CN108375560A - 一种激光共聚焦-双光子-上转换多模态荧光成像系统及其应用 - Google Patents
一种激光共聚焦-双光子-上转换多模态荧光成像系统及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种多模态光学成像系统，集成了多种先进光学成像技术，可以同时实现双光子成像、上转换荧光成像、普通荧光共聚焦成像，组成一个多功能的高分辨光学成像系统，可以适用于多种研究领域，在生物医学、临床诊断等领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及光学成像系统领域，特别是涉及一种多模态荧光成像系统。
背景技术
近年来，随着多种荧光材料和标记方法的出现，生物显微成像技术得到快速发展，使得人们能从宏观转向微观，在分子水平实时动态揭示反应的机理和调控机制，为科学研究提供详细的定性、定位、定量资料，实现生命科学与化学、物理等学科全面交叉融合。
双光子显微成像是一种高分辨率的荧光成像手段，相对于激光共聚焦显微成像，双光子显微成像不需要添加任何空间滤波装置就能获得低的背景噪声和天然的分辨率，具有很好的层析效果。荧光分子同时吸收两个长波长的光子发射出一个短波长的光子，提高了成像深度，又由于双光子激发仅仅局限在焦点附件的很小区域内，所以光漂白也被限制于该小区域内，对样品的光损伤也较小。
上转换显微成像是采用近红外连续激光作为激发源，是一种反-斯托克斯发光成像技术。生物样品内源性荧光物质和常用的有机荧光染料不具备上转换发光性能，这使得该显微成像技术能有效地消除生物样品自发荧光和有机荧光染料发光等背景荧光的干扰，同时由于稳态激光泵浦的上转换发光材料在稳态近红外激光激发下几乎不被光漂白，而且稳态近红外激光对有机荧光染料的光漂白很弱，因此对生物样品的损伤小。
激光共聚焦荧光成像是一种被广泛应用的成像技术。荧光标记物质种类繁多，并且不同的荧光蛋白或染料还可对样本进行多重标记实现同时成像，其光子强度较其他光学信号更强，持续时间长，成像速度快，信号所反映的样本信息量更丰富，对信号接收仪器的要求相对较低。
以上所列的显微成像技术各有优缺点，分别适用于不同的荧光染料和研究领域。如果把这些光学成像技术集成起来，在一套成像系统中可以实现双光子显微成像、上转换显微成像、激光共聚焦荧光成像，则将形成一个多模态光学成像系统，能够适用于不同生物样本的研究观测，成为化学生物学科强有力的研究工具。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多模态光学成像系统，该多模态光学成像系统能够实现双光子显微成像、上转换显微成像和激光共聚焦荧光成像，可以实现对不同荧光标记的研究检测。
本发明的技术方案如下：
一种多模态光学成像系统，其特征在于，主要包括控制单元、照明单元、研究级显微镜系统、工作站、荧光成像单位(扫描头)、EOM(Electric Optical Module)晶体、EOM转换器、EOM控制器、声光调制器、双光子激光器过滤及干燥空气循环系统、双光子激光器冷水机；所述照明单元包括双光子激光器(光参量震荡器)、波长980nm红外半导体激光器、普通荧光激光器(紫外、可见波长激光或白激光)和显微镜荧光灯箱；所述扫描头包括合束分束二色镜单元、反式二色镜(短通)、荧光成像单位(带通滤波片、成像透镜、针孔和光电倍增管)；合束分束二色镜单元包括与所述双光子激光器的光路连接的第一二色镜、与所述980nm红外半导体激光的光路连接的第二二色镜、与所述普通激光的光路连接的第三二色镜及第四二色镜；所述研究级显微镜系统主要包括物镜、载物台、三维纳米位移台；所述控制单元与所述双光子激光器(光参量震荡器)、980nm红外半导体激光器、普通激光、反式二色镜(短通)、光电倍增管及三维纳米位移台电性连接，所述控制单元用于控制所述双光子激光器、980nm红外半导体激光器、普通激光、反式二色镜(短通)的开启和关闭及控制所述三维纳米位移台沿XYZ方向的移动；所述控制单元控制开启双光子激光器，所述双光子激光出射的光束通过所述EOM晶体，由所述EOM转换器及所述EOM控制器调节双光子偏振方向和功率，并依次经第一二色镜、第二二色镜、第三二色镜及第四二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜焦平面处激发样本中的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被所述第四二色镜反射后进入所述带通滤波片，所述带通滤波片对所述荧光中可能透射的激光进行过滤，并过滤掉其他杂散光，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，针孔调节到最大，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现双光子荧光成像；所述控制单元数显电源，控制开启所述980nm红外半导体激光器和所述反式二色镜(短通)，所述980nm红外半导体激光出射的光束依次经第二二色镜、第三二色镜和第四二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜焦平面处激发样本中的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被第四二色镜反射后通过所述反式二色镜(短通)，以过滤掉980nm激发光，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，针孔调节到最大，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现上转换荧光成像；所述控制单元控制开启普通激光，所述普通激光出射的光束依次经第三二色镜、第四二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜焦平面处激发样本中的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被所述第四二色镜反射后进入所述带通滤波片，所述带通滤波片对所述荧光中可能透射的激光进行过滤，并过滤掉其他杂散光，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现普通荧光共聚焦成像。
本发明的优点是：
本发明提供的多模态光学成像系统，集成了多种先进光学成像技术，可以在一套成像系统中同时实现双光子显微荧光成像、上转换显微荧光成像、普通荧光共聚焦显微成像，组成一个多功能的高分辨光学成像系统，可以适用于多种研究领域，为科学研究提供详细的定性、定位、定量资料，实现生命科学与化学、物理等学科全面交叉融合，在生物医学、临床诊断等领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的多模态光学成像系统的组成示意图。其中：控制单元一20，含工作站对整个系统进行软件控制、双光子激光器电源21、980nm激光器数显电源22、照明单元30、双光子激光器(光参量震荡器)31、980nm红外半导体激光器32、普通激光33、EOM转换器34、EOM晶体35、EOM控制器36、双光子激光器用过滤及干燥空气的循环系统37、冷水机38、显微镜荧光灯箱39、研究级显微镜40、物镜41、载物台42、三维纳米位移台43、合束分束二色镜单元50、第一二色镜51、第二二色镜52、第三二色镜53、第四二色镜54、反式二色镜(短通)55、荧光成像单元60、带通滤波片61、成像透镜62、针孔63、光电倍增管64。
图2为双光子荧光成像图(激发波长800nm，发射波长560nm)。
图3为上转换荧光成像图(激发波长980nm，发射波长630nm)。
图4为紫外荧光成像图(激发波长405nm，发射波长440nm)。
具体实施方式
请参考图1，图1为本发明实施例提供的多模态光学成像系统10的结构示意图。
多模态光学成像系统10包括控制单元一20(包括显示器、控制面板、遥控手柄、键盘、电脑鼠标、电脑桌、电源控制、工作站)、照明单元30、EOM(Electric Optical Module)转换器34、EOM晶体35、EOM控制器36(徕卡公司)、双光子激光器用过滤及干燥空气的循环系统37(PACU-FTR1，PACU-FTR2)、冷水机38(CS-MRC-Q4002411，深圳市酷凌时代科技有限公司)、研究级显微镜40(奥林巴斯IX83)、合束分束二色镜单元50、反式二色镜(短通)55(DM490二色镜)、荧光成像单元60。
照明单位30包括双光子激光器31(相干公司)、980nm红外半导体激光器32(MW-IR-980，长春镭仕光电科技有限公司)、和普通激光器33(405nm紫外半导体激光器，长春镭仕光电科技有限公司)和显微镜荧光灯箱39(奥林巴斯)。
扫描头单元部分包括：合束分束二色镜单元50包括：与双光子激光31的光路连接的第一二色镜51(AOBS)、与980nm红外半导体激光器32的光路连接的第二二色镜52(AOBS)、与普通激光33的光路连接的第三二色镜53(AOTF)及第四二色镜54(AOTF)；荧光成像单元60包括带通滤波片61(FSR-BG系列，10BPF10系列，Newport公司)、成像透镜62(LM001-D4.7F6.2，丹阳市陵合美光学仪器有限公司)、针孔63(正方形针孔，0-600)和光电倍增管64(9113B，ETL)。
研究级显微镜系统主要包括物镜41、载物台42、三维纳米位移台43。
控制单元一20与普通激光33、反式二色镜(短通)55、光电倍增管64及三维纳米位移台43电性连接，控制单元一20用于控制普通激光33、反式二色镜(短通)55的开启和关闭及控制三维纳米位移台43沿XYZ方向的移动。
控制单元二21包含双光子激光电源，控制开启双光子激光31，双光子激光31出射的光束通过EOM晶体35，由EOM转换器34及EOM控制器36调节双光子偏振方向和功率，并依次经第一二色镜51、第二二色镜52、第三二色镜53及第四二色镜54透射后进入物镜41，并在物镜41焦平面处激发样本(细胞)中的荧光物质(双光子荧光染料)产生荧光，荧光经所述物镜41收集后被第四二色镜54反射后进入带通滤波片61，带通滤波片61对荧光中可能透射的激光进行过滤，并过滤掉其他杂散光，同时透射荧光，透射出的荧光经成像透镜62后聚焦在针孔63处，把针孔63开到最大，透过针孔63的荧光经光电倍增管64收集，光电倍增管64将光信号转变为电信号，电信号被控制单元20采集，控制单元20根据三维纳米位移台43的位置坐标和电信号实现双光子显微成像(图2)。
控制单元三22为980nm红外半导体激光器的数显控制电源，控制开启980nm红外半导体激光器32和反式二色镜(短通)55，980nm红外半导体激光器32出射的光束依次经第二二色镜52、第三二色镜53和第四二色镜54透射后进入物镜41，并在物镜41焦平面处激发样本(细胞)中的荧光物质(上转换荧光染料)产生荧光，荧光经所述物镜41收集后被第四二色镜54反射后通过反式二色镜(短通)55，以过滤掉980nm激发光，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜62后聚焦在针孔63处，将针孔63开到最大，透过针孔的荧光经光电倍增管64收集，光电倍增管64将光信号转变为电信号，电信号被控制单元20采集，控制单元20根据三维纳米位移台43的位置坐标和电信号实现上转换显微成像(图3)。
控制单元一20控制开启普通激光33，普通激光33出射的光束依次经第三二色镜53、第四二色镜54透射后进入物镜41，并在物镜41焦平面处激发样本中的荧光物质产生荧光，荧光经所述物镜41收集后被第四二色镜54反射后进入带通滤波片61，带通滤波片61对所述荧光中可能透射的激光进行过滤，并过滤掉其他杂散光，同时透射荧光，透射出的荧光经成像透镜62后聚焦在针孔63处，透过针孔63的荧光经光电倍增管64收集，光电倍增管64将光信号转变为电信号，电信号被所述控制单元20采集，控制单元20根据三维纳米位移台43的位置坐标和电信号实现普通荧光显微成像(图4)。
本发明提供的多模态光学成像系统，集成了多种先进光学成像技术，可以在一套光学成像系统中同时实现双光子显微成像、上转换显微成像、普通荧光显微成像，组成一个多功能的高分辨光学成像系统，可以适用于多种研究领域，为科学研究提供详细的定性、定位、定量资料，实现生命科学与化学、物理等学科全面交叉融合，在生物医学、临床诊断等领域具有广泛的应用前景。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (3)
1.一种多模态光学成像系统，其特征在于：它主要包括控制单元、照明单元(30)、研究级显微镜系统、工作站、荧光成像单位、EOM晶体(35)、EOM转换器(34)、EOM控制器(36)、声光调制器、双光子激光器、(31)、双光子激光器用过滤及干燥空气循环系统(37)、双光子激光器冷水机(38)；所述照明单元(30)包括双光子激光器(31)、波长980nm红外半导体激光器(32)、普通荧光激光器(33)和显微镜荧光灯箱(39)；所述扫描头包括合束分束二色镜单元(50)、反式二色镜(短通)(55)和荧光成像单元(60)；合束分束二色镜单元(50)包括与所述双光子激光器的光路连接的第一二色镜(51)、与所述980nm红外半导体激光的光路连接的第二二色镜(52)、与所述普通激光的光路连接的第三二色镜(53)及第四二色镜(54)；所述研究级显微镜系统主要包括物镜(41)、载物台(42)、三维纳米位移台(43)；所述控制单元一(20)与所述双光子激光器(光参量震荡器)(21)、980nm红外半导体激光器(32)、普通激光器(33)、反式二色镜(短通)(55)、光电倍增管(64)及三维纳米位移台(43)电性连接，所述控制单元用于控制所述双光子激光器、980nm红外半导体激光器、普通激光、反式二色镜(短通)的开启和关闭及控制所述三维纳米位移台沿X Y Z方向的移动；所述控制单元控制开启双光子激光器，所述双光子激光出射的光束通过所述EOM晶体(35)，由所述EOM转换器(34)及所述EOM控制器调节双光子偏振方向和功率，并依次经第一二色镜(51)、第二二色镜(52)、第三二色镜(53)及第四二色镜(54)透射后进入所述物镜(41)，并在所述物镜焦平面处激发样本中的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜(41)收集后被所述第四二色镜(54)反射后进入所述带通滤波片(61)，所述带通滤波片对所述荧光中可能透射的激光进行过滤，并过滤掉其他杂散光，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜(62)后聚焦在所述针孔处(63)，针孔调节到最大，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集(64)，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元一(20)采集，所述控制单元一(20)根据所述三维纳米位移台(43)的位置坐标和所述电信号实现双光子荧光成像；所述控制单元数显电源，控制开启所述980nm红外半导体激光器和所述反式二色镜(短通)，所述980nm红外半导体激光器(32)出射的光束依次经第二二色镜(52)、第三二色镜(53)和第四二色镜(54)透射后进入所述物镜(41)，并在所述物镜焦平面处激发样本中的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜(41)收集后被第四二色镜(54)反射后通过所述反式二色镜(短通)(55)，以过滤掉980nm激发光，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔(63)处，针孔调节到最大，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管(64)收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元一(20)采集，所述控制单元一(20)根据所述三维纳米位移台(43)的位置坐标和所述电信号实现上转换荧光成像；所述控制单元一(20)控制开启普通激光(33)，所述普通激光出射的光束依次经第三二色镜(53)、第四二色镜(54)透射后进入所述物镜(41)，并在所述物镜焦平面处激发样本中的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜(41)收集后被所述第四二色镜(54)反射后进入所述带通滤波片(61)，所述带通滤波片对所述荧光中可能透射的激光进行过滤，并过滤掉其他杂散光，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处(63)，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管(64)收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元一(20)采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现普通荧光共聚焦成像。
2.根据权利要求1所述的多模态光学成像系统，其特征是：所述的普通荧光激光器包括：紫外、可见波长激光或白激光器。
3.根据权利要求1所述的多模态光学成像系统，其特征是：所述的荧光成像单位包括带通滤波片、成像透镜、针孔和光电倍增管。
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