CN112835189A

CN112835189A - 自共焦近红外二区荧光寿命显微镜

Info

Publication number: CN112835189A
Application number: CN202011607103.6A
Authority: CN
Inventors: 钱骏; 周静
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112835189B

Abstract

本发明公开了一种自共焦近红外二区荧光寿命显微镜。本发明中激光光源出射后被分成两路，一路被光电二极管接收，经光电转换后传输至计数板卡，用来采集激发光脉冲信号；另一路经过准直透镜组被准直后透过二色镜，被第一透镜聚焦在小孔上，再经过第二透镜变成准直光，然后经过扫描振镜、扫描透镜和套筒透镜后，被物镜聚焦于样品上。聚焦点发出的近红外二区荧光信号按逆入射光路的方向传输，再次被聚焦于小孔上，然后被二色镜反射，经收集模块传输至光电倍增管转换成电信号，电信号再转换成电计数信号输入到计数板卡。荧光信号和激发光脉冲信号经处理后，得到样品的近红外二区荧光寿命共聚焦图像。本发明光路调节过程可控、稳定又简便。

Description

自共焦近红外二区荧光寿命显微镜

技术领域

本发明属于应用光学的显微成像领域，涉及一种共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统。

背景技术

一、基于单光子激发的共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像

根据生物组织窗口的相关理论，近红外二区（NIR-II，900-1700 nm）光相比于可见光和近红外一区（NIR-I，780-900 nm）光，其在生物组织中散射更小，且组织在这一波段的自发荧光很弱，因此在成像上可以实现更高的空间分辨率和信背比，以及更大的穿透深度。近红外二区已成为生物成像中非常吸引人的一个光学窗口。

近红外二区荧光成像系统从照明方式上可分为宽场照明和点扫描两大类。采取宽场照明的有近红外二区荧光宏观成像系统和近红外二区荧光宽场显微成像系统。近红外二区荧光宏观成像系统目前已实现商用化，可以实现大视野实时成像（如整只小鼠）。近红外二区荧光宽场显微成像系统则可以对小视野进行高放大倍数的实时成像。但是这两种系统的成像景深比较大，信背比和分辨率不够高。而采取点扫描激发的多光子近红外二区荧光扫描成像系统和共聚焦近红外二区荧光扫描成像系统则可以实现小景深、高信背比和高分辨率的成像。因共聚焦成像利用的是材料在单光子激发下产生的荧光信号，比多光子成像效率更高，故申请人将其与时间相关单光子计数(TCSPC)技术结合，在先前开发出了共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统来对样品进行多功能成像（荧光强度+荧光寿命）。但是之前系统的光路调节过程复杂且对光路的稳定性要求很高，为了解决这个问题并维持飞秒光的窄脉宽，本发明对光路进行了创新，能够实现全空间光下的自动共聚焦，该光路调节过程可控、稳定且简便。

二、时间相关单光子计数—— TCSPC（Time-Correlated Single PhotonCounting）

TCSPC技术用于荧光寿命测量的原理如下：在激发光的一个脉冲周期内，当荧光信号很微弱且探测器探测频率很高时，有的探测周期内可能探测不到光子，有的探测周期内能够探测到一个光子，将光子被探测到的时间对应到脉冲周期内的某个时间段，这样在对多个激发光脉冲周期内的荧光光子进行重复测量后，对各时间段内的光子数目进行统计就能得到光子随时间变化的频率分布直方图，对直方图进行拟合即可获得光信号随时间的强度变化，从而得到荧光寿命。

将TCSPC技术用于激光扫描显微成像系统，通过获得每个像素点的荧光寿命信息，构建出荧光寿命图像。此外，每个像素点上累积的光子数能代表该像素的总体光强度，于是荧光强度图也可以被重构出来。

发明内容

本发明为解决现有技术光路调节繁复的难点，提出了一种自动共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统。

本发明的主要技术构思：

本发明以奥林巴斯的扫描显微镜（FV1200）为基础光学系统，在其上添加自共焦模块，并结合飞秒脉冲激光光源、近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）及TCSPC计数板卡（Becker & Hickl SPC-150），开发出一套能在单光子激发下实现自动共聚焦的近红外二区荧光寿命显微成像系统。本发明将800 nm飞秒脉冲激光引入系统激发荧光探针，截取其900～1700nm波段荧光信号的光子进行探测，既获取了材料的近红外二区荧光寿命图像，又得到了材料的近红外二区荧光强度图像。

本发明的技术方案：

本发明包含800 nm飞秒脉冲激光光源、准直镜组、自共焦模块、奥林巴斯的扫描显微镜（FV1200）、近红外二区增透的收集模块、近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）、大带宽的信号放大器（C5594，滨松）、光电二极管、TCSPC计数板卡（Becker & Hickl SPC-150）等。

在该系统中，800 nm飞秒激光出射后，先被分束镜分成两路，一路入射到光电二极管上，获得激发光的脉冲信号，经光电转换后传输至TCSPC计数板卡，作为荧光寿命记录周期的终止信号。另一路则经准直镜组准直，然后透过短通二色镜入射到自共焦模块，再被引入到奥林巴斯的扫描显微镜。经过扫描振镜、扫描透镜和套筒透镜后，由近红外增透物镜（XLPLN25XWMP2）聚焦于样品，被收集的近红外二区荧光信号沿着逆激发光路的方向，被同一个物镜收集，经过套筒透镜、扫描透镜、扫描振镜、自共焦模块后，被短通二色镜反射到近红外增透的大口径准直器上并被耦合进大芯径（1mm）光纤，最终被近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）探测并转换成电信号，电信号由信号放大器（C5594，滨松）放大后转换成电计数信号输入TCSPC计数板卡，计数板卡根据接收到的荧光信号（CFD）和激发光脉冲信号（SYNC），计算出荧光光子的时间信息（光子所处的激光脉冲周期内的时间位置），经计算机处理后，得到样品的近红外二区荧光寿命图像和近红外二区荧光强度图像。

本发明中的二色镜虽然用于分光，但是其也是一块平行平板，不同入射方向的光线经过二色镜会产生不同距离的平移，其出射光线不能等效于由点光源发出，因此经过透镜聚焦后也不能在小孔上形成点光源。对激发光先进行准直，由于平行光线的入射方向都一致，在经过二色镜后仍为平行光，可以被透镜聚焦在小孔上形成点光源。

所述的自共焦模块由透镜-小孔-透镜组成，置于二色镜的后方光路。小孔前透镜把激发光聚焦于小孔上，小孔后透镜对小孔上的点光源进行准直。根据光路可逆原理，点光源聚焦于样品上的信号点发出的荧光信号一定会再被聚焦于小孔上，所以能够实现点光源、信号点、探测点三点的自动共轭（自共焦）。小孔可以滤除信号点之外荧光信号，减少离焦信号的干扰，调节小孔的大小可以获得不同分辨率和景深的图像。

本发明具有的有益效果：

第一，相较于先前的单光子激发的共聚焦近红外二区荧光寿命显微成像系统，该系统在光路上进行了创新，光路设计巧妙，二色镜在前，pinhole在后，从原理上实现点光源、信号点、探测点自动共聚焦。自动共聚焦模块的引入，大大简化了光路调节的复杂性，其可视化、可控性、稳定性、便捷性，大幅缩短了新手的学习周期和调节时间，且成像效果可以可控地进一步优化。

第二，相较于封装严密的商用近红外TCSPC系统，该系统由各个功能独立的硬件模块组成，拆装方便，使用方式多样，总成本远低于商用近红外TCSPC系统。

第三，相较于多光子激发的近红外二区荧光寿命显微成像系统，单光子激发效率更高，对荧光材料的要求大大降低，选择范围更广。

附图说明

图1为本发明的光路结构示意图。

图2为自共焦近红外二区荧光寿命显微镜获得的寿命图像（图中显示血管中的ICG的近红外二区荧光寿命为800皮秒左右）。

图3为自共焦近红外二区荧光寿命显微镜获得的强度图像。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步说明。

如图1所示，自共焦近红外二区荧光寿命显微镜包含800 nm飞秒脉冲激光光源、准直镜组、自共焦模块、奥林巴斯的扫描显微镜（FV1200）、近红外二区增透的收集模块、近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）、大带宽的信号放大器（C5594，滨松）、光电二极管、TCSPC计数板卡（Becker & Hickl SPC-150）等。

首先，800 nm飞秒激光器1出射800 nm飞秒光，然后被分束镜2分成两路光强不同的激光：较弱的一束激光被光电二极管3接收到，用以产生激发光脉冲的同步信号（SYNC）；另一束较强的激光透过分束镜，经准直镜组（由4-1、4-2组成）准直后被反射镜5反射，然后透过短通滤光片6（900nm SP）和短通二色镜7（900nm DMSP）进入自共焦模块（由8-1、8-2、8-3组成），对激发光进行准直的目的是保证其在经过二色镜产生平板平移后仍可视为一个点光源。入射到自共焦模块的激发光先被小孔前透镜（第一透镜）8-1聚焦于小孔8-2上，然后被小孔后透镜（第二透镜）8-3准直，进入奥林巴斯的扫描显微镜（FV1200）。激发光进入显微镜后，被反射镜9反射至扫描振镜模块（由10-1、10-2组成），实现XY平面扫描功能。

然后经扫描透镜11-1和套筒透镜11-2扩束后，进入可沿光轴方向移动的近红外增透物镜12（XLPLN25XWMP2）。物镜将激发光聚焦于XY平移台13上的样品，聚焦点处的荧光信号（信号点）根据光路可逆原理，沿逆入射光路的方向，被物镜12收集后，依次经过套筒透镜11-2、扫描透镜11-1和扫描振镜模块，然后被反射镜9反射至自共焦模块，由于光路可逆，荧光必然会被自共焦模块的小孔后透镜8-3聚焦于小孔8-2上，实现自动共聚焦，然后被小孔前透镜8-1准直，小孔的作用是阻挡非焦点处的荧光进入探测器，使单光子激发像多光子一样，具有较好的层析能力。从自共焦模块出射的荧光经短通二色镜7（900nm DMSP）反射并透过长通滤光片14（900nm LP）后，被近红外增透的大口径准直器15收集并耦合进大芯径（1mm）光纤16，经光纤传输后，最终被近红外二区响应的光电倍增管17（H12397-75）探测到。

由于探测到的荧光很弱，因此光电倍增管输出的电信号是不连续的，可以认为是电计数脉冲信号，这些电脉冲信号再被传输至高带宽信号放大器18（C5594，滨松）进行放大。电脉冲与光子一一对应，为计算荧光寿命提供了时间信息，同时统计其总数目就可以得到荧光光强。经放大后的电脉冲信号和来自光电二极管3的激发光脉冲同步信号（SYNC）被一起输入到计算机19的TCSPC计数板卡（Becker & Hickl SPC-150）进行统计运算。最后计算机根据板卡的统计数据（光子数目n和时间位置t）和控制振镜的扫描同步信号（提供像素位置信息xy），构建出荧光寿命图像和荧光强度图像。

本发明可用于如下实例：注射了荧光探针（ICG）的开颅小鼠，被固定在鼠架上并被置于物镜下方。ICG的吸收峰在800nm左右，荧光峰在865nm左右，但其荧光光谱在900nm以上（近红外二区）也有较多的分布。升降物镜使激发光聚焦于血管平面，得到的近红外二区荧光寿命成像效果和荧光强度成像效果如图2、图3所示。

本发明记载了一种新型的自共焦近红外二区荧光寿命显微镜。在先前的共聚焦近红外二区荧光寿命显微镜的基础上进行了光路的创新，调节更方便、成像效果更优、稳定性更好。同时基于功能独立、使用方式多样的硬件设备，使用方式也灵活。

Claims

1.自共焦近红外二区荧光寿命显微镜，包含飞秒脉冲激光光源、准直透镜组、自共焦模块、奥林巴斯的扫描显微镜、近红外二区响应的光电倍增管、大带宽的信号放大器、光电二极管、TCSPC计数板卡，其特征在于：

飞秒脉冲激光光源出射后被分束镜分成两路，一路被光电二极管接收，经光电转换后传输至TCSPC计数板卡，用来采集激发光脉冲信号作为荧光寿命计时停止信号；另一路先经过准直透镜组被准直后透过二色镜，被第一透镜聚焦在可调孔径的小孔上，再经过第二透镜变成准直光，然后进入奥林巴斯的扫描显微镜，依次经过扫描振镜、扫描透镜和套筒透镜后，被近红外增透的物镜聚焦于样品上，所述的第一透镜、第二透镜和小孔构成所述自共焦模块；

样品上的聚焦点，即信号点发出的近红外二区荧光信号按逆入射光路的方向传输，再次被聚焦于小孔上，实现点光源、信号点、探测点这三点的自动共轭；然后被二色镜反射，经大口径准直器耦合进大芯径光纤并传输至光电倍增管转换成电信号，电信号再转换成电计数信号输入到TCSPC计数板卡；

荧光信号和激发光脉冲信号经计算机处理后，得到样品的近红外二区荧光寿命共聚焦图像和近红外二区荧光强度共聚焦图像。

2.根据权利要求1所述的自共焦近红外二区荧光寿命显微镜，其特征在于：所述的小孔用于滤除信号点之外荧光信号，减少离焦信号的干扰，调节小孔的大小可获得不同分辨率和景深的图像。

3.根据权利要求1所述的自共焦近红外二区荧光寿命显微镜，其特征在于：所述的短通二色镜为900nm短通二色镜。