CN201242612Y

CN201242612Y - 稳态激光泵浦上转换发光显微镜

Info

Publication number: CN201242612Y
Application number: CNU2008200596170U
Authority: CN
Inventors: 李富友; 余梦晓; 杨红
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2008-06-12
Filing date: 2008-06-12
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2018-06-12

Abstract

本实用新型属于光学显微镜技术领域，具体为一种稳态激光泵浦上转换发光显微镜。该显微镜包括物镜和载物台组成的显微镜光学系统。由半导体激光器产生的稳态激光束通过光纤导入该显微镜光学系统中，沿该激光束前进方向上依次放置扩束透镜、光束整形镜和短通分色镜，其中短通分色镜与该激光束成45℃角放置，在垂直于该激光束且穿过该分色镜的光轴上，在该分色镜上方同轴地依次放置有发射滤光片和检测器，在该分色镜下方依次放置有物镜、样品和载物台。本实用新型能直接对具有稳态激光泵浦上转换发光性质的材料进行成像，也可以将稳态激光泵浦的上转换发光材料引入细胞、组织或其它基质中进行成像。

Description

稳态激光泵浦上转换发光显微镜

技术领域

本实用新型属于光学显微镜技术领域，具体涉及一种稳态激光泵浦上转换发光显微镜。

背景技术

荧光显微镜是生命科学、医学和材料科学研究中的一个重要工具。其中，基于荧光材料单光子过程的共聚焦荧光显微镜由于其高分辨率、高灵敏度和高放大率等特点，已经成为细胞形态学、(分子)细胞生物学、神经学、药理学、遗传学等领域中不可缺少的研究工具。但它也有固有的缺陷，如样品容易被光漂白，不能完全消除生物样品自发荧光的干扰，使用紫外光和蓝光等短波长的激光作为激发光造成成像深度有限(几十微米)，同时短波长的光容易损伤生物样品。随后发展起来的双光子荧光显微镜采用波长在红外光区的飞秒激光作为激发光源，减小了激发光对生物样品的光损伤，提高了成像深度(几百微米)，同时减弱了非焦面的光漂白。由于现有的荧光材料的双光子吸收性能非常有限，双光子显微镜的激发光源必须使用昂贵的飞秒脉冲激光器(～$200,000)，因此，基于飞秒激光技术的双光子荧光显微镜难以普及。此外，脉冲的飞秒激光具有极高的瞬时功率(峰值功率密度一般大于(10¹¹W/cm²)，所以焦点处的漂白不可避免，限制了双光子荧光显微镜在生物样品长时间连续成像中的使用。

最近，稳态激光泵浦的上转换发光材料在生物成像中的应用引起了越来越多研究者的重视。和传统的荧光材料相比，这类材料具有特殊的上转换发光性质，即能吸收两个或两个以上低能光子而辐射一个高能光子，通常是将近红外光转换成可见光。采用近红外光作为激发光，可以减小激发光对生物样品的损伤，提高成像深度，而使用廉价的稳态激光器(～$2,000)大大降低了仪器造价。另外，由于生物样品内源性荧光物质不能被稳态近红外激光激发，使用这类材料可以完全消除生物样品自发荧光的干扰。因此，如果能将稳态激光泵浦的上转换发光材料与显微技术结合起来，发展一种新型的显微镜，则有望解决共聚焦和双光子荧光显微镜存在的一些问题，为生命科学、医学和材料科学研究提供一种新的方法。

发明内容

本实用新型的目的在于提供一种稳态激光泵浦上转换发光显微镜，该显微镜能直接对具有稳态激光泵浦上转换发光性质的材料进行成像，也可以将稳态激光泵浦的上转换发光材料引入细胞、组织或其它基质中进行成像。

本实用新型的技术解决方案是：一种稳态激光泵浦上转换发光显微镜，包括物镜和载物台组成的显微镜光学系统。由半导体激光器(中心波长≥800nm)产生的稳态激光束通过光纤导入该显微镜光学系统中，沿该激光束前进方向上依次放置有扩束透镜、光束整形镜和短通分色镜(近红外光反射，可见光透过)，其中短通分色镜与该激光束成45℃角放置，在垂直于该激光束且穿过该分色镜的光轴上，在该分色镜上方同轴地依次放置有发射滤光片和检测器，在该分色镜下方同轴地依次放置有物镜、样品和载物台，样品位于载物台上。

本实用新型的工作过程是：半导体激光器(中心波长≥800nm)产生的稳态激光束经过扩束透镜和光束整形镜，变成一束较大的平行光束，短通分色镜(近红外光反射，可见光透过)使光束偏转90℃，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中具有稳态激光泵浦上转换发光性质的材料在激光的激发下发射沿各方向的上转换发光，一部分上转换发光信号由物镜收集转换成平行光束，通过该短通分色镜(近红外光反射，可见光透过)，再通过发射滤光片，一定波长范围的信号被截取，然后被检测器接收。

本实用新型与已有的荧光显微成像技术相比，具有以下优点：1.由于生物样品内源性荧光物质和常用的有机荧光染料不能被稳态近红外激光器激发，因此本实用新型消除了生物样品自发荧光和有机荧光染料发光等背景荧光的干扰，是一种高灵敏度的成像技术。2.由于稳态激光泵浦的上转换发光材料在稳态近红外激光激发下几乎不被光漂白，而且稳态近红外激光对有机荧光染料的光漂白很弱，对生物样品的损伤小，因此本实用新型是一种能对生物样品进行较长时间连续观察的成像技术。3.本实用新型采用半导体激光器作为激发光源，和双光子荧光显微镜采用的飞秒激光器相比，半导体激光器已经国产化，价格低廉，因此本实用新型易于推广普及。

附图说明

图1是本实用新型的基本结构示意图。

图2是本实用新型的一个实例的结构示意图。

图3是用本实用新型的一个实施例获得的稳态激光泵浦上转换发光材料、有机荧光染料DAPI和DiI的光漂白实验结果。(a)和(b)分别是在高功率980nm稳态激光(焦面处功率约为19mW)和低功率543，405nm稳态激光(焦面处功率分别约为15和0.8μW)同时照射下，有机荧光染料DAPI和DiI的发光强度随时间的变化曲线。(c)，(d)和(e)分别是在高功率980，543，405nm稳态激光(焦面处功率分别约为1.6，0.13和19mW)同时照射下，有机荧光染料DAPI和DiI，以及稳态激光泵浦上转换发光材料的发光强度随时间的变化曲线。

图中标号：1为半导体激光器，2为扩束透镜，3为光束整形镜，4为短通分色镜，5为发射滤光片，6为检测器，7为物镜、8为样品，9为载物台，10为照明针孔，11为反射镜，12为聚焦透镜，13为探测针孔，14为光栅，15为计算机，16为扫描镜。

具体实施方式

下面根据图2给出本实用新型的一个较好的实施例，用以说明本实用新型的结构特征和功能特点，而不是用来限定本实用新型的范围。

如图2所示，半导体激光器1产生的稳态激光束通过光纤导入，沿该激光束前进方向上依次放置有扩束透镜2、光束整形镜3、照明针孔10和短通分色镜4，其中短通分色镜4与该激光束成45℃角放置，在垂直于该激光束且穿过该分色镜的光轴上，在该分色镜下方与光轴成45℃放置有反射镜11，在该反射镜的反射光束的前进方向上依次放置有聚焦透镜12、探测针孔13、光栅14和光电倍增管检测器6，其中光电倍增管检测器与计算机15连接。另外，在分色镜4上方与激光束垂直的光轴上，同轴地放置有扫描镜16、物镜7、载物台9和样品8，其中扫描镜16与计算机15连接。本实施例中，通过光栅分光的方式选择一定波长范围的信号由检测器6接收。同时在光路中引入照明针孔10、探测针孔13和扫描镜16等组成的共聚焦扫描单元。计算机15与检测器6和扫描镜16连接，实现图像存储及扫描控制。此外，通过步进马达驱动载体台9沿Z轴移动可以获得三维图像。本实施例中，半导体激光器采用中心波长为980nm、输出功率为0-600mW可调的国产激光器(上海瀚宇光纤通信技术有限公司)，短通分色镜为反射波长大于850nm光，透过波长小于850nm光的分色镜(Model 850DMSP，OMEGA)，显微镜采用OLYMPUS IX81倒置显微镜，共聚焦扫描单元为OLYMPUS FV1000，检测器是R6357 Enhanced model(HAMAMATSU)，图像存储、分析及扫描控制软件为FV10-ASW(OLYMPUS)。

本实施例的工作过程是：

半导体激光器(中心波长为980nm)1发出的激光束经过扩束透镜2和光束整形镜3，变成一束直径较大的平行光束，通过照明针孔10后，短通分色镜(反射波长大于850nm的光，透过波长小于850nm的光)4使光束偏转90°，经过扫描镜16后被物镜7会聚在物镜的焦点上，样品8中具有稳态激光泵浦上转换发光性质的材料在激光的激发下发射沿各个方向的上转换发光，一部分上转换发光信号被物镜7收集，经过扫描镜16和短通分色镜4后被反射镜11反射，反射后的信号经聚焦透镜12，会聚在聚焦物镜的焦点处，再通过焦点处的探测针孔13和光栅14，由检测器6接收。然后通过计算机15控制扫描镜16，利用聚焦光斑扫描样品的方式获得一幅二维图像。在此基础上，通过步进马达驱动载体台9沿Z轴移动可以获得三维图像。

用本实施例对稳态激光泵浦上转换发光材料标记的细胞进行二维成像，可以获得清晰的图像。

用本实施例对稳态激光泵浦上转换发光材料掺杂的PMMA膜进行三维成像。

如图3所示，用本实施例通过时间序列扫描成像的方法考察了它对稳态激光泵浦上转换发光材料、有机荧光染料DAPI和DiI的光漂白情况。图中纵坐标表示发光强度(归一化后)，横坐标表示时间。首先考察980nm稳态激光对有机荧光染料的光漂白，(a)和(b)分别是在高功率980nm稳态激光(焦面处功率约为19mW)照射下有机荧光染料DAPI和DiI发光强度随时间的变化曲线；此时需要将543，405nm稳态激光控制在很低的功率(焦面处功率分别约为15和0.8μW)以得到DAPI和DiI图像，同时尽量避免它们对DAPI和DiI的漂白。由曲线(a)和(b)可知，经过425s的连续照射，DAPI和DiI的信号强度分别为初始强度的84％和90％。在只有相同功率的543，405nm稳态激光照射而没有980nm稳态激光的对照实验中，DAPI和DiI的信号强度分别为初始强度的94％和99％。对比两组数据说明稳态近红外激光对有机荧光染料的光漂白很弱。然后考察具有稳态激光泵浦上转换发光性质的材料、有机荧光染料DAPI和DiI的光稳定性，(c)，(d)和(e)分别是在高功率980，543，405nm稳态激光(焦面处功率分别约为1.6，0.13和19mW)同时照射下，有机荧光染料DAPI和DiI，以及稳态激光泵浦的上转换发光材料的发光强度随时间的变化曲线。由曲线(c)，(d)和(e)可知，经过425s的连续照射后，上转换发光材料的发光强度仍然为初始值的96％。而DAPI和DiI的发光强度衰减得很快，经过400s的连续照射，DAPI和DiI的发光强度分别衰减到初始值的1％和2.5％。对比两组数据说明稳态激光泵浦上转换发光材料的光稳定性远远高于有机荧光染料，它在稳态近红外激光激发下几乎不被光漂白。

Claims

1、一种稳态激光泵浦上转换发光显微镜，其特征在于由扩束透镜、光束整形镜、短通分色镜、发射滤光片、检测器、物镜和载物台组成，由半导体激光器产生的稳态激光束通过光纤导入该显微镜光学系统中，沿该激光束前进方向上依次为扩束透镜、光束整形镜和短通分色镜，其中短通分色镜与该激光束成45℃放置，在垂直于该激光束且穿过该分色镜的光轴上，在该分色镜上方同轴地依次放置发射滤光片和检测器，在该分色镜下方同轴地依次放置物镜、样品和载物台，样品位于载物台上。