CN106596497A - 一种短波红外荧光显微成像的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种短波红外荧光显微成像的方法。本发明采用近红外光源或可见光光源作为激发短波红外荧光探针的光源，激发光源经过物镜汇聚在短波红外荧光标本上并激发出荧光，荧光被物镜重新收集，并通过分束器分离激发光和荧光信号，最终只有荧光信号到达短波红外相机，短波红外相机将视频信号传输至电脑，实现标本的实时短波红外荧光成像。在此基础之上，通过调节荧光标本与物镜的相对位置，可以获得标本不同深度的层析荧光成像。本发明相较于传统的在可见光波段观察的荧光显微方法，具有大的生物组织穿透深度和小的生物损伤等优点；相较于短波红外荧光宏观成像方法，具有高成像分辨率、高成像放大倍数、可视频显微成像、可层析荧光成像等优点。

Description

一种短波红外荧光显微成像的方法
技术领域
本发明属于应用光学的显微成像领域，是一种结合了传统荧光显微成像技术和短波红外技术的短波红外荧光显微成像系统（Short-wave Infrared FluorescenceMicroscope 简称 SWIRFM）。
背景技术
荧光显微镜已经广泛应用于生物研究，相较于传统的透射式显微成像，荧光显微成像可以提供更高的成像信噪比，且将荧光材料用于标本的特异性标记，更有利于提取特异性位置的显微信息。常见的荧光显微成像系统遵循基本的反射荧光激发设计，它主要包括光源部分、分束器部分、物镜、荧光标本和成像部分。其原理是标本中的荧光材料被来自物镜的激发光照射并产生荧光，荧光被物镜收集用以成像，其中分束器（如二向色镜）用来分开激发光和荧光。在生物应用的研究中，随着不同荧光剂的出现，可以实现细胞或者生物组织的特异性标记，也使得荧光显微镜广泛地应用于生物医学领域的研究。在荧光显微成像技术基础上的激光扫描共聚焦显微成像技术和多光子荧光扫描显微成像技术也极大地扩展了荧光显微镜的应用范围。
短波红外（Short-wave Infrared 简称 SWIR）成像技术是一种新型的成像方法，目前主要应用于军事领域。通常短波红外是指在0.9-1.7的近红外波段，相较于可见光（一般指波长范围为380nm-780nm的光）而言，生物组织对该波段的光具有较小的散射，有利于提高生物成像的深度。此外，在生物成像领域，短波红外波段的光相较于可见光具有更小的光损伤，因此，短波红外成像十分有利于生物医学的研究。在此基础上，短波红外荧光宏观成像系统已经投入使用，通过引入短波红外荧光材料，选择特定的激发光和分束器，可以实现对标本的短波红外荧光宏观成像。短波红外荧光宏观成像这一技术已经应用于生物活体研究，且具有很大的发展前景。目前，已经有一些投入应用的短波红外荧光宏观活体成像系统，但尚未有一种可以提供短波红外荧光显微成像的方法。本发明基于目前比较成熟的在可见光波段应用的荧光显微成像系统，提出了一种全新的短波红外荧光显微成像（SWIRFM）技术。
短波红外荧光显微成像技术是一种全新的荧光显微成像方法，它主要结合短波红外成像技术和荧光显微成像技术，具有两种成像方法共同的优势，即在生物医学领域，具有大的生物组织成像深度、高的成像信噪比和小的生物组织损伤等优点。此外，结合目前比较成熟的短波红外相机技术，在短波红外光波段实现生物组织的荧光层析成像。短波红外相机也能将视频信息实时传输到计算机，实现了对生物组织的视频显微成像，这一技术可以用来实时观察生物组织中的动态变化（例如小鼠脑部血液流动），在生物医学领域具有广阔的发展应用前景。在此基础上，短波红外荧光显微成像技术也可以应用于农林、材料、化学等领域。
发明内容
本发明使用的装置是在奥林巴斯BX61正置显微成像系统基础上改造的一种新型短波红外荧光显微成像系统（SWIRFM）。本发明引入了近红外光（或可见光）作为激发光源，激发标本中的短波红外荧光探针，得到短波红外荧光信号，短波红外荧光信号进而被物镜收集，传输到短波红外相机进行成像。
本发明采用的技术方案是：
短波红外荧光显微成像系统包括近红外光源（或可见光光源）、光路爬高系统、扩束系统、二向色镜、物镜、成像透镜、短波红外相机、计算机等。
该短波红外荧光显微成像系统，采用近红外光源作为激发短波红外荧光探针的光源，但也不局限于近红外光源，可以根据所激发的荧光探针特性灵活选择（例如荧光波长在短波红外波段的量子点，可以用激发效率更高的可见光光源进行激发），激发光源经过物镜汇聚在短波红外荧光标本上并激发出荧光，荧光被物镜重新收集，并通过分束器分离激发光和荧光信号，最终只有荧光信号到达短波红外相机，短波红外相机将视频信号传输至电脑，实现标本的实时短波红外荧光成像。在此基础之上，通过调节荧光标本与物镜的相对位置，可以获得标本不同深度的层析荧光成像。
本发明具有的有益效果是：
该系统相较于传统的透射式显微成像系统，具有高成像信噪比的优势；相较于传统的在可见光波段观察的荧光显微系统，具有大的生物组织穿透深度和小的生物损伤等优点；相较于短波红外荧光宏观成像，具有高成像分辨率、高成像放大倍数、可视频显微成像、可层析荧光成像等优点，且该系统简单可靠，工作高效稳定。该系统是结合了传统的荧光显微成像技术和短波红外成像技术，首次提出的全新短波红外荧光显微成像方法，在生物医学、农林、材料、化学等学科领域具有广阔的发展和应用前景。
附图说明
图1 为短波红外荧光显微成像系统示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步说明。
如图1所示，短波红外荧光显微成像系统包括近红外光源（或可见光光源）、光路爬高系统、扩束系统、分束器（二向色镜）、物镜、成像透镜、短波红外相机、计算机等。
首先，将外置的近红外光源（或可见光光源）通过一个光路爬高系统（由两块反射镜组成，如图1中反射镜1和反射镜2所示）引入成像光路模块，该模块借用了商用奥林巴斯BX61正置显微成像系统中的成像光路模块（当然，该模块也可以自行搭建，或者借用其他传统的显微成像系统），激发光源经过由扫描透镜（Scan Lens）和镜筒透镜（Tube Lens）组成的扩束系统扩束，扩束光再经过一块短波长反射（长波长透射）的二向色镜（分束系统）反射，经物镜汇聚到荧光标本上激发出荧光信号，激发出的荧光信号经由物镜收集通过短波长反射（长波长透射）的二向色镜（通常荧光信号波长大于激发光源的波长），二向色镜分离出的荧光信号再经成像透镜被短波红外相机所接收，相机再将视频信号发送至计算机，实现标本的实时短波红外视频显微成像。在此基础之上，通过调节标本与物镜之间的相对位置，可以获得标本不同深度的荧光层析成像。通过这样一套系统，实现了短波红外荧光显微成像。
本实例中采用的近红外光源（或可见光光源）为半导体多模激光器，其发射波长为635nm，可调功率范围为0mW-300mW；光路爬高系统由两块镀银反射镜组成；二向色镜为Semrock公司生产的785nm短波长反射二向色镜，型号为LPD01-785；物镜为奥林巴斯公司生产，型号为XLPLN25XWMP2的25倍浸水镜，其工作距离为2mm，且在400nm～1600nm光波段具有良好的透过率；短波红外荧光探针为一种新型有机染料，其光吸收范围在500nm-700nm左右，发射荧光范围在700nm-1100nm左右；短波红外相机由深圳天盈光电有限公司生产，型号为SW640，探测器类型为InGaAs，光谱响应范围为900nm-1700nm,像素为640×512，帧频为25Hz。
综上，本发明陈述了一种全新的短波红外荧光显微成像技术。采用近红外光（或可见光）作为光源，激发标本中的短波红外荧光探针，使用二向色镜作分束器分离出荧光，然后荧光被短波红外相机接收并成像，视频信息传输至电脑实现实时短波红外显微成像。通过调节标本与物镜之间的相对位置，可以实现标本不同深度的层析荧光成像。这样一套短波红外荧光显微成像系统，具有高成像信噪比、高成像分辨率、高成像放大倍数、可视频显微成像、可层析荧光成像、大生物组织穿透深度，小生物组织损伤等优势，且系统简单可靠，工作高效稳定。

Claims (8)

1.一种短波红外荧光显微成像的方法，所使用的装置包括近红外光源或可见光光源、光路爬高系统、扩束系统、二向色镜、物镜、成像透镜、短波红外相机和计算机，其特征在于：
将外置的近红外光源或可见光光源通过一个光路爬高系统引入成像光路模块，激发光源在成像光路模块中经过由扫描透镜和镜筒透镜组成的扩束系统扩束，扩束光再经过一块短反长透的二向色镜反射，经物镜汇聚到荧光标本上激发短波红外荧光探针发出荧光信号，激发出的荧光信号经由物镜收集通过二向色镜，二向色镜分离出的荧光信号再经成像透镜被短波红外相机所接收，相机再将视频信号发送至计算机，实现标本的实时短波红外视频显微成像。
2.根据权利要求1所述的一种短波红外荧光显微成像的方法，其特征在于：通过调节标本与物镜之间的相对位置，可获得标本不同深度的荧光层析成像。
3.根据权利要求1所述的一种短波红外荧光显微成像的方法，其特征在于：二向色镜为Semrock公司生产的785nm短波长反射二向色镜，型号为LPD01-785。
4.根据权利要求1所述的一种短波红外荧光显微成像的方法，其特征在于：近红外光源或可见光光源为半导体多模激光器，其发射波长为635nm，可调功率范围为0mW-300mW。
5.根据权利要求1所述的一种短波红外荧光显微成像的方法，其特征在于：光路爬高系统由两块镀银反射镜组成。
6.根据权利要求1所述的一种短波红外荧光显微成像的方法，其特征在于：物镜是奥林巴斯公司生产，型号为XLPLN25XWMP2的25倍浸水镜，其工作距离为2mm，且在400nm～1600nm光波段具有良好的透过率。
7.根据权利要求1所述的一种短波红外荧光显微成像的方法，其特征在于：短波红外荧光探针的光吸收范围在500nm-700nm，发射荧光范围在700nm-1100nm。
8.根据权利要求1所述的一种短波红外荧光显微成像的方法，其特征在于：短波红外相机由深圳天盈光电有限公司生产，型号为SW640，探测器类型为InGaAs，光谱响应范围为900nm-1700nm,像素为640×512，帧频为25Hz。
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