CN108982443A - 多光子激发的近红外二区荧光扫描显微成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多光子激发的近红外二区荧光扫描显微成像系统。本发明中的1220nm飞秒激光被引入到奥林巴斯正置扫描显微镜，经过近红外增透物镜聚焦于样品，近红外二区荧光信号由大口径光纤准直器收集后耦合进近红外增透大口径光纤，最终被近红外二区响应的光电倍增管探测转换成电信号，电信号由信号放大器放大后输入到高速数据采集卡进行采集，经计算机处理后，得到样品的近红外二区荧光强度图像。本发明具有简单实用、稳定性好、激发波长可调谐、使用方式灵活等特点。

Description

多光子激发的近红外二区荧光扫描显微成像系统

技术领域

本发明属于应用光学的显微成像领域，涉及一种多光子激发的近红外二区荧光扫描显微成像系统。

背景技术

近红外二区一般是指1000-1700nm波段，波长位于近红外二区的光在生物组织中的散射较小，因此基于近红外二区的荧光生物成像具有成像深度大、空间分辨率高的优势。此外，生物组织在近红外二区波段的自发荧光相对较小，所以近红外二区荧光成像还具有很好的信噪比。

最近几年，近红外二区荧光生物成像技术得到了快速发展，在生物医学的研究中发挥了重要的作用。目前，近红外二区荧光宏观活体成像系统已经投入使用，通过引入在该波段有发光特性的材料，选择特定的激发光（一般是700-900nm的近红外光）、分光器和铟镓砷（InGaAs）相机，可以实现生物标本（如小鼠）的近红外二区荧光宏观（全身）成像。此外，近红外二区荧光成像还可以和宽场显微成像技术相结合，得到近红外二区荧光显微成像系统，进而实现对活体生物样品高分辨、大深度、动态的实时观测。

然而，这种近红外二区荧光显微成像系统采用宽场照明、二维面阵探测的方式，在样品深度方向（轴向）的空间分辨能力相对不足，此外，其在横向分辨率上也还有很大的改善余地。为了提高近红外二区荧光显微成像系统的轴向和横向分辨率，可以采用基于激光逐点扫描和光电倍增管逐点探测的三维显微成像方式，它主要有两种类型：单光子荧光共聚焦扫描成像和多光子荧光扫描成像（包括双光子，三光子激发等）。本发明采用第二种类型，即多光子激发下的扫描成像方式。由于多光子激发时所采用的飞秒激光波长较近红外二区荧光波长更长，因此它在生物组织中的散射更小，有利于获得更强的光穿透能力和光斑聚焦效果，进而实现更大的成像深度。

目前商用的多光子荧光扫描显微镜主要探测的是可见光波段的荧光信号，其激发光所经过的光路是经过近红外增透设计的，但荧光的收集光路则是针对可见光进行优化的。如果直接将其用于多光子激发的近红外二区荧光成像，荧光信号的损耗会很大。此外，商用多光子荧光扫描显微镜的光电倍增管（PMT）只能响应可见光波段，故无法有效的探测近红外二区的荧光信号。目前，市场上还没有适用于多光子激发的近红外二区荧光扫描显微成像系统。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种多光子激发的近红外二区荧光扫描显微成像系统。

本发明主要技术构思：本发明以奥林巴斯的正置扫描显微镜（FV1200+BX61）为基础光学系统，结合近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75，滨松）、大口径近红外增透光纤准直器、近红外增透大口径光纤、高速数据采集卡（NI USB-6251），开发出一套多光子激发的近红外二区荧光扫描显微成像系统。本发明将1220nm飞秒脉冲激光引入系统激发近红外二区荧光探针（PbS量子点，荧光峰1250nm），并截取了900～1180nm波段的荧光信号进行探测，获得了多光子激发下的近红外二区荧光强度图像。

本发明的技术方案是：

本发明包括奥林巴斯正置扫描显微镜（FV1200+BX61）、近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）、近红外增透的大口径光纤准直器、近红外增透大口径光纤、高速数据采集卡（NI USB-6251）、高增益、大带宽信号放大器（C12419，滨松）、1220nm飞秒脉冲激光光源等。

在该系统中，1220nm飞秒激光被引入到奥林巴斯正置扫描显微镜（其扫描透镜和管镜是红外增透的），经过近红外增透物镜（XLPLN25XWMP2）聚焦于样品（PbS量子点），近红外二区荧光信号由大口径光纤准直器收集后耦合进光纤，最终被近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）探测转换成电信号，电信号由信号放大器（C12419，滨松）放大后输入到高速数据采集卡（NI USB-6251）进行采集，经计算机处理后，得到（多光子激发下的）样品的近红外二区荧光强度图像。

本发明具有的优势是：

第一，相较于普通的多光子荧光显微成像系统，该系统由于其激发光和所探测到的荧光信号均位于近红外二区波段，且各部分光路都是针对该波段做特定优化的，因此具有更好的激发、探测效率，更大的生物组织成像深度，更小的生物组织损伤等。

第二，该系统由各个功能独立的硬件模块组成，拆装方便，使用方式多样。与单光子激发的共聚焦扫描显微成像方式（需采用针孔（pinhole）进行空间滤波以获得高空间分辨率）相比，本发明采用了多光子激发荧光的机制，省去了机械的针孔结构，无需做精准的成像匹配，这大大简化了系统，使得操作更加简便。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为多光子激发下的PbS量子点样品的近红外二区荧光强度图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步说明。

本发明利用功能独立的硬件设备，搭建了一套多光子激发的近红外二区（1000-1700nm）荧光扫描显微成像系统。它是在扫描显微镜的基础上，以波长可调谐的飞秒脉冲激光作为光源（这里以1220nm飞秒激光为例，检验系统的有效性），利用近红外增透的大口径光纤准直器及近红外增透的大口径光纤将样品的近红外二区荧光引入近红外二区响应的光电倍增管（PMT）进行探测。光信号转化为电信号后经高增益、大带宽的信号放大器放大，传入高速数据采集卡，经计算机处理后，实现多光子激发下的近红外二区荧光扫描显微成像。

如图1所示，本实施例包括奥林巴斯正置扫描显微镜（FV1200+BX61）、近红外二区响应的光电倍增管（H12397-75）、近红外增透的大口径光纤准直器、近红外增透大口径光纤、高速数据采集卡（NI USB-6251）、高增益、大带宽的信号放大器（C12419，滨松）、1220nm飞秒脉冲激光光源等。

首先，1220nm飞秒激光1通过爬高系统2（由两个全反镜组成），进入奥林巴斯正置扫描显微镜8（FV1200+BX61）。激发光进入显微镜后，通过扫描振镜系统3，达到扫描功能，再经过全反镜4，反射至1180nm短通二色镜5（1180nm以上的光被反射，1180nm以下的光能透射），经过二色镜反射后，准直的激发光进入近红外增透物镜9（XLPLN25XWMP2）。物镜将激发光聚焦于样品10（PbS量子点）。样品经激发光激励后产生荧光峰位于1250nm处的多光子荧光。荧光信号被物镜9收集后，入射到二色镜5，再经过二色镜的透射，入射到1180nm短通滤光片6（用于进一步滤除激发光），经其滤光后，由摄影透镜7将荧光充分收集并缩束，然后入射到大口径光纤准直器11。光纤准直器将荧光耦合进近红外增透大口径光纤12，经过光纤传输后，荧光最终被近红外二区响应的光电倍增管13（H12397-75）探测到。光电倍增管将光信号转化成电信号后，传输到高增益、大带宽的信号放大器14（C12419，滨松）。经放大后，电信号输入高速数据采集卡15（NI USB-6251）。最后计算机16根据数据采集卡收集到的电信号和控制振镜的同步扫描信号（提供像素位置信息X,Y），构建出荧光强度图像。通过这套自建的系统，所取得的实验效果如图2所示。

Claims (5)

1.多光子激发的近红外二区荧光扫描显微成像系统，包括奥林巴斯正置扫描显微镜、近红外二区响应的光电倍增管、近红外增透的大口径光纤准直器、近红外增透大口径光纤、高速数据采集卡、信号放大器、1220nm飞秒脉冲激光光源，其特征在于：

1220nm飞秒激光被引入到奥林巴斯正置扫描显微镜，经过近红外增透物镜聚焦于样品，近红外二区荧光信号由大口径光纤准直器收集后耦合进近红外增透大口径光纤，最终被近红外二区响应的光电倍增管探测转换成电信号，电信号由信号放大器放大后输入到高速数据采集卡进行采集，经计算机处理后，得到样品的近红外二区荧光强度图像。

2.根据权利要求1所述的多光子激发的近红外二区荧光扫描显微成像系统，其特征在于：所述的1220nm飞秒激光由爬高系统引入至奥林巴斯正置扫描显微镜。

3.根据权利要求2所述的多光子激发的近红外二区荧光扫描显微成像系统，其特征在于：所述的爬高系统由两个全反镜组成。

4.根据权利要求1所述的多光子激发的近红外二区荧光扫描显微成像系统，其特征在于：所述的奥林巴斯正置扫描显微镜中的扫描振镜系统受控于计算机。

5.根据权利要求1所述的多光子激发的近红外二区荧光扫描显微成像系统，其特征在于：所述的奥林巴斯正置扫描显微镜中的扫描振镜中的二色镜为1180nm短通二色镜。