CN110960198B - 基于多维调节架的近红外二区共聚焦显微成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于多维调节架的近红外二区共聚焦显微成像系统。该发明将共聚焦显微镜模块安装在多维调节架上，通过多维度的平移和旋转，物镜能方便地移动到成像平面的正上方。近红外激光从扫描单元上端口引入，通过扫描振镜实现在X‑Y平面的扫描。出射荧光在针孔模块被滤除离焦信号，最后被近红外二区响应的光电倍增管探测。物镜安装在电动调焦模块上，能实现精确对焦和层析成像。本发明采用多维调节架使共聚焦显微镜能方便地对大动物成像，同时通过优化成像波段来提高性能。具有性能优良、使用简便的优点，适于推广。

Description

基于多维调节架的近红外二区共聚焦显微成像系统

技术领域

本发明属于应用光学的显微成像领域，涉及一种基于多维调节架的近红外二区共聚焦显微成像系统。

背景技术

激光共聚焦扫描显微镜是在传统荧光显微镜的基础上发展起来的高精度显微成像设备，采用点激发和点探测的模式，具有很高的空间分辨率和信噪比，在光学生物成像领域发挥着重要的作用。在共聚焦扫描显微镜的结构中，激光作为激发光源被物镜聚焦在成像面的一个点上，通过扫描模块（如扫描振镜）实现在X-Y平面上的扫描。在探测器的接收面前端与成像点共轭的位置有针孔结构，只有焦点的荧光信号才能通过针孔，焦点以外的荧光被隔离在针孔外。因此，相对于宽场荧光显微镜，共聚焦显微镜具有更高的信噪比，空间分辨率也很高。在不同深度扫描能实现层析成像，将各个深度的图像通过三维重构可获得生物组织在整个空间的形貌，共聚焦的这些优势被广泛利用到生物组织的结构成像中。

由于成像器件以及荧光探针的限制，共聚焦扫描显微镜采用的激发光和出射的荧光信号往往在可见光（400~760 nm）或近红外一区(760~900 nm)波段，基于近红外二区（900~1700 nm）波段的成像设备较少。而近红外二区波段的光在生物组织中具有更小的散射、更大的穿透深度，同时生物组织在此波段自发荧光更小，所以近红外二区荧光成像空间分辨率和信噪比都更高，开发并优化近红外二区共聚焦显微镜显得尤为重要。

脑血管成像对于揭示大脑功能以及研究大脑疾病具有重要的意义，共聚焦显微镜是实现血管成像的利器。由于伦理性、实验成本以及实验设备等因素，该实验在小鼠等小动物模型上的研究更为广泛。大体积的实验动物（如猴）具有小动物不具有的某些脑血管结构特征，同时和人类大脑结构更为接近，研究大动物成像更具有临床意义。因此，适用于大动物成像的近红外二区共聚焦显微成像系统亟待开发，这将推动临床医学及生命科学的发展。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，开发出一套基于多维调节架的能对体积较大的实验动物成像的近红外二区共聚焦显微成像系统。

本发明在商用共聚焦模块基础上搭建。整个共聚焦显微镜安装在多维调节架上，显微物镜安装在电动对焦模块上。外置激发光从扫描头上方引入，通过扫描振镜实现X-Y平面的扫描，激发光通过显微物镜聚焦在样品上激发出荧光，该信号被物镜收集并依次通过一系列光路后最终被PMT收集，信号放大器放大该电信号后经计算机处理实现共聚焦显微成像。

本发明采用的技术方案是：

本发明针对体积较大的实验动物成像，包括激光器、准直器、共聚焦扫描模块、扫描透镜、三目镜、显微物镜、信号光滤光片、针孔模块、光电倍增管、信号放大器、计算机、载物台、物镜安装器、电动对焦模块、控制盒、旋钮盒以及多维调节架。

外置的激光器的激光从光纤引出，通过准直器导入到共聚焦扫描模块。其中的共聚焦扫描模块中包含二向色镜和两块转轴互相垂直的扫描振镜，二向色镜把激发光反射到扫描振镜上，后者通过两次反射使得激发光向下传输。此后激光依次通过扫描透镜和三目镜内的镜筒透镜后被扩束，扩束后的平行光被显微物镜聚焦成点来激发探针发出荧光信号，构成共聚焦成像结构。

产生的荧光信号被显微物镜收集，原路返回通过上述光路，并透过共聚焦扫描模块中二向色镜以及信号光滤光片，此后通过针孔模块聚焦到另一光纤中，被在近红外二区响应的光电倍增管探测。光电倍增管完成光电转化后，输出的电信号通过信号放大器放大输入至计算机中。通过控制扫描振镜实现在X-Y平面的扫描，从而得到在某个平面的一幅图像。

所述的共聚焦成像结构整体安装在多维调节架上，实现在X、Z方向上的平移以及绕着X、Y和Z三个轴的旋转。

所述的显微物镜安装在物镜安装器上，物镜安装器连接电动对焦模块，通过调节连接在控制盒上的旋钮盒实现沿Z轴方向上的移动，用于精确地对焦到某平面或者在不同深度的近红外二区荧光层析成像。

进一步说，在显微物镜上方设置有遮光器，用于防止杂散光进入。

进一步说，实验动物放置在载物台上，所述载物台实现在X和Y方向的精细微调，帮助调整成像区域到所述显微物镜的下方。

本发明具有的有益效果是：

第一，本系统共聚焦结构安装在多维调节架上，该调节架高度可调，因而物镜下方有较大的空间能对原显微镜难以容纳的大体积动物成像。同时在多个维度能平移和旋转，使得物镜能方便地调整到成像区域的中心，并和预定成像面垂直。

第二，显微物镜安装在电动调焦模块上，可通过旋钮控制物镜在Z轴上位置来实现对焦，在不同深度扫描还可实现层析成像。现有的共聚焦显微镜往往只能通过移动物体来实现对焦，在较大体积的动物或者不可移动的物体上成像受到很大限制。

第三，光学元件和探测器均在近红外二区波段优化，发挥了该波段荧光成像穿透深度大、信噪比高的优势。光学元件包括显微物镜、Scan lens以及Tube lens等在近红外二区波段增透，作为探测器的PMT在该波段具有很高的响应率。

附图说明

图1为本发明所述成像系统的结构示意图。

图2为本发明的成像效果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步说明。

本发明所述系统由激光器、准直器、共聚焦扫描头、二向色镜、扫描振镜、扫描透镜（Scan lens）、三目镜（内含镜筒透镜（Tube lens））、显微物镜、信号光滤光片、针孔模块、光电倍增管（PMT）、遮光器、信号放大器、计算机、载物台、物镜安装器、电动对焦模块、控制盒、旋钮盒以及多维调节架等组成。

该系统将共聚焦显微镜安装在多维调节架上，下方具有较大的空间放置成像物体，并能在多个维度平移和旋转，方便物镜对准并垂直于成像平面。激发光从扫描头上方通过准直器引入，经二向色镜和扫描振镜反射以及Scan lens和Tube lens扩束后，在物镜焦点处聚焦成点，激发荧光探针产生荧光信号。信号光通过原光路返回，再透过二向色镜和针孔被PMT收集，通过信号放大器放大后输出到计算机。显微物镜安装在电动调焦结构上，控制物镜在Z轴上的位置来精确对焦，在不同深度上扫描还可实现三维层析成像。实验动物放置在可沿X、Y方向精确调整位移的载物台上，方便成像时改变视场的位置。光学元件及探测器都在近红外二区波段进行优化，提高了信噪比和空间分辨率。

实施例：如图1所示，首先，来自外置激光器1的激光从光纤引出，通过准直器2导入到共聚焦扫描模块3。共聚焦扫描模块中包含二向色镜4（透过长波长，反射短波长）和两块转轴互相垂直的扫描振镜5，二向色镜把激发光反射到扫描振镜上，后者通过两次反射使得激发光向下传输。此后激发光束依次通过Scan lens 6和三目镜7内的Tube lens 8后被扩束，扩束后的平行光被物镜9聚焦成点来激发探针。产生的荧光信号被物镜收集，原路返回通过上述光路，并透过扫描模块中二向色镜以及信号光滤光片10，此后通过针孔模块11聚焦到光纤中，被在近红外二区响应的PMT 12探测。遮光器13放在物镜上方防止周围的杂散光进入。PMT完成光电转化后，输出的电信号通过信号放大器14放大，最后输入到计算机15中。通过控制扫描振镜实现在X-Y平面的扫描，这样就得到了在某个平面的一幅图像。

实验动物放置在载物台16上，可以实现在X和Y方向的精细微调，帮助调整视场的位置。物镜安装在物镜安装器17上，并连接到电动对焦模块18，通过控制连接在控制盒19上的旋钮盒20可以使物镜沿Z轴移动，精确地对焦到某平面或者在不同深度层析成像。

整个共聚焦成像结构安装在多维调节架21上，能实现如箭头所示的在X、Z方向上的平移以及绕着X、Y和Z三个轴的旋转。该支架底座有适配光学平台的螺孔，可安装在光学平台的任意位置。支架的高度可以调节，使物镜下方留有较大的空间用于放置体积较大的实验动物。通过多维度的平移和旋转，物镜能调整到实验动物成像区域的正下方，并使其垂直于成像平面。

本实施例中的激光光源采用峰值波长为793 nm的连续光激光器。扫描模块和Scanlens均来自索雷博光电科技有限公司（以下简称索雷博）。三目镜来自舜宇光学科技有限公司（以下简称舜宇）的RX50生物显微镜，多维调节架也来自舜宇。电动调焦结构采用索雷博的ZFM2020电动对焦模块和MCM3001三通道控制盒和旋钮盒。物镜选用奥林巴斯XLPLN25XWMP2 （放大倍数25，工作距离2 mm，工作介质是水，适用波段400~1600 nm）。二色镜选用索雷博DMLP900R，反射900 nm以下的光并透过900nm以上的光，信号光滤光片选用索雷博FELH900长通滤光片。探测器选用日本滨松公司生产的型号为H12397-75光电倍增管，信号放大器采用滨松公司的C12419放大器。荧光探针是商用的注射用吲哚菁绿，其吸收峰在785 nm左右，荧光峰在850 nm左右。将上述荧光材料通过静脉注射到大型实验动物（如：猴）体内，可用本系统得到高信噪比的共聚焦图像（如图2所示）。

综上，本发明陈述了一种基于多维调节架的共聚焦显微成像系统。该系统将共聚焦光路结构安装在多维调节架上，支架下方的空间能放置体积较大的实验动物或者其他成像物体，且能通过多个维度的平移和旋转将物镜调整到成像平面正上方，克服了普通共聚焦系统只能对小动物成像的缺点。通过控制电动对焦模块移动物镜来对焦，精确且方便。光学系统在近红外二区波段具有较高的透过率，探测器在此波段有很好的响应率，发挥了近红外二区共聚焦成像穿透深度大以及信噪比高的优势。该系统性能优良，使用简便，适用范围广，在研究脑科学、神经科学等方面有广阔的前景。

Claims (3)

1.基于多维调节架的近红外二区共聚焦显微成像系统，包括激光器、准直器、共聚焦扫描模块、扫描透镜、三目镜、显微物镜、信号光滤光片、针孔模块、光电倍增管、信号放大器、计算机、载物台、物镜安装器、电动对焦模块、控制盒、旋钮盒以及多维调节架，其特征在于：

外置的激光器的激光从光纤引出，通过准直器导入到共聚焦扫描模块；其中的共聚焦扫描模块中包含二向色镜和两块转轴互相垂直的扫描振镜，二向色镜把激发光反射到扫描振镜上，后者通过两次反射使得激发光向下传输；此后激光依次通过扫描透镜和三目镜内的镜筒透镜后被扩束，扩束后的平行光被显微物镜聚焦成点来激发探针发出荧光信号，构成共聚焦成像结构；

产生的荧光信号被显微物镜收集，原路返回通过上述光路，并透过共聚焦扫描模块中二向色镜以及信号光滤光片，此后通过针孔模块聚焦到另一光纤中，被在近红外二区响应的光电倍增管探测；光电倍增管完成光电转化后，输出的电信号通过信号放大器放大输入至计算机中；通过控制扫描振镜实现在X-Y平面的扫描，从而得到X-Y平面的一幅图像；

所述的共聚焦成像结构整体安装在多维调节架上，实现在X、Z方向上的平移以及绕着X、Y和Z三个轴的旋转；

所述的显微物镜安装在物镜安装器上,由电动对焦模块单独控制，物镜安装器连接电动对焦模块，通过调节连接在控制盒上的旋钮盒实现沿Z轴方向上的移动，用于精确地对焦到某平面或者在不同深度的近红外二区荧光层析成像。

2.根据权利要求1所述的基于多维调节架的近红外二区共聚焦显微成像系统，其特征在于：在显微物镜上方设置有遮光器，用于防止杂散光进入。

3.根据权利要求1或2所述的基于多维调节架的近红外二区共聚焦显微成像系统，其特征在于：实验动物放置在载物台上，所述载物台实现在X和Y方向的精细微调，帮助调整成像区域到所述显微物镜的下方。

Images