CN109324026A - 共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统。本发明中飞秒激光光源所发出的激光引入正置共聚焦扫描显微镜，经过扫描振镜、扫描透镜和套筒透镜后，由近红外增透物镜聚焦于样品；样品的近红外荧光二区荧光信号由同样的近红外增透物镜收集，经过套筒透镜、扫描透镜和扫描振镜，被长通二色镜分光引出系统，收集后耦合进大口径光纤，最终被光电倍增管探测转换成电信号，电信号转换成电计数信号输入计数板卡，同时计数板卡接收到来自激发光的同步脉冲信号，将其作为计时停止信号，经计算机处理后，得到样品的近红外二区荧光寿命图像和近红外二区荧光强度图像。本发明拓展出近红外二区荧光寿命成像功能，获得了更加丰富的图像信息。

Description

共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统

技术领域

本发明属于应用光学的显微成像领域，涉及一种共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统。

背景技术

一、基于单光子激发的共聚焦近红外二区荧光显微成像

根据生物组织窗口的相关理论，近红外二区（1000～1700nm）荧光在生物组织中散射小，具有较强的组织穿透能力，有利于实现大深度和高（空间）分辨的成像。此外，生物组织在这一波段的自发荧光较低，因此近红外二区荧光成像还具有信号背景比高的优势。

目前，市场上已出现商用的近红外二区荧光宏观成像系统，可以实现生物标本（如小鼠）的近红外二区荧光全身成像。此外，近红外二区荧光成像还可以和宽场显微成像技术相结合，构成近红外二区荧光显微成像系统，进而实现对活体生物样品高放大倍率下动态的实时观测。

然而，无论是近红外二区荧光宏观成像还是近红外二区荧光显微成像系统都采用了采用宽场照明、二维面阵探测的方式，这使得对生物样品的空间分辨率不足，图像对比度不高。

为解决这一问题，申请人开发出了激光逐点扫描和光电倍增管逐点探测的三维显微成像方式，它主要有两种类型：单光子激发的共聚焦近红外二区荧光扫描成像和多光子激发的近红外二区荧光扫描成像（包括双光子，三光子激发等）。考虑到，目前近红外二区荧光显影剂大多数是无机材料，这会带来生物安全性问题，而生物兼容性较好的有机染料，其量子效率一般比较低，大多数的双光子荧光很弱。因此，要想使用更理想的近红外二区有机染料，则单光子激发是一种理想的方式。故本发明在第一种类型“单光子激发的共聚焦近红外二区荧光扫描成像系统”的基础上，进一步引入时间相关单光子计数(TCSPC)技术，使用生物兼容性好的有机纳米颗粒—TB1@PEG2000，实现了单光子激发下的共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像。

二、时间相关单光子计数——TCSPC（Time-Correlated Single PhotonCounting）

TCSPC技术是20世纪60年代晚期开始出现的一种极弱光探测技术。早期由于光源重复频率低和电子学系统速度慢的限制，TCSPC技术的采集时间相对较长。经过20多年的发展，该技术已经从一种慢速、一维的荧光寿命测量技术，发展成为一种快速、多维的光学信号记录技术。现在，先进的TCSPC技术已被广泛应用于单分子光谱、荧光相关光谱、时间分辨激光扫描显微成像和扩散光学层析成像等领域。

目前，商用的基于TCSPC技术的时间分辨激光扫描显微成像系统，其基本原理如下：记录下所探测的每一个光子的时间信息（t）和像素位置信息（X，Y），分别存入不同的内存。（X,Y）这两个参数表征该光子属于图像的哪个像素点，根据这两个参数的不同，可以把所探测到的光子分配给图像上不同的像素点；t这一参数表明该光子所处的激光脉冲周期的时间位置，根据这一参数的不同，可以把所探测到的光子按照时间分布累积起来，进而拟合出荧光衰减曲线，得到样品每个像素点上的荧光寿命。此外，每个像素点上累积的光子数能代表该像素的总体光强度，于是一幅光强度成像图也可以被重构出来。然而，目前该商用成像系统主要存在以下两点不足：

1.主要用于探测可见光波段（380～780nm）的微弱荧光。由于实验室环境中可见光波段的杂散光较多，为防止系统过曝，需要做严格的遮光处理并且对激发光功率也有严格限制，以防样品过亮而使成像过曝——这些限制都对实验条件提出了严格要求。

2.可见光波段对于大深度的生物显微成像而言并非最优，而波长位于近红外二区（1000～1700nm）的光在生物组织中的散射较小，并且生物组织在近红外二区波段的自发荧光相对较小，因此基于近红外二区的荧光生物成像具有大深度、高分辨率、高信噪比的特点。而且实验室环境中的近红外杂散光很少，所以不需要非常严格的遮光处理。然而，基于近红外二区成像的TCSPC显微成像系统，市面上鲜有商用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种基于单光子激发的共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统。

本发明的主要技术构思：本发明以奥林巴斯的正置扫描显微镜（FV1000+BX61）为基础光学系统，结合近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）、近红外增透大口径光纤、TCSPC计数板卡（Becker & Hickl SPC-150），开发出一套基于TCSPC技术的（单光子激发的）共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统。本发明将810 nm飞秒脉冲激光引入系统激发荧光探针（TB1@PEG2000纳米颗粒，荧光峰950nm），截取其1000～1700nm波段荧光信号的光子进行探测，既获取了材料的近红外二区荧光寿命图像，又得到了材料的近红外二区荧光强度图像。

本发明的技术方案是：

本发明包括奥林巴斯正置共聚焦扫描显微镜（FV1000+BX61）、近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）、近红外增透的大口径光纤、TCSPC计数板卡（Becker & Hickl SPC-150）、大带宽的信号放大器（C5594，滨松）、810 nm飞秒脉冲激光光源等。

在该系统中，810 nm飞秒激光被引入奥林巴斯正置共聚焦扫描显微镜，经过扫描振镜、扫描透镜和套筒透镜后，由近红外增透物镜（XLPLN25XWMP2）聚焦于样品（TB1@PEG2000纳米颗粒），纳米颗粒的近红外荧光二区荧光信号由同样的近红外增透物镜收集，经过套筒透镜、扫描透镜和扫描振镜，被长通二色镜分光引出系统，由光纤准直器收集后耦合进光纤，最终被近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）探测转换成电信号，电信号由信号放大器（C5594，滨松）放大后转换成电计数信号输入TCSPC计数板卡，同时计数板卡接收到来自激发光的同步脉冲信号（SYNC），将其作为计时停止信号，用以计算出所接收光子的t信息（光子所处的激光脉冲周期的时间位置），经计算机处理后，得到样品的近红外二区荧光寿命图像和近红外二区荧光强度图像。

本发明具有的优势是：

第一，相较于传统的单光子激发的共聚焦近红外二区荧光强度显微成像系统，该系统结合了TCSPC技术，拓展出近红外二区荧光寿命成像功能，获得了更加丰富的图像信息。由于TCSPC技术模块的引入，大大增强了（单光子激发的）共聚焦近红外二区荧光显微成像的灵敏度，可对极微弱荧光进行成像。

第二，相较于封装严密的商用近红外TCSPC系统，该系统由各个功能独立的硬件模块组成，拆装方便，使用方式多样，总成本远低于商用近红外TCSPC系统。

第三，有pinhole，单光子激发，这样对荧光材料的要求就大大降低了，就可以使用生物兼容性更好的有机染料。

附图说明

图1为本发明的结构示意图。

图2为基于单光子激发的共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像图（图中显示TB1@PEG2000纳米颗粒的近红外二区荧光寿命为2.5纳秒左右）。

图3为基于单光子激发的共聚焦近红外二区荧光强度成像图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步说明。

本发明利用功能独立的硬件设备以及时间相关单光子计数(TCSPC)技术，搭建了一套基于单光子激发的共聚焦近红外二区（1000-1700nm）荧光寿命显微成像系统。它是在激光扫描共聚焦显微镜（FV1000+BX61）的基础上，用810 nm飞秒脉冲激光作为光源激发样品，通过近红外增透的大口径光纤，将样品的近红外二区荧光引入近红外二区波段响应的光电倍增管（PMT）（H12397-75）并转换为电信号，配合Becker&Hickl的计数板卡（SPC-150），利用TCSPC技术，实现共聚焦条件下的近红外二区荧光寿命显微成像。

如图1所示，基于TCSPC技术的、单光子激发的共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统包括奥林巴斯正置共聚焦扫描显微镜（FV1000+BX61）、近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）、近红外增透的大口径光纤、TCSPC计数板卡（Becker & Hickl SPC-150）、大带宽信号放大器、810 nm飞秒脉冲激光光源等。

首先，810 nm飞秒激光1透过半波片2，用以改变激光偏振状态，偏振状态可调的飞秒激光通过偏振分光棱镜3分成两束光强不同的激光：较弱的一束激光被光电二极管4接收到，用以产生同步脉冲信号（SYNC）；另一束较强的激光通过由全反镜5、6组成的爬高系统，进入奥林巴斯正置共聚焦扫描显微镜（FV1000+BX61）。激发光进入显微镜后，经长通二色镜7反射到980长通二色镜8,810 nm激光再经长通二色镜8反射进入扫描振镜系统9，达到扫描功能（同时，扫描振镜输出同步扫描信号给TCSPC计数板卡），经扫描透镜10和套筒透镜11准直后，激发光进入近红外增透物镜12（XLPLN25XWMP2）。物镜将激发光聚焦于样品13（TB1@PEG2000纳米颗粒）。样品经激发光激励后产生荧光峰位于950nm处的荧光。荧光信号被物镜12收集后，荧光依次通过套筒透镜11、扫描透镜10和扫描振镜系统9，最后入射到980长通二色镜8，980nm以上的荧光透过二色镜，被透镜14聚焦于针孔15，针孔的作用是使单光子激发像多光子一样，具有较好的层析能力，阻挡非焦点处的荧光进入探测器，最后耦合进近红外增透大口径光纤16，经过光纤传输后，荧光最终被近红外二区响应的光电倍增管17（H12397-75）探测到。由于探测到的荧光很弱，因此光电倍增管输出的电信号是不连续的，可以认为是电计数脉冲信号，电脉冲的个数与光子数一一对应，因此，统计出了电脉冲数目也就统计出了光子数。这些电脉冲信号传输到高带宽信号放大器18（滨松C5594信号放大器）。经放大后的电脉冲信号和来自光电二极管4的同步脉冲信号（SYNC）一起输入带有TCSPC计数板卡（Becker & Hickl SPC-150）的计算机19进行统计运算。最后计算机根据板卡的统计数据（提供光子数目n和时间t的信息）和控制振镜的同步扫描信号（提供像素位置信息X,Y），构建出荧光寿命图像和荧光强度图像。通过这套自建的系统，取得不错的实验效果，如图2、图3所示。

综合基于单光子激发的共聚焦近红外二区荧光（强度）显微成像和TCSPC技术的特点，本发明基于功能独立、使用方式多样的硬件设备，开发了一款简单实用、稳定性好、使用方式灵活、且适合于活体生物成像的共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统。此外，由于TCSPC技术能通过每个像素点上累积的光子数得到该像素的光强度，因此该系统还能实现灵敏度更高的共聚焦近红外二区荧光强度显微成像。

Claims (6)

1.共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统，包括奥林巴斯正置共聚焦扫描显微镜、近红外二区响应的光电倍增管、近红外增透的大口径光纤、TCSPC计数板卡、大带宽的信号放大器和810nm飞秒脉冲激光光源，其特征在于：

810nm飞秒激光光源所发出的激光引入奥林巴斯正置共聚焦扫描显微镜，经过扫描振镜、扫描透镜和套筒透镜后，由近红外增透物镜聚焦于样品，即纳米颗粒；纳米颗粒的近红外荧光二区荧光信号由同样的近红外增透物镜收集，经过套筒透镜、扫描透镜和扫描振镜，被长通二色镜分光引出系统，由光纤准直器收集后耦合进近红外增透的大口径光纤，最终被近红外二区响应的光电倍增管探测转换成电信号，电信号由信号放大器放大后转换成电计数信号输入TCSPC计数板卡，同时计数板卡接收到来自激发光的同步脉冲信号，将其作为计时停止信号，用以计算出所接收光子的t信息，即光子所处的激光脉冲周期的时间位置，经计算机处理后，得到样品的近红外二区荧光寿命图像和近红外二区荧光强度图像。

2.根据权利要求1所述的共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统，其特征在于：所述的810nm飞秒激光由爬高系统引入至奥林巴斯正置扫描显微镜。

3.根据权利要求2所述的共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统，其特征在于：所述的爬高系统由两个全反镜组成。

4.根据权利要求1所述的共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统，其特征在于：810nm飞秒激光光源所发出的激光先透过半波片，用以改变激光偏振状态，偏振状态可调的飞秒激光通过偏振分光棱镜分成两束光强不同的激光：较弱的一束激光被光电二极管接收到，用以产生同步脉冲信号；另一束较强的激光通过爬高系统进入奥林巴斯正置共聚焦扫描显微镜。

5.根据权利要求1所述的共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统，其特征在于：所述的长通二色镜为980nm长通二色镜。

6.根据权利要求1所述的共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统，其特征在于：在所述长通二色镜和光纤准直器之间还设置有透镜和针孔，980nm以上的荧光透过长通二色镜后被透镜聚焦于针孔。