水泵及聚光镜组成，金属遮光盒底部开有透光孔，孔内装一聚光镜，聚光镜上方是超高压汞灯，金属遮光盒上设置有循环水冷却器，循环水冷却器顶部装有出水管和入水管，出水管和入水管又与循环水泵相连；图象处理软件包括：图象融合、光子图象处理及光子图象模拟；计算机对光子图象的图象处理式为： $K>({\mathrm{\λ}}_s-{\mathrm{\λ}}_n)/\ln \left(\frac{{\mathrm{\λ}}_s}{{\mathrm{\λ}}_n}\right)$

                  λ_s＝E(P₁)          λ_n＝E(P₀)其中，K为光子个数，λ_s及λ_n为信号区和噪声区光子数量的期望值，P₁和P₀为光子样本x在信号区和噪声区的概率密度函数；

计算机对光子图象以及光子图象处理过程模拟采用的方法为：通过对要模拟的图像[IMG]的分析，生成一矩阵[P]，其元素值正比于图象[IMG]相应元素的灰度值。矩阵[P]的每一元素代表该象素在一帧光子图象中出现光子的几率：

               [P]＝[IMG]/(K×GRAY)

其中[IMG]为n×n图像矩阵；GRAY为灰度等级，通常为256级；K用于根据要模拟的发光水平来控制光子图象的光子总数；[P]即为图像对应的概率分布函数矩阵，矩阵中每一元素值对应相应象素点在一帧光子图象中出现光子的分布函数。由计算机模拟一泊松分布，使该分布大于阈值TH(i，j)的概率为P(i，j)，于是可以推出TH(i，j)的值，这样遍历了矩阵[P]后，可以得到对应的阈值矩阵[TH]。然后生成一随机矩阵[RND]，其对应元素RND[i，j]的值随机出现并服泊松分布。当RND(i，j)＞TH(i，j)时，认为点X(i，j)出现光子，否则认为该点没有出现光子，比较后得到一个新的2值矩阵[X]，矩阵元素中1表示对应象素出现光子，0表示对应象素没有光子。由其生成的过程可知，X(i，j)出现1的概率为P(i，j)，矩阵[X]即为模拟的光子图象。

超高灵敏度荧光显微探测与处理系统具有以下主要性能和特点：

1.灵敏度高，对样品可实现小样本光子图象探测；

2.运用图像融合技术，实现荧光的准确定位；

3.可研究细胞荧光图像的动力学特征；

4.样品适用范围广，适合于观察切片和活细胞；

5.图像处理软件功能完善，操作方便；可实现对小样本光子图象的处理，提高图象的分辨率；

6.可实现生物超微弱发光的计算机模拟，降低成本，提高效率，对实验具有指导作用。

本发明的具体结构由附图1～5.5给出。

图1为超高灵敏度荧光显微探测与处理系统原理框图

图2为像增强器保护电路图

图3为系统光源结构示意图

图4.1为处理前2129个光子的图象

图4.2a为背景噪声分布图

图4.2b为背景噪声概率分布图

图4.3为图4.1的概率分布图

图4.4a为图4.1处理后图象

图4.4b为C14辐射光源外形图

图5.1a为计算机模拟的单帧光子图像，

图5.1b为计算机模拟的200帧光子图像的叠加

图5.1c为计算机模拟的5000帧光子图像叠加

图5.1d为实际的Hela细胞的荧光图像(原图)

图5.2为累积光子图象的积分数目与原图象5.1d的均方根差rms关系

图5.3为均方根差rms与积分光子图象总数m的m^-1/2的关系曲线

图5.4为计算机模拟的信噪比为1的光子图象

图5.5为计算机模拟的1000幅信噪比为1的光子图象积分图

图中主要结构为：超高压汞灯1、循环水冷却器1a、金属遮光盒1b、出水管1c、入水管1d、循环水泵1e、聚光镜2、滤色片3、可调光孔4、暗视野集光器5、样品6、物镜7、半反射镜8、目镜9、耦合透镜10、滤色片11、可移动反射镜12、CCD13、多功能插孔14、像增强器15、耦合透镜16、CCD17、图象采集板18、计算机19、磁铁20、干簧继电器21、电源22。

下面结合附图对本发明加以详细说明。

在同一系统上获得细胞的荧光图像和普通透射图像必须考虑许多因素，如透射图像与荧光图象的测试条件不同，荧光图象的获得需要暗视野集光器和合适的激发波长，当荧光较弱时，为了得到高质量的荧光图象，还要使用像增强器对图像进行增强；而在透射图像的获得过程中，所用光源仅仅用于照明，未染色的活细胞本身呈半透明状态，对比度较低，因此必须有充足的光线照明，才能得到较高的图像对比度。为了使两种图像都获得较好的视觉效果，图像的采集必须通过两条光路。光源中的超高压汞灯(1)出射的光经聚光镜(2)后成为平行光，此平行光通过滤色片(3)后成为单色激发光后经过可调光孔(4)和暗视野集光器(5)照射到生物样品(6)上。生物样品所激发的荧光通过物镜(7)后分为两路：一路被半反射镜(8)反射经过目镜(9)进入人眼，另一路透过半反射镜后通过耦合透镜(10)进入采集系统。如采集的是荧光图象，此时装在反射镜抽插装置中的且与光轴成45°角的可移动反射镜(12)被移出光路，抽出反射镜，使出射光全部通过像增强器。装在多功能插孔(14)中的滤色片(11)滤除激发光而仅通过被激发的荧光，该荧光再进入像增强器(15)被放大，增益可达106。被增强的图象通过耦合透镜(16)后进入CCD(17)成为图象信号被图象采集板(18)采集后送入计算机(19)进行处理。当采集透射图像时，去掉暗视野集光器(5)，以便获得充分的照明，将可移动反射镜(12)推到与光轴成45°角的指定位置，使出射光束全部反射到另一光路，光线从耦合透镜(10)出射后，经反射镜(12)后进入CCD(13)成为图象信号被图象采集板(18)采集后送入计算机(19)进行处理。此方案的突出优点是利用显微镜的出射光效率较高，荧光图像无光能损失，采集透射图像时光能损失仅取决于反射镜的反射率，而一般反射镜的反射率都较高，能满足要求。

本系统采用C2166-01型微通道板像增强器作为光强放大装置，其光子能量放大装置是两级微通道板(microchannel plate，MCP)，当光子入射到像增强器光阴极上时，经两级MCP被放大10⁶数量级。光子在放大过程中保持空间信息不丢失；荧光屏上光斑用通常的光电成像装置CCD(MINTRON MTV-1801CB或1802CB)即可接收，从而实现对单个光子时间和空间信息的记录。C2166-01微通道板像增强器的基本参数如表1所示。以微通道板像增强器为核心，与CCD耦合构成超高灵敏度荧光显微镜系统的图像采集部分，使该系统不仅具有极高的放大能力，还具有较好的空间和时间分辨率。

光谱范围	280nm～850nm

荧光屏衰减时间	最大0.1ms
		像面分辨率多光子模式单光子模式	中心：181p/mm typ.151p/mm typ.
最大输入照度(多光子模式)	10-21x
		最大输入照度(单光子模式)	104Photons/mm2/s
像增强器最大增益	106typ
		暗计数：    (20℃)(-15℃)	最大：10cps/mm20.5cps/mm2

    表1 C2166-01微通道板像增强器基本参数

在实验过程中，通过循环水致冷减小微通道板像增强器和光阴极的噪声，同时尽可能排除外界杂散光的影响，在-15℃时仪器的暗噪声小于0.5cps/mm²，可实现光子计数成像，完全满足研究极微弱荧光的条件。因此可以减少荧光标记物的用量，使样品在近真实条件下观察；

在荧光图像的采集光路中，由于像增强器阴极面承受的最大照度极为有限，超过规定值会损害仪器；为了防止像增强器受损，首先在像增强器阴极面入射面附近设置一个多功能插孔(14)，当采集荧光图像时，可插入干涉滤色片(11)，选择透过一定波长的荧光；当采集透射图像时，可插入特制的挡光板，使激发光和杂散光完全被阻挡，起到保护像增强器(15)的作用且在像增强器上装有保护装置，保护装置如图2所示，该保护装置包括磁铁(20)、干簧继电器(21)及电源(22)，将干簧继电器(21)固定于显微镜上，在暗视野集光器上装磁铁(20)，当暗视野集光器在显微镜上时，干簧继电器吸合，像增强器电源接通可以工作。当暗视野集光器被取下时，像增强器的电源(22)自动被切断，使其停止工作，不会因为过强光线的进入而受到损伤。

为了实现对样品动态特征的观察，必须采用具有快速采集功能的图象采集卡。本系统采用中科院自动化所科技嘉公司生产的CA-MPE-1000图像采集卡，可实现三路视频切换输入，保证了荧光图像和透射图像能够切换采集；图像采集菜单还包括单帧采集，实时采集，序列采集，循环采集，采集漫游等功能，采集速率最高为25帧/秒，基本满足对样品动态特征的观察需要。

通常荧光显微镜所采用的暗视野集光器，工作距离很小，只能观察样品的切片，特别是放大倍数较大时操作比较困难。本发明改进了暗视野集光器的焦距使其工作距离为3mm～30mm，这样不仅可观察样品的切片，而且可用于研究培养皿中活细胞的形态变化和生理反应，拓宽了观察样品的范围。

改进后的系统激发光源由于成像系统工作所要求的暗室条件，因此将超高压汞灯(1)密封在一金属遮光盒(1b)中，遮光盒底部开有直径5厘米的透光孔，孔内装一聚光镜(2)，聚光镜上方是100瓦超高压汞灯(1)，汞灯的出射光经聚光镜后成为平行光。由于超高压汞灯工作于密闭环境而容易使工作温度上升而影响发光的稳定性，因此在金属遮光盒的上方装入了循环水冷却器(1a)，冷却器内的水经出水管(1c)和入水管(1d)通过循环水泵(1e)进行循环冷却，将汞灯多余的热量带走而达到使光源工作稳定。本系统采用100W超高压汞灯作为激发光源，而通常的荧光显微镜则需要200W，进一步降低了激发光源的能量。

在保证对样品的荧光图象和透射图象都可以方便地观察的基础上，采用图象融合技术，将荧光图象和对应的透射图象合成一幅图象，就可以实现在透射图象的背景上显示荧光图象的目的，从而准确判断荧光图象的发光位置，这对于分析样品的发光机理是非常重要的。实现图象融合要求被融合的两幅或多幅图象必须严格配准，因此为了保证荧光图像和透射图像的完全配准，可移动反射镜(12)的前后位置、左右、俯仰角均可自由微调，实验前对系统进行配准校验；此外进行图像获取的两个CCD位置可调，且采用同样型号(敏通MTV-1801CB或1802CB)，保证两幅图像的分辨率、文件格式和图像比例一致，从硬件上基本实现两幅图像的粗配准。在此基础上，再通过软件的后期图像处理实现更精确的图像配准，利用图像任意角度旋转、实数倍缩放、镜像变换等处理，达到两幅图像完全匹配(象素级细配准)，为图像融合作好准备。

图象处理软件

图象处理软件是对获取的样品信息的后期处理，对于混杂有系统噪声的光学图象来说是必不可少的。本系统所配备的软件能够实现基于Windows环境操作，支持多文档窗口的编辑，可以同时打开多个窗口；具有量化显示图像信息及研究图像动力学特征的功能。对微弱图像可采用序列累加，增强图像及多种算法消除噪声。同时，该软件还可以实现图象融合，对小样本光子图象的统计处理以及小样本光子的图象的计算机仿真。现简要介绍这三项功能。

图象融合处理

图像融合技术是近年来在遥感，计算机视觉和医学等领域中广泛研究的“数据融合”中以图像为研究对象的技术，它把对同一目标或场景用不同传感器所获得的图象或用同一传感器用不同方式所获得的多重图象合成一幅图象，在这幅图象中能反映多重原始图象中的信息，以达到对目标和场景更精确、更全面的分析和判断。

生物图像，特别是细胞的荧光图像，具有信号弱，信噪比低，信息量小的特点，而且许多重要信息反映在图象的一些细微变化上；细胞的荧光图像主要反映了细胞内某些荧光物质的分布，缺乏细胞形态方面的信息，尤其当荧光较弱时，进行判断和分析就更为困难，需要借助于其它生化手段。为了准确判断荧光的发光位置，我们将遥感等领域中已经运用得较为成熟的图像融合技术引入到生物图像处理中，将荧光图像与其对应的透射图像进行融合，使融合图象充分显示源图像的信息，既体现了细胞中荧光物质的分布，又有细胞的形态特征，实现了细胞的荧光定位。图像清晰、直观，信息量增加，具有改善图像置信度，降低模糊度，提高了检测性能和空间分辨能力的优点，最大限度地发掘细胞图像的信息资源，更有利于分析和判断其生物机理和含义。这项操作方便、快捷、准确，比一般的生化手段大大提高了实验效率，且也减少了实验的费用，在生物学上具有重要意义。

我们针对生物图象的特点，采用图象处理中的多种融合算法，包括基于小波变换的算法有：取系数绝对值较大值算法，改进取系数绝对值较大值算法的突出主题图象法，加权平均法，改进的消除高频噪声法，以及针对生物显微图象特点提出的一种新算法——双阈值法；其它类型的三种算法：直接映射法，逻辑OR算法，Toet算法等融合算法对图象进行处理，利用灰度、伪彩色两种显示方式，从而实现了在透射图象背景上显示荧光图象的目的，可以准确判断荧光的发光位置，对进一步分析发光机理非常有利。

对小样本光子图象的统计处理

在微弱光探测中，对极微弱光辐射(10⁰--10⁴Photons/cm²·s)的探测已作为一种重要探测手段运用于生物医学，天文等领域。由于发光物体的发光强度极弱，大致为0～100光子计数/平方厘米·秒，因此必须使用灵敏度极高的光子成像系统才能探测到如此低水平的光子发射。光子图象极大地区别于传统的灰度图象，光子图象表现为二值分布，即对像面上的一点，只存在有无光子两种可能。因此对光子图象的处理也有别于传统的图象处理方式。当光子总计数远小于像素数时，我们称此光子图像为小样本光子图像。在小样本光子图像的处理中，由于光子的量子性，光子并不遵循几何光学中的预定轨道传送，而是服从于统计分布，因而通常用统计理论来研究少数光子在时间和空间上的分布。

超微弱发光图像受背景暗噪声及探测系统暗计数的影响，在光子图像上叠加随机分布的噪声点，在信号较弱的情况下，光子图象的信噪比极低，信号湮没于噪声光子中而难以区分。在图像信号和背景噪声都较弱的条件下，信号和噪声都服从泊松分布。因而可用统计检验来对小样本光子图像进行处理，剔除噪声光子，以提高光子图象的信噪比。

采用超高灵敏度荧光显微探测与处理系统实现光子图像探测，探测对象由照相物镜成像在微通道板像增强器的多碱光阴极上，透过输入窗口落在像增强器光阴极上的光子由于光电效应转换成电子图像，电子透镜将电子图像耦合到微通道板上，从微通道板出射的电子撞击荧光屏重新激发出光子图像。微通道板像增强器的光子放大能力为(10³～10⁷)，每一落在像增强器上的光子经过放大后，在像增强器的出射荧光屏的光斑直径为60μm，延迟时间为30ms～100ms(增益为10⁶时)。整个成像系统的空间分辨率为15line pairs/mm(线对/毫米)(在10⁴photons/(mm²·s)以下的单光子成像条件下)。荧光屏上的图像由中继透镜投射在CCD摄像系统的像面上，经图像采集板进入计算机，成像系统的阴极灵敏度(等效背景噪音)为0.5[counts/mm²·s]。

为了便于对统计处理前后的光子图像进行分析比较，需要一个稳定的光子源。我们采用了装C₁₄的一端开口的圆形金属小盒，当C₁₄衰变时产生稳定的微弱光子辐射。

利用上述光子源及成像系统，我们得到图4.1含噪声光子图像，图4.1有2129个光子记数。

由于探测系统本身的背景噪声，使图像信号和噪声难以直接区分，必须用统计理论对光子图像进行图像处理，去除噪声，提高光子图像的信噪比。

探测系统的本底噪声表现为光子图像上的服从泊松分布分布的噪声点。为方便对光子图像进行处理，将图像分割为N×N个区域，其中信号区S_s含N_s个小区域，无信号的噪声区S_n含N²-N_s个小区域，每一小区域中有k个光子。我们作如下假设：

                     H₀：K(t)＝n(t)

                     H₁：K(t)＝s(t)+n(t)

H₀表示接收到的信号K(t)为噪声，H₁表示接收到的信号K(t)为信号与噪声的叠加，t为时间。

n(t)表示小区域内出现记数点的是噪声光子或暗记数，s(t)表示小区域内出现的光子是信号光子。

P(H₀/x)为给定样本x下H₀为真的概率，P(H₁/x)为给定样本x下H₁为真的概率。根据最大后验概率的判决规则：

若P(H₁/x)≥P(H₀/x)则判定H₁为真，否则H₀为真。对随机的光子图像，P(H₁/x)＝P(H₀/x)的概率极小，可视为零。于是有： $\frac{P(H_1/x)}{P(H_0/x)}>1.........\left(1\right)$

若(1)成立，则P(H₁/x)为真，否则P(H₀/x)为真。

设P(H₁)和P(H₀)分别为假设H₁和H₀为真的先验概率，即光子图像任一小区域中有信号和无信号的先验概率，P(x/H₁)和P(x/H₀)分别为假设H₁和H₀为真，光子样本x的概率密度函数。令  ξ＝P(H₀)，则1-ξ＝P(H₁)，P₁(x)＝P(x/H₁)，P₀(x)＝P(x/H₀)，则(1)式左端由先验概率表示为： $\frac{P(H_1/x)}{P(H_0/x)}=\frac{(1-\mathrm{\ξ})P_1\left(x\right)}{{\mathrm{\ξP}}_0\left(x\right)}.........\left(2\right)$ (1)式进一步化简为： $\frac{P_1\left(x\right)}{P_0\left(x\right)}>\frac{\mathrm{\ξ}}{1-\mathrm{\ξ}}........\left(3\right)$

若(3)成立，则P(H₁/x)为真，即判定其区域中有信号光子；否则P(H₀/x)为真，即判定区域内光子为噪声光子。在光子图像中，噪声表现为加性噪声，因此信号区光子分布的密度函数为： $P_1(U=k)=\frac{{\mathrm{\λ}}_s^k}{K!}{e}^{{-\mathrm{\λ}}_s}+\frac{{\mathrm{\λ}}_n^k}{K!}{e}^{{-\mathrm{\λ}}_n}......\left(4\right)$ 噪声区光子分布的密度函数为： $P_0(U=k)=\frac{{\mathrm{\λ}}_n^k}{K!}{e}^{{-\mathrm{\λ}}_n}......\left(5\right)$ 即信号光子和噪声光子分别服从于参数为λ_s和λ_n的泊松分布。P₁(U＝k)表示在信号区内出现k个光子的几率，P₀(U＝k)表示在噪声区内出现k个光子的几率。图4.2a和4.2b为背景噪声及其概率分布图。将光子图分割为若干相同大小的区域，统计含有相同光子数的小区域，纵轴表示含有相同光子数的小区域的数量，横轴表示小区域中的光子数。

图4.3为图4.1的概率密度的概率分布。为方便讨论，我们假定信号光子服从同一分布。即图4.1中只存在两种分布，即信号分布和噪声分布。取两峰值之间的最小值为信号分布和噪声分布的交点，对λ_s和λ_n分别作出估计：

              λ_s＝E(P₁)        ，      λ_n＝E(P₀)E(P₁)和E(P₀)表示求P₁和P₀的数学期望。条件(2)变为： $K>[\ln \frac{2\mathrm{\ξ}-1}{1-\mathrm{\ξ}}+({\mathrm{\λ}}_s-{\mathrm{\λ}}_n)]/\ln \left(\frac{{\mathrm{\λ}}_s}{{\mathrm{\λ}}_n}\right).....\left(6\right)$ 当上式成立时，判定区域内含有信号光子，否则为噪声光子。

假定ξ＝2/3，(6)式简化为： $K>({\mathrm{\λ}}_s-{\mathrm{\λ}}_n)/\ln \left(\frac{{\mathrm{\λ}}_s}{{\mathrm{\λ}}_n}\right).......\left(7\right)$

以上讨论给出了一个简明的判据：当小区域内的光子数大于k时，判定区域内含有信号光子，否则为噪声光子或暗记数，k的大小由λ_s和λ_n决定。图像处理时剔除只含噪声光子或暗记数的区域，保留含信号光子的区域，得到信噪比改善的图像。

由公式(6)可看出，当ξ在一较大范围内变动时，K的取值保持不变(K只可取整数)。

另外，当给出假定ξ＝2/3时，我们同时也得到信号分布和噪声分布交点的假定。在概率分布图4.3中，曲线下的面积就是含有信号光子和噪声光子的小区域的总和。假定ξ＝2/3，即假定只含有噪声光子的小区域数占了小区域总数的2/3，信号分布和噪声分布的交点就是曲线下总面积的2/3处，由此可得λ_s和λ_n的估计。取得信号分布和噪声分布的交点，对λ_s和λ_n分别作出估计：

          λ_s＝E(P₁)                       λ_n＝E(P₀)E(P₁)和E(P₀)表示求P₁和P₀的数学期望。

和前一种对λ_s和λ_n估计相比，此方法具有更广泛的适用性。对照图4.1，用此方法可得λ_s＝2.032，λ₀＝13.08，K的取值仍然不变。在大多数情况下，两种λ_s和λ_n的估计方法都可得到相同的结果，当概率分布图中信号分布和噪声分布交点不明显时，可用此方法估计λ_s和λ_n。

由公式(7)对图4.1进行处理，得到图4.4a。和图4.1相比，图4.4a极大地提高了图像的信噪比。处理后的光子图像和光源外形图4.4b较好地吻和，说明对光子图象的处理是成功的。

本统计方法适用于小样本光子图像的处理，能较大地提高光子图像的信噪比，可以较好地从噪声背景中提取有用的光子信号，对研究生物超微弱发光有很大的意义。本方法还适用于其他超微弱发光的研究，对噪声背景下的生物细胞超微弱光子辐射，也可提取出相应的信号图像。

光子图象的计算机模拟

光子图象是由单个的光子组成，由于光子的波粒二象性，图象表现为空间不连续的离散光子，光子到达某一区域的概率由光子的统计规律决定，只有探测、积累足够长的时间后，才会形成通常意义上的空间连续分布的图象。光子图象采集时易受到背景噪声和成像系统背景暗噪声的影响，表现为光子图象上叠加的随机分布的噪声点。在信噪比不高的情况下，光子图象很容易湮没于噪声中，使图象信号和噪声难以区分。因此，通过对样品发光规律进行分析，利用计算机模拟，并结合小样本光子图象的统计处理，在获取单帧或少数帧图象的基础上，即可判断其积累足够长时间后的结果，必然将节省大量时间，提高实验效率。超微弱发光的强度极其微弱，信噪比低，采集条件要求较高，因此，利用计算机仿真研究光子图象的处理方法，有助于了解细胞的微弱自发发光的发光规律，减少实验时间，降低实验条件及实验仪器、药品的费用。利用该方法对某些微弱发光目标进行模拟仿真，可以在获取小样本光子图象的情况下，与先验知识结合对目标加以判断识别，从而缩短操作时间，提高工作效率。

由于光子图象的累积涉及数量极大的光子图象数量及数据处理量，因此有必要用计算机对光子图象以及光子图象的处理过程进行模拟，以验证光子图象积分的有效性。

理论指出：光子图象的光子密度分布和物函数的光子辐射水平成正比，在极弱光条件下，由于光子辐射的随机性，光子密度分布实际是光子密度分布的期望值。这样就为光子图象的模拟提供了依据。

如果认为样品中不同部位的自发发光是相互独立的，可以采用蒙特卡洛方法在平面上不同区域不同的光子密度分布来模拟样品的光子图像，通过控制光子图象的光子密度来模拟不同强度的光子辐射。光子图像的光子分布是随机的，其期望和灰度图象相应区域的灰度成正比。

通过对要模拟的图像[IMG](本文要模拟的对象为Hela细胞的荧光图象)的分析，生成一矩阵[P]，其元素值正比于图象[IMG]相应元素的灰度值。矩阵[P]的每一元素代表该象素在一帧光子图象中出现光子的几率：

                       [P]＝[IMG]/(K×GRAY)                         (8)

其中[IMG]为n×n图像矩阵；GRAY为灰度等级，通常为256级；K用于根据要模拟的发光水平来控制光子图象的光子总数；[P]即为图像对应的概率分布函数矩阵，矩阵中每一元素值对应相应象素点在一帧光子图象中出现光子的分布函数。由计算机模拟一泊松分布，使该分布大于阈值TH(i，j)的概率为P(i，j)，于是可以推出TH(i，j)的值，这样遍历了矩阵[P]后，可以得到对应的阈值矩阵[TH]。然后生成一随机矩阵[RND]，其对应元素RND[i，j]的值随机出现并服泊松分布。当RND(i，j)＞TH(i，j)时，认为点X(i，j)出现光子，否则认为该点没有出现光子，比较后得到一个新的2值矩阵[X]，矩阵元素中1表示对应象素出现光子，0表示对应象素没有光子。由其生成的过程可知，X(i，j)出现1的概率为P(i，j)，矩阵[X]即为模拟的光子图象。

由于成像系统固有的系统噪声，在实际采集的光子图像中存在噪声光子分布，噪声光子在像平面服从于参数为λ_n的泊松分布，表现为加性噪声。

噪声分布： $P_n\left(k\right)=\frac{{\mathrm{\λ}}_n^k}{K!}{e}^{-{\mathrm{\λ}}_n}......\left(9\right)$

P_n(k)表示在某区域内出现k个噪声光子的几率。

因此在模拟光子图像中，需要加入成像系统的噪声，噪声光子矩阵[Noise]由随机泊松分布矩阵产生，噪声水平根据成像系统的实际噪声水平通过改变泊松分布参数λn来控制。在同一帧光子图像光子分布极为疏散，我们认为同一象素出现2个或2个以上光子的概率可视为零。

噪声矩阵[Noise]和模拟光子图象矩阵[X]相加，就得到含噪声的模拟光子图像[Simu]，即：

              [Simu]＝[Noise]+[X]                       (10)

大量光子图像的图像矩阵相应象素的值进行相加，最后得到的矩阵进行灰度化处理，最大值设为灰度最高等级，就可以得到叠加后的光子图象[SUM]。

下面是对一Hela细胞的荧光图像进行的光子图像模拟。图5.1a为单帧光子图像，图5.1b为200帧光子图像的叠加，图5.1c为5000帧光子图像叠加，图5.1d为实际的Hela细胞的荧光图像(原图)。从图中可以看出随着累积次数的增加，所得到的灰度图象越来越近似于实际的细胞荧光图象图5.1d。图5.1c和图5.1d的差别已经很小，图5.1c的灰度层次尚不足图5.1d，但可以预料，随着积累次数的增加，累积得到的灰度图象可以很好地再现物函数的实际光子发射水平。

图5.2是累积光子图象的积分数目与原图象图5.1d的均方根差rms关系，其中： $\mathrm{rms}=\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}\underset{j=1}{\overset{l}{\mathrm{\Σ}}}{[{\mathrm{SUM}}_m(i,j)-\mathrm{Cell}(i,j)]}^2}{k\×l}}........\left(11\right)$ 可见，随着积分数目的增加，均方根差值逐渐减少，均方根值rms是累积光子图象总数m的函数。

图象的大小为K×L，rms代表了积分图象SUM和原图象Cell之间的差别。如果将原图Cell视为标准图象，则均方根差代表了积分图象SUM的噪声水平。由相关积分器的分析可知，噪声水平和积分光子图象总数m的平方根成反比且当m趋于无穷时，rms趋于零。图5.3是rms和m^-1/2的关系曲线，曲线表现出较好的线性与理论分析极好地吻合。

如果我们将信号区(光子图象中有信号的区域)信号光子平均分布密度和噪声区(信号区以外的区域)光子平均分布密度之比称为光子图象的信噪比，通过调节噪声水平可以很容易地改变模拟光子图象的信噪比。为便于比较，我们仍然用上图5.1d作为模拟对象。图5.4即为信噪比为1的光子图象，从图中很难用统计的方法区分信号和噪声光子，但如果运用同步积分(累加)的原理，将若干幅光子图象进行累加，噪声被衰减，就可以从信噪比极低的光子图象中得到所需的信号。运用此方法，甚至可以从信噪比大大低于1的光子图象中提取到有用信号，但所需的累积数目也相应增大。

图5.5为1000幅信噪比为1的光子图象积分的结果，按照先前的推导，信噪比将有约15dB的改善，对比图5.4信噪比有了极大的提高。参考图5.1d，图5.5的灰度级真实地反映了物函数的光子发射几率，因为图5.5是信噪比为1光子图象累积得到的，所以此图的灰度等级也直接表明了图象各区域的光子相关水平。

在微弱发光领域的研究中，对光子图象的处理是解决光子图象信噪比低的有效办法，但众多的处理方法中，对信噪比小于或接近于1的光子图象的处理难以得到令人满意的结果。而受生物的低自发发光水平和成像系统的影响，实际采集到的光子图象很多情况下都得不到高的信噪比。本发明介绍的方法有助于对低信噪比光子图象的检测，根据计算机模拟的结果，该方法对低信噪比光子图象处理的结果能满足对光子图象探测的要求，是对低水平光子发射探测处理的有效方法。通过对光子图象的积分处理，将光子图象和传统灰度图象建立了联系。可以直观地观测微弱发光体的光子出射水平。

本发明介绍的光子图象的计算机仿真方法在实际工作中也有较大意义，由于可以容易的调节模拟图象的噪声水平，所以我们可以根据成像系统的实际噪声水平进行计算机仿真，这样在实际的采集积分系统中，我们可以预期积分时间以及图象质量。光子图象的计算机仿真还可以大大减少贵重实验设备的损耗，避免了大量光子图象的实际采集与存储，也为光子图象的研究及处理提供了得到光子图象的简捷途径。

Claims (1)

1.一种超高灵敏度荧光显微探测与处理系统，包括显微镜，该显微镜由同轴的超高压汞灯(1)、聚光镜(2)、滤色片(3)、可调光孔(4)、暗视野集光器(5)、物镜(7)、半反射镜(8)、耦合透镜(10)及目镜(9)组成，其特征在于：该系统包括高灵敏度荧光显微镜和图象处理软件两部分；显微镜中的耦合透镜(10)与可移动反射镜(12)相连，与光轴成45°角的可移动反射镜(12)与像增强器(15)相连，像增强器(15)阴极面入射面附近设置有可插入干涉滤色片(11)或挡光板的多功能插孔(14)，可移动反射镜(12)分别与像增强器(15)和CCD(13)相连，像增强器(15)和CCD(17)相连，像增强器(15)与CCD(17)之间设置有耦合透镜(16)，CCD(17)和CCD(13)同时与图象采集板(18)相连，图象采集板(18)与计算机(19)相连；显微镜中的暗视野集光器(5)的焦距为3mm～30mm，像增强器(15)上设置有保护装置，该保护装置包括磁铁(20)、干簧继电器(21)及电源(22)，干簧继电器(21)固定于显微镜上，暗视野集光器(5)上装磁铁(20)，电源(22)与像增强器(15)、干簧继电器(21)串联；本系统的光源由超高压汞灯(1)、循环水冷却器(1a)、金属遮光盒(1b)、出水管(1c)、入水管(1d)、循环水泵(1e)及聚光镜(2)组成，金属遮光盒(1b)底部开有透光孔，孔内装一聚光镜(2)，聚光镜(2)上方是超高压汞灯(1)，金属遮光盒(1b)上设置有循环水冷却器(1a)，循环水冷却器(1a)顶部装有出水管(1c)和入水管(1d)，出水管(1c)和入水管(1d)又与循环水泵(1e)相连；图象处理软件包括：图象融合、光子图象处理及光子图象模拟；计算机(19)对光子图象的图象处理式为： $K>({\mathrm{\λ}}_s-{\mathrm{\λ}}_n)/\ln \left(\frac{{\mathrm{\λ}}_s}{{\mathrm{\λ}}_n}\right)$

                   λ_s＝E(P₁)           λ_n＝E(P₀)其中，K为光子个数，λ_s及λ_n为信号区和噪声区光子数量的期望值，P₁和P₀为光子样本x在信号区和噪声区的概率密度函数；计算机对光子图象以及光子图象处理过程模拟采用的方法为：通过对要模拟的图像[IMG]的分析，生成一矩阵[P]，其元素值正比于图象[IMG]相应元素的灰度值。矩阵[P]的每一元素代表该象素在一帧光子图象中出现光子的几率：

                    [P]＝[IMG]/(K×GRAY)

其中[IMG]为n×n图像矩阵；GRAY为灰度等级，通常为256级；K用于根据要模拟的发光水平来控制光子图象的光子总数；[P]即为图像对应的概率分布函数矩阵，矩阵中每一元素值对应相应象素点在一帧光子图象中出现光子的分布函数；由计算机模拟一泊松分布，使该分布大于阈值TH(i，j)的概率为P(i，j)，于是可以推出TH(i，j)的值，这样遍历了矩阵[P]后，可以得到对应的阈值矩阵[TH]；然后生成一随机矩阵[RND]，其对应元素RND[i，j]的值随机出现并服泊松分布；当RND(i，j)＞TH(i，j)时，认为点X(i，j)出现光子，否则认为该点没有出现光子，比较后得到一个新的2值矩阵[X]，矩阵元素中1表示对应象素出现光子，0表示对应象素没有光子；由其生成的过程可知，X(i，j)出现1的概率为P(i，j)，矩阵[X]即为模拟的光子图象。

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