JP5377738B2 - 非侵襲性三次元検出用のフレキシブルな非線形レーザー走査型顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、特に生物体（生体内で）内において、好ましくは動物の皮膚内で、植物及び細胞培養において、及び、例えば鉱物、繊維及び芸術作品のような非生物体における、軟質（フレキシブル）で非侵襲性三次元検出用の、非線形レーザー走査型顕微鏡に向けられている。非線形レーザー走査型顕微鏡、又は、多光子（MP）励起を備えた顕微鏡は、以後常に、二光子又は多光子励起を備えた顕微鏡を意味する。

蛍光信号とSHG（第二高調波発生）信号とが、生体内の生物分子内において近赤外領域のパルスレーザー放射光によって励起されて、適切な高感度で、迅速なレシーバによって検出される、二光子顕微鏡と多光子断層撮影装置（MPT）とが公知である（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３）。また、水及び脂質のような、蛍光及びSHG不活性成分は、CARS（コヒーレント反ストークス・ラマン分光）顕微鏡及びCARS断層撮影装置によって表示可能である（例えば、未公開の特許文献４参照）。

これら非線形光学顕微鏡と断層撮影装置によって、三次元内における、マイクロメーター未満領域の水平解像度と、数百マイクロメーターの走査範囲（対象物範囲）が成し遂げられる。

この種類の非線形顕微鏡と断層撮影装置は、固定式設計と、振動抑制型光学ステージ装置の使用に基づいている。それらは、正立型の、又は、倒立型光学顕微鏡装置のいずれかとして操作可能である。しかしながら、非線形顕微鏡又は断層撮影装置には、マイクロメーター未満領域での所望の方位（横方向）と軸（軸方向）分解能で（約１μｍ又はそれ未満の方位分解能で）、測定ヘッドの自由な位置決めを可能にする、高分解能画像処理システムが存在しないことが知られている。

このために必要なビーム伝送は、光ファイバーシステムによって、又は、フリービーム伝送システムとして実施可能である。例えば、関節ミラーアームの形で公知であるような、フリービーム式レーザー伝送システムの精度は、機械的公差、機械的応力と、これらアームの機械的保持構造体内部の温度変化に影響される。様々な関節アームにおいて、関節ミラーアームの機械軸への（例えば温度変化による）影響は、関節アームの出力において、目標位置又は機械軸に対するレーザービームの位置ずれを導き、その結果、高分解能集束光学部品による、様々な測定ヘッドの向きにおける測定対象物の高信頼走査が、限定された範囲でのみ可能となる。前記光学関節アームの出力における、レーザービームの位置のゆらぎは、「伝送システムの精度」という概念に包含されうる。

レーザービーム伝送の精度はまた、関節アームにおける光ビーム路の所与の長さと、レーザーのビーム位置安定性（照準安定性）とによって影響される。

この事例では、照準安定性は、レーザーの直接出力においてレーザーの共振器構成に熱的に誘発された影響の結果として生じた、レーザー放射光の方向安定性における変化に関している。

関節ミラーアームへのレーザ放射光の結合は特に重要である。レーザービームの光学軸が関節アームの機械的（入射）軸と一致する場合（共線性）、結合は最適となる。この点において生じるずれは、先に述べた機械的に且つ熱的に生じた関節アームのずれとは別の精度に影響する。

ファイバー伝送光学部品を用いる場合、レーザービームを誘導する際に補償されるべきずれが、専らビームの結合及び分離に変えられる一方で、目標位置における、好ましくないレーザービーム公差の基本的な問題が残る。特に、望まないファイバー外装への結合の危険も存在する（クラッド）。

特許文献５は、光ビームを一つの光ファイバーへ結合するために、光ビームを位置合せする装置を開示しており、ファイバー径へ結合していないレーザービームの一部は、再帰反射鏡として備えられた二つの環状円錐鏡と、一つの輪上を４５°で回転する鏡とを介して、検出装置へ分離される。検出器を回転鏡の位置と一致させることによって、レーザー軸及びファイバー軸の共線性からのずれと、焦点はずれとが検出可能となる。また、ファイバー入口の重なり照射（つまり、ファイバー径よりも大きなビーム径）が要求されるので、強度の損失が既に初めから避けられない。

したがって、従来技術は以下の不利益を与えている。
− 固定式構成により、従来の二光子顕微鏡と多光子断層撮影装置（MPTｓ）は、適用範囲が制限されており、例えば、人体への多機能性検査には不適切であること、
− 柔軟性（フレキシブルな）構造を実現するために、ビーム誘導システムの機械的公差が大きすぎて、マイクロメーター未満の分解能が可能な走査箇所の再現性のある放射光に対し、十分一定な測定点（スポット）の照射を確保できないこと、及び、
− 多光子顕微鏡において、内在的な物質の自己蛍光の検出、及び、特定の分子の非線形周波数逓倍への画像化（画像形成：imaging）の制限がしばしば不利益となっており、CARSシステムとの好ましい組み合わせが、共線性に係る厳しい要求により、これまで固定式システムにおいてのみ実現可能であったことである。

US 5 034 613 A DE 201 17 294 U1 DE 203 06 122 U1 DE 10 2010 047 578 A1 US 5,463,215 A

したがって、本発明の課題は、測定ヘッドの無制限な柔軟性（屈曲性）によって集束光学部品の再現性のある照射が可能である、特に皮膚、人体の泌尿生殖器範囲内、口腔内、及び眼域の組織だけでなく、植物、動物、細胞培養における組織、及び、非生物体における組織の、多機能高分解能非線形検査のための、非侵襲性三次元検出用の可動式で柔軟に使用可能な非線形レーザー走査型顕微鏡をもたらすことである。広い課題は、異なる測定方法、好ましくはMP断層撮影装置とCARS断層撮影装置とを一つの共用の柔軟性（フレキシブルな）測定ヘッド内へ組み合わせるために、二ビーム路の再現性のある集束と同時適用を実現することである。

本発明にしたがい、原子と分子によって放出される２次放射光を生じるために、励起ビームを生じる少なくとも一つの放射光源と、
前記放射光を、集束光学部品を備えた測定ヘッドへ伝送するための柔軟な伝送光学部品であって、それによって前記放射光が測定対象物内に集束され、前記放出された２次放射光が誘導されて戻り、且つ、少なくとも一つの検出システムへ向けられる、伝送光学部品とを含んでいる、非侵襲性三次元検出のためのフレキシブルな非線形レーザー走査型顕微鏡において、先に述べた課題は、
前記測定ヘッドが前記少なくとも一つの放射光源と、空間スペースにおいて自由に旋回（ピボット、枢転）及び回転可能となるように、且つ、柔軟に位置決め可能となるように結合され、その結果、正立顕微鏡、倒立顕微鏡、及び、あらゆる立体角の顕微鏡が実施可能となること、
少なくとも一つの制御可能な傾斜鏡が、少なくとも一つの放射光源におけるパルスレーザー放射光の少なくとも一つの励起ビームを屈折及び配向するために備えられて、前記少なくとも一つの励起ビームを、前記測定ヘッドのいかなる位置においても、当該測定ヘッドのアパーチャで制限された光学要素と同軸配列するように、前記伝送光学系を通って前記測定ヘッド内に位置合せすること、
前記励起ビームからテストビームを分けるためのビームスプリッタが、測定ヘッド内の集束光学部品の正面に配置され、目標位置において既定された前記励起ビームのビーム位置を決定するための空間分解光検出器が、前記目標位置にテストビームが結合する位置に配置され、光検出器上のテストビームの中心位置は、目標位置における励起ビームの直角の配向と一致すること、及び、
前記制御可能な傾斜鏡を、光検出器上の中心位置からのテストビームの検出ずれにしたがって駆動して、伝送光学部品の位置依存性欠陥の程度に関係なくレーザービームの方向安定性を達成するように、制御ユニットが設けられること、によって解決される。

前記制御可能な傾斜鏡は、静電容量式の、電気誘導式の、又は、圧電式（ピエゾ式）の作動装置、ステップモーター、又は、DCモーターから成る群に由来の駆動原理に基づいた鏡ホルダーによって有利に駆動される。

前記制御可能な傾斜鏡は、二軸式鏡ホルダー又は二つの単軸式鏡ホルダーによって実行しても良いだろう。

集束光学系の、又は、他のアパーチャで制限された光学要素の入射瞳は、前記少なくとも一つの励起ビームの安定した（位置）調整用の目標位置として有利に選択される。

テストビームを生じるためのビームスプリッタが、測定ヘッド内の前記少なくとも一つの励起ビームの誘導に応じて、反射型ビームスプリッタとして、又は、透過型ビームスプリッタとしてのいずれかとして構成されることが賢明であると判明している。

前記テストビームを分離するためのビームスプリッタは同時に、二つの異なる励起ビームのコリニヤ（共線）結合用の二色性ミラーとしても有利に構成される。

テストビームを、標的位置における励起ビームの等価物として検出するための、位置検知型光検出器は、好ましくは円形光ダイオードである。しかしながら代わりに、長方形の検出器形状又は他の検出器形状、ならびに、四分割（クオドラント）光ダイオード、互いに直交するように配列した側方作用ダイオード、交差した検出器アレー（CCD又はCMOS）、CCDマトリックスアレー、又は、CMOSマトリックスアレーのような、空間（セグメント）分解レシーバも使用可能である。

伝送光学部品におけるビーム安定性の制御に加え、前記位置検知型光検出器は、レーザーの焦点安定性を有利に決定及び補正することも可能である。

測定対象物から放出された前記２次放射光用の検出システムが、MPT画像化、又は、SHG画像化用の検出器で好ましくは構成されることにより、低い機械的精度のフレキシブルな（柔軟な）光学関節アームによって、空間スペースにおいて測定ヘッドの自由な位置決めを可能にし、且つ、再現性のあるMPT画像化を確保する、蛍光発光物質用の柔軟な診断システムをもたらす。

前記２次放射光用の検出システムは、特に有利な手法で、MPT画像化、SHG画像化、及び、CARS画像化用の多数の検出器によって形成することが可能であるので、共用フレキシブルな光学関節アームによって、空間スペース内における共用測定ヘッドのいかなる自由な位置決めも可能とし、且つ、MPT信号、SHG信号、及び、CARS信号から、同時且つ同位置の画像を生じる、生物体内の蛍光発光する物質と蛍光発光しない物質用の柔軟な診断システムをもたらす。そのため、このようにして組み合わせられた、蛍光発光及び蛍光を発しない物質用の診断システムは、フレキシブルな光学関節アームと別の光ファイバーによって、共用測定ヘッドの自由な位置決めを便利に行うこともできる。また、前記柔軟な組み合わせ診断システムにおいて、二つの別々の光ファイバーによって、同時且つ同位置の画像化用共用測定ヘッドの自由な位置決めが実現可能となる。

また、小型の変形例において、前記２次放射光用検出システムは、MPT画像化用及びCARS画像化用共用測定検出器を有することも可能であり、組み合わせられた信号表示に対してMPT画像化の分離を可能にする手段が、周期的にCARS励起を妨害するために設けられる。

前記検出システムは、有利には、時間相関単一光子計数法と呼ばれる、MPT画像化用のTCSPC検出器を有している。そのため、当該検出システムは、測定信号を分離するために、測定ヘッド内に設けられたビームスプリッタの背面反射を使用する、追加のトリガーダイオードを実装するのが便利である。

フレキシブルなレーザー走査型顕微鏡の有利な実施形態では、前記測定ヘッドは、フレキシブルな支持アームによって機械的に支持されており、前記支持アームは、伝送光学部品を確実伝導（駆動）する移動式基部装置においていかなる位置にも固定可能であり、パルス励起放射光を生じる少なくとも一つの放射光源と、前記パルス励起放射光の同期用及び測定ヘッドに対する少なくとも一つの伝送光学部品の位置合せ用光学ユニットと、測定ヘッド内の励起放射光の方向を安定するための制御ユニットと、表示装置ユニットによって測定ヘッドの検出システムから画像表示装置へ伝送される信号を処理するための評価ユニットとが、前記基部装置内に設けられる。

本発明は、関節ミラーアーム内の柔軟なビーム伝送の精度を達成するためには一般的に二つの可能性が存在すると考えている、つまり、大きく嵩張る、重くて費用の高い、機械式光保持器システムの使用によるか、又は、高度に複雑なレーザー放射光の方向安定化（装置）の使用によるか、である。

本発明は、これら非常に異なる要求を、単純で費用効率が良く、且つ、小型のレーザー放射光（又はインコヒーレント：非干渉性放射光）用方向安定化（装置）に集約し、公差を最小化するために、一つの検出器と、一つの制御ユニットと、一つの駆動部とを備えている。自由で柔軟な測定ヘッド内の共役標的面内において検出された公差（ずれ）に依存して、レーザービームのビーム方向の補正が、このレーザービームが測定ヘッドの照明及び記録システム（集束光学部品）内に結合されるよりも前に、制御ユニット（単純論理回路）によって実行される。同時に、このビーム安定化は、多数の励起ビームが用いられる場合に、測定放射光の共線性も確保する。

したがって、関節ミラーアームの機械式保持器構造体に課された、ビーム誘導装置の所望の精度に関する要求が減じ、且つ、結果として生じる小容積化と軽量化が、顕微鏡測定システム（例えば、断層撮影装置）の柔軟性と可動性に適合した。方向安定化の利点、例えば、小型で、小さな寸法の構造体と高い費用効率が、特にファイバー伝送システム内のファイバー結合入口において明白にされた。

本発明の解決手段は、フレキシブルな測定ヘッドを備えた顕微鏡画像化システムによって検査すべき対象物箇所が、別の測定手法によって、例えば、高分解能多光子蛍光顕微鏡、多光子SHG顕微鏡、及び／又は、CARS顕微鏡によって同時に検査可能となることをさらに特徴とする。そのため、一つ以上の短パルスレーザーの様々な励起ビームが、同一のフレキシブルな光学関節アームによって、又は、フレキシブルな光学関節アームと追加の光ファイバーによって、又は、二つの光ファイバーによって伝送可能であり、且つ、ビーム安定化用の同装置によって制御と調整が可能となる。

本発明により、マイクロメーター未満の分解能で検査を画像化するための、測定ヘッドの無制限な屈曲性により測定対象物の再現性のある照明を可能にする、小型で、柔軟な、非侵襲性三次元検出用非線形レーザー走査型顕微鏡が実現できる。また、別々の測定手法の、好ましくは、多光子蛍光顕微鏡の、多光子SHG顕微鏡の、及び／又は、CARS顕微鏡のビーム路を、一つのフレキシブルな共用測定ヘッドに組み合わせることが可能となり、そのため、同一の再現性有る照射と、ピンポイントの（細胞毎の）走査を実現することが可能となる。

本発明は、以下の実施例を参照しながらより十分に記載する。

関節ミラーアームをビーム誘導システムとして用いることにより、レーザービームを測定ヘッド内の目標点に位置合せするための、本発明の概略図である。 円形光ダイオードを用いることにより、一つの共役標的面内におけるビーム公差の検出原理の図である。 人皮膚の断層画像測定検査用の、空間スペースで自由に位置決め可能な測定ヘッドを備えた、可動式、多機能レーザー走査型顕微鏡としての、本発明の実施形態の三次元図である。 一つの共用関節ミラーアームを、垂直な例えば絵画内の非生物体測定対象物（９０度位置）の測定用に位置合せされた測定ヘッドにビームを誘導するシステムとして用いる、二つの検出システムを備えたフレキシブルなレーザー走査型顕微鏡における本発明の一実施形態の概略図である。 一つの関節ミラーアームと一つの光ファイバーとを、動物、例えばネズミの生体組織を検査するために平常位置（０°）に位置合せされた共用測定ヘッドにビームを誘導するシステムとして用いる、二つの検出システムを備えたフレキシブルなレーザー走査型顕微鏡における本発明の一実施形態の概略図である。 二つの光ファイバーを、例えばシャーレ内の溶液を検査するために、倒立顕微鏡（１８０度位置）として位置合せされた共用測定ヘッドにビームを誘導するシステムとして用いる、二つの検出システムを備えた断層撮影装置における本発明の一実施形態の概略図である。

図１は本システムの基本的な構造を表す。レーザー１、好ましくは、単一モード（横モード）レーザーであって、円形ビームプロファイル（又は、例えば楕円形のビームプロファイル、又は、多モードレーザービーム）を備えており、レーザービーム１１を制御可能な傾斜鏡２へ伝送し、それ（傾斜鏡）によって前記レーザービーム１１は、伝送光学部品３に結合され、且つ、測定ヘッド４内の標的位置４１へ誘導される。レーザービーム１１の小部分（例えば、＜１０％）が、測定ヘッド４内に設置されたビームスプリッタ４２によって、テストビーム４３として分離されて、空間分解光検出器５へ結合される。空間分解光検出器５の位置は、標的位置４１と共役して置かれ、それによって光検出器５は、平常位置又は中央位置からのレーザービーム１１の（又は、そこから分離されたテストビーム４３の）（図２中に示された）ビームプロファイル１３の位置ずれ（位置公差）を検知する。このことは、テストビーム４３がレーザービーム１１に対し、（例えば、９０°の角度だけ）光学軸ずれを有していることを意味する。

制御ユニット６（単純論理ユニットとして実施可能である）は、光検出器５の出力信号を評価し、前記制御可能な傾斜鏡２の角度配向を、当該光検出器５の中央位置からのテストビーム４３（図２に示しているように、ビームプロファイル１３の中央又は出力重心）のずれに基き、光検出器信号の最大値に調整する。

図２は、空間分解光検出器５を、影になった四角内の、単独の広い領域の円形光ダイオード５１として表している。しかしながら、レーザービーム１１のビームプロファイル１３の位置ずれの検出について、他に多くの可能性が存在する。それらは、四分割光ダイオードのように空間分解手法で測定する検出器によって、互いに直交するように配列した二つの側方作用ダイオード（位置検知型装置（PSD））によって、交差した検出器アレー（荷電結合装置（CCD）、又は、相補形金属酸化膜半導体（CMOS））によって、CCDマトリックス又はCMOSマトリックスによって実現可能であり、前記二次元センサーアレーは、環状に結合された（束ねられた）部分要素によって構成され、又は、光伝導ファイバーと組み合わせるような統合手法で記録する。また、可動溝（走査型スリット検出器）を有する、あまり一般的でない検出器システムも使用可能である。

制御可能な傾斜鏡２の角度位置に変化が生じる場合には（図１参照）、レーザービーム１１のビームプロファイル１３（この場合は、円形と推定される）が、影の四角内で偏向される。前記ビームプロファイル１３の範囲と、有利には円形ビームプロファイル１３と一致する円形光ダイオード５１として構成されるべき光検出器５の範囲とが部分的に重なる場合には、入射レーザー放射光によって生じた光検出器５の光電流に基いて、出力信号が発生する。

図１に係る装置の目的は、ビームプロファイル１３を、光検出器５の中央にその中央が永続的にくるように調整することである。ビームプロファイル１３の位置は、ここでは、測定ヘッド４の標的位置４１におけるレーザービーム１１の理想の位置に関連した、直交座標（カルテシアン座標）系内の座標XとYとによって既定される。同様の座標系が、光検出器５が配置され、且つ、ビーム公差の検出の基礎を形成する共役位置と関連している。図１における標的位置４１の直交座標系の原点は、円形光ダイオード５１の中心と相関関係にある、というのも、後者が標的位置４１と共役する面内に配置されているからである。

光検出器５の出力信号は、図２中の実施例によって示されたように、X座標における信号成分５２、及び、影のつけられた四角内のY座標における（仮定された座標系）質的に同一な信号の成分５３のガウス分布近似にしたがう、ビームプロファイル１３の強度関数と、円形光ダイオード５１の感度分布の重ね合わせ、又は、たたみこみによって作り出される。出力信号を、X成分とY成分とに分割した結果、ビームプロファイル１３の位置は、制御可能な傾斜鏡２の角偏向によって変化可能であり、且つ、段階的に調節可能である（例えば、最初にX座標を、次に、Y座標を、光ダイオード信号の最大値へ合わせる）。

直交座標系のX方向へのビームプロファイル１３の偏向は、範囲の広い最大値５２１を有する位置依存性信号成分５２を生じる。信号成分５２の振幅は、（円形）ビームプロファイル１３と円形光ダイオード５２の重なりに基づく、又は、より正確には、光ダイオード５２の感度関数と、レーザービーム１１の強度関数のたたみこみに基づく。最大値５２１に関連したレーザービーム１１の偏向角は、X方向において捜し求められた座標を表す。これにより、傾斜鏡２のX軸の、捜し求められた補正位置が決定されて位置合せされる。このX座標から始まり、直交方向の（前記座標系のY軸の）偏向は、円形光ダイオード５１の第２信号成分５３を導き、その最大値５３１は、Y方向の捜し求められた座標と相関関係にある。傾斜鏡２の当該捜し求められたY軸の補正位置は、このようにして決定され、傾斜鏡２は、同様にして位置合せされうる。信号成分５３の振幅は、信号成分５２に対しビームプロファイル１３と光ダイオード５１表面との重なりを拡大することによる第一追跡運動の結果、拡大又は最大化される。

一度の座標決定は、理想的な円形のガウス型ビームプロファイル１３と理想的な円形光ダイオード５１には十分である。ここで、標的位置４１の直交座標系の原点は、前記座標のX方向とY方向の方へ動いた後の、ビームプロファイル３１の中心又は重心と相関関係にある。

理想的でない（円形のガウス型形状からずれている）ビームプロファイル１３について、又は、非円形光ダイオード５２については、X方向とY方向における座標検索処理が、何度か繰り返されなければならない。最初の位置合せの結果が、次にテストビーム４３において必要ならば再度試験可能であり、傾斜鏡２は再調整可能である。

したがって、円形（単一モード）ビームプロファイル以外の、多モード、又は、非対称なビームプロファイル１３も、心合わせ（位置決め）処理の繰り返し適用によって、標的位置へ心合わせ（反復的近似）可能である。この場合、理想的円形ビームプロファイル１３の中心の代わりに、当該ビームプロファイル１３の強度重心が位置合せされる。

座標XとYにおける円形光ダイオード５１の二つの信号成分５２、５３からの情報により、光ダイオード５１の信号がより大きくなり、その結果ビームプロファイル１３（又はその強度重心）が標的面４１の中心へ移動するように、制御可能な傾斜鏡２は制御ユニット６によって位置合せされる。

この制御手法における最大精度について、信号成分５５、５６はそれぞれ、平坦域の無い最大値５２１、５３１を有していなければならない。このことは、円形光ダイオード５１の直径とビームプロファイル１３の直径とを一致することによって成し遂げられるが、そのために、前記光ダイオード５１の直径は、レーザービーム１の強度の１／２ｅでビーム半径の二倍になるべきである。出来るだけ精確に、信号成分５２、５３の最大値５２１、５３１をそれぞれ決定するための他の可能性は、後の信号処理にある（例えば、ガウス適合、又は、低域フィルタ）。これは、信号がビームスプリッタにおいて多重反射による干渉を有する、長い可干渉性（コヒーレンス）レーザー放射光源も備えた当該システムの操作を可能にする。

信号成分５２、５３のダイナミックレンジは、対数増幅器（図示せず）を用いることによって増加可能であり、それはまた、変化し得る出力を備えたレーザーによる方向安定性の機能を保証する。

レーザービーム１１が測定ヘッド４内にさらに誘導されるであろう方向に依存し、ビームスプリッタ４２における、レーザービーム１１の反射（図１に示すような）、又は、レーザービーム１１の透過（図４に示すような）が、テストビーム４３を生じるために用いられうる。

（図５に与えられているように）ファイバー伝送光学部品を用いる場合には、レーザービーム１１の結合、したがって、当該システムの伝送性は、光学ユニット７２内の熱的変化と機械応力によって影響される。非常に小さなコア径を有する単一モードファイバーを使用する場合には、当該伝送性は、ほんの数分以内に１０パーセント以上低下しうる。このことは、測定ヘッド４内のレーザー出力不足だけでなく、ファイバー内での熱的相互作用によってファイバー伝送システムの破壊をも結果として生じえるので、絶対に避けなければならない。

ファイバー伝送光学部品のコア内におけるレーザービーム１１の補正とその心合わせ（センタリング）の操作原理は、図１中の図と同様に実施され、図２を参照して記載された円形光ダイオード５１の機能は、一本のファイバーとして形成された伝送光学部品３の円形コア直径と、後者の下流に結合され且つ伝送された全ての光を統合する光検出器５とによって表されうる。そのため、その後方に配置されたあらゆる形体の光検出器５と共に光伝送ファイバー３２は、円形光ダイオード５１の制御のために、図１、２を参照して記載された機能を同様にシミュレーションする。

図３に示したように、本測定システムは移動式の、フレキシブルな非線形操作型顕微鏡であって、位置合せを自由に選択できる車輪付きの移動式基部装置７を備えている。空間スペースにおいて自由に動くことのできる測定ヘッド４が、支持アーム８によってこの基部装置に取り付けられている。また、二つの異なる光伝送光学部品３である、関節ミラーアーム３１と光ファイバー３２とが、画像化レーザー走査に必要なレーザー放射光を光学的に誘導するために、前記基部装置７と測定ヘッド４との間に配置される。これらは、異なる検出手法用の、例えば、普遍性を制限することなく、測定ヘッド４内で、異なる励起ビームが同一直線上に（共線的に）重ね合わせられる、多光子断層撮影装置、及び、CARS断層撮影装置用の励起放射光の伝送用に設けられている。このために、位置検知型光検出器５と、制御ユニット６と、制御可能な傾斜鏡２とを備えた図１に概略的に示したビーム安定化用システムが、測定ヘッド４内で用いられる。このようにして、図３に示したように、測定ヘッド４を空間スペース内のあらゆる位置の、測定対象物９（人間）としての人皮膚９１の一部に、広い範囲に測定ヘッド４を回転可能なことから励起条件（の低下）に応じたいかなる変化も結果的に生じることなく、自由に位置合せすることが可能である。

応用のための多くの可能性を含む、本発明に係る走査型顕微鏡の様々な他の技術態様を、以下の実施例において詳細に記述する。

図３を参照しながら先に記載したように、図４に示した本発明に係る顕微鏡は、位置決めを自由に選択可能とするための、車輪付きの移動式基部装置７を備えている。

多光子画像化用に、基部装置７内に、短パルスレーザーシステム７１（５fs−５００ps；ガウス型ビームプロファイル、例えば、チタン：サファイアレーザー）と、光学ユニット７２とを備えており、当該光学ユニット内では、制御可能な傾斜鏡２は、二軸式傾斜鏡２１として、前記パルスレーザーシステム７１から出て関節ミラーアーム３１の形体のフレキシブルな伝送光学部品３へ入るレーザービーム１１と結合する。この第一実施例において、レーザービーム１１は、フレキシブルな関節ミラーアーム３１によって光学式測定ヘッド４へ誘導される。多数の部品を備え且つあらゆる位置で固定可能な可動式支持アーム８は、光学式測定ヘッド４を自由に位置決め可能にするので、前記関節ミラーアーム３１は、同様にして確動作動（positive drive）される。したがって、その集束光学部品４４を含む測定ヘッド４は、この場合には垂直表面を有する測定対象物９上の９０度位置において、この例では、組成（材料又は層状組成）を分析すべき掛けられた絵画９２である、測定対象物９に対して、あらゆる配向で位置決め可能である。そのため、標的面４１は常に均一に照射される、というのも、レーザービーム１１の軸方向の制御と調整により、変動する励起放射光から結果として生じる測定エラーが回避されるからである。

短パルスレーザー７１から発散する波長による、（MPT画像化に加え）CARS画像化に必要な２次放射光源が、短パルスレーザー７１から生じ、当該放射光の約二分の一が、ビームスプリッタ７２５によってレーザービーム１１から分離され、レーザービーム１１’として周波数シフタ７３へ供給される。後者から発散された発散波長を有するレーザービーム１２は、同様に光学ユニット７２へ結合されるが、その際、レーザービーム１２は、二軸において制御可能な（二軸式傾斜鏡２１と同様の機能を有する）一つの第２傾斜鏡２２によってさらに誘導され、様々なレンズ間隔（lens separation）と様々な光学遅延回路（optical delay line）７２３を備えたテレスコープ（望遠鏡式）システム７２２とを通り、調整可能なミラー装置７２４と二色性ミラー７２６を通過した後で、短パルスレーザー７１のレーザービーム１１と同一直線上（同一軸に沿った二つのビーム成分の空間的な重ね合わせ）に位置合せされる。前記二色性ミラー７２６の後、両レーザービーム１１、１２は、関節ミラーアーム３１へ同一直線上に結合されて、測定ヘッド４へ伝送される。二つのレーザービーム１１、１２の軸の一致性が次に、ビームスプリッタ４２によってビーム路から集束光学部品４４へ分離されたテストビーム４３内の位置検知型光ダイオード５１の中心照射をチェックすることによって、且つ、検出された各レーザービーム１１、１２のずれを二軸において制御可能な光学ユニット７２の傾斜鏡２１、２２によって補正することによって、測定ヘッド４内において永久的に監視される。このようにして、関節ミラーアーム３１のあらゆる位置合わせにおいて、集束光学部品４４の入射瞳（標的面４１）が一様に照射されることを確保する。集束光学部品４４の入射瞳の代わりに、測定ヘッド４内で用いられた別の光学要素のアパーチャ制限も採用可能である。

時間に対する、二つのレーザービーム１１、１２における個々のレーザーパルスの重なりは、可変性の光学遅延回路７２３の手動又はモーター作動調整によって実現可能である。様々な波長のレーザービーム１１、１２の集束位置は、当該集束位置は散乱によって集束光学部品４４の後で互いに分離されるのであるが、テレスコープシステム７２２によって測定対象物９（この例では絵画９２の）内に重ね合わされうる。

測定ヘッド４内では、二つのレーザービーム１１、１２のレーザー放射光の主要部分は、ビームスプリッタ４２によって、二次元走査用に設けられた走査ユニット４６内へ誘導される。前記走査ユニット４６の後に、当該レーザー放射光は、テレスコープシステム４７を介して集束光学部品４４の入射瞳内へ誘導され、集束光学部品４４によって、検査すべき絵画９２内へ集束される。

走査ユニット４６は、集束光学部品４４の焦点面内でのレーザービーム１１、１２の二次元偏向を可能にするので、ラスター型二次元走査と、絵画９２の励起とが実行されうる。

（絵画９２の様々な層に渡る記録の積み重ねとしての）測定対象物９の三次元断層表示が、Z-軸位置決め手段４８を用いた集束光学部品４４の系統立った調整によって可能となる。

異なる励起ビーム（異なる波長とパルス繰り返し数を有するレーザービーム１１、１２）によって絵画９２内における集束光学部品４４の焦点面内で生じた信号は、測定ヘッド４の集束光学部品４４によって統合されて受け取られ、二つの二色性ビームスプリッタ４５１、４５２によって屈折され、複数の測定信号に、例えば、自己蛍光信号とSHG信号に分離されて、反射励起放射光から二つの測定検出器、例えばMP検出器５４とCARS検出器５５へ別々に送られる。MP信号とCARS信号の評価が、基部装置７において評価ユニット６１で実行され、表示装置ユニット６２上に多次元グレースケール値分布として表示可能である。

原子、分子、及び、その環境の詳細を、当該原子、及び、分子振動の減衰時間の測定によって提供することを目的とした、単光子計数法（TCSPC）と相関した時間に基づく画像記録用には、測定検出器５４、５５が、高時間分解能の検出器で置き換えられれば良く、それらの信号は、評価ユニット６１において処理可能である。TCSPC測定で必要なトリガリングに対して、トリガーダイオード５６が備えられ、ビームスプリッタ４５１又は４５２のうち一つの非励振後方反射を使用する。この実施例では、ビームスプリッタ４５１の後方反射が用いられる。

必要に応じて、ビームスプリッタ４５１又は４５２のうち一つの非励振後方反射も、位置検知型光ダイオード５１に用いることが可能であり、位置検知型光ダイオード５１の出力信号により、制御ユニット６は、測定ヘッド４内に既定された標的面４１に対するレーザービーム１１、１２の安定位置を、二軸式傾斜鏡２１、２２を用いて制御する。光ダイオード５１の代わりとして、この位置を図４中に点線で示し、光ダイオード５１’として明示しており、ビームスプリッタ４５２の非励振後方反射が用いられている。この代替の光ダイオード５１’が好ましい、というのも、標的面４１（集束光学部品４４の入射瞳）により近接して存在し、光ダイオード５１がテストビーム４３内に配置されていることが明白だからである。この場合、ビームスプリッタ４２は、フルミラー（図示せず）によって置き換えることも可能である。

本方向安定性は、この測定すべき絵画９２の安定化したレーザービーム励起によって１０から２０倍改善された。この種類の改善は、測定ヘッド４の全ての位置における画像フィールドの均一な照射と、したがって再現性のある同一の測定結果を確保するのである。

図５は、関節アームミラー３１と光ファイバー３２を二つの別々のビーム誘導光伝送システム３として用いる測定システムを示している。

実施例２と同様にして、短パルスレーザー７１は、二軸式傾斜鏡２１を介して光学ユニット７２によってフレキシブルな関節ミラーアーム３１に結合されて、光学測定ヘッド４に誘導される。

追加のCARS画像を生じるために用いられる周波数シフタ７３には、偏向ミラー７２１を介してビームスプリッタ７２５から分離されたレーザービーム１１’により、短パルスレーザー７１で生じた出力波長が備えられて、短パルスレーザー７１からずれている波長を有するレーザービーム１２を発する。先の実施例とは異なり、初期にテレスコープシステム７２２を横断した後、レーザービーム１２は次に、光学遅延回路７２３の前に、直角に配置された第一単軸式傾斜鏡２３と第二単軸式傾斜鏡２４によって二つの座標方向へ別々に位置合せされる。その他に、図４を参照しながら記載したように、それは前記遅延回路７２３とミラー装置７２４を通り抜ける。引き続いて、レーザービーム１２−また、図４中の構成からずれている−は、レーザービーム１１と結合するために二色性ビームスプリッタ７２６を通り抜けるのではなく、むしろ分離されて光誘導ファイバー３２へ結合され、且つ、後者を介して測定ヘッド４へ誘導される。

測定ヘッド４において、レーザービーム１１用の偏向機能と、テストビーム４３を光ダイオード５１へ分離するための分離機能とを同時に備えた適切な二色性スプリッタ４２１によって、レーザービーム１２は、関節ミラーアーム３１から進行するレーザービーム１１と同一直線上に重ね合わされて、（特定の測定対象物９としての）ねずみ９３の組織内へ集束される。

ねずみ９３の組織から戻ってくる信号の、更なる検出と進行が、この実施例ではビームスプリッタ４５１を介して分離されるように、発生したMP信号とCARS信号用の共用検出器５７によって実施される。CARS信号は、レーザービーム１１又は１２の一つを遮断することによって、又は代わりに、二つのレーザービーム１１、１２の位相位置（時間的基準）を遅延群７２３によって互いに変化することによって、MP信号から区別可能であり、その結果、検出器５７はMP信号だけを受信する。また、二つのレーザービーム１１、１２の相内励起により、ねずみ９３の組織のCARS信号とMP信号が一緒に（重ね合わさった状態で）検出可能である。

本レーザー走査型顕微鏡の別の有利な実施形態が図６に示されており、二つの光ファイバー３２、３３が、ビーム誘導光伝送システム３として用いられる。

異なる波長を有する二つのレーザビーム１１、１２は、実施例３のようにして、光学ユニット７２内に誘導されて、重ねあわされることなく互いに位置合せされて使用される。しかしながら先の実施例とは異なり、レーザービーム１２は第２レーザー源７４において発生し、且つ、遅延群７２３において幾らか広範囲の位相同期と引き続きのミラー装置７２４の後に、（図５を参照しながらの実施例３のようにして）光誘導ファイバー３２内に結合される。この場合、レーザービーム１１は第２ファイバー、好ましくは単一モードファイバー３３内に結合される。両ファイバー３２、３３は次に、実施例３と同じように測定ヘッド４内において、二色性スプリッタ４２１によって同一直線上に重ね合わせられる。レーザービーム１１、１２の安定な同一直線上位置合せと、それによって励起された信号の取得を、実施例２の記載と同様にして実施する。

測定対象物９として、液体又は固体物質で満たされたシャーレ９４を、測定ヘッドに（最も単純な場合、例えば両面テープによって）かたく固定するか、又は、位置決めステージ（例えば、図示していない二軸又は三軸式機械的ステージ）に可動に結合することが可能である。これは、殆んど技術的手段を用いることなく顕微鏡画像化を可能とする。シャーレ９４の代わりに、同様にして微量検定板内の物質を検査することも可能である。図６中に概略的に示した倒立顕微鏡装置は、したがって、例えば、栄養液地中に包埋された試料、粉末状又は粒状の固体材料、又は、固体（近表面領域）のようなあらゆる標本を検査することを可能にする。

従来の非フレキシブルシステムと比較した、CARS検出器を備えた記載のMPTシステムの利点は、光関節アーム３１及び／又は光誘導ファイバー３２、３３によって空間スペース内で自由に位置決め可能である低重量測定ヘッド４と、移動式基部装置７において存する。この種類の装置は、オペレータに、（時間と費用を節約することによって）組み合わせられた高分解能測定を再現性よく迅速に実行可能とし、且つ、それによって、全く同じ（互換性のある）手法で、且つ、測定対象物を動かす（例えば、患者を別の場所に移す）ことなく、又は、測定対象物９から試料を取り出すことなく、あらゆる配向の対象物表面に対し、測定対象物９（特に、人体又は動物体表面）の異なる部分における多数の測定を実行可能とする顕微鏡測定装置をもたらしうる。

また、測定ヘッド４の柔軟な位置決めは、従来の顕微鏡検査法において一般的に用いられているようないわゆる反転画像化（inverse imaging）を可能にする。

正立顕微鏡（０°）又は倒立顕微鏡（１８０°）としてのみ可能な従来の顕微鏡システムとは対照的に、無制限な可動性を有する測定ヘッド４を備えた本発明は、９０度位置又はそれから逸脱するあらゆる位置への配置も可能にする。したがって、例えば、壁の上にあるカビ培養物、作付け領域における植物部分、部材分析（図４参照）、動物実験（図５参照）、及び、人間の皮膚検査（図３参照）のような立った姿勢での対象物表面の測定、ならびに、広い範囲の法医学的検査を可能とし、さらに、あらゆる液体又は固体物質（図６参照）を検査するための、倒立レーザー走査型顕微鏡としても使用可能である。

また、測定ヘッド４において適切に採用された取付部品（図示せず）より、測定ヘッド４で位置決めテーブル（機械的ステージ）を使用することが可能となり、走査型顕微鏡の可動性（基部装置７）の結果として、あらゆる位置での顕微鏡試料領域の高分解能測定を、従来の顕微鏡機能に提供する。

多光子励起と画像化、多光子励起と画像化、及び、CARS励起と画像化が、フレキシブルな測定ヘッド４を備えた一つの小型移動式基部装置７に組み合わせられている、多光子蛍光顕微鏡、多光子SHG顕微鏡、及び／又は、CARS顕微鏡の画像診断システムの統合は、別々の画像診断システムと比較して利点を有する。フレキシブルな関節アーム３１又は光ファイバー３２、３３を備えた本提案の装置は、分解能を制限することなく、且つ、励起放射光の調整不良から生じる欠陥信号もなく、測定ヘッド４の自由な位置決めを可能にする、というのも、励起放射光が、単純でしっかりとした手法で確実に検出及び補正され、従って、画像化と評価が最小限の誤差であることを保証することによるからである。

１ レーザー
１１ レーザービーム（励起ビーム）
１２ レーザービーム（２次励起ビーム）
１３ ビームプロファイル
２ （制御可能）傾斜鏡
２１、２２ 二軸式傾斜鏡
２３、２４ 単軸式傾斜鏡
３ 伝送光学部品
３１ 関節ミラー光学部品
３２ 光誘導ファイバー
３３ 単一モードファイバー
４ 測定ヘッド
４１ 標的位置
４２ ビームスプリッタ
４２１ 二色性スプリッタ
４３ テストビーム
４４ 集束光学部品
４５ 信号分離スプリッタ
４５１ 二色性ビームスプリッタ
４５２ 二色性ビームスプリッタ
４６ 走査ユニット
４７ テレスコープシステム
４８ Z-軸 位置決め装置
５ （位置検知型）光検出器
５１ （円形）光ダイオード
５２、５３ （X及びY方向の）信号成分
５２１、５３１ 最大値
５４ （MP）検出器
５５ （CARS）検出器
５６ トリガーダイオード
５７ 共用検出器
６ 制御ユニット
６１ 評価ユニット
６２ 表示ユニット
７ （移動式）基部装置
７１ 短パルスレーザー
７２ 光学ユニット
７２１ 偏向ミラー
７２２ テレスコープシステム
７２３ 遅延群
７２４ ミラー装置
７２５ ビームスプリッタ
７２６ 二色性ミラー
７３ 周波数シフタ
７４ 第２レーザー源
８ 支持アーム
９ 測定対象物
９１ 人皮膚
９２ 絵画
９３ ねずみ組織
９４ （液体物質を備えた）シャーレ

Claims (15)

1. 原子及び分子によって放出される２次放射光を発生するための励起ビームを生じる、少なくとも一つの放射光源と、
   集束光学部品を備えた測定ヘッドへ前記放射光を伝送するためのフレキシブルな伝送光学部品であって、前記放射光は集束光学部品によって測定対象物内に集束されて、放出された前記２次放射光を誘導して戻し、少なくとも一つの検出器システムへ向ける、フレキシブルな伝送光学部品と、
   を備えた、非侵襲性三次元検出用のフレキシブルな非線形レーザー走査型顕微鏡であって、前記測定ヘッド（４）は、空間スペースで自由に旋回及び回転可能、且つ、柔軟に位置決め可能となるように、前記少なくとも一つの放射光源に結合していることで、あらゆる立体角の顕微鏡が実施可能となる、レーザー走査型顕微鏡において、
   前記少なくとも一つの放射光源からの、パルスレーザー放射光の少なくともひとつの励起ビーム（１１；１２）を偏向及び位置合せするため、少なくとも一つの制御可能な傾斜鏡（２）が配置されて、前記少なくとも一つの励起ビーム（１１；１２）が前記測定ヘッド（４）のあらゆる位置にて測定ヘッド（４）のアパーチャ制限された光学要素と同軸配列するように、前記少なくとも一つの励起ビーム（１１；１２）を前記伝送光学部品（３）を介して前記測定ヘッド（４）内へ位置合せすること、
   前記励起ビーム（１１；１２）からテストビーム（４３）を分離するためのビームスプリッタ（４２）が、測定ヘッド（４）内の集束光学部品（４４）の正面に配置されること、
   標的位置（４１）内に範囲を限定された前記励起ビーム（１１；１２）のビーム位置を決定するための空間分解光検出器（５）が、当該標的位置（４１）と共役する前記テストビーム（４３）の位置内に置かれ、その際、前記光検出器（５）上の当該テストビーム（４３）の中心位置が、前記励起ビーム（１１；１２）の平常位置に該当すること、及び、
   前記光検出器（５）上の中心位置からの前記テストビーム（４３）のずれ検出にもとづいて制御可能な傾斜鏡（２）を駆動する制御ユニット（６）が設けられて、前記測定ヘッド（４）での標的位置（４１）に関して前記励起ビーム（１１；１２）の方向安定性を達成すること、を特徴とする、レーザー走査型顕微鏡。
2. 前記制御可能な傾斜鏡（２）が、静電容量式の、電気誘導式の、又は、圧電式（ピエゾ式）の作動装置、ステップモーター、又は、DCモーターから成る群のうち一つの駆動原理に基づいた鏡ホルダーによって駆動されることを特徴とする、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
3. 前記制御可能な傾斜鏡（２）が、二軸式鏡ホルダー（２１；２２）によって、又は、二つの単軸式鏡ホルダー（２３；２４）によって実現されることを特徴とする、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
4. 前記集束光学部品（４４）の入射瞳、又は、アパーチャで制限された別の光学要素の入射瞳が、少なくとも一つの励起ビーム（１１；１２）の標的位置（４１）として選択されることを特徴とする、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
5. テストビーム（４３）を生じるためのビームスプリッタ（４２）が、測定ヘッド（４）内への少なくとも一つの励起ビーム（１１；１２）の誘導に基づいて、反射型ビームスプリッタとして、又は、透過型ビームスプリッタとして構成されることを特徴とする、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
6. テストビーム（４３）を分離するためのビームスプリッタ（４２）が、二つの異なる励起ビーム（１１；１２）を同一直線上に結合するための二色性ミラーとしても構成されることを特徴とする、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
7. 光検出器（５）が円形光ダイオード（５１）であることを特徴とする、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
8. 伝送光学部品（３）内のビーム安定性の制御に加え、レーザーの照準安定性が決定及び補正可能であることを特徴とする、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
9. ２次放射光用の検出器システムが、蛍光発光物質用の柔軟な診断システムをもたらすMPT画像化用又はSHG画像化用の検出器（５４）で構成され、フレキシブルな光学関節アーム（３１）により、空間スペース内での測定ヘッド（４）の自由な位置決めを可能にし、且つ、再現性のあるMPT画像化を確保することを特徴とする、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
10. ２次放射光用の検出器システムが、生物体内の蛍光発光物質用又は非蛍光発光物質用の柔軟な診断システムをもたらすMPT画像化用及びCARS画像化用の検出器（５４；５５）で構成され、共用する一つの軟性光学関節アーム（３１）により、空間スペース内での共用する測定ヘッド（４）のあらゆる自由な位置決めを可能にし、且つ、同じ場所を共用する、MPT信号及びCARS信号からの画像化を同時に生じることを特徴とする、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
11. ２次放射光用の検出器システムが、生物体内の蛍光発光物質用又は非蛍光発光物質用の柔軟な診断システムをもたらすMPT画像化用及びCARS画像化用に設計され、フレキシブルな光学関節アーム（３１）と別の光ファイバー（３２）とにより、空間スペース内での共用する測定ヘッド（４）のあらゆる自由な位置決めを可能にし、且つ、同じ場所を共用する、MPT信号及びCARS信号からの画像化を同時に生じることを特徴とする、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
12. ２次放射光用の検出器システムが、生物体内の蛍光発光物質用又は非蛍光発光物質用の柔軟な診断システムをもたらすMPT画像化用及びCARS画像化用に設計され、二つの別々の光ファイバー（３２；３３）により、空間スペース内での共用する測定ヘッド（４）のあらゆる自由な位置決めを可能にし、且つ、同じ場所を共用する、MPT信号及びCARS信号からの画像化を同時に生じることを特徴とする、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
13. ２次放射光用の検出器システムが、MPT画像化用及びCARS画像化用に共用する一つの測定検出器（５７）を有し、CARS励起を定期的に遮断する手段が設けられて、信号組み合わせ表示に対してMPT画像の分離を可能にすることを特徴とする、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
14. ２次放射光用の検出器システムが、MPT画像化用にTCSPC検出器を有し、さらに、測定信号を分離するために設けられた、ビームスプリッタ（４５１）の後方反射を使用するトリガーダイオード（５６）を有することを特徴とする、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
15. 測定ヘッド（４）が、移動式基部装置（７）においてあらゆる位置に固定可能であり且つ伝送光学部品を確動作動するフレキシブルな支持アーム（８）によって機械的に支持され、
    パルス励起放射光（１１；１２）を生じる少なくとも一つの放射光源（７１）と、
    前記パルス励起放射光（１１；１２）の同期化及び測定ヘッド（４）に対する少なくとも一つの伝送光学部品（３１；３２；３３）の位置合せ用の光学ユニット（７２）と、
    測定ヘッド（４）内の励起放射光（１１；１２）の方向を安定するための制御ユニット（６）と、及び、
    表示ユニット（６２）によって映像化するために、測定ヘッド（４）の検出器システム（５４、５５）から伝送される信号を処理する評価ユニット（６１）とが、前記基部装置（７）内に設けられることを特徴とする、請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。